Name: Mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj mikropreparację prostaty i kastrację chirurgiczną u myszy w celu badania wpływu hormonów na karcynogenezę prostaty. Ta metoda umożliwia analizę poszczególnych gruczołów prostaty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niektóre z rycin w tym manuskrypcie zostały hojnie dostarczone przez laboratorium Barta O. Williamsa. Autorzy są wspierani przez granty National Cancer Institute U54CA143803, CA163124, CA093900 ORAZ CA143055.

Protokół ten spełnia i jest zgodny z wytycznymi określonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Mikropreparacja prostaty myszy
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla lub alternatywną zatwierdzoną metodę zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt.</li>
	<li>Przypnij mysz w pozycji leżącej do deski sekcyjnej, wbijając szpilkę przez każdą z czterech łap.</li>
	<li>Spryskaj brzuch 70% etanolem.</li>
	<li>Przytrzymaj skórę dolnej części brzucha kleszczami i nożyczkami przeciąć skórę i otrzewną około 1 cm przed otworem prącia, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów.</li>
	<li>Odetnij skórę i otrzewną od podbrzusza, po obu stronach brzucha do klatki piersiowej, odsłaniając jamę otrzewnej.</li>
	<li>Zidentyfikuj pęcherz moczowy i drogi moczowo-płciowe i odsłoń je, delikatnie przesuwając tłuszcz i inne narządy na bok.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy chwyć nasieniowody u podstawy w pobliżu cewki moczowej i oderwij je.</li>
	<li>Powtórz z przeciwległymi nasieniowodami.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy ostrożnie chwyć pęcherz i pociągnij go do góry, jednocześnie używając nożyczek, aby przeciąć cewkę moczową poniżej pęcherza moczowego i brzuszną prostatę (około 1 cm poniżej podstawy pęcherza). 
	Uwaga: Gdy pęcherz jest podciągany do góry, całe drogi moczowo-płciowe (zawierające pęcherz moczowy, część cewki moczowej, wszystkie płaty prostaty i pęcherzyki nasienne) pojawią się wraz z nim. Może pojawić się pewien opór.</li>
	<li>Umieścić drogi moczowo-płciowe (UGT) na szalce Petriego o średnicy 60-100 mm zawierającej około 5-10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Pozostałą część protokołu należy wykonać pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj dwóch cienkich kleszczyków, po jednym w każdej ręce. Trzymaj kleszcze "jak ołówek" i oprzyj przedramiona na blacie stołu, aby je ustabilizować.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy, aby ustawić UGT tak, aby pęcherz znajdował się na górze, cewka moczowa była skierowana w dół, a pęcherzyki nasienne były umieszczone po obu stronach pęcherza.</li>
	<li>Chwyć cewkę moczową jednym kleszkiem i ostrożnie odciągnij tłuszcz drugimi kleszczami, nie odrywając tkanki prostaty. Uwaga: Tłuszcz będzie wyglądał na "błyszczący" w stosunku do otaczającej tkanki.</li>
	<li>Po usunięciu tłuszczu użyj kleszczy, aby rozerwać tkankę łączną między dwoma brzusznymi płatami prostaty i rozdzielić je.</li>
	<li>Aby usunąć jeden z płatów brzusznych, użyj jednego kleszczyka, aby chwycić pojedynczy płat brzuszny w pobliżu czubka, a drugi kleszcz użyj kleszczy, aby chwycić ten płat u podstawy jak najbliżej cewki moczowej. Nadal chwytając podstawę płata, użyj innych kleszczy, aby chwycić cewkę moczową. Odciągnij płat od cewki moczowej zdecydowanym, płynnym ruchem. Upewnij się, że żadna tkanka prostaty nie pozostaje przyczepiona do cewki moczowej. Umieść płat w odpowiednim podłożu, w zależności od następnego kroku doświadczalnego.
	<ol>
		<li>Aby utrwalić i zatopić parafinę próbkę do analizy histologicznej, umieść płat w 10% neutralnie buforowanej formalinie (NBF) 8.</li>
		<li>Umieść płat w podłożu zamrażającym, takim jak OCT, w celu kriokonserwacji i podziału na sekcje 8.</li>
		<li>Umieścić płat w zimnym PBS w celu izolacji pojedynczej komórki do hodowli lub cytometrii przepływowej 9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz krok 1.15 z drugim płatem brzusznym.</li>
	<li>Aby usunąć jeden z przednich płatów, użyj kleszczy, aby delikatnie odciągnąć płat od pęcherzyka nasiennego, uważając, aby nie przebić pęcherzyka nasiennego. Gdy płat jest niezależny od pęcherzyka nasiennego, usuń go w taki sam sposób, jak płat brzuszny w kroku 1.15.</li>
	<li>Powtórz krok 1.17 z drugim płatem przednim.</li>
	<li>Odwróć pozostały układ moczowo-płciowy tak, aby widoczna była gruczoł krokowy na grzbiecie serca.</li>
	<li>Aby usunąć jeden z płatów grzbietowo-bocznych, użyj kleszczy, aby rozerwać tkankę łączną między dwoma płatami grzbietowo-bocznymi, a także tkankę łączną między płatami a tylną częścią pęcherzyków nasiennych. Usuń płat w podobny sposób, jak płat brzuszny w kroku 1.15.</li>
	<li>Powtórz krok 1.20 z drugim płatem grzbietowo-bocznym.</li>
</ol>
2. Kastracja chirurgiczna
Uwaga: Jest to operacja przetrwania, więc aseptyka, znieczulenie i leczenie bólu są ważne dla etycznego i pomyślnego zakończenia tego protokołu. Przestrzegaj wszystkich wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt w instytucjach. Podczas zabiegu chirurgicznego należy używać zewnętrznego źródła ciepła, takiego jak recyrkulacyjny koc wodny, aby zapobiec hipotermii. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje. Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne przed użyciem w chirurgii.
<ol>
	<li>Na czystej, sterylnej powierzchni znieczulić mysz za pomocą odpowiednich środków (np. 2% wziewnego izofluranu) i ustawić mysz w pozycji leżącej. Uwaga: Można również zastosować alternatywne metody znieczulenia, takie jak ketamina, w zależności od zatwierdzonego protokołu na zwierzętach.</li>
	<li>Sprawdź refleks myszy, ściskając palce u stóp. Jeśli mysz nie reaguje, przejdź do następnego kroku. Jeśli zareaguje, odczekaj 1-3 minuty i sprawdź ponownie. Ogol obszar operacyjny maszynką do golenia za pomocą elektrycznej maszynki do golenia.</li>
	<li>Aseptyczne przygotowanie brzucha myszy za pomocą naprzemiennych peelingów z 70% etanolu i jodu lub procedur zalecanych przez instytucjonalny personel weterynaryjny lub IACUC.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj pionowe nacięcie skóry o długości 1 cm w linii środkowej dolnej części brzucha, około 1,5 cm przed penisem.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (<1 cm) przez otrzewną, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy chwyć przeciętą krawędź otrzewnej i delikatnie ją podnieś, aby móc zobaczyć jamę otrzewnej pod spodem.</li>
	<li>Za pomocą innych sterylnych kleszczy sięgnij do jamy otrzewnej i chwyć lewą lub prawą poduszkę tłuszczową jądra, bocznie do pęcherza. Przeciągnij poduszkę tłuszczową przez otwór w otrzewnej i skórze, aż jądro również wyjdzie. Uważaj, aby nie uszkodzić żadnych innych tkanek ani narządów podczas tego kroku.</li>
	<li>Za pomocą długopisu kauteryzacyjnego przetnij poduszeczkę tłuszczową, która trzyma jądro. Powoli przeciąć tętnicę jądra za pomocą pióra kauterycznego Uwaga: Jeśli tętnica jądra zostanie przecięta zbyt szybko, może wystąpić zbyt duże krwawienie i mysz może wymagać eutanazji.</li>
	<li>Po przecięciu poduszeczki tłuszczowej i tętnicy usuń jądro i poduszkę tłuszczową.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.6-2.9 z drugim jądrem. Uwaga: Alternatywną metodą usunięcia jąder jest chirurgiczne podwiązanie tętnicy jądra, a następnie przecięcie naczynia nożyczkami.</li>
	<li>Zszyć otrzewną zamknąć szwem wchłanialnym.</li>
	<li>Zszyć skórę za pomocą spinek chirurgicznych.</li>
	<li>Podaj środek przeciwbólowy, aby poradzić sobie z bólem i umieść mysz w czystej klatce na podgrzewaczu na 5-10 minut. Monitoruj mysz pod kątem oznak bólu lub krwawienia.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Roehrborn, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+benign+prostatic+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Impot+Res%22%5BJournal%5D)">Pathology of benign prostatic hyperplasia.</a> Int J Impot Res. 20 (suppl 3), 11-18 (2008).</li>
<li>Valkenburg, K. C., Williams, B. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models of prostate cancer.</a> Prostate Cancer. , 895238(2011).</li>
<li>Shappell, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+pathology+of+genetically+engineered+mice%3A+definitions+and+classification.+The+consensus+report+from+the+Bar+Harbor+meeting+of+the+Mouse+Models+of+Human+Cancer+Consortium+Prostate+Pathology+Committee%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee.</a> Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).</li>
<li>Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+discovery+in+prostate+cancer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Drug discovery in prostate cancer mouse models.</a> Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).</li>
<li>El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+features+of+the+basal+cells+of+human+prostate+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Unique features of the basal cells of human prostate epithelium.</a> Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).</li>
<li>Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogens+in+normal+and+abnormal+development+of+the+prostate+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland.</a> Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).</li>
<li>Valkenburg, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+a+subpopulation+of+murine+prostate+luminal+epithelial+cells+induces+high+grade+prostate+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia.</a> Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).</li>
<li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).</li>
<li>Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+men--warning%3A+intact+versus+castrated+adult+male+mice+as+xenograft+hosts+are+equivalent+to+hypogonadal+versus+abiraterone+treated+aging+human+males%2C+respectively%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively.</a> Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luminal+epithelial+stem+cell+that+is+a+cell+of+origin+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer.</a> Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).</li>
<li>Pascal, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5alpha-Reductase+inhibition+coupled+with+short+off+cycles+increases+survival+in+the+LNCaP+xenograft+prostate+tumor+model+on+intermittent+androgen+deprivation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy.</a> J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).</li>
<li>Shen, M. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+prostate+cancer%3A+new+prospects+for+old+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges.</a> Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Mikrorozwarstwienie prostaty pozwala na eksperymentowanie i analizę prostaty myszy specyficzne dla płata (ryc. 1). W genetycznie modyfikowanych modelach mysich fenotypy mogą być widoczne w jednym płacie, a nie są widoczne w innych. Również w przypadku analizy histologicznej protokół ten zapewnia, że maksymalna ilość czystej tkanki prostaty może zostać pocięta i wybarwiona, bez innych tkanek dróg moczowo-płciowych obecnych w przekroju. Wreszcie, w przypadku eksperymentów z pojedynczymi komórkami, protokół...

Prostata jest najczęstszym miejscem raka u mężczyzn w USA. Każdego roku u prawie 220 000 mężczyzn zostanie zdiagnozowany rak prostaty, a około 27 000 mężczyzn zapadnie na tę chorobę 1. Mężczyźni mają 1 na 7 ryzyko zdiagnozowania raka prostaty w ciągu całego życia w USA 1. Łagodny przerost gruczołu krokowego (BPH), nienowotworowe powiększenie gruczołu krokowego związane z wiekiem, jest również powszechnym schorzeniem, dotykającym ponad 80% mężczyzn w wieku powyżej 80 lat 2. W związku z tym prostata jest przedmiotem wielu badań.
Modele mysie były szeroko wykorzystywane do badania chorób prostaty 3. Ogólnie rzecz biorąc, prostata myszy jest doskonałym przedstawicielem gruczołu ludzkiego 4, ale istnieją podobieństwa i różnice między anatomią i fizjologią prostaty myszy i człowieka 5. U obu gatunków prostata znajduje się u podstawy pęcherza moczowego, otaczając cewkę moczową. Ludzki gruczoł krokowy to pojedynczy płat, podzielony na cztery strefy: centralny, przejściowy, obwodowy i przedni zrąb włóknisto-mięśniowy. Natomiast prostata myszy składa się z trzech sparowanych płatów w różnych miejscach wokół cewki moczowej: przedniej, brzusznej i grzbietowo-bocznej. Na poziomie komórkowym główna różnica polega na tym, że stosunek komórek podstawnych do komórek świetlnych u człowieka wynosi około 1:1, ale u myszy 6 wynosi 1:4. Mysie zrąb jest również inny u myszy w porównaniu z ludźmi – ludzie mają bardziej rozbudowane mięśnie gładkie, podczas gdy warstwa mięśniowa jest znacznie cieńsza u mysiej prostaty. Właściwa identyfikacja, sekcja i postępowanie z prostatą myszy są niezbędne do badań nad prostatą u myszy.
Poziom hormonów drastycznie wpływa na rozwój i homeostazę gruczołu krokowego zarówno u ludzi, jak i u myszy. Podczas gdy estrogen wydaje się odgrywać rolę w rozwoju prostaty 7, najważniejszym hormonem w prostacie jest testosteron. Testosteron jest niezbędny do rozwoju i utrzymania gruczołów. Po fizycznej lub chemicznej kastracji około 90% komórek świetlnych w dorosłej prostacie ulega apoptozie, a gruczoł kurczy się. Jeśli testosteron zostanie ponownie wprowadzony do organizmu w warunkach kastracji, prostata jest w stanie zregenerować się do pełnej wydajności. Testosteron wydaje się również napędzać raka prostaty, dlatego terapia deprywacji androgenów jest powszechnie stosowaną strategią terapeutyczną. Jednak wiele nowotworów prostaty staje się opornych na niedobór androgenów. Ponadto mężczyźni poddawani terapii deprywacji androgenów w leczeniu raka prostaty przechodzą cykle stanów kastrowanych i regeneracyjnych. U myszy kastracja chirurgiczna, wraz z hormonalną regeneracją prostaty poprzez ponowne wprowadzenie testosteronu, jest ważnym narzędziem do badania odporności na kastrację i wpływu cyklu testosteronu na prostatę.
W tym artykule omówimy i zademonstrujemy właściwe techniki, za pomocą których można zlokalizować i przeprowadzić mikrosekcję prostaty myszy, a także chirurgicznie wykastrować mysz.

<table><tbody><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Roboz Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Należy umieścić na suchym lodzie do zamrożenia i przechowywać w temperaturze -80 & stopni; C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Johns Hopkins</td><td></td><td>Dostępne również u sprzedawców online</td></tr><tr><td>Długopis do kauteryzacji</td><td>Medline</td><td>ESCT002</td><td></td></tr><tr><td>Szew jedwabny</td><td>AD Chirurgiczne</td><td>klipsy do ran chirurgicznych M-S330R19</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roboz</td><td>RS-9265</td><td></td></tr></tbody></table>

mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna

Murine Prostate Micro-dissection and Surgical Castration

Modele myszy są szeroko wykorzystywane do badania raka prostaty i innych chorób. Mysz jest doskonałym modelem do badania prostaty i była używana jako substytut dla odkryć w rozwoju i chorobie prostaty u ludzi. Mikrorozwarstwienie prostaty umożliwia spójne badanie anatomii prostaty, histologii i cech komórkowych specyficznych dla płata prostaty przy braku zanieczyszczenia innych tkanek. Testosteron wpływa na rozwój i choroby prostaty. Terapia deprywacji androgenów jest powszechnym sposobem leczenia pacjentów z rakiem prostaty, ale wiele guzów prostaty staje się opornych na kastrację. Chirurgiczna kastracja modeli mysich pozwala na badanie odporności na kastrację i innych aspektów biologii hormonalnej prostaty. Procedura ta może być połączona z ponownym wprowadzeniem testosteronu lub hormonalną regeneracją prostaty, co jest potężną metodą badania linii komórek macierzystych w prostacie. Mikrorozwarstwienie prostaty i kastracja chirurgiczna otwierają wiele możliwości solidnych i spójnych badań nad rozwojem i chorobami prostaty. W manuskrypcie opisano protokoły mikrorozwarstwienia gruczołu krokowego i kastracji chirurgicznej u myszy laboratoryjnej.

Wszystkie sześć płatów prostaty zostało usunięte od myszy za pomocą mikrosekcji prostaty (Rycina 1). Pełny układ moczowo-płciowy (UGT) składa się ze wszystkich płatów prostaty, pęcherza moczowego, pęcherzyków nasiennych oraz cewki moczowej (Rycina 1a). Przewód nasienny przyczepia się do cewki moczowej, ale nie jest on niezbędny do przeprowadzenia mikrosekcji prostaty, dlatego można go oddzielić przed usunięciem UGT poprzez przecięcie cewki moczowej (<stro...

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikropreparacji prostaty i chirurgicznej kastracji u myszy laboratoryjnej. Przedstawiamy również reprezentatywne wyniki uzyskane przez te protokoły. Na koniec omawiamy zalety i wykorzystanie tych protokołów.

Mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna

Mouse models are used extensively to study prostate cancer and other diseases. The mouse is an excellent model with which to study the prostate and has ...

Ogólnym celem tych procedur jest umożliwienie badania prostaty, a także zmiennych warunków hormonalnych u myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie raka prostaty, takie jak wpływ deprywacji hormonalnej na kancerogenezę prostaty. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania efektów różnych procesów patologicznych i zmian hormonalnych w poszczególnych gruczołach prostaty.Zacznij od przytwierdzenia myszy do deski sekcyjnej w pozycji grzbietowej, przebijając szpilkami poduszki stóp każdej łapy, a następnie spryskaj brzuch 70% ethanolem. Następnie, trzymając pęsetą skórę w dolnej części brzucha, za pomocą nożyczek przetnij skórę i otrzewną około jednego centymetra przed otworem prącia. Kontynuuj nacinanie skóry i otrzewnej od dolnej części brzucha wzdłuż obu stron brzucha aż do klatki piersiowej, odsłaniając jamę otrzewną.Po zlokalizowaniu pęcherza moczowego i dróg moczowo-płciowych (UGT), delikatnie odsuń tkankę tłuszczową oraz inne organy na bok, aby odsłonić tkanki układu moczowego. Następnie za pomocą pęsety chwyć przewód nasienny u jego podstawy w pobliżu cewki moczowej i przerwij naczynie. Po usunięciu drugiego przewodu, ostrożnie chwyć i unieś pęcherz moczowy pęsetą, jednocześnie przecinając nożyczkami cewkę moczową poniżej brzusznej części prostaty i około jednego centymetra poniżej podstawy pęcherza.Przenieś pobrany UGT do szalki Petriego o średnicy od 60 do 100 mm zawierającej około 5 do 10 ml PBS i umieść szalkę pod mikroskopem sekcyjnym. Następnie weź do każdej ręki po jednej parze precyzyjnych pęset, trzymając narzędzia jak ołówki, i oprzyj przedramiona o blat stołu po obu stronach mikroskopu, aby zachować stabilność. Używając pęset, ustaw UGT tak, aby pęcherz był skierowany ku górze, cewka moczowa w dół, a pęcherzyki nasienne znajdowały się po obu stronach pęcherza.Chwytając cewkę moczową jedną pęsetą, należy drugą pęsetą ostrożnie oddzielić tkankę tłuszczową, nie usuwając żadnej tkanki prostaty. Po usunięciu całego tłuszczu należy przerwać tkankę łączną pomiędzy dwoma płatami brzusznymi prostaty, aby je rozdzielić. Następnie, trzymając jeden z płatów brzusznych jedną pęsetą w pobliżu wierzchołka, należy chwycić podstawę płata jak najbliżej cewki moczowej.Teraz przesuń drugą parę pęsety, aby ustabilizować cewkę moczową, jednocześnie odciągając płat od naczynia pewnym, płynnym ruchem. Upewnij się, że do cewki moczowej nie przylega już żadna tkanka prostaty. Następnie umieść płat w odpowiednim medium, zgodnie z kolejnym krokiem eksperymentu.Po wyizolowaniu drugiego płata brzusznego w ten sam sposób, należy użyć pęsety, aby delikatnie odsunąć jeden z płatów przednich od pęcherzyka nasiennego, uważając, by nie przebić pęcherzyka nasiennego. Następnie, gdy płat zostanie oddzielony od pęcherzyka nasiennego, należy go usunąć w ten sam sposób, jak przed chwilą pokazano dla płata brzusznego. Po wyizolowaniu drugiego płata przedniego, należy obrócić pozostałą UGT tak, aby widoczna była prostata grzbietowa, a następnie za pomocą pęsety rozerwać tkankę łączną między dwoma grzbietowymi płatami bocznymi oraz między płatami a tylnym regionem pęcherzyków nasiennych.Następnie usuń poszczególne płaty grzbietowo-boczne, zgodnie z przeprowadzoną przed chwilą demonstracją. Aby przeprowadzić kastrację, zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy w pozycji grzbietowej na czystej, sterylnej powierzchni i potwierdź odpowiedni poziom sedacji za pomocą testu uciśnięcia palca. Jeśli mysz nie reaguje, użyj golarki elektrycznej do ogolenia obszaru operacyjnego i wysterylizuj brzuch.Następnie za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie pionowe o długości 1 cm wzdłuż linii środkowej skóry dolnej części brzucha, około 1,5 cm przed prąciem, a następnie wykonaj mniejsze nacięcie przez otrzewną, uważając, aby nie przeciąć żadnych narządów. Używając sterylnej pęsety, delikatnie unieś przecięty brzeg otrzewnej, aby uwidocznić jamę otrzewną, i użyj drugiej sterylnej pęsety, aby wyciągnąć jedną z poduszek tłuszczowych jąder, aż do momentu pojawienia się jąder. Następnie za pomocą koagulatora powoli przetnij poduszkę tłuszczową, trzymając jądro, aż do przecięcia tętnicy jajnika.Jeśli tętnica zostanie przecięta zbyt szybko, naczynie może krwawić zbyt mocno, co będzie wymagało eutanazji myszy. Zalecam podgrzewanie penetratora koagulacyjnego w krótkich odstępach czasu, aby nie rozgrzał się on nadmiernie, a następnie powolne przesuwanie instrumentu przez tętnicę, tak aby zwierzę nie wykrwawiło się. Po przecięciu tkanki tłuszczowej i tętnicy, należy usunąć jądro oraz tkankę tłuszczową, a następnie powtórzyć kastrację dla drugiego jądra.Po usunięciu drugiego jądra zamknij otrzewną za pomocą sterylnych jedwabnych szwów, a skórę zaciśnij chirurgicznymi zszywkami do ran. Następnie podaj leki przeciwbólowe w celu opanowania bólu i umieść mysz w czystej klatce, na podgrzewaczu do klatek, na 5 do 10 minut pod nadzorem, aż do pełnego wybudzenia. Kompletny układ moczowo-płciowy składa się z wszystkich sześciu płatów prostaty, pęcherza moczowego, pęcherzyków nasiennych i cewki moczowej.Przewód nasienny przylega do cewki moczowej, jednak nie jest on niezbędny do mikrodysekcji prostaty, w związku z czym można go oddzielić przed usunięciem układu moczowo-płciowego (UGT). Układ moczowo-płciowy pozostanie nienaruszony po jego wyjęciu z jamy brzusznej; jest on pokryty tkanką tłuszczową, którą należy usunąć, aby uzyskać dostęp do płatów prostaty. W tym reprezentatywnym eksperymencie po kastracji przeprowadzono dwa cykle regeneracji hormonalnej, a poziom testosteronu w surowicy monitorowano za pomocą testu ELISA.Zgodnie z oczekiwaniami, w warunkach kastracji poziom testosteronu niemal całkowicie zanikł. W obecności tamoksyfenu, selektywnego modulatora receptorów estrogenowych, nie zaobserwowano istotnej różnicy w porównaniu do stanu hormonalnej normy. Jednak po kastracji ponowne wprowadzenie testosteronu spowodowało gwałtowny wzrost jego poziomu w surowicy.Po mikrodysekcji płaty prostaty u kastrowanych myszy są znacznie zmniejszone, natomiast płaty zwierząt traktowanych testosteronem powracają do swojej pierwotnej wielkości. Ponadto barwienie hematoksyliną i eozyną tkanki przedniej części prostaty w warunkach normalnych, po kastracji oraz po regeneracji wykazuje gwałtowny spadek intensywnego wzrostu tkanki w przekrojach pobranych od zwierząt kastrowanych. Po opanowaniu tej techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć pięć minut na jedną mysz.Podczas przeprowadzania kastracji ważne jest zachowanie pełnej sterylności oraz zapewnienie odpowiedniego kontroli nad bólem odczuwanym przez mysz. Po kastracji można zastosować inne metody, takie jak ponowne wprowadzenie androgenów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu testosteronu na guzy prostaty. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie raka prostaty do eksploracji kancerogenezy, rozwoju oraz oporności na kastrację u myszy.

murine-prostate-micro-dissection-and-surgical-castration

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie opisujemy procedurę sekcji układu moczowo-płciowego lub UGS od męskiego modelu myszy. Ten UGS jest dalej analizowany ex vivo w celu wyizolowania gruczołu krokowego i zbadania jego roli w rozwoju raka prostaty.

Ekstrakcja prostaty z układu moczowo-płciowego myszy: technika oddzielania gruczołu krokowego od innych narządów moczowych i płciowych u samców myszy

W tym filmie pokazujemy procedurę podawania komórek raka prostaty do modelu mysiego do wstrzykiwania dogruczołowo prostaty. Ortotopowe modele myszy mogą być wykorzystywane do badania pochodzenia choroby i odpowiedzi na terapie lecznicze w nieinwazyjnym i klinicznie istotnym środowisku.

Wstrzyknięcie komórek rakowych do gruczołu krokowego: technika dostarczania komórek rakowych w celu ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty

Ten film opisuje metodę edycji określonych genów w komórkach gruczołu krokowego za pomocą systemu dostarczania opartego na adenowirusie. Podejście to pozwala na ortotopową i miejscową zmianę ekspresji genów przy użyciu technologii CRISPR do opracowania nowych mysich modeli raka prostaty.

Modelowanie raka prostaty w genetycznie modyfikowanych modelach mysich: technika zlokalizowanej edycji genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach przedniego płata prostaty myszy

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Rak prostaty jest drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem w Stanach Zjednoczonych. Ortotopowy model raka stanowi użyteczne podejście do zrozumienia biologii raka prostaty i oceny skuteczności schematów terapeutycznych. Protokół ten opisuje szczegółowe kroki niezbędne do ustalenia ortotopowego modelu myszy raka prostaty.

Przedkliniczny ortotopowy mysi model ludzkiego raka prostaty

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie domięśniowego wstrzykiwania komórek raka prostaty do środka prostaty, z późniejszą kastracją. Ortotopowe modele przedkliniczne androgenozależnego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego mają kluczowe znaczenie dla badania choroby w kontekście klinicznie istotnego mikrośrodowiska guza i immunokompetentnego gospodarza.

Bioluminescencyjny i fluorescencyjny, ortotopowy, syngeniczny mysi model androgenowego i opornego na kastrację raka gruczołu krokowego

Inżynierskie konstrukty nerkowe dostarczają rozwiązania na niedobór narządów i szkodliwe skutki dializy. W tym miejscu opisujemy protokół mikropreparacji mysich nerek w celu izolacji segmentów korowo-rdzeniowych. Segmenty te są wszczepiane do konstruktów komórkowych wolnych od rusztowań, tworząc organoidy nerkowe.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Ten protokół opisuje nowo ustaloną metodę dostarczania wirusa do mysiej prostaty. Wykorzystując technologię CRISPR/Cas9, nadekspresję genów lub dostarczanie rekombinazy Cre, technika ta umożliwia ortotopową zmianę ekspresji genów i wdraża nowy mysi model raka prostaty.

Dostarczanie wirusów z przewodników CRISPR do mysiej prostaty w celu zmiany genów

Genetycznie modyfikowane myszy są użytecznymi modelami do badania mechanizmów raka prostaty. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji i preparowania płatów prostaty z układu moczowo-płciowego myszy, różnicowania ich na podstawie histologii oraz izolowania i hodowli pierwotnych komórek prostaty in vitro jako sferoid do dalszych analiz.

Identyfikacja, charakterystyka histologiczna i sekcja płatów prostaty myszy dla modeli hodowli sferoidalnych 3D in vitro

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Ten manuskrypt opisuje konsekwentny sposób szybkiego przeprowadzania przetrwania orchiektomii i jajników.

Mysia orchidektomia i owariektomia w celu zmniejszenia produkcji hormonów płciowych

Poznaj mikropreparację prostaty i kastrację chirurgiczną u myszy w celu badania wpływu hormonów na karcynogenezę prostaty. Ta metoda umożliwia analizę poszczególnych gruczołów prostaty.

Mysia mikropreparacja prostaty i kastracja chirurgiczna

Przeglądaj więcej filmów