Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami
30 maja 2016
Ten artykuł zawiera szczegółowy przewodnik po montażu i obsłudze mikroskopu z oświetleniem strukturalnym działającym z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF-SIM) do obrazowania dynamicznych procesów biologicznych z optyczną superrozdzielczością w wielu kolorach.
Ogólnym celem tego protokołu jest skonstruowanie i wyrównanie strukturalnego mikroskopu oświetleniowego odpowiedniego do szybkiego obrazowania na żywo komórek w super rozdzielczości, zdolnego do pracy w trybach TIRF i sekcji optycznej z wieloma kolorami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, na które obecnie nie można odpowiedzieć przy użyciu standardowej mikroskopii TIRF z ograniczoną dyfrakcją. Główną zaletą tej techniki jest jej szybka rozdzielczość czasowa w porównaniu z innymi technikami mikroskopii superrozdzielczej, co sprawia, że dobrze nadaje się do obrazowania dynamicznych procesów w żywych komórkach.
Chociaż protokół ten opisuje etapy budowy mikroskopu TIRF-SIM, konfiguracja jest elastyczna i łatwa do modyfikacji w celu wdrożenia modalności obrazowania, takich jak 3D-SIM, wieloogniskowa karta SIM i nieliniowa karta SIM. Aby ułożyć i wyrównać ścieżkę wzbudzenia dla strukturalnego mikroskopu oświetleniowego, zacznij od zaznaczenia pozycji elementów na stole optycznym, jak wskazano tutaj. Po włożeniu pierwszego zwierciadła dichroicznego, DM4, do wieżyczki sześcianu filtra ramy mikroskopu, włóż drugie zwierciadło dichroiczne, DM3, do jednocalowego kwadratowego mocowania zwierciadła kinematycznego i ustaw je o jedną ogniskową od soczewki kondensatora, L5. Następnie, aby dokładnie określić dostęp optyczny dla systemu, wyjmij soczewkę obiektywu, OB, z głowicy rewolwerowej i zamiast tego wkręć narzędzie do ustawiania.
Następnie użyj zwierciadła dichroicznego DM3 i tymczasowego zwierciadła wyrównującego umieszczonego w przybliżonym ostatecznym położeniu SLM, aby skierować skolimowaną wiązkę odniesienia od lasera pierwszego przez środek otworów w dwóch tarczach wyrównujących. Używając trzech luster i lustra dichroicznego DM2, jak pokazano tutaj, skieruj wiązkę z lasera pierwszego na tymczasowe lustro. Po wyznaczeniu zgrubnej osi optycznej wyjmij narzędzie do wyrównywania.
Następnie włóż tęczówkę do ścieżki wiązki, zanim wejdzie ona do korpusu mikroskopu i wyśrodkuj ją na wiązce. Przymocuj kawałek białej karty z małym otworem wyśrodkowanym na przysłony, a następnie ponownie włóż soczewkę obiektywu. Następnie dokonaj iteracyjnych regulacji kątowych lusterek DM3 i w pozycji SLM, aby wyśrodkować odbicie wsteczne na karcie z nadchodzącą wiązką.
Następnie tymczasowo zdejmij soczewkę obiektywu i zaznacz plamkę lasera na suficie, aby utworzyć pozycję odniesienia. Włóż soczewkę tubusu, L5, mniej więcej o jedną ogniskową od obiektywu, montując ją na liniowym stoliku translacyjnym ustawionym tak, aby przesuwał się wzdłuż kierunku wiązki odniesienia. Dostosuj położenie i kąt soczewki tubusu tak, aby wiązka wychodząca z obiektywu była skolimowana i uderzała w punkt odniesienia na suficie.
Sprawdź, czy obiektyw jest prostopadły do wiązki, ponownie sprawdzając odbicie wsteczne za pomocą przysłony i białej karty. Następnie zdejmij soczewkę obiektywu i włóż drugą soczewkę teleskopu przekaźnikowego, L4. Użyj stolika translacji liniowej, aby dostosować położenie i kąt tego obiektywu, aby utrzymać kolimację i upewnić się, że wiązka referencyjna nadal uderza w zaznaczone miejsce na suficie. Wymień soczewkę obiektywu i włóż pierwszą soczewkę teleskopu, L3. Dostosuj położenie i kąt tego obiektywu, aby zapewnić kolimację i brak ugięcia, jak opisano wcześniej.
Po zamontowaniu układu SLM zgodnie z protokołem tekstowym, przy wyrównanych soczewkach, włóż SLM w miejsce lustra. Dostosuj położenie SLM tak, aby wiązka referencyjna znajdowała się w środku układu SLM i dostosuj kąt tak, aby wiązka przechodziła przez dwie soczewki przekaźnika. Następnie sprawdź, czy belka referencyjna jest nadal wyśrodkowana w zaznaczonym miejscu.
Zamontuj ciekłokrystaliczny zwalniacz zmienny (LCVR) z jego szybką osią pod kątem 45 stopni do padającej polaryzacji. Następnie po zakończeniu ustawiania rotatora polaryzacji zgodnie z protokołem tekstowym, wykorzystując światło przepuszczane przez lornetki, skup się na siatce i ustaw soczewkę obiektywu w tej pozycji. Następnie przygotuj monowarstwę koralików fluorescencyjnych, rozprowadzając kroplę wielokolorowych koralików o wielkości 100 nanometrów na szkle nakrywkowym o numerze 1,5.
Pozostaw koraliki do wyschnięcia, aby zaadsorbować je do szkła przed ponownym zanurzeniem w wodzie. Za pomocą olejku immersyjnego umieść próbkę koralików na obiektywie. Dokładnie dostosuj położenie aparatu, aby warstwa koralików fluorescencyjnych była ostra.
Po wygenerowaniu binarnych wzorców siatki SIM jako plików bitmapowych i przesłaniu ich do SLM zgodnie z protokołem tekstowym, załaduj oprogramowanie sterujące SLM i kliknij Połącz. W zakładce Repertuar kliknij przycisk Załaduj", aby otworzyć plik z repertuarem i sprawdź liczbę uruchomionych zamówień zawartych w pliku. Kliknij Wyślij na tablicę", aby przesłać plik z repertuarem do SLM.
Następnie wybierz zakładkę "Status" i wprowadź numer uruchomionego zamówienia. Kliknij Wybierz", aby zmienić kolejność jazdy na kratę wyrównującą. Włóż maskę przestrzenną lub SM zamontowaną na stoliku XY do ścieżki wiązki w pozycji ogniskowej L3 i przesuń jej położenie względem osi optycznej tak, aby przekazywane były tylko pożądane pierwsze zamówienia.
Bezpośrednio za filtrem przestrzennym widoczne będą tylko dwie okrągłe belki. Sprawdź obraz warstwy koralików fluorescencyjnych w aparacie. Jeśli dwie okrągłe wiązki nie nakładają się na siebie, jak pokazano tutaj, zmień położenie płaszczyzny próbki, iteracyjnie dostosowując soczewkę obiektywu i pozycję kamery.
Po dostrojeniu ostrości i ustawieniu płaszczyzny próbki zgodnie z protokołem tekstowym, potwierdź oświetlenie TIRF, obrazując na przykład roztwór 10-mikromolowego barwnika rodaminy 6G poprzez ustawienie ostrości barwnika. Jeśli dwie wiązki padną pod odpowiednim kątem TIRF, pojedyncze cząsteczki będą widoczne bez wysokiego tła, a krawędzie okrągłej apertury będą ostre. Precyzyjna regulacja położenia belek może być dokonana poprzez regulację lustra dichroicznego DM3.
Aby zsynchronizować i skalibrować system, umieść próbkę jednowarstwową koralików na obiektywie i ustaw ostrość. Użyj oprogramowania sterującego SLM, aby zaprogramować SLM tak, aby wyświetlał każdy z trzech obrazów przesunięcia fazowego po kolei dla pierwszej orientacji wzoru. Następnie przełącz się na czwartą kolejność biegową z przykładowego repertuaru.
W oprogramowaniu do akwizycji skonfiguruj kamerę na globalny okres ekspozycji, wybierając opcję Advanced Camera Properties (Zaawansowane właściwości kamery) i ustawiając Output Trigger Kind (Rodzaj wyzwalacza wyjściowego) 1" na wartość dodatnią i Output Trigger Kind (Rodzaj wyzwalacza wyjściowego) 2" na wartość ujemną. W okienku sekwencji w obszarze Scan Type (Typ skanowania) wybierz opcję Hard Disk Record (Rekord dysku twardego) i ustaw liczbę klatek na trzy. Następnie kliknij Start"aby uzyskać trzy klatki.
Wzór SLM będzie się zmieniał przy każdej ekspozycji. Po skalibrowaniu systemu zgodnie z protokołem tekstowym, w oprogramowaniu sterującym SLM przełącz kolejność pracy SLM na pełną serię dziewięciu binarnych obrazów siatki wymaganych dla TIRF-SIM. Jest to kolejność zerowa w przykładowym repertuarze.
Po uzyskaniu dziewięciu obrazów próbki koralików, w okienku sekwencji oprogramowania aparatu wybierz Zapis dysku twardego"jako typ skanowania i zmień liczbę klatek na dziewięć. Następnie kliknij Start"aby uzyskać obrazy. Na koniec w obszarze Zapisz buforowane obrazy wybierz TIFF jako typ obrazu i kliknij przycisk OK. Zrekonstruuj obraz w super rozdzielczości zgodnie z protokołem tekstowym.
Pokazane tutaj wielokolorowe koraliki fluorescencyjne o średnicy 100 nanometrów zostały zobrazowane w celu porównania standardowego TIRF z TIRF-SIM. TIRF-SIM miał wyraźnie wyższą rozdzielczość boczną w porównaniu do TIRF. Szacowana rozdzielczość mikroskopu wynosi 90 nanometrów i 120 nanometrów odpowiednio dla 488 i 640 nanometrów TIRF-SIM.
Odpowiada to dwukrotnej poprawie rozdzielczości poprzecznej dla obu długości fal w porównaniu z teoretycznym przypadkiem ograniczonym dyfrakcją. Jak widać tutaj, znakowane fluorescencyjnie fibryle amyloidowe zostały utworzone in vitro, a także wykorzystane jako próbka testowa w celu wykazania podwójnej rozdzielczości. Struktury subkomórkowe o wysokim kontraście, takie jak mikrotubule znakowane emGFP lub LifeAct-GFP, są idealne do obrazowania TIRF-SIM i dają obrazy o wysokim kontraście i super rozdzielczości.
Obrazowanie TIRF-SIM z wykorzystaniem zademonstrowanej konfiguracji umożliwia obserwację subpopulacji mikrotubul zlokalizowanych w pobliżu kory podstawnokomórkowej, a polimeryzację i depolimeryzację mikrotubul można zaobserwować w czasie. Próbki o niskim kontraście bez dyskretnych struktur nie mają informacji o wysokiej rozdzielczości, z wyjątkiem krawędzi błony plazmatycznej, a zatem są nieoptymalne do obrazowania TIRF-SIM. Wreszcie, wysoki kontrast modulacyjny jest niezbędny do udanego obrazowania karty SIM.
Jak pokazano tutaj, transformacja Fouriera zrekonstruowanego obrazu umożliwia wizualizację funkcji transferu optycznego SIM. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu około tygodnia, jeśli wszystkie niezbędne części zostały zdobyte. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy zdawać sobie sprawę z najważniejszych kwestii związanych z pomyślnym wdrożeniem TIRF-SIM.
Po pierwsze, niezbędne jest precyzyjne wyrównanie belek. Może to być trudne, ponieważ muszą one znajdować się na krawędziach przysłony obiektywu. Po drugie, bardzo ważne jest, aby stan polaryzacji światła był współbieżny ze wzorem.
Bez tego kontrast wzoru próbki będzie niski, a późniejsza budowa obrazu będzie niemożliwa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć najważniejsze etapy budowy i ustawiania mikroskopu TIRF-SIM opartego na SLM. Nie zapominaj, że praca z laserami klasy 3B może być bardzo niebezpieczna.
Moc lasera musi być utrzymywana na bezpiecznym dla oczu poziomie podczas wykonywania procesu ustawiania z założonym obiektywem TIRF.
Przegląd
Niniejszy artykuł stanowi szczegółowy przewodnik po konstrukcji i kalibracji mikroskopu z oświetleniem strukturalnym do szybkiego obrazowania superrozdzielczego żywych komórek z wykorzystaniem techniki TIRF-SIM. Metoda ta jest korzystna przy obrazowaniu dynamicznych procesów biologicznych w wielu kolorach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
- Obrazowanie o superrozdzielczości
Wstęp
- Standardowa mikroskopia TIRF posiada ograniczenia w rozdzielczości obrazowania procesów dynamicznych.
- Techniki superrozdzielczości zwiększają możliwości obrazowania.
- Mikroskopia z ustrukturyzowanym oświetleniem (SIM) zapewnia szybszą rozdzielczość czasową.
- Niniejszy protokół umożliwia elastyczne modyfikacje konfiguracji mikroskopu.
Cel badania
- Budowa mikroskopu TIRF-SIM do zaawansowanego obrazowania.
- Umożliwienie badania procesów biologicznych wymagających wysokiej rozdzielczości czasowej.
- Zapewnienie szczegółowego protokołu w celu replikacji układu przez innych badaczy.
Zastosowane metody
- Ustawienie komponentów optycznych, w tym luster dichroicznych i soczewek.
- Zastosowanie ciekłokrystalicznego zmiennego retardera do kontroli polaryzacji.
- Przygotowanie próbek kulek fluorescencyjnych do kalibracji.
- Wdrożenie oprogramowania sterującego SLM do generowania wzorów.
Główne wyniki
- Pomyślne wyrównanie mikroskopu TIRF-SIM.
- Demonstracja możliwości obrazowania z wykorzystaniem kulek fluorescencyjnych.
- Weryfikacja warunków oświetlenia TIRF.
- Ustanowienie protokołu dla przyszłych badań obrazowych.
Wnioski
- Układ TIRF-SIM umożliwia szybkie obrazowanie procesów dynamicznych.
- Metoda ta pozwala na rozwiązanie problemów w biologii komórki, które wcześniej były nieosiągalne.
- Elastyczność układu umożliwia zastosowanie różnych trybów obrazowania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie, wielokolorowe obrazowanie w superrozdzielczości odpowiada na potrzebę wizualizacji procesów dynamicznych w testach na żywych komórkach, umożliwiając mechanistyczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki subkomórkowej. TIRF-SIM zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów dzięki rozdzielczości nanoskalowych oddziaływań białkowych i zdarzeń transportu z wiernością czasową, co wspiera decyzje typu go/no-go we wczesnej fazie odkrywania leków. Możliwość ta usprawnia opracowywanie testów do przesiewania fenotypowego, dostarczając ilościowych, rozdzielczych przestrzennie wyników, które zwiększają pewność co do wybranego celu i redukują liczbę wyników fałszywie dodatnich w procesie identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację lokalizacji i dynamiki białek z rozdzielczością 90-120 nm w żywych komórkach.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację polimeryzacji i depolimeryzacji mikrotubul w pobliżu kory bazalnej.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność w badaniach nad zaangażowaniem celu poprzez rozdzielenie subpopulacji mikrotubul i włókien amyloidowych przy dwukrotnie wyższej rozdzielczości bocznej w porównaniu z granicą dyfrakcyjną.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych etapów analizy poprzez kalibrację z wykorzystaniem monowarstw koralików fluorescencyjnych w celu ustanowienia punktów odniesienia dla rozdzielczości.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów dzięki zsynchronizowanemu generowaniu wzorów SLM, kontroli długości fali oraz wyzwalaniu kamery dla spójnego pozyskiwania klatek.
- Skalowalność: Umożliwienie ponownego wykorzystania platformy dla różnych długości fal wzbudzenia (488 nm, 640 nm) oraz różnych trybów obrazowania, w tym TIRF i trybów sekcjonowania optycznego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje odkrywcze struktur subkomórkowych (np. mikrotubul emGFP, LifeAct-GFP) z walidacją przedkliniczną dzięki obrazowaniu o wysokim kontraście i superrozdzielczości.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez wizualizację dynamicznych procesów w żywych komórkach, które są niewidoczne w standardowej mikroskopii TIRF, co wspomaga wybór celu terapeutycznego.
- System istotny dla przebiegu choroby: Wykazuje przydatność w modelach żywych komórek, wspierając dopasowanie biomarkerów dla procesów takich jak dynamika mikrotubul w neurodegeneracji lub nowotworach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta znajduje zastosowanie na etapie od wczesnego odkrywania do identyfikacji wiodących związków, gdzie rozdzielczość nanometryczna procesów dynamicznych dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celu oraz przygotowania testów do screeningu związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez obrazowanie dystrybucji i dynamiki białek w nanoskali w modelach żywych komórek.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki ilościowemu obrazowaniu z wysoką częstotliwością klatek (do 10 Hz) i możliwością wielokolorowego barwienia w celu wiarygodnej oceny związków.
- Analityka: Dostarcza wyników statystycznych za pomocą zrekonstruowanych obrazów o superrozdzielczości oraz walidacji funkcji przenoszenia optycznego opartej na transformacie Fouriera w celu porównania warunków.
- Badania translacyjne: Zapewniają ciągłość przedkliniczną poprzez obrazowanie struktur subkomórkowych istotnych dla przebiegu choroby z wysokim kontrastem i rozdzielczością.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Definiuje system jako wielokrotnie wykorzystywalny zasób dla wielu modalności obrazowania (TIRF-SIM, 3D-SIM, multifocal SIM) w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność predykcyjna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w obrazowaniu żywych komórek.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność dzięki zautomatyzowanej kontroli polaryzacji, struktury przestrzennej i synchronizacji długości fali.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa i zredukowane ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki wczesnej wizualizacji dynamiki celu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje o dalszym rozwoju oparte na bezpośredniej obserwacji zachowania celu terapeutycznego w kontekstach istotnych fizjologicznie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu wyrównania optycznego, bezpieczeństwa laserowego (klasa 3B) oraz generowania wzorów za pomocą SLM dla oświetlenia strukturalnego.
- Wymagane jest oprzyrządowanie do kontroli polaryzacji (zmienne opóźniacze ciekłokrystaliczne), wyzwalania kamery wysokiej prędkości oraz integracji laserów wielodługościowych.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w zakresie konfiguracji stołu optycznego, rozmieszczenia komponentów oraz protokołów kalibracji z wykorzystaniem monowarstw kulek fluorescencyjnych.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacyjne dla różnych typów próbek, ponieważ próbki o niskim kontraście nie dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości poza krawędziami błon.
- Ograniczenia praktyczne obejmują konieczność uzyskania wysokiego kontrastu modulacji dla skutecznego obrazowania SIM oraz precyzyjnego wyrównania wiązki w aperturach obiektywu.
