Name: Protokół długości ścieżki żerowania dla larw Drosophila melanogaster (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj protokół pomiaru długości ścieżki żerowania larw Drosophila melanogaster w badaniach genetyki zachowań. Metoda umożliwia szybką, powtarzalną analizę wpływu genetycznych i środowiskowych czynników na ruchliwość.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają dalsze finansowanie Kanadyjskiej Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) dla MBS.

1. Przygotuj talerze z winogronami i butelki do zbierania larw
<ol>
	<li>Aby zrobić butelki do trzymania, wytnij otwory z jednej strony butelek z kulturami much o pojemności 6 uncji, wystarczająco duże, aby zmieścić zatyczkę fiolki na muchy do dostarczania powietrza (ryc. 1D).</li>
	<li>Aby przygotować talerze winogronowe, przygotuj 250 ml pożywki z soku winogronowego (1,8% agaru, 45% soku winogronowego, 2,5% kwasu octowego, 2,5% etanolu), gotując agar, sok winogronowy i większość wody, schłodzić do 70 ºC (mieszać podczas chłodzenia), następnie dodać kwas octowy i etanol i uzupełnić do kreski wodą.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki (bez igły) napełnić pokrywki szalek Petriego o wymiarach 35 x 10 mm, aż powierzchnia podłoża z sokiem winogronowym utworzy kopułę nad krawędzią pokrywki (rys. 1A).</li>
	<li>Talerze winogronowe przechowywać w wilgotnym i hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 ºC do czasu użycia (maksymalnie do 2 tygodni).</li>
</ol>
2. Przygotowanie talerzy z jedzeniem
<ol>
	<li>Przygotuj standardowy przepis na pokarm dla much. 
	Uwaga: Aby przetestować wpływ jakości pokarmu hodowlanego na długość ścieżki, użyliśmy pokarmu dla much o niskiej zawartości składników odżywczych: 10% sacharozy, 1,3% agaru, 0,8% winianu potasu sodu, 0,1% fosforanu monopotasowego, 0,05% chlorku sodu, 0,05% chlorku wapnia, 0,05% chlorku magnezu, 0,05% siarczanu żelaza, 5% drożdży i 0,5% kwasu propionowego w wodzie; oraz pokarm dla much o wysokiej zawartości składników odżywczych: 1,5% sacharozy, 1,4% agaru, 3% glukozy, 1,5% mąki kukurydzianej, 1% kiełków pszenicy, 1% mąki sojowej, 3% melasy, 3,5% drożdży, 0,5% kwasu propionowego, 0,2% Tegoseptu i 1% etanolu w wodzie. W przypadku obu produktów spożywczych roztwór należy sterylizować w autoklawie i schłodzić do temperatury 50 oC przed dodaniem kwasu propionowego, Tegoseptu i etanolu.</li>
	<li>Wlej 40 ml pokarmu na muchy do szalek Petriego o wymiarach 100 x 15 mm.</li>
	<li>Talerze spożywcze należy przechowywać w wilgotnym i hermetycznym pojemniku w temperaturze 4 ºC do czasu użycia (maksymalnie do 2 tygodni).</li>
</ol>
3. Przygotuj płytki testowe
<ol>
	<li>Przygotować czarne płytki z pleksiglasu o wymiarach 58 x 25 cm i grubości 6 mm z 10 okrągłymi dołkami o głębokości 1 mm i średnicy 10 cm, ułożone w układzie 2 x 5 (ryc. 1C) do badania larw na. 
	Uwaga: Jednorazowo można przebadać do 30 larw, jeśli dostępne są 3 lub więcej z powyższych płytek z pleksiglasu. Alternatywnie, larwy można badać na szalkach Petriego o średnicy 10 cm. Ta opcja jest znacznie bardziej pracochłonna i pozwala na badanie mniejszej liczby larw.</li>
	<li>Zaopatrz się w rozsiewacz z pleksiglasu o wymiarach 39 x 8 cm i grubości 6 mm do rozprowadzania pasty drożdżowej na płytkach testowych z pleksiglasu.</li>
	<li>Przygotować pokrywki na szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm do rejestrowania długości dróg larwalnych, oddzielając wcześniej pokrywki od dna.</li>
</ol>
4. Ustawianie populacji rodzicielskich
<ol>
	<li>Utrzymuj stałe warunki chowu przez cały czas trwania testu (np. 25 ºC, 60% wilgotności i cykl 12:12 światło: ciemność w przypadku standardowego pokarmu dla much).</li>
	<li>Hodować populację rodzicielską w tych samych warunkach chowu.</li>
	<li>Zbierz 100 - 150 samic i 50 - 75 samców i starzej je przez 5 ± 1 dni, aby uzyskać optymalną płodność.</li>
	<li>Pozwól samicom i samcom łączyć się w pary przez noc w butelce z kulturą much o pojemności 6 uncji ze standardowym pokarmem na muchy.</li>
	<li>Przenieś muchy do butelki do przechowywania i zabezpiecz talerz winogronowy (niewielka ilość świeżej pasty drożdżowej na talerzu winogronowym ułatwi składanie jaj; Rys. 1B) od góry taśmą maskującą (rys. 1E).</li>
	<li>Pozostaw butelki stojące do góry nogami (ryc. 1F), z talerzem winogronowym na dole, aby umożliwić dorosłym osobom złożenie jaj na talerzu winogronowym.</li>
	<li>Po 24 godzinach wyrzuć pierwszy talerz winogronowy i umieść nowy talerz winogronowy w butelce do przechowywania. Będzie to talerz winogronowy, z którego następnego dnia zbiera się larwy. 
	Uwaga: Talerze winogronowe będą musiały zostać oczyszczone z larw 22 godziny po ustawieniu, ustaw płytki tak, aby można je było oczyścić wcześnie następnego dnia (np. ustawić talerz o godzinie 12 i wyczyścić o 10 rano następnego dnia). Wskazane jest wyrzucenie pierwszego talerza winogronowego, aby uniknąć jaj, które samice mogły wstrzymywać i które mogą być w zaawansowanym rozwoju.</li>
</ol>
5. Zbierz larwy L1 (First Instar) z Talerzy Winogron
<ol>
	<li>Wyjmij talerze winogronowe z butelek 22 godziny po ich ustawieniu i umieść na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm.</li>
	<li>Umieść nowy talerz winogronowy ze świeżą pastą drożdżową na butelce do przechowywania.</li>
	<li>Usuń i wyrzuć wszystkie larwy z talerza winogron z pestkami za pomocą sondy preparującej.</li>
	<li>Inkubuj oczyszczone talerze winogronowe przez 4 godziny w standardowych warunkach.</li>
	<li>Po 4 godzinach zbierz 100 larw L1 z każdej odmiany z talerzy winogronowych i umieść na talerzach z jedzeniem.
	<ol>
		<li>Delikatnie umieszczaj larwy na pokarmie (bez perforacji pokarmu i zakopywania larw) i unikaj stłoczenia, rozprowadzając larwy na talerzu z jedzeniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować talerze z pokarmem do momentu, gdy badane zwierzęta znajdą się około 10 godzin przed rozpoczęciem wędrówki. 
	Uwaga: W temperaturze 25 ºC, 10 godzin przed wędrówką odpowiada na ogół 72 - 96 godzinom po wykluciu. Dokładny czas inkubacji należy określić przed rozpoczęciem eksperymentu, zbierając początkowy zestaw larw dla każdego szczepu i rejestrując liczbę godzin do rozpoczęcia wędrówki (wędrujące larwy przenoszą się z pokarmu na boki i pokrywkę talerzy z jedzeniem). 
	Uwaga: W razie potrzeby ci sami rodzice mogą być użyci do zbierania larw przez 3-4 dni testów, powtarzając kroki od 4.7 do 5.5. Zmień kolejność, w jakiej szczepy są konfigurowane i testowane w ciągu kilku dni, aby uniknąć wpływu kolejności testów na długość ścieżki. Testuj ten sam "kontrolny" szczep/szczepy każdego dnia testów, aby kontrolować efekty dzienne.</li>
	<li>Jeśli testowanych jest wiele szczepów, należy rozłożyć czas zapoczątkowania i zbierania larw, aby umożliwić późniejsze przetestowanie każdego szczepu w odpowiednim momencie.</li>
</ol>
6. Test długości drogi larwalnej
<ol>
	<li>Drożdże piekarskie sucho czynne rozpuścić w wodzie w stosunku 1:2 (wagowo do objętości). Gotowa pasta drożdżowa powinna być cieńsza od ciasta naleśnikowego, w taki sposób, aby po wyjęciu łyżki z pasty kapała i pozostawiała na powierzchni pasty wstążki, które szybko się topią. 
	Uwaga: Konsystencja pasty drożdżowej jest ważna i powinna być stała przez cały czas trwania eksperymentu. Dokładny stosunek drożdży do wody może wymagać dostosowania w zależności od marki i partii drożdży.</li>
	<li>Delikatnie zbierz larwy pierwszego szczepu do badania z talerza za pomocą pędzla.</li>
	<li>Zbierz larwy na szalkę Petriego i delikatnie umyj wodą, aby usunąć całe jedzenie.
	<ol>
		<li>Szybko umyj larwy 1-2 ml wody i delikatnie osusz larwy chusteczką laboratoryjną, aby uniknąć przenoszenia wody podczas umieszczania larw na płytce testowej. Aby uniknąć stresu, utrzymuj larwy wilgotne, ale nie zanurzone w wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ułóż trzy płytki testowe obok siebie i ustaw 5-minutowy timer dla każdej płytki testowej.</li>
	<li>Nałóż pastę drożdżową na wierzch płytek testowych i za pomocą rozsiewacza rozprowadź cienką warstwę pasty drożdżowej na każdej płytce testowej, tak aby wszystkie studzienki miały równą warstwę drożdży.</li>
	<li>Delikatnie umieść jedną larwę na środku każdej studzienki, uruchamiając 5-minutowy timer po umieszczeniu pierwszych larw na każdej płytce. Uwaga: Jednorazowo można wykonać trzy płytki, co daje próbkę o wielkości 30 na szczep/dzień testowy, maksymalnie do 500 larw.</li>
	<li>Umieść pokrywkę szalki Petriego na wierzchu każdej studzienki.</li>
	<li>Gdy skończy się czas, bez usuwania larw z płytki, zacznij śledzić długości ścieżek pozostawione w drożdżach za pomocą trwałego markera. Na płytkach badawczych umieszczono ślady o długości w tej samej kolejności co larwy.
	<ol>
		<li>Wykonuj śledzenie z tą samą prędkością, z jaką larwy zostały umieszczone na płytkach. Aby zachować spójność w późniejszej analizie danych, należy użyć tego samego znacznika dla wszystkich długości ścieżek. Zalecany jest marker permanentny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz kroki od 6.2 do 6.8.1 dla każdego badanego szczepu. Wybierz każdy szczep z karmy bezpośrednio przed badaniem, aby uniknąć wpływu głodu na długość ścieżki.</li>
</ol>
7. Deprywacja żywności
<ol>
	<li>Jeżeli larwy mają być pozbawione pokarmu przed badaniem, należy pobrać larwy zgodnie z opisem w krokach 6.2–6.3, ale pożądaną ilość pokarmu należy pobrać wcześniej (np. jeśli larwy mają być pozbawione pokarmu przez 4 godziny, należy pobrać larwy 4 godziny przed czasem badania).</li>
	<li>Podzielić umyte larwy na dwie grupy i umieścić grupę pozbawioną pokarmu na szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm z 5 ml 1% agaru, a grupę kontrolną na szalce Petriego z 5 ml standardowego pokarmu.</li>
	<li>Umieść ciężarek na odwróconej pokrywie szalek Petriego (w przeciwnym razie larwy będą w stanie wypełznąć podczas szukania pożywienia).</li>
	<li>Inkubować przez poprzednio ustalony okres deprywacji pokarmowej i kontynuować badania zgodnie z opisem w krokach 6.2 do 6.9.</li>
	<li>Jeśli ma być testowanych wiele szczepów, należy rozłożyć czas rozpoczęcia deprywacji pokarmowej, aby umożliwić przetestowanie każdego szczepu w odpowiednim punkcie czasowym.</li>
</ol>
8. Analiza danych
Uwaga: Ta sekcja opisuje metodę analizy danych przy użyciu ImageJ7 lub Fiji8 do przetwarzania długości ścieżek, chociaż można użyć innego oprogramowania.
<ol>
	<li>Użyj podświetlanego stołu, aby przenieść wszystkie odwzorowane długości ścieżek z pokrywek szalek Petriego na biały papier (pokrywki można umyć etanolem i ponownie wykorzystać do dalszego rejestrowania długości ścieżki).</li>
	<li>Odrysuj prostą linię odniesienia o długości 50 mm na jednym z arkuszy papieru.</li>
	<li>Skanuj ścieżki w rozdzielczości 300 dpi i zapisuj je jako pliki obrazów bitmapowych lub tiff.</li>
	<li>Otwórz plik obrazu, wybierz zakładkę "Proces" > "Binarny" > "Utwórz plik binarny". Następnie w zakładce "Proces" wybierz "Binarny" > "Szkielet". W ten sposób powstaje linia o szerokości jednego piksela, niezależnie od grubości śladu.</li>
	<li>Upewnij się, że każda długość ścieżki jest wyświetlana jako ciągła pojedyncza linia bez przecięć.</li>
	<li>Oddziel wszelkie skrzyżowania za pomocą "Narzędzia Linia prosta" i pokoloruj linię na biało (ciągłość ścieżki można sprawdzić za pomocą narzędzia "Różdżka" (śledzenie), cała ścieżka powinna być podświetlona na żółto (rys. 2).</li>
	<li>Wybierz zakładkę "Analiza" > Ustaw pomiary, a następnie wybierz "Obwód" i "Wyświetl etykietę".</li>
	<li>Wybierz zakładkę "Analiza" > "Ustaw skalę" i wybierz "Usuń skalę".</li>
	<li>Na obrazie wybierz tylko linię odniesienia, wybierz zakładkę "Analiza" > "Analizuj cząstki" i wybierz "Pokaż: Kontury", "Wyświetl wyniki" i "Wyczyść tabelę wyników". Uwaga: Dane wyjściowe pokażą liczbę pikseli odpowiadającą linii skali 50 mm.</li>
	<li>Wybierz zakładkę "Analiza" > "Ustaw skalę" i wpisz numer piksela w polu "Odległość w pikselach" oraz odpowiadającą mu odległość (50 mm) w polu "Znana odległość".</li>
	<li>Na koniec zaznacz wszystkie rysunki długości ścieżki dla jednego genotypu na raz, wybierz zakładkę "Analizuj" > "Analizuj cząstki" i wybierz "Pokaż: kontury", "Wyświetl wyniki" i "Wyczyść tabelę wyników".
	<ol>
		<li>Usuń wszelkie pisemne etykiety lub oczywiste obce oznaczenia (zostaną one rozpoznane jako długości ścieżek) w zaznaczonym obszarze, zaznaczając obszar i wypełniając go na biało.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo plik wyjściowy "Kontury", aby upewnić się, że obwody zostały prawidłowo ustalone. Dane wyjściowe pokażą długość ścieżki w mm dla każdego rysunku długości ścieżki w zaznaczeniu. Można je łatwo wyeksportować do arkusza kalkulacyjnego i przeanalizować za pomocą dowolnego oprogramowania statystycznego.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Behavioral+Genetics+of+the+Fly+%28Drosophila+melanogaster%29%22">Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster)</a>. Dubnau, J. , Cambridge University Press. New York. 173(2014).</li>
<li>Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foraging+strategies+of+Drosophila+melanogaster%3A+a+chromosomal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Genet%22%5BJournal%5D)">Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis.</a> Behav Genet. 10, 291-302 (1980).</li>
<li>de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+localization+of+foraging+%28for%29%3A+A+major+gene+for+larval+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 123, 157-164 (1989).</li>
<li>Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+behavior+polymorphism+due+to+a+cGMP-dependent+protein+kinase+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila.</a> Science. 277, 834-836 (1997).</li>
<li>Kalderon, D., Rubin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+protein+kinase+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila.</a> J Biol Chem. 264 (18), 10739-10748 (1989).</li>
<li>Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+protein+kinase+as+a+modifier+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior.</a> Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaser+%28Csr%29%2C+a+new+gene+affecting+larval+foraging+behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 140, 263-270 (1995).</li>
<li>Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+larval+behavioral+mutants+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster.</a> J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).</li>
<li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rover%2Fsitter+Drosophila+foraging+polymorphism+as+a+function+of+larval+development%2C+food+patch+quality+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation.</a> J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).</li>
<li>Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Larval+competition+in+Drosophila+melanogaster%3A+effects+on+development+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time.</a> Genetics. 82, 33-44 (1990).</li>
<li>Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+social+behavior+in+fruit+fly+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamics of social behavior in fruit fly larvae.</a> PLoS One. 9 (4), e95495(2014).</li>
<li>Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+transformation+from+light+reception+to+phototactic+behavior+in+Drosophila+larvae+%28Diptera%3A+Drosophilidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Behav%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae).</a> J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).</li>
<li>de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heredity+of+rover%2Fsitter%3A+alternative+foraging+strategies+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster.</a> Heredity. 59, 73-83 (1987).</li>
<li>de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+foraging+microregion+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genome%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster.</a> Genome. 36, 94-101 (1993).</li>
<li>Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+foraging+behavior+in+Drosophila+by+density+dependent+selection%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection.</a> PNAS. 94, 7373-7377 (1997).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiony tutaj test długości ścieżki oferuje solidną i prostą miarę zachowań żywieniowych larw Drosophila . Protokół jest zgodny z ogólną metodologią opisaną w Sokołowski2, ale od tego czasu został ulepszony pod względem skuteczności i kontroli eksperymentalnej. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, metoda ta jest jedyną dostępną metodą pomiaru długości drogi larwalnej. Pierwotna wersja protokołudługości ścieżki 2, 3, 15, 16 testowała larwy na szalkach Petriego za pomocą cienkiej warstwy p...

Od czasu odkrycia białego genu w laboratorium Thomasa Hunta Morgana w 1910 roku, muszka owocowa, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), jest używana jako model do badania molekularnych i fizjologicznych podstaw różnych procesów biologicznych. Popularność D. melanogaster wynika w dużej mierze ze znacznej ilości i różnorodności narzędzi genetycznych. Niewielkie rozmiary, względna łatwość obsługi i krótki czas generacji sprawiają, że Drosophila jest idealnym modelem do badań genetycznych. Równie ważna jest zdolność Drosophila do wykazywania wielu fenotypów wyrażanych przez bardziej złożone organizmy, w tym ssaki. Obejmuje to złożone fenotypy, takie jak zachowanie, które stoją na styku organizmu i jego środowiska. W związku z tym badania behawioralne muszki owocowej znacząco przyczyniły się do naszego zrozumienia, w jaki sposób geny i środowisko pośredniczą w zachowaniu1.
Jedno z pierwszych badań nad zachowaniem larw D. melanogaster badało indywidualne różnice w strategiach żerowania larw, mierząc długość ścieżek larw2 podczas żerowania. Długość ścieżki zdefiniowano jako całkowitą odległość przebytą przez pojedynczą larwę na drożdżach w ciągu pięciu minut. Zarówno szczepy laboratoryjne, jak i muchy z naturalnej populacji w Toronto różniły się zachowaniami związanymi z żerowaniem, a indywidualne różnice w długości ścieżek miały podłoże genetyczne. Na podstawie ilościowego rozkładu długości ścieżek opisano dwa morfy żerowania larw i nazwano je łazikiem i opiekunem. Łaziki wykazują dłuższe ścieżki podczas pokonywania większego obszaru na podłożu pokarmowym niż opiekunowie. Korzystając z tego testu długości ścieżki, de Belle i wsp.3 zmapował gen żerowania (for) leżący u podstaw tych indywidualnych różnic w zachowaniu do dyskretnej lokalizacji na chromosomie 2 (24A3-24C5). Gen D. melanogaster został później sklonowany4 i okazało się, że jest to kinaza białkowa zależna od cGMP5, modulator fizjologii i zachowania u Drosophila i innych organizmów6.
Tutaj przedstawiamy obecny protokół dla testu długości drogi larwalnej, pierwotnie opracowanego w Sokolowski2. Chociaż niektóre aspekty testu zmieniły się na przestrzeni lat, koncepcja stojąca za projektem nie uległa zmianie. Dostarczamy również dane ilustrujące potencjał testu do oceny wkładu genetycznego i środowiskowego w indywidualne różnice w zachowaniach żerowych larw Drosophila. Test długości drogi larwalnej jest prosty, skuteczny, a jednocześnie solidny. Jedna osoba może z łatwością przetestować do 500 larw w ciągu czterech godzin, a wyniki można uzyskać z wysokim poziomem odtwarzalności. Pierwotnie opracowany do lokalizacji, może być stosowany w genetycznych badaniach przesiewowych, ilościowym mapowaniu locus cech oraz w badaniach interakcji gen-środowisko (GxE). Co więcej, jego prostota i powtarzalność sprawiają, że jest doskonałym źródłem informacji do nauczania na studiach licencjackich.

<table><tbody><tr><td>6 uncji&nbsp; Butelki z kulturami much&nbsp;</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td>AS355&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zatyczki do fiolek</td><td>Droso-Plugs</td><td>59-201</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm szalki Petriego&nbsp;</td><td>Szalki Petriego Sokół</td><td></td> 351008 <td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm&nbsp;</td><td>Szalki</td> Petriego <td>Fisher 875712</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384-168&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sondy preparacyjne</td><td>Almedic</td><td>2325-58-5300&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Drożdże</td><td>laboratoryjne naukowe</td><td>FLY-8040-20F</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół długości ścieżki żerowania dla larw drosophila melanogaster

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

Fenotyp długości ścieżki larwalnej Drosophila melanogaster jest ustaloną miarą używaną do badania genetycznego i środowiskowego wkładu w zmienność behawioralną. Test długości drogi larwalnej został opracowany w celu zmierzenia indywidualnych różnic w zachowaniach związanych z żerowaniem, które później powiązano z genem żerowania. Długość ścieżki larwalnej jest łatwą do oceny cechą, która ułatwia pobieranie dużych rozmiarów próbek przy minimalnych kosztach do badań genetycznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis obecnego protokołu dla testu długości drogi larwalnej, który został po raz pierwszy zastosowany przez Sokołowskiego. Protokół szczegółowo opisuje, jak w sposób powtarzalny obchodzić się ze zwierzętami doświadczalnymi, przeprowadzać test behawioralny i analizować dane. Podano również przykład, w jaki sposób test może być wykorzystany do pomiaru plastyczności behawioralnej w odpowiedzi na zmiany środowiskowe, poprzez manipulowanie środowiskiem żywieniowym przed wykonaniem testu. Na koniec omówiono odpowiedni projekt testu, a także czynniki środowiskowe, które mogą modyfikować długość drogi larw, takie jak jakość pokarmu, wiek rozwojowy i wpływ na dzień.

Różnice w długości ścieżki łazika i obiektu stacjonarnego dla szczepy oraz wpływ deprywacji pokarmowej na długość ścieżki przedstawiono w Rys. 3Dane zebrane podczas trzech kolejnych dni badań wykazały istotny efekt szczepu (F(1,421) = 351,89, p &lt; 2,20 x 10-16; Ryc. 3A), przy czym osobniki typu „rovers” przemieszczały się na większe odległości niż osobniki typu „sitters”. Oprócz efektu szczepu odnotowano również istotny ef...

Dostarczamy szczegółowy protokół do badania długości ścieżki żerowania Drosophila melanogaster. Omawiamy przygotowanie i postępowanie ze zwierzętami doświadczalnymi, sposób wykonywania testu i analizy danych.

Protokół długości ścieżki żerowania dla larw Drosophila melanogaster

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Ogólnym celem tego testu jest ilościowe określenie komponentu lokomotorycznego w zachowaniu larw Drosophila. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki behawioralnej dotyczące wpływu czynników genetycznych i środowiskowych na indywidualne różnice w zachowaniu larw. Głównymi zaletami tej techniki są szybkość, powtarzalność oraz możliwość gromadzenia dużych prób badawczych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ sukces analizy zależy od czasu rozwoju oraz konsekwentnego i ostrożnego obchodzenia się z badanymi zwierzętami. Procedurę zaprezentują Ina Anreiter i Oscar Vasquez, doktoranci w moim laboratorium. Przygotuj butelkę utrzymującą, wycinając otwory w jednej ściance plastikowej butelki do hodowli muszek o pojemności sześciu uncji.Następnie za pomocą strzykawki napełnij pokrywki szalek Petri wcześniej przygotowaną pożywką z soku winogronowego, aż powierzchnia pożywki utworzy wypukłość ponad krawędzią pokrywki. Przechowuj płytki z sokiem winogronowym w wilgotnym i szczelnym pojemniku w temperaturze 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie. Wlej 40 ml wcześniej przygotowanej pożywki dla muszek do szalek Petri o wymiarach 100 by 15 mm.Należy przygotować trzy czarne płytki z pleksiglasu z dziesięcioma okrągłymi dołkami o średnicy 10 cm, rozmieszczonymi w układzie 2x5 do badania larw, oraz czarny rozprowadzacz z pleksiglasu służący do nakładania pasty drożdżowej na płytki. Następnie należy oddzielić pokrywki od spodów szalek Petriego. Należy zebrać od 100 do 150 samic oraz od 50 do 75 samców.Pozostaw samice i samców do zapłodnienia przez noc w sześciouncjowej butelce hodowlanej z jedzeniem dla muszek standardowej. Przenieś muszki do butelki przechowawczej i za pomocą taśmy maskującej przymocuj do góry butelki płytkę z winogron z niewielką ilością świeżej pasty drożdżowej. Pozostaw butelkę w pozycji odwróconej dnem do góry, tak aby płytka z winogron znajdowała się na dole, umożliwiając osobnikom dorosłym zniesienie jaj na płytce z winogron.Po 24 godzinach należy usunąć pierwszą płytkę z winogronem i umieścić nową płytkę w butelce utrzymującej. Po 22 godzinach należy wyjąć płytki z winogronem z butelek i przełożyć je do szalki Petriego o wymiarach 60 by 15 mm. Następnie na butelce utrzymującej należy umieścić nową płytkę z winogronem i świeżą pastą drożdżową.Za pomocą sondy sekcyjnej usuń i zutylizuj wszystkie larwy z posianej płytki z winogronem. Inkubuj oczyszczone płytki z winogronem przez cztery godziny w standardowych warunkach. Po upływie czterech godzin wybierz z płytek z winogronem 100 larw L1 (pierwszego stadium rozwojowego) na każdy szczep i przenieś je na płytki z pożywką.Należy delikatnie umieścić larwy na pożywce, nie przebijając jej i nie zakopując larw. Można pobierać i przenosić larwy w grupach po dziesięć sztuk. Aby uniknąć nadmiernego zagęszczenia, należy rozmieścić larwy równomiernie na płytce z pożywką.Inkubuj płytki z pożywką do momentu, gdy zwierzęta testowe znajdą się na dziesięć godzin przed rozpoczęciem wędrówki, czyli fazy, w której larwy opuszczają pożywkę w poszukiwaniu miejsca do przepoczwarczenia. Jeśli larwy rozpoczęły już wędrówkę i poruszają się po wieczku szalki Petriego, co widać tutaj, zwierzęta są zbyt stare do testów, a ich czas rozwoju musi zostać ponownie oceniony. Rozpuść drożdże w wodzie w stosunku jeden do dwóch.Należy upewnić się, że gotowa pasta spływa i tworzy na swojej powierzchni wstążki, które szybko się rozpływają. Ocena właściwej konsystencji pasty drożdżowej jest ważniejsza niż zastosowanie dokładnych proporcji ze względu na różnice między markami, partiami drożdży oraz warunkami środowiskowymi. Za pomocą pędzla delikatnie przenieś larwy z płytki z pożywką pierwszego szczepu.Przenieś larwy do szalki Petriego i delikatnie opłucz je wodą, aby usunąć resztki pokarmu. Szybko opłucz larwy 2 mL wody i delikatnie osusz je za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Przechowuj larwy w wilgotnym środowisku, ale nie zanurzaj ich w wodzie, aby uniknąć stresu.Ustaw trzy płytki testowe obok siebie i ustaw pięciominutowy timer dla każdej z nich. Nanieś pastę drożdżową na wierzch płytek testowych, a następnie za pomocą rozpylacza rozprowadź cienką warstwę pasty na każdej płytce w taki sposób, aby wszystkie dołki miały równomierną warstwę drożdży. Ostrożnie umieść jedną larwę w centrum każdego dołka.Uruchom pięciominutowy timer natychmiast po umieszczeniu pierwszej larwy na każdej płytce. Następnie umieść pozostałe larwy w pozostałych dołkach. Na każdym dołku połóż pokrywkę od szalki Petriego.Po upływie czasu ustawionego na minutniku, zacznij odrysowywać pozostawione przez larwy ścieżki w drożdżach za pomocą niezmywalnego markera, nie usuwając larw z płytki. Odrysowuj długości ścieżek w tej samej kolejności i z taką samą prędkością, w jakiej larwy były umieszczane na płytkach. Na koniec powtórz etapy testu długości ścieżki larwalnej dla każdego szczepu.Dane zebrane podczas trzech kolejnych dni testów wykazały istotny efekt szczepu, przy czym osobniki typu „rover” przebywały większe odległości niż osobniki typu „sitter”. Oprócz efektu szczepu, larwy pozbawione pokarmu na cztery godziny przed testami wykazywały znacznie krótsze długości ścieżek niż larwy karmione. Ogólnie rzecz biorąc, długości ścieżek były większe w przypadku obu szczepów hodowanych na pożywce bogatej w składniki odżywcze w porównaniu do pożywki ubogiej w składniki odżywcze.Przy prawidłowym wykonaniu test ten pozwala jednej osobie z łatwością przebadać do 500 larw w ciągu czterech godzin, co czyni go wartościowym w przypadku fenotypowania na dużą skalę. Postępując zgodnie z zaprezentowaną procedurą, można badać inne zmienne, takie jak płeć, deprywacja pokarmowa lub jakość pokarmu, aby wykazać wpływ tych czynników na wzorce poruszania się związane z poszukiwaniem pokarmu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak mierzyć lokomocję larw Drosophila związaną z pokarmem w celu oceny genetycznych i środowiskowych uwarunkowań różnic indywidualnych w zachowaniu.

foraging-path-length-protocol-for-drosophila-melanogaster-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Drosophila larwy są w stanie kojarzyć bodźce zapachowe z nagrodą smakową. W niniejszej pracy opisujemy prosty paradygmat behawioralny, który umożliwia analizę apetytywnego uczenia się asocjacyjnego w odpowiedzi na zapachy.

Apetytywne warunkowanie węchowe u larw Drosophila

Naukowcy używają protokołu długości życia Drosophila do mierzenia, jak różne warunki eksperymentalne wpływają na długowieczność muszek i generowania krzywych przeżycia w tym procesie, aby określić ilościowo wyniki eksperymentu. Protokół próbki obejmuje test stosowany do badania wpływu narażenia na długowieczność substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub EDC, takich jak 17-α-etynyloestradiol (EE2).

Protokół długości życia dla Drosophila melanogaster: generowanie krzywych przeżycia w celu identyfikacji różnic w długości życia much

Ten film opisuje, jak śledzić swobodnie chodzące muchy, aby ocenić ich ogólną zdolność poruszania się. Prezentowany protokół demonstruje konfigurację testu i analizę danych za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo.

Śledzenie swobodnie chodzących much: metoda oceny lokomocji u Drosophila

W tym artykule wideo opisujemy zautomatyzowany test do pomiaru wpływu głodu lub sytości na zależne od węchu zachowanie związane z poszukiwaniem pokarmu u dorosłej muszki owocowej Drosophila melanogaster.

Test pojedynczej muchy na zachowania żerowe u Drosophila

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Drosophila melanogaster są przydatne w badaniu manipulacji genetycznych lub środowiskowych, które wpływają na zachowania takie jak spontaniczna aktywność lokomotoryczna. Tutaj opisujemy protokół, który wykorzystuje monitory z wiązkami podczerwieni i oprogramowanie do analizy danych do ilościowego określania spontanicznej aktywności lokomotorycznej.

Oznaczanie spontanicznej aktywności lokomotorycznej u Drosophila melanogaster

Larwa Drosophila to potężny system modelowy do badania neuronalnej kontroli zachowania. Publikacja ta opisuje zastosowanie liniowych kanałów agarozowych do wywoływania długotrwałych napadów liniowego pełzania oraz metody ilościowego określania dynamiki struktur larwalnych podczas powtarzających się zachowań pełzania.

Wykorzystanie liniowych kanałów agarozowych do badania pełzania larw Drosophila

Ten protokół ma na celu ocenę żywotności Drosophila na każdym etapie rozwoju, od zarodka do dorosłego osobnika. Metoda ta może być stosowana do określania i porównywania żywotności różnych genotypów lub warunków wzrostu.

Bezpośrednia i prosta metoda oceny żywotności Drosophila melanogaster od zarodka do dorosłego osobnika

Ten protokół opisuje test behawioralny do rejestrowania zachowań związanych z wyszukiwaniem wywołanym cukrem za pomocą Drosophila melanogaster. Test może być wykorzystany do badania zachowań związanych z karmieniem i żerowaniem, a także leżących u ich podstaw mechanizmów neuronalnych.

Śledzenie lokalnych zachowań związanych z poszukiwaniami wywołanymi cukrem u Drosophila

Tutaj przedstawiono protokół długoterminowego obrazowania na żywo nogi Drosophila w fazie poczwarki, obejmujący całkowite usunięcie poczwarki. Protokół ten można również zastosować do innych tkanek.

Długoterminowe obrazowanie na żywo rozwoju nogi poczwarki Drosophila po usunięciu pupary

Poznaj protokół pomiaru długości ścieżki żerowania larw Drosophila melanogaster w badaniach genetyki zachowań. Metoda umożliwia szybką, powtarzalną analizę wpływu genetycznych i środowiskowych czynników na ruchliwość.

Protokół długości ścieżki żerowania dla larw Drosophila melanogaster

Przeglądaj więcej filmów