Protokół długości ścieżki żerowania dla larw Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tego testu jest ilościowe określenie składnika lokomotorycznego zachowania larw Drosophila. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki behawioralnej dotyczące genetycznego i środowiskowego wkładu w indywidualne różnice w zachowaniu larw. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, powtarzalna i pozwala na pobieranie próbek o dużych rozmiarach.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mogą mieć trudności, ponieważ sukces testu zależy od czasu rozwoju i konsekwentnego, ostrożnego obchodzenia się ze zwierzętami testowymi. Procedurę zademonstrują Ina Anreiter i Oscar Vasquez, doktoranci w moim laboratorium. Przygotuj butelkę do trzymania, wycinając otwory z jednej strony sześciouncjowej, plastikowej butelki do hodowli much.

Następnie za pomocą strzykawki napełnij pokrywki szalek Petriego wcześniej przygotowanym podłożem z sokiem winogronowym, aż powierzchnia pożywki z sokiem winogronowym utworzy kopułę nad krawędzią pokrywki. Przechowuj talerze winogronowe w wilgotnym i hermetycznym pojemniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch tygodni. Wlej 40 mililitrów wcześniej przygotowanego pokarmu na muchy do szalek Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów.

Zdobądź trzy czarne płytki z pleksiglasu z dziesięcioma okrągłymi dołkami o średnicy dziesięciu centymetrów i ułożone w wzór dwa na pięć w celu przetestowania larw oraz rozsiewacz z pleksiglasu używany do rozprowadzania pasty drożdżowej na płytkach z pleksiglasu. Następnie oddziel pokrywki od dna szalek Petriego. Zbierz od 100 do 150 samic i od 50 do 75 samców.

Pozwól samicom i samcom łączyć się w pary przez noc w sześciouncjowej butelce z kulturą much ze standardowym pokarmem dla much. Przenieś muchy do butelki i użyj taśmy maskującej, aby zabezpieczyć talerz winogronowy niewielką ilością świeżej pasty drożdżowej na wierzchu butelki. Pozostaw butelkę stojącą do góry nogami z talerzem winogronowym na dole, aby umożliwić dorosłym osobom składanie jaj na talerzu winogronowym.

Po 24 godzinach wyrzuć pierwszy talerz winogronowy i umieść nowy talerz winogronowy w butelce do przechowywania. Po 22 godzinach wyjmij talerze winogron z butelek i umieść je na szalce Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów. Następnie umieść nowy talerz winogronowy ze świeżą pastą drożdżową na butelce do przechowywania.

Usuń i wyrzuć wszystkie larwy z talerza winogron z pestkami za pomocą sondy preparującej. Inkubować oczyszczone talerze winogronowe przez cztery godziny w standardowych warunkach. Po czterech godzinach zbierz 100 L1 lub larw pierwszego stadium rozwojowego z każdego szczepu z talerzy winogronowych i umieść je na talerzach z jedzeniem.

Delikatnie umieszczaj larwy na pokarmie, nie przebijając pokarmu i nie zakopując larw. Grupy po dziesięć larw można zbierać i umieszczać na raz. Unikaj stłoczenia, rozprowadzając larwy na talerzu z jedzeniem.

Inkubować talerze z pokarmem do momentu, gdy badane zwierzęta znajdą się dziesięć godzin przed rozpoczęciem wędrówki, kiedy larwy opuszczają pokarm w poszukiwaniu miejsca przepoczwarzenia. Jeśli larwy zaczęły wędrować i poruszają się na pokrywie szalki Petriego, jak widać tutaj, zwierzęta są zbyt stare, aby je badać, a ich czas rozwoju musi zostać ponownie oceniony. Rozpuść drożdże w wodzie w stosunku jeden do dwóch.

Upewnij się, że gotowa pasta kapie i pozostawia na powierzchni pasty wstążki, które szybko się topią. Ocena właściwej konsystencji pasty drożdżowej jest ważniejsza niż stosowanie dokładnych proporcji ze względu na zmienność między markami, partiami drożdży i środowiskiem. Za pomocą pędzla delikatnie wybierz larwy z talerza z jedzeniem z pierwszego szczepu.

Zbierz larwy na szalkę Petriego i delikatnie umyj larwy wodą, aby usunąć cały pokarm. Szybko umyj larwy dwoma mililitrami wody i delikatnie osusz larwy chusteczką laboratoryjną. Trzymaj larwy w wilgotnym środowisku, ale nie zanurzaj ich w wodzie, aby uniknąć stresu.

Ułóż trzy płytki testowe obok siebie i ustaw pięciominutowy timer dla każdej płytki testowej. Nałóż pastę drożdżową na wierzch płytek testowych i za pomocą rozsiewacza rozprowadź cienką warstwę pasty drożdżowej na każdej płytce testowej, tak aby wszystkie studzienki miały równą warstwę drożdży. Delikatnie umieść jedną larwę w środku każdej studzienki.

Uruchom pięciominutowy minutnik natychmiast po umieszczeniu pierwszych larw na każdej płytce. Następnie umieść resztę larw w pozostałych studzienkach. Umieść pokrywkę szalki Petriego na wierzchu każdej studzienki.

Kiedy skończy się czas, zacznij śledzić długości ścieżek pozostawione w drożdżach za pomocą trwałego markera bez usuwania larw z płytki. Na płytkach umieszczono długości ścieżek w tej samej kolejności i z tą samą prędkością, co larwy. Na koniec należy powtórzyć etapy badania długości drogi larwalnej dla każdego szczepu.

Dane zebrane w ciągu trzech kolejnych dni testów ujawniły znaczący efekt przeciążenia, przy czym łaziki podróżowały dalej niż siedzący. Oprócz efektu szczepu, larwy, które były pozbawione pożywienia przez cztery godziny przed badaniem, miały znacznie krótsze długości ścieżek niż larwy karmione. Ogólnie rzecz biorąc, długości ścieżek były dłuższe, gdy oba szczepy były hodowane na pokarmie o wysokiej zawartości składników odżywczych w porównaniu z pokarmem o niskiej zawartości składników odżywczych.

Jeśli test ten zostanie wykonany prawidłowo, pozwala jednej osobie z łatwością przetestować do 500 larw w ciągu czterech godzin, co czyni go cennym dla fenotypowania na dużą skalę. Zgodnie z procedurą, którą właśnie pokazaliśmy, inne zmienne, takie jak płeć, deprywacja żywności lub jakość żywności, mogą być testowane, aby pokazać wpływ tych zmiennych na wzorce ruchowe związane z jedzeniem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć lokomocję larw Drosophila związaną z pokarmem w celu oceny genetycznego i środowiskowego wkładu w indywidualne różnice w zachowaniu.