Mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna
11 maja 2016
Ten manuskrypt opisuje protokoły mikropreparacji prostaty i chirurgicznej kastracji u myszy laboratoryjnej. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki uzyskane przez te protokoły. Na koniec omawiamy zalety i wykorzystanie tych protokołów.
Ogólnym celem tych procedur jest umożliwienie badania prostaty, a także różnych warunków hormonalnych u myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka prostaty, takie jak: jaki jest wpływ na deprywację hormonów na kancerogenezę prostaty. Główną zaletą tej techniki jest to, że można badać skutki różnych procesów patologicznych i zmian hormonalnych w poszczególnych gruczołach krokowych.
Zacznij od przygwożdżenia myszy do deski preparacyjnej w pozycji leżącej przez opuszkę stopy każdej łapy i spryskania brzucha 70% etanolem. Następnie, trzymając skórę dolnej części brzucha kleszczami, użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i otrzewną około jednego centymetra przed otworem penisa. Kontynuuj cięcie skóry i otrzewnej od dolnej części brzucha w górę po obu stronach brzucha do klatki piersiowej, odsłaniając jamę otrzewnej.
Po zidentyfikowaniu lokalizacji pęcherza moczowego i dróg moczowo-płciowych lub UGT, delikatnie przesuń tłuszcz i inne narządy na bok, aby odsłonić tkanki moczowe. Następnie za pomocą kleszczy chwyć nasieniowód u podstawy w pobliżu cewki moczowej i oderwij naczynie. Po usunięciu drugiego przewodu za pomocą kleszczy ostrożnie przytrzymaj i podciągnij pęcherz, jednocześnie używając nożyczek, aby przeciąć cewkę moczową poniżej brzusznej prostaty i około jednego centymetra poniżej podstawy pęcherza.
Przenieś zebrany UGT na szalkę Petriego o średnicy od 60 do 100 milimetrów zawierającą około pięciu do 10 mililitrów PBS i umieść naczynie pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie podnieś po jednej parze cienkich kleszczy w każdą rękę, trzymając instrumenty jak ołówki, i oprzyj przedramiona na blacie stołu, po obu stronach mikroskopu, aby utrzymać je stabilnie. Ustaw UGT za pomocą kleszczy tak, aby pęcherz był skierowany do góry, cewka moczowa była skierowana w dół, a pęcherzyki nasienne były umieszczone po obu stronach pęcherza.
Chwytając cewkę moczową jednym kleszczem, użyj drugich kleszczy, aby ostrożnie usunąć tłuszcz, nie usuwając tkanki prostaty. Kiedy cały tłuszcz zostanie usunięty, rozerwij tkankę łączną między dwoma brzusznymi płatami prostaty, aby je rozdzielić. Następnie, przytrzymując jeden z płatów brzusznych w pobliżu czubka jedną parą kleszczy, chwyć podstawę płata jak najbliżej cewki moczowej.
Teraz przesuń drugą parę kleszczy, aby przytrzymać cewkę moczową, jednocześnie odciągając płat od naczynia zdecydowanym, płynnym ruchem. Upewnij się, że żadna tkanka prostaty nie pozostaje przyczepiona do cewki moczowej. Następnie umieść płat w odpowiednim podłożu, zgodnie z następnym krokiem eksperymentalnym.
Po odizolowaniu drugiego płata brzusznego w ten sam sposób za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij jeden z przednich płatów od pęcherzyka nasiennego, uważając, aby nie przebić pęcherzyka nasiennego. Następnie, gdy płat jest niezależny od pęcherzyka nasiennego, usuń go w taki sam sposób, jak właśnie pokazano dla płata brzusznego. Po wyizolowaniu drugiego płata przedniego odwróć pozostały UGT, tak aby widoczna była gruczoł krokowy, i użyj kleszczy, aby rozerwać tkankę łączną między dwoma grzbietowymi płatami bocznymi oraz między płatami a tylną częścią pęcherzyków nasiennych.
Następnie usuń poszczególne grzbietowe płaty boczne, jak właśnie pokazano. Aby przeprowadzić kastrację, należy rozpocząć od umieszczenia znieczulonej myszy na czystej, sterylnej powierzchni w pozycji leżącej na plecach i potwierdzić odpowiedni poziom sedacji poprzez uszczypnięcie palca. Jeśli mysz nie reaguje, użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić obszar operacyjny i wysterylizować brzuch.
Następnie użyj sterylnych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać jednocentymetrowe pionowe nacięcie przez linię środkową skóry dolnej części brzucha, około jednego punktu pięć centymetrów przed penisem, a następnie mniejsze nacięcie przez otrzewną, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów. Za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie podnieś przeciętą krawędź otrzewnej, aby uwidocznić jamę otrzewnej i użyj innych sterylnych kleszczy, aby wyciągnąć jedną z poduszek tłuszczowych jąder, aż pojawią się jądra. Następnie użyj długopisu kauterycznego, aby powoli przeciąć poduszeczkę tłuszczową, przytrzymując jądra, aż tętnica jądrowa zostanie przecięta.
Jeśli tętnica zostanie przecięta zbyt szybko, naczynie może zbyt mocno krwawić, co wymaga eutanazji myszy. Zalecam podgrzewanie pióra kauterycznego w zrywach i nie dopuszczenie do tego, aby stał się zbyt gorący, a następnie powolne przesuwanie instrumentu przez tętnicę, aby zwierzę się nie wykrwawiło. Po przecięciu poduszeczki tłuszczowej i tętnicy wyrzuć jądra i poduszeczkę tłuszczową i powtórz kastrację dla pozostałych jąder.
Po usunięciu drugiego jądra zamknij otrzewną sterylnymi jedwabnymi szwami i zszyj skórę klipsami chirurgicznymi do ran. Następnie zastosuj środek przeciwbólowy, aby opanować ból i umieść mysz w czystej klatce, na cieplejszym klatce, na 5 do 10 minut z monitorowaniem, aż w pełni wyzdrowieje. Cały układ moczowo-płciowy składa się ze wszystkich sześciu płatów prostaty, pęcherza moczowego, pęcherzyków nasiennych i cewki moczowej.
Nasieniowód przyczepia się do cewki moczowej, ale nie jest potrzebny do rozwarstwienia gruczołu krokowego i dlatego może zostać odłączony przed usunięciem UGT. Drogi moczowo-płciowe pozostaną nienaruszone po usunięciu z jamy brzusznej; pokryty tkanką tłuszczową, która musi zostać usunięta, aby uzyskać dostęp do płatów prostaty. W tym reprezentatywnym eksperymencie po kastracji nastąpiły dwa cykle regeneracji hormonalnej, a poziom testosteronu w surowicy był monitorowany za pomocą testu ELISA.
Zgodnie z przewidywaniami, w warunkach kastracji poziom testosteronu praktycznie zniknął. W obecności tamoksyfenu, selektywnego modulatora receptora estrogenowego, nie zaobserwowano istotnej różnicy w stosunku do stanu normalnego hormonalnie. Jednak po kastracji ponowne wprowadzenie testosteronu spowodowało dramatyczny wzrost poziomu testosteronu w surowicy.
Po mikrorozwarstwieniu płaty prostaty u wykastrowanych myszy ulegają znacznemu zmniejszeniu, podczas gdy płaty u zwierząt leczonych testosteronem wracają do swoich pierwotnych rozmiarów. Co więcej, barwienie hematoksyliną i eozyną przedniej tkanki gruczołu krokowego w normalnych, wykastrowanych i zregenerowanych warunkach ujawnia dramatyczne zmniejszenie silnego wzrostu tkanki w skrawkach od wykastrowanych zwierząt. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu minut na mysz, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Podczas próby kastracji należy pamiętać o tym, aby wszystko było sterylne i kontrolować ból odczuwany przez mysz. Po kastracji można zastosować inne metody, takie jak reintrodukcja androgenów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu testosteronu na guzy prostaty. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się rakiem prostaty do zbadania kancerogenezy, rozwoju i oporności na kastrację u myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt opisuje protokoły mikrodysekcji prostaty oraz chirurgicznej kastracji u myszy laboratoryjnych. Metody te ułatwiają badanie raka prostaty oraz zaburzeń hormonalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Badania nad rakiem prostaty
Wstęp
- Rak prostaty znajduje się pod wpływem zmian hormonalnych.
- Zrozumienie efektów deprywacji hormonalnej ma kluczowe znaczenie.
- Pojedyncze gruczoły kroracze można badać przy użyciu tych technik.
- Myszy laboratoryjne służą jako model raka prostaty u ludzi.
Cel badania
- Zbadanie wpływu warunków hormonalnych na kancerogenezę prostaty.
- Przedstawienie szczegółowych protokołów procedur chirurgicznych.
- Zaprezentowanie reprezentatywnych wyników uzyskanych za pomocą tych metod.
Zastosowane metody
- Przytwierdzanie myszy do deski sekcyjnej.
- Dezynfekcja brzucha 70% etanolem.
- Wykonanie nacięć w celu odsłonięcia jamy otrzewnej.
- Przeprowadzenie mikrodysekcji prostaty.
Główne wyniki
- Pomyślne odsłonięcie gruczołu krokowego w celu przeprowadzenia badań.
- Wyraźna wizualizacja efektów hormonalnych w tkance prostaty.
- Wykazane zalety analizy poszczególnych gruczołów.
- Protokoły zapewniają powtarzalne wyniki do dalszych badań.
Wnioski
- Opisane protokoły są skuteczne w badaniach nad prostatą.
- Umożliwiają one szczegółowe badanie wpływu hormonów.
- Metody te mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia raka prostaty.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikrodysekcja prostaty mysiej oraz kastracja chirurgiczna stanowią solidną platformę przedkliniczną do badania mechanizmów napędzanych przez androgeny w biologii i patologii prostaty. Metody te umożliwiają precyzyjną manipulację stanami hormonalnymi, wspierając ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów w badaniach nad rakiem prostaty. Ich powtarzalność oraz rozdzielczość specyficzna dla poszczególnych płatów zwiększają pewność prognostyczną w badaniach translacyjnych i selekcji projektów badawczych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę wpływu deprywacji androgenowej i regeneracji na architekturę tkankową oraz komórkowość prostaty.
- Wspiera walidację funkcjonalną szlaków reagujących na hormony, które są zaangażowane w kancerogenezę prostaty.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację zmiennych hormonalnych w modelach istotnych dla przebiegu choroby.
- Stanowi podstawę do oceny oporności na kastrację oraz dynamiki linii komórek macierzystych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną, wolną od zanieczyszczeń tkankę prostaty do dalszych analiz molekularnych i histologicznych.
- Gwarantuje odtwarzalne pobieranie próbek z konkretnych płatów, co jest kluczowe dla ilościowych analiz biomarkerów i szlaków sygnałowych.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewania związków w określonych warunkach hormonalnych.
- Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy w wielu kohortach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie manipulacji hormonalnych u myszy do klinicznych paradygmatów terapii deprywacji androgenowej.
- Pozwala na modelowanie oporności na kastrację oraz regeneracji hormonalnej istotnych dla postępu choroby u ludzi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po przedkliniczną walidację hipotez terapeutycznych.
- Dostarcza istotnych translacyjnie punktów końcowych dla badań nad biomarkerami i skutecznością.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejsze protokoły pozycjonują mysie modele prostaty jako pomost między wczesną fazą odkryć a oceną przedkliniczną, umożliwiając badanie sygnalizacji androgenowej i mechanizmów oporności w oparciu o sformułowane hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotezy zerowej dotyczącej zależności od androgenów w rozwoju prostaty i kancerogenezie.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki tkankowe do opracowywania testów i oceny związków.
- Analityka: Wspiera pomiar poziomu testosteronu w surowicy oraz ocenę punktów końcowych w badaniu histologicznym do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Modeluje klinicznie istotne interwencje hormonalne i stany oporności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany, wielokrotnego użytku schemat postępowania dla badań nad manipulacją hormonalną w modelach mysich.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w celowaniu w szlak androgenowy oraz w modelowaniu oporności.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, szybkie i powtarzalne przygotowanie tkanek w celu zachowania porównywalności między badaniami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wyjaśnienie zależności hormonalnych i mechanizmów oporności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację strategii terapeutycznych ukierunkowanych na androgeny i przełamywanie oporności z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy technicznej w zakresie chirurgii mysiej oraz mikrodissekcji w warunkach sterylnych.
- Wymaga dostępu do mikroskopów stereoskopowych, instrumentów chirurgicznych oraz testów do oznaczania poziomu hormonów.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i integralności danych.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania dla różnych szczepów myszy i projektów eksperymentalnych, przy uwzględnieniu niuansów anatomicznych.
- Ograniczenia obejmują konieczność starannego zarządzania bólem oraz potencjalną zmienność odpowiedzi hormonalnej.
