Iniekcja do tętnicy biodrowej w celu skutecznego i selektywnego modelowania mikroskopijnych przerzutów do kości
26 września 2016
Ten manuskrypt zawiera szczegółową procedurę wstrzykiwania do tętnicy biodrowej (IIA), techniki dostarczania komórek rakowych specyficznie do tkanek kończyn tylnych, w tym kości, w celu ustalenia eksperymentalnych przerzutów do kości. Chociaż początkowo ustalono go na podstawie modeli guzów piersi, protokół ten można łatwo rozszerzyć na inne typy raka.
Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie eksperymentalnych przerzutów do kości poprzez dostarczenie komórek nowotworowych bezpośrednio do tkanek kończyn tylnych, w tym kości, poprzez wstrzyknięcie do tętnicy biodrowej. Tak więc ta metoda może nam pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące kolonizacji kości przez raka piersi, zwłaszcza we wczesnej fazie tego procesu, jak komórki raka piersi oddziałują z komórkami mikrośrodowiska w kości. Dzisiaj zrobiliśmy iniekcję do tętnicy biodrowej.
Główną zaletą tej techniki jest to, że skutecznie i selektywnie ustanawia eksperymentalny mikroskopijny model przerzutów do kości dla różnych typów nowotworów, nie powodując miejscowego uszkodzenia tkanek. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ znalezienie zastrzyku, który jest dokładny, pozycja wstrzyknięcia tętnicy biodrowej pod mikroskopem może wymagać praktyki, aby osiągnąć wyższy niż dziewięćdziesiąt procent wskaźnik sukcesu wstrzyknięcia. Zacznij od potwierdzenia odpowiedniego poziomu uspokojenia przez uszczypnięcie palca u pięciu do sześciu tygodni dwudziestogramowej myszy.
Po nałożeniu maści do oczu należy kilkakrotnie przetrzeć ogoloną prawą okolicę pachwiny sekwencyjnymi, sterylnymi, nasączonymi 70% etanolem bawełnianym wacikami, a następnie wykonać peeling chirurgiczny betadyny. Następnie przykryj całą mysz sterylną zasłoną. Następnie użyj sterylnego ostrza skalpela ze stali węglowej numer dziesięć i uchwytu numer trzy, aby wykonać nacięcie skóry o długości od jednego do 1,2 centymetra między czwartym a piątym sutkiem w prawej dolnej części brzucha.
I przenieś zwierzę pod standardowy mikroskop preparacyjny na stole. Pod obiektywem 4X włóż kleszcze separacyjne do nacięcia między tkanką tłuszczową a otrzewną i wypchnij tkanki na zewnątrz po obu stronach, aby odsłonić naczynia biodrowe i nerwy. Następnie użyj prostych, cienkich kleszczy, aby przebić się przez tkankę łączną między naczyniami a nerwem znajdującym się najbliżej naczyń.
Następnie wsuń kleszcze pod kątem przez tkankę łączną i pod naczyniami biodrowymi, jednocześnie wkładając proste kleszcze do tkanek łącznych po drugiej stronie naczyń, aby poprowadzić kleszcze pod kątem przez tkankę. Zalecamy oddzielenie i uniesienie obręczy biodrowej i tętnicy jako wiązki na tym etapie. Chociaż komórki nowotworowe są wstrzykiwane tylko do tętnicy, oszczędza to czas i wysiłek, aby wyizolować oba naczynia razem.
Po umieszczeniu kleszczyków pod kątem należy dodatkowo oddzielić żyłę biodrową i tętnicę od otaczającej tkanki, utrzymując naczynia na wierzchu kleszczy ustawionych pod kątem podczas sekcji. Gdy naczynia są czyste, użyj prostych kleszczy, aby dostarczyć końcówkę jedwabnego szwu 4-0 do kleszczy ustawionych pod kątem i powoli i delikatnie przeciągnij szew pod naczyniami. Obie żyły biodrowej i naczynia tętnicze powinny być następnie podtrzymywane przez szew.
Gdy naczynia będą gotowe, kilkakrotnie pipetuj komórki nowotworowe w górę iw dół, aby ponownie zawiesić je w roztworze jednokomórkowym i rozbić wszelkie grudki. Następnie odessać 100 mikrolitrów komórek na mysz do strzykawki insulinowej o rozmiarze 31. Teraz wsuń kleszcze pod kątem z powrotem pod naczynia, używając szwu jako prowadnicy, i otwórz kleszcze tak, aby naczynia delikatnie spoczywały na końcach.
Drugą ręką włóż końcówkę igły ukośnie do góry w światło odcinka tętnicy między końcówkami kleszczy. Powoli wciskać tłok, aby wstrzyknąć komórki. Zawiesina komórkowa przepłukuje krew przez naczynie.
Po dostarczeniu wszystkich komórek delikatnie wyjmij igłę, trzymając naczynia uniesione na kleszczach, aby zapobiec krwawieniu. Następnie odciągnij szew. Na koniec szybko usuń kleszcze i przyciśnij bawełniany wacik do nacięcia przez pięć do 10 minut, aby zatrzymać krwawienie.
Tutaj pokazano reprezentatywny obraz bioluminescencyjny całego zwierzęcia po wstrzyknięciu do tętnicy biodrowej pięć razy 10 do piątych komórek raka piersi MCF-7 znakowanych lucyferyną GFP, a następnie podaniu d-lucyferyny przez wstrzyknięcie do zatoki zaoczodołowej. W 14 dniu po wstrzyknięciu uzyskano silny sygnał bioluminescencyjny z tylnej kości do tętnicy wewnątrzbiodrowej, ale nie z przeciwległej kości kontrolnej, co potwierdza specyficzną lokalizację wstrzykniętych komórek. Sekcja barwienia H&E kości zawierających guz wykazała również zwartą, przypominającą bruk populację komórek z dużymi jądrami wskazującymi na mikroskopijne zmiany przerzutowe MCF-7 w tkance kostnej 14 dni po wstrzyknięciu tętnicy biodrowej.
Co więcej, barwienie immunofluorescencyjne skrawków kości ujawniło również mieszanie się komórek MCF-7 z osteoblastami i preosteoblastami. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu dziesięciu do piętnastu minut. Postępując zgodnie z tymi procedurami, możesz użyć innych metod, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.
Na przykład możemy użyć RNA-Seq do profilowania komórek mikrośrodowiska w niszy przerzutów i porównania ich z normalnymi komórkami. Technika ta stanowi jeden ze sposobów dla badaczy raka piersi i raka prostaty do badania mikroprzerzutów do kości u zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinnaś dobrze zrozumieć, jak ustalić model przerzutów raka piersi do kości poprzez wstrzyknięcie do tętnicy biodrowej.
Prosimy o podjęcie odpowiednich środków ostrożności, ponieważ praca z ketaminą i ksylazyną może być bardzo niebezpieczna.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt szczegółowo opisuje technikę wstrzykiwania do tętnicy wewnętrznej miednicznej (IIA) w celu dostarczenia komórek nowotworowych do tkanek kończyn tylnych, w tym do kości, w celu wywołania eksperymentalnych przerzutów do kości. Metoda ta jest szczególnie użyteczna w badaniu oddziaływań komórek raka piersi z mikrośrodowiskiem kostnym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Techniki eksperymentalne
Wstęp
- Przerzuty do kości są częstym powikłaniem u pacjentów onkologicznych.
- Zrozumienie mechanizmów kolonizacji kości przez komórki nowotworowe jest kluczowe dla opracowania metod terapeutycznych.
- Metoda wstrzyknięcia do tętnicyy wewnętrznej miednicy pozwala na celowane dostarczenie komórek nowotworowych.
- Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanek miejscowych w porównaniu z innymi metodami.
Cel badania
- Ustanowienie modelu do badania przerzutów do kości.
- Zbadanie oddziaływań między komórkami raka piersi a komórkami mikrośrodowiska kostnego.
- Poprawa dokładności i skuteczności techniki iniekcji.
Zastosowane metody
- Wstrzykiwanie komórek nowotworowych do tętnicy biodrowej wewnętrznej.
- Wykorzystanie modelu mysiego w wieku od pięciu do sześciu tygodni.
- Monitorowanie poziomu sedacji poprzez test uszczypnięcia palca.
- Ćwiczenie technik wstrzykiwania w celu osiągnięcia wysokiego wskaźnika sukcesu.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia efektywne tworzenie modeli przerzutów do kości.
- Dzięki praktyce można osiągnąć wysoki odsetek sukcesu.
- W przypadku tej metody obserwuje się minimalne uszkodzenia tkanek lokalnych.
- Uzyskano wiedzę na temat wczesnych faz kolonizacji przez komórki raka piersi.
Wnioski
- Wtryskiwanie do tętnicy wewnętrznej miednicy jest cennym narzędziem w badaniach nad rakiem.
- Metodę tę można dostosować do różnych typów nowotworów poza rakiem piersi.
- Dalsze badania mogą pogłębić zrozumienie oddziaływań między nowotworem a kością.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Tworzenie wiarygodnych modeli przerzutów do kości we wczesnym stadium pozostaje krytycznym wyzwaniem w procesie poszukiwania leków onkologicznych, szczególnie w przypadku oceny interwencji terapeutycznych celujących w kolonizację mikroprzerzutową. Technika wstrzykiwania do tętnicy biodrowej wewnętrznej umożliwia spatiotemporalnie zsynchronizowaną dysseminację komórek nowotworowych do kości kończyn dolnych, co pozwala na precyzyjne ilościowe określenie liczby rozproszonych komórek nowotworowych i ogranicza zakłócające reakcje zapalne wynikające z uszkodzenia tkanek podczas procedury. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przedklinicznych, umożliwiając ciągłe monitorowanie utajonych zmian kostnych bez występowania przerzutów do narządów systemowych, co tym samym poprawia istotność translacyjną modeli przerzutów do kości w badaniach nad walidacją celów terapeutycznych i identyfikacją substancji wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez modelowanie wczesnych interakcji komórek nowotworowych z komponentami mikrośrodowiska kostnego, takimi jak osteoblasty i preosteoblasty.
- Wartość operacyjna: Zapewnia selektywną i wydajną metodę wprowadzania komórek nowotworowych do kości kończyn tylnych, co ułatwia powtarzalne generowanie modeli w kohortach eksperymentalnych.
- Wartość strategiczna: Wspiera mechanistyczną analizę ryzyka w obrębie szlaków przerzutowania do kości, umożliwiając wizualizację progresji mikroprzetrzutów od pojedynczych komórek do zmian wielokomórkowych za pomocą odczytów bioluminescencyjnych i histologicznych.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne wyniki, takie jak natężenie sygnału bioluminescencyjnego i gęstość zmian histologicznych, co umożliwia standaryzowaną ocenę obciążenia przerzutowego.
- Wartość operacyjna: Zapobiega lokalnym uszkodzeniom tkanek i powiązanym z nimi zakłóceniom wynikającym z gojenia ran, co poprawia powtarzalność testu i zmniejsza zmienność w analizach końcowych.
- Wartość strategiczna: Pozwala na stworzenie systemów istotnych dla przebiegu choroby z minimalnym przerzutowaniem do organów poza docelowych, co umożliwia wydłużenie okien obserwacyjnych w badaniach zależności dawka-odpowiedź oraz harmonogramu w kampaniach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodny z systemami istotnymi dla przebiegu choroby, obejmując progresję od rozproszonych komórek nowotworowych do mikroprzerzutów w kości, co stanowi kluczowy problem kliniczny.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, wspierając podłużne obrazowanie oraz analizy końcowe, takie jak barwienie H&E i immunofluorescencyjne.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka, dostarczając wczesnych sygnałów skuteczności związków zaburzających współistnienie nowotworu ze zrostem lub tworzenie nisz w mikrośrodowisku kostnym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda wstrzykiwania do tętnicy wewnętrznej biodrowej wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po przedkliniczne badania skuteczności, szczególnie w przypadku terapeutyków skierowanych do kości, gdzie wczesne modelowanie przerzutów pozwala na zrozumienie mechanizmów oraz określenie okien terapeutycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem kostnym poprzez umożliwienie kontrolowanego dostarczania komórek nowotworowych do miejsc w szkielecie.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy systemy biologiczne z ilościowymi odczytami bioluminescencyjnymi i histopatologicznymi, odpowiednimi dla platform wysokoprzepustowego przesiewania (high-content screening).
- Analityka: Generuje mierzalne zmienne zależne, w tym strumień fotonów z bioluminescencji, powierzchnię zmiany w przekrojach histologicznych oraz wskaźniki kolokalizacji komórek nowotworowych i zrazowych.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością przedkliniczną poprzez modelowanie beznaczyniowej fazy mikrometastatycznej, która poprzedza progresję osteolityczną lub osteoblastyczną w klinicznych przerzutach do kości.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi standaryzowaną technikę chirurgiczną, którą można dostosować do różnych typów nowotworów i laboratoriów, co sprzyja spójności międzyprojektowej w generowaniu modeli przerzutów do kości.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję szumów wynikających z zapalenia proceduralnego oraz umożliwienie jasnego przypisania zmian fenotypowych do mechanizmów działania leku.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym punktom orientacyjnym anatomicznym i izolacji naczyń z wykorzystaniem szwów, co minimalizuje zmienność zależną od operatora.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wczesnych, organospecyficznych odczytów przerzutów, co ogranicza niepowodzenia na późnych etapach wynikające z nieprzewidzianego tropizmu kostnego.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację kandydatów celowanych w kości z uwzględnieniem ryzyka, umożliwiając bezpośrednie porównanie obciążenia przerzutowego w różnych grupach terapeutycznych w modelach syngenicznych lub ksenoprzeszczepowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga biegłości w technikach mikrochirurgicznych, w tym w izolacji naczyń i ligacji szwem pod mikroskopem sekcyjnym.
- Zależne od dostępu do sterylnych mikroskopów sekcyjnych, precyzyjnych pęset, strzykawek insulinowych oraz sprzętu do przygotowania izotonicznej zawiesiny komórkowej.
- Wymaga standaryzacji protokołów znieczulenia (np. ketamina/ksylazyna) oraz monitorowania pooperacyjnego w ramach całego zespołu w celu zapewnienia dobrostanu zwierząt i spójności modelu.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie objętości wstrzyknięcia i stężenia komórek w zależności od agresywności linii komórkowej nowotworu oraz zmienności szczepu myszy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują okres nauki niezbędny do osiągnięcia skuteczności wstrzyknięć na poziomie >90% oraz konieczność stosowania technik aseptycznych w celu zapobiegania zanieczyszczeniu otrzewnej podczas nacięcia w okolicy pachwiny.
