Budowa modeli do nieniszczącego przewidywania zawartości składników w borówkach za pomocą spektroskopii bliskiej podczerwieni w oparciu o pomiary HPLC

Ogólnym celem tej procedury jest skonstruowanie i walidacja modeli do nieniszczącego przewidywania całkowitej zawartości cukru, całkowitej zawartości kwasu organicznego i całkowitej zawartości antycyjaniny w poszczególnych jagodach za pomocą spektroskopii w bliskiej podczerwieni. Metoda ta odpowie na kluczowe problemy w zakresie oceny produktów rolnych, takich jak owoce i warzywa. Dla mnie zaletą tej techniki jest to, że wiele naszych produktów można sprawdzić nieniszcząco za pomocą spektroskopii.

I modele skonstruowane za pomocą procedury pokazanej tutaj. Spektroskopia w bliskiej podczerwieni jest potężnym narzędziem do nieniszczącej oceny produktów rolnych. Modele predykcyjne są konstruowane poprzez badanie korelacji między widmem a zawartością wyznaczoną przez analizę chemiczną każdego celu.

Procedurę zademonstrują Yusuke Kimura, absolwent z mojego laboratorium oraz Jingai Che z uniwersytetu i jeden z autorów tego protokołu. Zbierz wystarczającą liczbę próbek różnych rodzajów borówek z docelowych odmian. Zbierz najlepiej 100 jagód do budowy modelu kalibracyjnego.

I co najmniej 10 do walidacji skonstruowanego modelu. Aby skonstruować solidne modele, zbierz próbki różnych typów, na przykład o różnych kolorach, rozmiarach i w różnych warunkach dojrzewania. Zważ każdą jagodę.

Zmierzone masy są później wykorzystywane do obliczania procentowej zawartości składników każdej borówki. Następnie umieść próbkę borówki na środku okna spektrofotomotera bliskiej podczerwieni w celu pomiarów odbicia rozproszonego. Korzystając z polecenia próbkowania pojedynczego kanału, zmierz widma każdej borówki.

Najlepiej w kilku miejscach owocu. Jagody należy przechowywać w zamrażarce, w temperaturze poniżej minus 30 stopni Celsjusza, jeśli nie mają być analizowane tuż po pomiarach widma. Aby rozpocząć obróbkę wstępną, pokrój jagodę na kilka kawałków, aby można ją było łatwo zhomogenizować.

Krojenie borówki bez rozmrażania, gdy jest zamrożona. Włóż kawałki do 50-mililitrowej zlewki. Dodaj około 10 mililitrów ultra czystej wody do zlewki.

Podgrzej pokrojoną jagodę w ultra czystej wodzie w kuchence mikrofalowej przez 20 sekund, aby dezaktywować enzymy, które mogą rozkładać cukry podczas analiz. Dodaj około 10 mililitrów ultra czystej wody do zlewki. Homogenizować mieszaninę przez pięć minut przy 12 000 obr./min za pomocą homogenizatora wyposażonego w standardowy wał i generator.

Odwirować homogenizowaną mieszaninę przez 10 minut przy 3 000 obr./min. Następnie zebrać filtrat przez filtrację próżniową odwirowanej próbki za pomocą filtra bibułowego o wartości pięciu B. Po dwukrotnym powtórzeniu etapów homogenizacji zmierzyć pH filtratu i dostosować je do siedmiu za pomocą rozcieńczonego kwasu solnego i rozcieńczonych wodnych roztworów wodorotlenku sodu.

Rozcieńczyć filtrat do 50 mililitrów ultra czystą wodą. Podzielić próbkę na dwie części. Jeden do analizy cukrów, a drugi do analizy kwasów organicznych.

Przepuść pierwszą próbkę roztworu przez kolumny połączone szeregowo, aby wykluczyć pigmenty, kationy i aniony. Wyrzuć pierwszy mililitr roztworu próbki z kolumn. Następnie należy użyć roztworu próbki z kolumn do analizy cukrów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej lub HPLC.

Odwirować roztwór przy 6 600 obr./min przez 10 minut w mikroprobówce wyposażonej w filtr 0,445 mikrona z mini-wirówką przed analizą metodą HPLC. Ułożyć system HPLC za pomocą kolumny do przenikania żelu w piecu kolumnowym w temperaturze 40 stopni Celsjusza. Jako eluent należy użyć odgazowanej ultra czystej wody o natężeniu przepływu 0,1 mililitra na minutę.

Używaj również detektora indeksu refrakcji. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów wzorcowych, wstrzykując podwielokrotność 20 mikrolitrów do każdego pomiaru. W tym przypadku do pomiaru używane jest oprogramowanie w pakiecie roztworu.

Uzyskaj intensywność obszaru pasma cukru na chromatogramie każdego roztworu wzorcowego, klikając ponowną analizę prawym przyciskiem myszy. Następnie połącz intensywność obszaru z odpowiednimi stężeniami, aby uzyskać krzywą roboczą dla każdego cukru za pomocą regresji liniowej. Z krzywej uzyskuje się równanie przedstawiające zależność między intensywnością obszaru a stężeniem dla każdego cukru.

Po uzyskaniu krzywej wzorcowej zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów próbek, wstrzykując 20 mikrolitrów podwielokrotności dla każdego pomiaru. Uzyskaj intensywność obszaru pasm cukrów na chromatogramie każdego roztworu próbki, tak jak poprzednio. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby zapoznać się z krokami dotyczącymi wykonywania pomiarów kwasów organicznych metodą HPLC.

Przechowuj jagody w zamrażarce w temperaturze poniżej minus 80 stopni Celsjusza, jeśli nie mają być analizowane na obecność antocyjanów tuż po pomiarach widma. Aby przeprowadzić obróbkę wstępną do pomiarów antocyjanów metodą HPLC, należy suszyć każdy zamrożony owoc liofalizatorem próżniowym przez 12 godzin. Wyekstrahuj antocyjany z suszonych jagód w jednoprocentowym roztworze metanolu kwasu trifluruoctowego, pozostawiając mieszaninę w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 12 godzin.

Odwiruj ekstrakt przez 15 minut w dwumililitrowej mikroprobówce za pomocą ultrawirówki w temperaturze minus ośmiu stopni Celsjusza i 15 000 obr./min. Następnie przefiltruj ekstrakt przez filtr 0,45 mikrona, aby uzyskać próbkę do pomiarów HPLC. Ułożyć system HPLC za pomocą kolumny z odwróconymi fazami C18 w piecu kolumnowym w temperaturze 40 stopni Celsjusza.

Metodę gradientową należy zastosować przy użyciu 0,1 % wodnego roztworu kwasu triflurooctowego jako LUNA. I 0,5 procent kwasu triflurooctowego w acetonitrylu jako LUNB. Stosować natężenie przepływu 0,1 mililitra na minutę, przy czym stosunek LUNB wzrasta od ośmiu procent do 15% w okresie od zera do 50 minut po wstrzyknięciu.

I od 15% do 75% w ciągu 50 do 60 minut po wstrzyknięciu. Użyj detektora matrycy fotodiodowej monitorującego przy 520 nanometrach. Zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów wzorcowych, wstrzykując 10 mikrolitrów podwielokrotności przez automatyczny próbnik dla każdego pomiaru.

Do pomiaru użyj oprogramowania LC solution. Na koniec zmierzyć spektrogramy HPLC roztworów próbek, wstrzykując 10 mikrolitrów podwielokrotności przez automatyczny próbnik dla każdego pomiaru. Na tym etapie budowa modeli kalibracyjnych do przewidywania zawartości składników, a następnie walidacja tych skonstruowanych modeli, jest wykonywana zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Modele predykcyjne są konstruowane na podstawie obserwowanych widm i zawartości składników określonych za pomocą przedstawionej tutaj procedury. Przykład wyniku walidacji krzyżowej modelu skonstruowanego do prognozowania całkowitej zawartości cukru przedstawiono tutaj. Korelacja między wartościami przewidywanymi przez spektroskopię bliskiej podczerwieni a wartościami wyznaczonymi przez HPLC jest zadowalająca.

Podobny wynik obserwuje się w przypadku walidacji krzyżowej modelu dla całkowitej zawartości antocyjanów. Również w tym przypadku korelacja między wartościami przewidywanymi a obserwowanymi jest zadowalająca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać poprzednie wartości zawartości jagód za pomocą HPLC.

Odmienna ocena jest możliwa tylko przy użyciu modeli skonstruowanych odpowiednio na podstawie zadanej zawartości zmierzonej za pomocą niszczącej analizy chemicznej. Oznacza to, że wcześniejsza analiza chemiczna celu jest tajemnicą w celu skonstruowania wysokowydajnych modeli predykcyjnych. Prosimy o zapoznanie się z protokołem tekstowym, aby zapoznać się z procedurą budowy modeli predykcyjnych, które nie są pokazane w tym filmie.

Po prawidłowym skonstruowaniu modele do przewidywania mają zastosowanie do przewidywania cukru, kwasów organicznych i dowolnej zawartości borówek. Oczekuje się, że spektroskopia w bliskiej podczerwieni, jak pokazano tutaj, będzie miała zastosowanie do korelacji wielu rodzajów produktów rolnych. Nie zapominaj, że konieczne jest uzyskanie wstępnie ustawionych barier treści za pomocą analizy chemicznej w celu zbudowania dobrego modelu podczas stosowania spektroskopii w bliskiej podczerwieni do oceny dowolnego produktu rolnego.