Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów

Ogólnym celem tego protokołu jest ilościowe określenie obrotu kardiomiocytów przy użyciu długoterminowego znakowania nukleozydów i cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia jąder neo kardiomiocytów przy jednoczesnym uwzględnieniu poliploidyzacji jąder. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji kardiomiocytów i może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe do ilościowego określenia zmian w dynamice wytwarzania kardiomiocytów. Główną zaletą tego protokołu jest to, że umożliwia czułą i dokładną ocenę ilościową wytwarzania neo kardiomiocytów, niezależnie od źródła komórkowego i kontrolowania poliploidacji.

24 godziny po szóstym wstrzyknięciu EdU należy ułożyć leczone zwierzę w pozycji leżącej na plecach i za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonać nacięcie skóry od środkowej części brzucha do przepony. Następnie, trzymając mostek z dala od jamy ciała, obustronnie przetnij przeponę, aby odsłonić serce. Następnie lekko unieś serce i przetnij główne naczynia krwionośne drogi odpływu, aby wypreparować serce z jamy klatki piersiowej.

Natychmiast po zbiorach umieść serca w pojedynczych probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml zawierających 10 ml PBS schłodzonych do czterech stopni Celsjusza. Następnie przenieś próbki na pojedyncze szalki Petriego o średnicy 10 cm i za pomocą skalpela pokrój każde serce na dwie części w orientacji strzałkowej. Następnie delikatnie ściśnij kawałki serca za pomocą kleszczy.

Usuń oba kawałki serca i umieść je na szalce Petriego zawierającej 20 ml świeżego PBS. Powtórz jeszcze raz z nową szalką Petriego i 20 ml świeżego PBS. Umieść obie części serc w tej samej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i użyj igły o rozmiarze 25, aby zrobić mały otwór w pokrywie każdej probówki, aby zapobiec otwarciu pokrywki podczas przetwarzania serca.

Następnie oznacz każdą probówkę i zamroź tkanki serca w pojemniku z ciekłym azotem. Dla każdego serca, które ma być analizowane, inkubuj 36 ml jednego procenta BSA i PBS w ultra probówce wirówkowej. Wyrzuć roztwór po 30 minutach.

Gdy probówki wyschną na powietrzu, dodaj 10 ml gradientowego roztworu sacharozy do każdej probówki. Po indywidualnym rozdrobnieniu próbek serca zamrożonych ciekłym azotem za pomocą skalpela, należy przenieść fragmenty tkanek z każdego serca do pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 50 ml zawierających 15 ml buforu do lizy komórek. Homogenizować próbki przez 15 sekund przy 25 000 obr./min za pomocą homogenizatora z sondą w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj 15 ml buforu do lizy do każdej probówki i przenieś próbki pojedynczo do 40 ml odbić za pomocą dużego tłuczka do prześwitu. Wykonaj 10 uderzeń tłuczkiem i przefiltruj zawiesiny komórek przez sitko o średnicy 100 mikronów, a następnie sitko o średnicy 40 mikronów do pojedynczych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Następnie zebrać jądrowe granulki serca przez odwirowanie i ponownie zawiesić komórki w 25 ml roztworu gradientu sacharozy każda.

Ułóż komórki na wierzchu gradientu sacharozy wolnej od jąder w przygotowanych probówkach do ultra wirówek i odwiruj warstwy za pomocą odchylanego wirnika probówkowego. Po odwirowaniu ponownie zawiesić granulki jąder w 1 300 mikrolitrach buforu do przechowywania jąder i przenieść jądra do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml oznaczonej PCM1. Przenieś 300 mikrolitrów każdej zawiesiny z probówek PCM1 do nowej probówki do mikrowirówki i dodaj 700 mikrolitrów buforu do przechowywania świeżych jąder i oznacz kontrolą ISO.

Następnie znakuj jądra PCM1 przeciwciałem anty-PCM1, a jądra kontrolne ISO szybkim przeciwciałem kontrolnym IGG przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia należy odwirować próbki i ponownie zawiesić granulki w jednym ml buforu do przechowywania świeżych jąder w celu drugiego odwirowania w tych samych warunkach. Po drugim wirowaniu ponownie zawieś granulki w jednym ml buforu do przechowywania świeżych jąder i inkubuj jądra z jednym mikrolitrem fitzy sprzężonego fragmentu F(ab'2 z koziego przeciwciała przeciw wściekłości IGG przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Aby ocenić stopień włączenia EdU, odwirować zawiesiny jąder znakowanych PCM1 i kontrolą ISO i ponownie zawiesić granulki w jednym ml 1% BSA PBS dwa razy przez dwa kolejne płukania. Po drugim przemyciu zastąpić supernatant 100 mikrolitrami utrwalacza EdU i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Pod koniec utrwalania przemyć jądra jeszcze dwa razy w jednym ml PBS BSA, a następnie inkubować próbki ze 100 mikrolitrami roztworu permeablacyjnego na bazie saponin w temperaturze pokojowej.

Po 15 minutach dodaj 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego koktajlu do znakowania EdU do każdej probówki na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji odwirować próbki trzykrotnie, przemywając jądra w jednym ml PBS BSA podczas kolejnych dwóch wirowań. Na koniec oznacz próbki 400 mikrolitrami roztworu do barwienia DNA.

Analiza immunohistologiczna pulsujących serc wykazuje obecność kardiomiocytów wykazujących ekspresję PCM1, które włączyły EdU. Jednak dane uzyskane za pomocą metod immunohistologicznych mogą być błędnie interpretowane, ponieważ inne typy komórek, które zawierają EdU, mogą być błędnie identyfikowane jako kardiomiocyty. W badaniu myszy mdx i kontrolnych analiza cytometrii przepływowej szczegółowo opisana w tym protokole umożliwia szybkie ilościowe określenie generacji jądra neo kardiomiocytów, jednocześnie wykluczając komórki, które włączyły EdU do depoliploidyzacji.

Podobnie jak w przypadku wcześniej opublikowanych danych, w tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano wzrost szybkości wytwarzania jąder neo kardiomiocytów w sercach myszy mdx w porównaniu z grupą kontrolną dopasowaną do wieku. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin w ciągu dwóch dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać zarówno o kontrolach ujemnych EdU, jak i PCM1, aby można było dokładnie ustawić bramki podczas analizy.

Technika ta jest również kompatybilna z wieloma dodatkowymi technikami immunohistologicznymi, które umożliwiają ilościowe określenie inkorporacji nukleocytów w wielu różnych typach komórek serca. Technika ta została wykorzystana w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych do badania zmian w regeneracji kardiomiocytów w modelu mdx kardiomiopatii nieniedokrwiennej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak szybko określić ilościowo jądra neo kardiomiocytów, obserwować liczenie poliploidów w celu zbadania zmian w regeneracji i obrocie kardiomiocytów.