Name: Iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj technikę iniekcji do tętnicy biodrowej w celu modelowania mikroskopijnych przerzutów nowotworowych do kości. Ta metoda umożliwia badanie interakcji komórek raka piersi z mikrośrodowiskiem kostnym u myszy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Zhang były wspierane przez X. H.-F. Z. NCI CA151293, CA183878, Fundacja Badań nad Rakiem Piersi, Departament Obrony USA DAMD W81XWH-13-1-0195, Nagroda Pilota CA149196-04, McNair Medical Institute oraz przez Departament Obrony USA DAMD W81XWH-13-1-0296.

Wszystkie prace nad zwierzętami zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Baylor College of Medicine dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Przygotowanie komórek
Uwaga: Różne linie komórek rakowych mogą być używane do wstrzykiwania IIA, w zależności od celów badawczych. W naszych badaniach wykorzystaliśmy linie komórkowe raka piersi MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 oraz linię komórkową raka prostaty C4-2. Zazwyczaj używamy do naszego badania komórek rakowych znakowanych lucyferazą GFP i świetlików i pokazujemy tutaj pewne dane z linii komórkowej MCF7 znakowanej GFP-lucyferazy.
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki w DMEM zawierające 10% FBS i 0,1 mg/ml penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem IIA trypsynizuj komórki w 80 - 90% zbiegu z 0,25% roztworem trypsyny/EDTA. Użyj zimnego PBS do dwukrotnego umycia komórek i ponownie zawieś komórki w 10 ml PBS do zliczania komórek. Aby usunąć PBS, odwiruj komórki w temperaturze 800 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 x 106 komórek/ml w lodowatym PBS.</li>
	<li>Użyj 100 μl komórek rakowych znakowanych lucyferazą GFP i świetlikiem do wstrzyknięcia IIA jednej myszy. 
	Uwaga: Dlatego liczba komórek otrzymanych przez każde zwierzę wynosi 5 x 105. Liczba ta może wymagać zmiany w zależności od agresywności linii komórkowych.</li>
	<li>Utrzymuj zawiesiny komórkowe na lodzie. 
	Uwaga: Wibracje mogą być konieczne, aby zapobiec agregacji komórek co kilka minut, aż będą gotowe do wstrzyknięcia. W przypadku niektórych linii komórkowych (takich jak MDA-MB-231) mogą być konieczne bardziej rygorystyczne procedury (np. przepuszczenie przez sitko komórkowe 45 μm), aby zapobiec agregacji. Należy pamiętać, że zatkanie naczyń może powodować martwicę tkanek, a tym samym zakłócać eksperymenty.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>W celu leczenia bólu zwierząt należy podawać myszom karprofen w dawce 5 mg/kg mc./dobę (lub inny środek przeciwbólowy) z suplementem diety nie mniej niż 24 godziny przed zabiegiem. Dawkę 0,1 mg/ml buprenorfiny należy podać podskórnie na 60 minut przed zabiegiem. Uwaga: opcjonalną procedurą jest wszczepienie palety estradiolu w grzbiet zwierzęcia w celu dostarczenia dodatkowego estradiolu. Przyspieszy to wzrost komórek nowotworowych ER+ (np. komórek MCF-7)9.</li>
	<li>Znieczulić 4-6 tygodniową mysz (około 20 g) ketaminą (80 - 100 mg / kg) i ksylazyną (10 -12,5 mg / ml) przez wstrzyknięcie dootrzewnowe.</li>
	<li>Potwierdź odpowiedni poziom sedacji myszy o wadze 20 g przez uszczypnięcie palca u nogi i zaobserwowanie 50% zmniejszenia częstości oddechów i różowych błon śluzowych (np. skóry uszu myszy i skóry łap). Monitoruj te parametry życiowe co 15 minut podczas zabiegu. Uwaga: Brak ruchu zwierzęcia wskazuje, że zwierzę jest wystarczająco znieczulone i gotowe do operacji.</li>
	<li>Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.</li>
	<li>Ogol mysz w dolnej części brzucha, szczególnie w prawej okolicy pachwiny, w której odbędzie się operacja i wstrzyknięcie. 
	Uwaga: Nie jest to konieczne, jeśli używane są atymiczne myszy nagie.</li>
	<li>Połóż mysz na plecach, rozłóż nogi w ich naturalnych pozycjach i przyklej palce u nóg do mobilnego kartonu preparacyjnego za pomocą taśmy.</li>
	<li>Przetrzyj prawy obszar pachwiny sterylnymi wacikami nasączonymi 70% etanolem izopropylowym, a następnie kilkakrotnie przetrzyj peeling chirurgiczny betadyny.</li>
</ol>
3. Wspólne umiejscowienie i separacja żyły biodrowej i tętnicy
<ol>
	<li>Wykonaj nacięcie skóry o długości 1,0 - 1,2 cm między 4. a 5. sutkami w dolnej prawej części brzucha za pomocą sterylnych ostrzy skalpela ze stali węglowej #10 umieszczonych w rękojeści nr 3. Następnie użyj sterylnej serwety chirurgicznej, aby przykryć ciało zwierzęcia z wyjątkiem miejsca nacięcia.</li>
	<li>Przenieś zwierzę do standardowego mikroskopu preparacyjnego na stole. Do wstrzykiwania należy używać powiększenia 4X.</li>
	<li>Pod 4-krotnym powiększeniem mikroskopu preparacyjnego włóż kleszcze separacyjne między tkanką tłuszczową a otrzewną i wypchnij tkanki na zewnątrz po obu stronach, aby odsłonić naczynia biodrowe i nerwy (patrz ryc. 1). 
	Uwaga: Tętnica między aortą od linii środkowej a dolną częścią odgałęzień tętnicy nazywana jest tętnicą biodrową wspólną. To tutaj odbywa się wstrzyknięcie.</li>
	<li>Użyj jednej pary prostych cienkich kleszczy, aby przebić się przez tkankę łączną (jak błonę) między naczyniami a nerwem, bliżej naczyń.</li>
	<li>Przesuń proste cienkie kleszcze na lewą rękę. Chwyć parę cienkich kleszczy pod kątem, używając prawej ręki. Włóż kleszcze prawej ręki w tę samą pozycję, w której zostały przerwane tkanki łączne. A potem wsuń kleszcze prawej ręki pod naczynia.</li>
	<li>W tym samym czasie włóż kleszczyki lewej ręki do tkanek łącznych po lewej stronie naczyń, aby poprowadzić przechodzące kleszcze prawej ręki.</li>
	<li>Gdy kleszcze prawej ręki znajdą się pod naczyniami, spróbuj nieco bardziej oddzielić naczynia od otaczającej tkanki, a następnie trzymaj je na kleszczach prawej ręki.</li>
	<li>Użyj kleszczyków lewej ręki, aby dostarczyć końcówkę jedwabnego szwu 4-0 do kleszczyków prawej ręki, a następnie delikatnie i powoli przeciągnij szew pod naczyniami. Uwaga: Teraz zarówno żyła wspólna, jak i naczynia tętnicze są podnoszone przez szew (patrz ryc. 2).</li>
</ol>
4. Pielęgnacja iniekcyjna i poiniekcyjna
<ol>
	<li>Przygotować komórki do wstrzyknięcia w strzykawce insulinowej 31 G. Należy użyć 100 μl zawiesiny komórkowej w PBS na wstrzyknięcie. Upewnij się, że pipetujesz w górę i w dół kilka razy, aby oddzielić komórki i uniknąć agregacji, aby wstrzyknięte komórki nie zatkały się i nie zablokowały przepływu krwi.</li>
	<li>Trzymając kleszcze pod kątem w lewej ręce, umieść kleszcze pod naczyniami wzdłuż prowadnicy szwu, a następnie otwórz dwa ramiona kleszczy, delikatnie trzymając naczynia na kleszczach. 
	Uwaga: Odstęp między dwoma ramionami kleszczy będzie miejscem wstrzyknięcia.</li>
	<li>Trzymać igłę 31 G z zawiesinami komórek 100 μl w prawej ręce, skosem igły do góry, gotową do wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wbić igłę do światła tętnicy (krew dostanie się do końcówki igły). Następnie powoli wepchnij zawiesinę komórek, aby wstrzyknąć komórki. Zawiesina komórkowa odepchnie czerwoną krew w naczyniu. Staraj się nie rozbijać naczyń ani nie przeciekać zawiesiny komórek.</li>
	<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia delikatnie odciągnij igłę i przytrzymaj naczynia na kleszczach lewej ręki, aby zatamować krwawienie. Następnie odciągnij szew.</li>
	<li>Odciągnij kleszcze lewej ręki i szybko użyj bawełnianego wacika, aby docisnąć obszar nacięcia tętnicy, aby zatrzymać krwawienie. 
	Uwaga: Zwykle 5 - 10 minut ciągłego ucisku wystarcza, aby zatrzymać krwawienie.</li>
	<li>Po ustaniu krwawienia użyj kleju do skóry, aby zamknąć krawędzie skóry w obszarze operacyjnym. Zrób kolczyk w uszach i sprawdź, czy sygnalizacja bioluminescencji bada rozmieszczenie wstrzykniętych komórek. 
	Uwaga: Udane wstrzyknięcie spowoduje uzyskanie obrazu podobnego do pokazanego na rysunku 3.
	<ol>
		<li>Sprawdź sygnalizację bioluminescencyjną przez wstrzyknięcie 100 μl 15 mg/ml lucyferyny do PBS w stężeniu myszy 75 mg/kg przez zatokę wewnątrzoczodołową.
		<ol>
			<li>W przypadku wstrzyknięcia doorbitalnego połóż palce po obu stronach oka myszy, użyj nacisku, aby gałka oczna lekko wyskoczyła z oprawki oka, włóż igły do strzykawki insulinowej 28 G między gałkę oczną a nos, a następnie powoli wciśnij strzykawkę, aby wstrzyknąć lucyferynę. 
			Uwaga: W prawidłowej pozycji igła powinna być w stanie osiągnąć głębokość 2 - 3 mm przed uderzeniem w twardą tkankę (kość).</li>
			<li>Umieść mysz w systemie obrazowania do obrazowania in vivo całych zwierząt na 10 - 60 sekund w ciągu 5 minut (patrz rysunek 3). 
			Uwaga: Opcjonalna procedura polega na wszczepieniu osadu estradiolu w plecy zwierząt w celu dostarczenia dodatkowego estradiolu. Przyspieszy to wzrost komórek nowotworowych ER+ (np. komórek MCF-7)15.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw mysz na ciepłej poduszce grzewczej, aż się obudzi. Monitoruj krwawienie, obrzęk, oznaki rozejścia się i ból w okresie pooperacyjnym. Umieść myszy z powrotem w klatce z pokryciem przeciwbólowym (sugerowany suplement diety karprofin) podawanym w celu leczenia bólu, aż do momentu, gdy nie pojawią się oznaki bólu. Zwróć szczególną uwagę i troskę o zwierzęta przez 7 dni po zabiegu.</li>
</ol>
5. Monitorowanie wzrostu przerzutów
<ol>
	<li>Histomorfometria:
	<ol>
		<li>Zbierz tkanki kostne zawierające guz, utrwal kości w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny, a następnie odwapnij je w roztworze pH 7,0 14% EDTA przez 3 - 5 dni i poddaj osadzaniu w parafinie, jak opisano wcześniej14.</li>
		<li>Przeciąć tkanki kostne zatopione w parafinie o grubości 3 μm i przeprowadzić standardową metodę histologiczną barwienia Hematoksyliną/Eozyną, jak opisano wcześniej14.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia:
	<ol>
		<li>Poddano zatopiony w parafinie guz z przenoszoną kośćmi do barwienia immunohistochemicznego w różnych celach, jak opisano wcześniej14. Krótko mówiąc, immunostaina komórek nowotworowych MCF7 za pomocą przeciwciał anty-GFP, a komórki osteogenne immunostainy (pre-osteoblasty i osteoblasty) odpowiednio za pomocą przeciwciał anty-Osterix i przeciwciał anty-fosfatazy alkalicznej (ALP).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+alpha4beta1-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer cell. 20 (6), 701-714 (2011).</li>
<li>Ell, B., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: Bone Metastasis.</a> Cell. 151 (3), 690-690 (2012).</li>
<li>Kretschmann, K. L., Welm, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Mouse models of breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Metastasis Rev. 31 (3-4), 579-583 (2012).</li>
<li>Lelekakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+orthotopic+model+of+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone.</a> Clin Exp Metastasis. 17 (2), 163-170 (1999).</li>
<li>Rose, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoactivin+promotes+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone.</a> Mol Cancer Res. 5 (10), 1001-1014 (2007).</li>
<li>Welm, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-stimulating+protein+pathway+promotes+metastasis+in+a+mouse+model+for+breast+cancer+and+predicts+poor+prognosis+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7570-7575 (2007).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+TGF-beta+Responsiveness+in+Prostate+Stromal+Cells+Alters+Chemokine+Levels+and+Facilitates+the+Development+of+Mixed+Osteoblastic%2FOsteolytic+Bone+Lessions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lessions.</a> Mol. Cancer. Res. 10 (4), 494-503 (2012).</li>
<li>Gregory, L. S., Choi, W., Burke, L., Clements, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer+Cells+Induce+Osteolytic+Bone+Lesions+In+vivo+through+a+Reduction+in+Osteoblast+Activity+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ON%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer Cells Induce Osteolytic Bone Lesions In vivo through a Reduction in Osteoblast Activity in Mice.</a> PLoS ON. 8 (9), e68103(2013).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-%CE%B2+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nat Med. 21 (11), 1262-1271 (2015).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Bone+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Bone Metastasis.</a> Vet Pathol. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Werbeck, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+regulates+metastasis+and+metastasis+genes+of+mouse+MMTV-PymT+mammary+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo.</a> Vet Pathol. 51 (4), 868-881 (2014).</li>
<li>Xiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+Protein+Epitope+Mimetic+Antagonist%2C+POL5551%2C+Disrupts+Metastasis+and+Enhances+Chemotherapy+Effect+in+Triple+Negative+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">CXCR4 Protein Epitope Mimetic Antagonist, POL5551, Disrupts Metastasis and Enhances Chemotherapy Effect in Triple Negative Breast Cancer.</a> Mol Cancer Ther. 14 (11), 2473-2485 (2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteogenic+niche+promotes+early-stage+bone+colonization+of+disseminated+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells.</a> Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).</li>
<li>Hoffmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+new+estrogen+receptor+destabilizing+compounds%3A+effects+on+estrogen-sensitive+and+tamoxifen-resistant+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Characterization of new estrogen receptor destabilizing compounds: effects on estrogen-sensitive and tamoxifen-resistant breast cancer.</a> J Natl Cancer Inst. 96 (3), 210-218 (2004).</li>
<li>Tannehill-Gregg, S. H., Levine, A. L., Nadella, M. V., Iguchi, H., Rosol, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+zoledronic+acid+and+osteoprotegerin+on+growth+of+human+lung+cancer+in+the+tibias+of+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">The effect of zoledronic acid and osteoprotegerin on growth of human lung cancer in the tibias of nude mice.</a> Clin Exp Metastasis. 23 (1), 19-31 (2006).</li>
<li>Slyfield, C. R., Tkachenko, E. V., Wilson, D. L., Hernandez, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Dynamic+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Dynamic Bone Histomorphometry.</a> J Bone Miner Res. 27 (2), 486-495 (2012).</li>
<li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FSPECT%2FCT+imaging+of+small+animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> Am J Pathol. 182 (2), 319-324 (2013).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+prostate+cancer+cell+line+%28Probasco%29+produces+osteoblastic+metastases+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo.</a> Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).</li>
<li>Amend, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin-1+regulates+bone+homeostasis+through+effects+on+bone+matrix+integrity+and+nitric+oxide+signaling+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts.</a> J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż tylko tętnica biodrowa jest celem wstrzyknięcia komórek rakowych, zalecamy oddzielenie zarówno żyły biodrowej, jak i tętnicy od otaczających tkanek i uniesienie ich razem jako wiązki. Dzieje się tak, ponieważ żyła i tętnica intensywnie stykają się ze sobą, a ściana naczynia żylnego jest cienka i łatwa do złamania. Dlatego, aby wstrzyknięcie zakończyło się sukcesem, oszczędza czas i wysiłek, aby utrzymać oba naczynia razem, chociaż komórki rakowe są wstrzykiwane tylko do tętnicy. Aby wspomóc ten proces, stosuje si...

Przerzuty odpowiadają za ponad 90% zgonów spowodowanych guzami litymi. Kość jest najczęstszym narządem dotkniętym przerzutami różnych typów nowotworów, zwłaszcza raka piersi i prostaty. Po zdiagnozowaniu w klinice, przerzuty do kości zwykle weszły już w zaawansowane stadium ze zmianami osteolitycznymi lub osteoblastycznymi w kości, którym często towarzyszą objawy neurologiczne.
Poprzednie badania koncentrowały się głównie na jawnych przerzutach osteolitycznych do kości1-3, jednak obecnie mamy ograniczoną wiedzę na temat mikroprzerzutów w kościach przed rozpoczęciem procesu osteolitycznego. Wynika to przynajmniej częściowo z braku odpowiednich modeli i podejść eksperymentalnych. Genetycznie zmodyfikowane mysie modele raka piersi często dają przerzuty do płuc, ale znacznie mniej skutecznie dokości4. Podobnie, w guzach przeszczepionych ortotopowo rzadko rozwijają się spontaniczne przerzuty do kości, z niektórymi podklonami raka sutka 4T1 z tropikalnymi kośćmi i transgenicznym modelem myszy z nadekspresją MSP PyMT jako wyjątkami5-7. Wiercenie dopiszczelowe może dostarczyć komórki rakowe do kości8-10, ale powoduje również uszkodzenia i stan zapalny lokalnych tkanek. Obecnie wstrzyknięcie dosercowe linii komórkowych raka piersi jest głównym podejściem do badania kolonizacji kości11-13. Jednak po wprowadzeniu komórek rakowych do lewej komory tylko niewielka ich część ostatecznie dotrze do kości i szpiku kostnego, co utrudnia śledzenie mikroskopijnych przerzutów w wymierny sposób.
W tym badaniu ustalamy technikę, a mianowicie wstrzyknięcie14 do tętnicy biodrowej (IIA), aby selektywnie dostarczać komórki rakowe do tkanek kończyn tylnych, wzbogacając w ten sposób komórki rakowe w kości i szpiku kostnym bez powodowania uszkodzeń lokalnych tkanek. Ze względu na specyficzność kości, takie podejście daje również wystarczająco dużo czasu na ostateczną kolonizację leniwych komórek rakowych, zanim zwierzęta ulegną pierwotnym guzom lub przerzutom do innych ważnych narządów. W połączeniu z wieloma innymi technikami, takimi jak obrazowanie bioluminescencyjne, barwienie immunofluorescencyjne i histomorfometria kości, wstrzyknięcie IIA jest potencjalnie przydatne w szerokim zakresie celów badawczych związanych z przerzutami do kości, zwłaszcza do śledzenia progresji od pojedynczych komórek rakowych do mikroprzerzutów wielokomórkowych. W szczególności wykazaliśmy, że iniekcja IIA umożliwia nam wizualizację interakcji między komórkami nowotworowymi a różnymi typami otaczających komórek w mikrośrodowisku kości.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep Amphatericin B</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-745E</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza Biowhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny/EDTA</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>45 &mu; Sitko do komórek M</td><td>Międzynarodowe Laboratorium VWR</td><td>195-2545</td><td></td></tr><tr><td>MediGel CPF z karprofenem&nbsp;</td><td>Kontrolowany przedmiot z opieki weterynaryjnej w BCM</td><td></td><td>Do leczenia bólu</td></tr><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Kontrolowany przedmiot z opieki weterynaryjnej w BCM</td><td></td><td>Do leczenia bólu</td></tr><tr><td>Granulat estradiolu</td><td>Innowacyjne badania Ameryki</td><td>SE-121</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina i ksylazyna</td><td>Kontrolowany przedmiot z opieki weterynaryjnej w BCM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna</td><td>Kontrolowany przedmiot z opieki weterynaryjnej w BCM</td><td></td><td>Unikaj suchości oczu</td></tr><tr><td>Golarka</td><td>Oster</td><td>78005-050</td><td>Do myszy futrzane</td></tr><tr><td>Etanol izopropylowy</td><td>ACROS</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Peeling chirurgiczny Betadine</td><td>Kontrolowany przedmiot z opieki weterynaryjnej w</td> ostrzach skalpela BCM<td></td><td></td></tr><tr><td>#10</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>549-3CS-10</td><td>Wielokrotny</td></tr><tr><td>uchwyt nr 3</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>541-31</td><td>Musi być autoklawowany</td></tr><tr><td>Sterylna serweta chirurgiczna</td><td>Technologia</td> <td>infuzji SaiPSS-SD1</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze proste&nbsp;</td><td>Instrument chirurgiczny Roboz</td><td>RS-5132</td><td>Musi być autoklawowany</td></tr><tr><td>Proste cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td>Muszą być autoklawowane</td></tr><tr><td>Kleszcze drobno krawędziowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td>Muszą być autoklawowane</td></tr><tr><td>4-0 Nici jedwabne</td><td>Vicryl Johnson & Strzykawki insulinowe Johnson Health Care</td><td>J214H</td><td></td></tr><tr><td>31 G</td><td>BD</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>Waciki bawełniane z wieloma końcówkami Q (sterylne)</td><td>Międzynarodowe laboratorium VWR</td><td>89031-272</td><td></td></tr><tr><td>Klej do skóry</td><td>Henry Schein Zdrowie zwierząt</td><td>31477</td><td>Do zamykania skóry w miejscu operacji</td></tr><tr><td>Aplikator kolczyków</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-00</td><td></td></tr><tr><td>Kolczyki</td><td>Fine Science Tools</td><td>24220-50</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK</td><td>Unikaj światła i połóż na lodzie</td></tr><tr><td>strzykawki insulinowe 28 G</td><td>BD</td><td>329410</td><td>Do wstrzykiwań doorbitalnych</td></tr><tr><td>Paraformadehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>30525-89-4</td><td>Do utrwalania tkanek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>OmniPur</td><td>4050</td><td>Do odkamieniania tkanki kostnej</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>Leica S6E stereo</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II system obrazowania</td><td>Zaawansowane widzenie</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>molekularneNazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-GFP (JL-8)</td><td>Przeciwciała anty-ALP Clontech</td><td>632381</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab108337</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Osterix przeciwciała</td><td>Abcam</td><td>ab22552</td><td></td></tr></tbody></table>

iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości

Intra-iliac Artery Injection for Efficient and Selective Modeling of Microscopic Bone Metastasis

Wstrzyknięcie do tętnicy biodrowej (IIA) jest skutecznym podejściem do wprowadzania przerzutowych zmian różnych komórek rakowych u zwierząt. W porównaniu z powszechnie stosowanymi iniekcjami dosercowymi i piszczelowymi, iniekcja IIA ma kilka zalet. Po pierwsze, może dostarczyć dużą ilość komórek rakowych specyficznie do kości kończyn tylnych, zapewniając w ten sposób czasowo zsynchronizowane zdarzenia kolonizacji we wczesnym stadium i umożliwiając solidną kwantyfikację i szybkie wykrywanie rozsianych komórek nowotworowych. Po drugie, wstrzykuje komórki rakowe do krążenia bez uszkadzania lokalnych tkanek, unikając w ten sposób procesów zapalnych i gojenia się ran, które zakłócają proces kolonizacji kości. Po trzecie, wstrzyknięcie IIA powoduje bardzo mały wzrost przerzutów w narządach innych niż kości, zapobiegając w ten sposób zwierzętom uleganiu innym ważnym przerzutom i umożliwiając ciągłe monitorowanie powolnych zmian w kościach. Zalety te są szczególnie przydatne do kontroli progresji od pojedynczych komórek nowotworowych do mikroprzerzutów wielokomórkowych, które w przeszłości były w dużej mierze nieuchwytne. W połączeniu z najnowocześniejszymi podejściami do obrazowania biologicznego i histologii kości, iniekcja IIA może być stosowana do różnych celów badawczych związanych z przerzutami do kości.

Rysunek 1 ilustruje anatomiczną lokalizację i wzajemne położenie tętnicy (czerwona) i żyły (niebieska) biodrowej wspólnej.
Rysunek 2 przedstawia względne położenie naczyń i nerwów miednicznych pod mikroskopem sekcyjnym. Jak pokazano na Rysunku 2A, naczynia i nerwy znajdują się bezpośrednio pod ścianą otrzewną i stają się widoczne po wykonaniu nacięcia skóry i odsunięciu otrzewne...

Ten manuskrypt zawiera szczegółową procedurę wstrzykiwania do tętnicy biodrowej (IIA), techniki dostarczania komórek rakowych specyficznie do tkanek kończyn tylnych, w tym kości, w celu ustalenia eksperymentalnych przerzutów do kości. Chociaż początkowo ustalono go na podstawie modeli guzów piersi, protokół ten można łatwo rozszerzyć na inne typy raka.

Iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości

Intra-iliac artery (IIA) injection is an efficient approach to introduce metastatic lesions of various cancer cells in animals. Compared to the widely ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie eksperymentalnych przerzutów do kości poprzez bezpośrednie wprowadzenie komórek nowotworowych do tkanek kończyn dolnych, w tym do kości, za pomocą wstrzykiwania do tętnicy biodrowej wewnętrznej. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące kolonizacji kości przez raka piersi, zwłaszcza we wczesnej fazie tego procesu, oraz na to, w jaki sposób komórki raka piersi oddziałują z komórkami mikrośrodowiska w kości. Dzisiaj wykonaliśmy wstrzyknięcie do tętnicy biodrowej.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wydajne i selektywne stworzenie eksperymentalnego mikroskopowego modelu przerzutów do kości dla różnych typów nowotworów bez powodowania lokalnych uszkodzeń tkanek. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ znalezienie precyzyjnego miejsca wstrzyknięcia do tętnicy biodrowej pod mikroskopem może wymagać praktyki, aby osiągnąć skuteczność wstrzykiwania powyżej dziewięćdziesięciu procent. Rozpocznij od potwierdzenia odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uszczypnięcie w palec u nogi myszy w wieku od pięciu do sześciu tygodni o masie 20 g.Po nałożeniu maści do oczu, przemyj ogoloną prawą pachwinę kilka razy, używając kolejno sterylnych patyczków bawełnianych nasączonych 70% izopropanolen, a następnie chirurgicznego płynu do mycia Betadine. Następnie przykryj całą mysz sterylną chustą. Po tym użyj sterylnego stalowego skalpela z ostrzem nr 10 i rękojeścią nr 3, aby wykonać nacięcie skóry o długości od 1 do 1,2 cm między czwartą a piątą sutczką w dolnej prawej części brzucha.Następnie przenieś zwierzę pod standardowy stereomikroskop laboratoryjny. Przy użyciu obiektywu 4X wprowadź tępe pęsety rozdzielające do nacięcia pomiędzy tkankę tłuszczową a otrzewną i odsuń tkanki na boki, aby odsłonić naczynia biodrowe oraz nerwy. Następnie za pomocą prostych, cienkich pęset przerwij tkankę łączną znajdującą się pomiędzy naczyniami a nerwem położonym najbliżej naczyń.Następnie wsuń pęsetę kątową przez tkankę łączną i pod naczynia miedniczne, jednocześnie wprowadzając pęsetę prostą w tkankę łączną po przeciwnej stronie naczyń, aby prowadzić pęsetę kątową przez tkankę. Na tym etapie zaleca się oddzielenie i uniesienie brzegu miednicy oraz tętnicy jako wspólny pakiet. Mimo że komórki nowotworowe są wstrzykiwane wyłącznie do tętnicy, izolacja obu naczyń razem pozwala zaoszczędzić czas i wysiłek.Po umieszczeniu pęsety kątowej należy dalej oddzielić żyłę i tętnicę biodrową od otaczających tkanek, utrzymując naczynia na pęsecie kątowej podczas preparowania. Gdy naczynia będą odsłonięte, należy użyć pęsety prostej, aby dostarczyć końcówkę nici jedwabnej 4-0 do pęsety kątowej, a następnie powoli i ostrożnie przeciągnąć szew pod naczyniami. W ten sposób zarówno wspólna żyła, jak i tętnica biodrowa powinny zostać uniesione przez szew.Po przygotowaniu naczyń, kilkukrotnie pipetuj komórki nowotworowe w górę i w dół, aby zawiesić je w formie jednorodnej zawiesiny pojedynczych komórek i rozbić wszelkie skupiska. Następnie pobierz do strzykawki insulinowej o rozmiarze 31 G 100 µL komórek na jedną mysz. Teraz wsuń pęsetę kątową pod naczynia, prowadząc ją wzdłuż szwu, i otwórz pęsetę tak, aby naczynia spoczywały delikatnie na jej końcówkach.Drugą ręką wprowadź końcówkę igły ściętą stroną do góry do światła odcinka tętnicy znajdującego się między końcówkami pincety. Powoli naciśnij tłok, aby wstrzyknąć komórki. Zawiesina komórkowa wypłucze krew z naczynia.Po podaniu wszystkich komórek ostrożnie wyjmij igłę, utrzymując naczynia uniesione pęsetą, aby zapobiec krwawieniu. Następnie usuń szew. Na koniec szybko zdejmij pęsetę i dociśnij patyczek watny do miejsca nacięcia przez 5 do 10 minut, aby zatamować krwawienie.Tutaj przedstawiono reprezentatywny obraz bioluminescencyjny całego zwierzęcia po wstrzyknięciu do tętnicy biodrowej wewnętrznej 5×10⁵ komórek raka piersi MCF-7 znakowanych GFP i lucyferyną, a następnie podaniu d-lucyferyny drogą wstrzyknięcia do zatoki zaoczodołowej. W 14. dniu po wstrzyknięciu uzyskano silny sygnał bioluminescencji z kości kończyny dolnej, w którą wstrzyknięto preparat do tętnicy biodrowej wewnętrznej, natomiast nie zaobserwowano go w przeciwległej kości kontrolnej, co potwierdza specyficzną lokalizację wstrzykniętych komórek. Wykonanie skrawków i barwienie H&E kości z nowotworem wykazało również zwartą, brukową populację komórek z dużymi jądrami, co wskazuje na obecność mikroskopijnych ognisk przerzutowych MCF-7 w tkance kostnej 14 dni po wstrzyknięciu do tętnicy biodrowej wewnętrznej.Ponadto barwienie immunofluorescencyjne przekrojów kości wykazało współwystępowanie komórek MCF-7 z osteoblastami i preosteoblastami. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje od dziesięciu do piętnastu minut. Po zastosowaniu tych procedur można wykorzystać inne metody w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania.Na przykład możemy wykorzystać sekwencjonowanie RNA (RNA-Seq) do profilowania komórek mikrośrodowiska w niszy przerzutowej i porównania ich z komórkami prawidłowymi. Technika ta stanowi jeden ze sposobów badania mikroprzerzutów do kości w modelach zwierzęcych przez badaczy raka piersi oraz raka prostaty. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat tego, jak ustanowić model przerzutów raka piersi do kości poprzez wstrzyknięcie do tętnicy biodrowej wewnętrznej.Należy zachować odpowiednie środki ostrożności, ponieważ praca z ketaminą i ksylazyną może być niezwykle niebezpieczna.

intra-iliac-artery-injection-for-efficient-selective-modeling

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W patogenezie przerzutów do kości angiogeneza jest procesem kluczowym, w związku z czym stanowi cel obrazowania i terapii. W niniejszej pracy przedstawiamy szczurzy model miejscowych przerzutów raka piersi do kości oraz opisujemy strategie nieinwazyjnego obrazowania angiogenezy in vivo z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultrasonografii.

Wielomodalne obrazowanie angiogenezy w modelu przerzutów raka piersi do kości u szczurów nago z wykorzystaniem obrazowania rezonansem magnetycznym, wolumetrycznej tomografii komputerowej i ultradźwięków

Modele zwierzęce są często wykorzystywane do badania przerzutów nowotworowych do kości. W niniejszym protokole opiszemy dwie powszechne metody inokulacji guza w badaniach nad przerzutami do kości oraz krótko omówimy niektóre z analiz stosowanych do monitorowania i ilościowego określania tych modeli.

Modele przerzutów do kości

Źródło: Lim, M., et al. Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej. J. Vis. Exp. (2022)W tym filmie znieczulona mysz przechodzi zabieg chirurgiczny, w którym komórki rakowe są wstrzykiwane do wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), aby ułatwić celowe dostarczanie do mózgu. Procedura polega na precyzyjnym zszywaniu i manipulowaniu tętnicami szyjnymi w celu skierowania wstrzykniętych komórek w kierunku tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), co z...

Modelowanie przerzutów guza mózgu poprzez wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej wewnętrznej

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Procedura chirurgiczna została opracowana w celu dostarczenia komórek guza sutka do mysiej wątroby poprzez wstrzyknięcie do żyły wrotnej. Model ten umożliwia badanie późnych stadiów przerzutów do wątroby u w pełni kompetentnego immunologicznie gospodarza, w tym wynaczynienia komórek nowotworowych, siewu, przeżycia i przerzutowego wzrostu w wątrobie.

Model iniekcji żyły wrotnej do badania przerzutów raka piersi do wątroby

Modelowanie przerzutów wewnątrzczaszkowych do mózgu jest skomplikowane przez niemożność monitorowania wielkości guza i odpowiedzi na leczenie za pomocą precyzyjnych i szybkich metod. Przedstawiona metodologia łączy iniekcję guza śródczaszkowego z analizą rezonansu magnetycznego, która w połączeniu zapewnia precyzyjne i spójne iniekcje, ulepszone monitorowanie zwierząt i dokładne pomiary objętości guza.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez iniekcję wewnątrzczaszkową i rezonans magnetyczny

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Opisujemy mysi model raka piersi z przerzutami do mózgu generowanymi przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej endogennej linii komórkowej zapalnego raka piersi z amplifikacją HER2.

Modelowanie przerzutów do mózgu poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej komórek zapalnego raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół dosercowego wstrzykiwania ludzkich komórek raka prostaty w celu wygenerowania mysiego modelu ze zmianami przerzutowymi do kości.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

Stereotaktyczna technika wstrzyknięć wewnątrzczaszkowa umożliwia precyzyjne i lokalne wszczepienie komórek nowotworowych do kory myszy, czyniąc ją potężnym modelem do badania kolonizacji przerzutowej mózgu.

Modelowanie przerzutów mózgowych: standaryzowana analiza kolonizacji przerzutowej i wzorców wzrostu histologicznego za pomocą stereotaktycznego zastrzyku wewnątrzkorowego

Poznaj technikę iniekcji do tętnicy biodrowej w celu modelowania mikroskopijnych przerzutów nowotworowych do kości. Ta metoda umożliwia badanie interakcji komórek raka piersi z mikrośrodowiskiem kostnym u myszy.

Iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości

Przeglądaj więcej filmów