Name: Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Poznaj konstrukcję i ustawienie mikroskopu TIRF-SIM do szybkiego obrazowania superrozdzielczego żywych komórek w wielu kolorach. Ta metoda umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych z wysoką rozdzielczością czasową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Leverhulme Trust, Rady Badań Inżynieryjnych i Fizycznych [EP/H018301/1, EP/G037221/1]; Brytyjskie Badania nad chorobą Alzheimera [ARUK-EG2012A-1]; Wellcome Trust [089703/Z/09/Z] oraz Rada ds. Badań Medycznych [MR/K015850/1, MR/K02292X/1]. Dziękujemy E. Avezovowi i M. Lu za transfekcję odpowiednio komórek LifeAct-GFP i cytozol-GFP oraz W. Chenowi za przygotowanie hodowli HEK293. Dziękujemy również K. O'Holleranowi za pomoc w zaprojektowaniu mikroskopu oraz L. Shao i R. Heintzmannowi za przydatne dyskusje i sugestie.

<ol><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laterally+modulated+excitation+microscopy%3A+improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating%5BTitle%5D)+AND+%22BiOS+Eur%22%5BJournal%5D)">Laterally modulated excitation microscopy: improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> BiOS Eur. 3568, 185-196 (1999).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Shim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys. J. 101 (5), 1277-1284 (2011).</li>
<li>Liu, Z., Lavis, L. D., Betzig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Live-Cell+Dynamics+and+Structure+at+the+Single-Molecule+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level.</a> Mol. Cell. 58 (4), 644-659 (2015).</li>
<li>Westphal, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-Rate+Far-Field+Optical+Nanoscopy+Dissects+Synaptic+Vesicle+Movement%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Video-Rate Far-Field Optical Nanoscopy Dissects Synaptic Vesicle Movement.</a> Science. 320 (5873), 246-249 (2008).</li>
<li>Davies, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYK4+Promotes+Antiparallel+Microtubule+Bundling+by+Optimizing+MKLP1+Neck+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biol%22%5BJournal%5D)">CYK4 Promotes Antiparallel Microtubule Bundling by Optimizing MKLP1 Neck Conformation.</a> PLOS Biol. 13 (4), e1002121(2015).</li>
<li>Laine, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+herpes+simplex+virus+by+optical+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of herpes simplex virus by optical super-resolution imaging.</a> Nat. Commun. 6, 5980(2015).</li>
<li>Pinotsi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+heterogeneous+amyloid+fibril+growth+kinetics+via+two-color+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Direct observation of heterogeneous amyloid fibril growth kinetics via two-color super-resolution microscopy.</a> Nano Lett. 14 (1), 339-345 (2014).</li>
<li>Esbjörner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+amyloid+%CE%B2+Self-assembly+in+live+cells+provide+insights+into+differences+in+the+kinetics+of+A%CE%B2%281-40%29+and+A%CE%B2%281-42%29+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of amyloid β Self-assembly in live cells provide insights into differences in the kinetics of Aβ(1-40) and Aβ(1-42) aggregation.</a> Chem. Biol. 21 (6), 732-742 (2014).</li>
<li>Michel, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+monomeric+tau+protein+is+sufficient+to+initiate+the+spread+of+tau+protein+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extracellular monomeric tau protein is sufficient to initiate the spread of tau protein pathology.</a> J. Biol. Chem. 289 (2), 956-967 (2014).</li>
<li>Pinotsi, D., Kaminski Schierle, G. S., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Super-Resolution+Imaging+of+%CE%B2-Amyloid+Aggregation+In+Vitro+and+In+Vivo%3A+Method+and+Techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Syst.+Biol.+Alzheimer%27s+Dis.+SE+-+6%22%5BJournal%5D)">Optical Super-Resolution Imaging of β-Amyloid Aggregation In Vitro and In Vivo: Method and Techniques.</a> Syst. Biol. Alzheimer's Dis. SE - 6. 1303, 125-141 (2016).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Cragg, G. E., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+resolution+enhancement+with+standing+evanescent+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Lateral resolution enhancement with standing evanescent waves.</a> Opt. Lett. 25 (1), 46-48 (2000).</li>
<li>Chung, E., Kim, D., So, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+resolution+wide-field+optical+imaging%3A+objective-launched+standing-wave+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Extended resolution wide-field optical imaging: objective-launched standing-wave total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Opt. Lett. 31 (7), 945(2006).</li>
<li>Kner, P., Chhun, B. B., Griffis, E. R., Winoto, L., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+video+microscopy+of+live+cells+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution video microscopy of live cells by structured illumination.</a> Nat. Methods. 6 (5), 339-342 (2009).</li>
<li>Fiolka, R., Shao, L., Rego, E. H., Davidson, M. W., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+two-color+3D+imaging+of+live+cells+with+doubled+resolution+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Time-lapse two-color 3D imaging of live cells with doubled resolution using structured illumination.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (14), 5311-5315 (2012).</li>
<li>Brunstein, M., Wicker, K., Hérault, K., Heintzmann, R., Oheim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-field+dual-color+100-nm+super-resolution+imaging+reveals+organization+and+dynamics+of+mitochondrial+and+ER+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Full-field dual-color 100-nm super-resolution imaging reveals organization and dynamics of mitochondrial and ER networks.</a> Opt. Express. 21 (22), 26162-26173 (2013).</li>
<li>Förster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+structured+illumination+microscope+setup+with+high+acquisition+speed+by+using+a+spatial+light+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Simple structured illumination microscope setup with high acquisition speed by using a spatial light modulator.</a> Opt. Express. 22 (17), 20663(2014).</li>
<li>Lu-Walther, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fastSIM%3A+a+practical+implementation+of+fast+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">fastSIM: a practical implementation of fast structured illumination microscopy.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3, 014001(2015).</li>
<li>Shaw, M., Zajiczek, L., O'Holleran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+speed+structured+illumination+microscopy+in+optically+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High speed structured illumination microscopy in optically thick samples.</a> Methods. , (2015).</li>
<li>von Olshausen, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Total+internal+reflection+microscopy%3A+super-resolution+imaging+of+bacterial+dynamics+and+dark+field+imaging%22">Total internal reflection microscopy: super-resolution imaging of bacterial dynamics and dark field imaging</a>. , University of Freiburg. (2012).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Meadowlark Optics Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Polarization+Techniques+and+Devices%22">Basic Polarization Techniques and Devices</a>. , (2005).</li>
<li>O'Holleran, K., Shaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effects+on+contrast+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Polarization effects on contrast in structured illumination microscopy.</a> Opt. Lett. 37 (22), 4603(2012).</li>
<li>Brankner, S. Z., Hobson, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrankner%2C+SZ+%22Synchronization+and+Triggering+with+the+ORCA-Flash4.0+Scientific+CMOS+Camera%22">Synchronization and Triggering with the ORCA-Flash4.0 Scientific CMOS Camera</a>. , <a target="_blank" href="http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf">http://www.hamamatsu.com/resources/pdf/sys/SCAS0098E_synchronization.pdf</a> (2013).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li>
<li>Wicker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-iterative+determination+of+pattern+phase+in+structured+illumination+microscopy+using+auto-correlations+in+Fourier+space%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Non-iterative determination of pattern phase in structured illumination microscopy using auto-correlations in Fourier space.</a> Opt. Express. 21 (21), 24692(2013).</li>
<li>Boulanger, J., Pustelnik, N., Condat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-smooth+convex+optimization+for+an+efficient+reconstruction+in+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%222014+IEEE+11th+Int.+Symp.+Biomed.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Non-smooth convex optimization for an efficient reconstruction in structured illumination microscopy.</a> 2014 IEEE 11th Int. Symp. Biomed. Imaging. 3 (1), 995-998 (2014).</li>
<li>Ströhl, F., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+joint+Richardson-Lucy+deconvolution+algorithm+for+the+reconstruction+of+multifocal+structured+illumination+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl.+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">A joint Richardson-Lucy deconvolution algorithm for the reconstruction of multifocal structured illumination microscopy data.</a> Methods Appl. Fluoresc. 3 (1), 014002(2015).</li>
<li>Mudry, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+microscopy+using+unknown+speckle+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Photonics%22%5BJournal%5D)">Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns.</a> Nat. Photonics. 6 (5), 312-315 (2012).</li>
<li>Ayuk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structured+illumination+fluorescence+microscopy+with+distorted+excitations+using+a+filtered+blind-SIM+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Structured illumination fluorescence microscopy with distorted excitations using a filtered blind-SIM algorithm.</a> Opt. Lett. 38 (22), 4723(2013).</li>
<li>Ball, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+a+Toolbox+for+Successful+Super-resolution+Structured+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: a Toolbox for Successful Super-resolution Structured Illumination Microscopy.</a> Sci. Rep. 5, 15915(2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended-resolution+structured+illumination+imaging+of+endocytic+and+cytoskeletal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extended-resolution structured illumination imaging of endocytic and cytoskeletal dynamics.</a> Science. 349 (6251), (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+live%2C+multicellular+organisms+via+multifocal+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy.</a> Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Systemy TIRF-SIM budowane na zamówienie, takie jak układ opisany w niniejszym protokole, umożliwiają wielokolorowe obrazowanie w superrozdzielczości z wysoką prędkością w porównaniu z mikroskopami dostępnymi komercyjnie. Wrodzoną zaletą SIM jako techniki superrozdzielczej jest to, że rozdzielczość czasowa nie jest ograniczona fotofizyką fluoroforu, w przeciwieństwie do innych metod, takich jak mikroskopia lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM) czy metody skanowania punktowego, takie jak mikroskopia z ugaszaniem emisji stymulowanej (STED). W przeciwieństwie do tych technik, SIM nie wymaga fluoroforów fotoprzełączalnych lub podatnych na ugaszenie, dzięki czemu obrazowanie wielokolorowe jest proste w realizacji. Systemy niebędące TIRF-SIM, takie jak SIM z sekcjonowaniem optycznym oraz SIM multifokalny, w praktyce zazwyczaj osiągają poprawę rozdzielczości o 1,7 raza lub mniej, w przeciwieństwie do dwukrotnej poprawy opisanej w niniejszej pracy, a systemy komercyjne są często wolniejsze i mniej elastyczne niż układ przedstawiony w tym protokole.
Dwie główne trudności w implementacji tej techniki to po pierwsze konieczność precyzyjnego pozycjonowania sześciu wiązek SIM w strefie TIR tylnej apertury obiektywu, co wymaga żmudnej i czasochłonnej procedury wyrównania optycznego. Po drugie, aby uzyskać wysoki kontrast wzorca w próbce, niezbędna jest rotacja polaryzacji. W systemach 2D-SIM o niskiej aperturze numerycznej (NA) rotacji polaryzacji można uniknąć poprzez staranny dobór orientacji polaryzacji liniowej, jednak w przypadku TIRF-SIM25 jest to niemożliwe. Do szybkiego obrazowania wielokolorowego niezbędna jest elektrooptyczna kontrola polaryzacji, co zwiększa złożoność i koszt systemu.
Ograniczenia techniki
Metoda TIRF-SIM, podobnie jak konwencjonalna mikroskopia TIRF, jest z natury ograniczona do obserwacji struktur i procesów biologicznych zlokalizowanych w podstawowej błonie komórkowej, które mogą być oświetlone przez pole ewanescentne o głębokości penetracji 150-200 nm. Choć często wskazuje się, że SIM jest mniej fotodestrukcyjna dla komórek niż STED lub SMLM, dwukrotne zwiększenie rozdzielczości bocznej nadal zwiększa wymaganą liczbę fotonów co najmniej 4-krotnie5 w porównaniu z konwencjonalną mikroskopią TIRF. W przypadku obrazowania z wysoką częstotliwością klatek i krótkimi czasami ekspozycji, ten wzrost liczby fotonów wymusza zastosowanie większych intensywności oświetlenia. O ile do obrazowania SIM utrwalonych lub wolno poruszających się próbek można użyć dowolnego fluoroforu, o tyle do obrazowania żywych komórek zaleca się stosowanie białek fluorescencyjnych o wysokiej jasności lub syntetycznych barwników nowej generacji o zwiększonej fotostabilności.
Chociaż ta implementacja umożliwia obrazowanie w jednym kolorze z częstotliwością klatek SIM przekraczającą 20 Hz, obrazowanie wielokolorowe w prezentowanym systemie jest ograniczone czasem przełączania zmotoryzowanego koła filtrów emisyjnych. Ze względu na duży rozmiar matrycy kamery sCMOS, możliwe byłoby zastosowanie wielopasmowego filtru emisyjnego oraz optyki rozdzielającej obraz, co pozwoliłoby na jednoczesne obrazowanie z wykorzystaniem wielu długości fal bez utraty szybkości. Inną możliwością byłoby naprzemienne używanie różnych laserów wzbudzających i zastosowanie wielopasmowego filtru notch w celu odcięcia światła wzbudzenia. Zastosowanie binarnego ferroelektrycznego SLM w tej implementacji również nie jest optymalne. Sprawność dyfrakcyjna takiego SLM jest bardzo niska, przez co większość światła padającego znajduje się w odbiciu zerowego rzędu, które jest odfiltrowywane przez maskę przestrzenną. W przypadku zastosowań wymagających bardzo wysokiej częstotliwości klatek, szybkość obrazowania jest zatem ograniczona mocą wyjściową diod laserowych. SLM wprowadza również pewną eliptyczność polaryzacji dla długości fal oddalonych od projektowanej długości fali 550 nm, przy której piksele nie działają jako idealne płytki półfalowe. Chociaż można by to skompensować za pomocą dodatkowego LCVR, idealnym rozwiązaniem może być zastosowanie urządzenia cyfrowego mikrolusterek (DMD) jako generatora wzorów.
Możliwe modyfikacje
Przedstawiona tutaj konfiguracja jest elastyczna i łatwiejsza w modyfikacji niż instrumenty komercyjne, dzięki czemu można w niej zaimplementować inne modalności obrazowania, takie jak 3D-SIM, szybki 2D-SIM, wieloogniskowy SIM (MSIM) oraz nieliniowy SIM (NL-SIM)21,34,35.
2D-SIM może być odpowiednio dopasowany do obrazowania stosunkowo płaskich, szybko poruszających się struktur, takich jak obwodowy retikulum endoplazmatyczny. Obwodowe ER znajduje się głębiej w komórce, niż pozwala na oświetlenie polem ewanescentnym TIRF, lecz ze względu na swoją płaską strukturę może być obrazowane przy użyciu standardowego 2D-SIM z pomijalnym tłem poza ogniskową. Dodatkowo, zastosowanie ulepszonych algorytmów rekonstrukcji sekcji optycznej w celu stłumienia światła poza ogniskową rozszerza zastosowanie 2D-SIM na próbki optycznie grube, choć w przypadkach, w których dwukrotne zwiększenie rozdzielczości osiowej nie jest wymagane21.
W technice MSIM próbka jest oświetlana rzadką siecią ognisk wzbudzenia36. Tryb ten można zaimplementować, po prostu usuwając maskę przestrzenną (SM) i zastępując ją polaryzatorem. SLM działa teraz jako modulator amplitudy. Binarne kratki SIM wyświetlane na SLM mogą zostać zastąpione dwuwymiarową siecią punktów, przy czym rozmiar punktów dobiera się tak, aby był równy rozmiarowi ognisk ograniczonych dyfrakcją w płaszczyźnie obrazu. Na Rysunku 7A na SLM wyświetlona jest sieć kwadratów o rozmiarze 4 x 4 piksele (wstawka), która po zredukowaniu na próbkę generuje ograniczone dyfrakcją ogniska o rozmiarach 150 x 150 nm, przy fizycznym rozmiarze piksela SLM wynoszącym 13,62 µm. Ogniska wzbudzenia można następnie przesuwać poprzez zmianę położenia wzoru sieci na SLM; czynność tę powtarza się wielokrotnie, aby oświetlić całe pole widzenia. Obrazy są pozyskiwane dla każdego przesuniętego położenia wzoru, a uzyskany stos jest poddawany postprocesingowi w celu uzyskania zrekonstruowanego obrazu o rozdzielczości zwiększonej nawet o czynnik <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq19.jpg" /> i zredukowanym świetle poza ogniskową w porównaniu do równoważnego obrazu szerokopolowego30. Tryb ten może być użyteczny do obrazowania grubych, gęstych próbek, do których standardowe SIM jest nieodpowiednie, na przykład struktur o niskim kontraście, takich jak barwione erytrocyty (Rysunek 7C), choć czas akwizycji jest wydłużony ze względu na dużą liczbę surowych klatek wymaganych dla jednego pola widzenia (w tym przypadku N = 168).
Ostatecznie układ można zmodyfikować, aby umożliwić stosowanie albo liniowej TIRF-SIM o wysokiej aperturze numerycznej (high-NA), albo nieliniowej SIM z wzorcowaną aktywacją (PA NL-SIM), zgodnie z niedawną prezentacją Li i wsp...., poprzez zastosowanie obiektywu o ultrawysokiej aperturze numerycznej (NA 1,7) lub dodanie lasera do fotoaktywacji o długości fali 405 nm oraz staranną optymalizację wzorów siatek SLM35.
Przyszłe zastosowania
SIM jest wciąż szybko rozwijaną techniką, która w przyszłości umożliwi wiele zastosowań w naukach o życiu. Zwiększenie szybkości, rozdzielczości i kontrastu tej metody oraz możliwość stosowania standardowych fluoroforów sprawiają, że w obrazowaniu biologicznym SIM ma szansę zastąpić konwencjonalne systemy mikroskopowe, takie jak platformy konfokalne i szerokopolowe. Komercyjne systemy SIM są już dziś dostępne i oferują wyjątkowe specyfikacje techniczne, jednak pozostają one poza zasięgiem finansowym wielu laboratoriów badawczych i, co kluczowe, są nieelastyczne w kwestii modyfikacji i rozwoju w celu wdrażania najnowszych osiągnięć badawczych w tej dziedzinie. Brakuje im również niezbędnej możliwości „dostosowania do konkretnego eksperymentu”, co często stanowi krytyczne wąskie gardło w przełomowych badaniach nad naukami o życiu. System opisany w niniejszej pracy będzie szczególnie odpowiedni do badania procesów dynamicznych w pobliżu powierzchni komórki, do badań in vitro rekonstytuowanych systemów dwuwarstwowych, do badania chemii powierzchni w naukach o materiałach i fizyce, np. materiałów 2D, a także do wielu innych zastosowań.

W ciągu ostatnich pięciu lat mikroskopia superrozdzielcza dojrzała i przeniosła się z wyspecjalizowanych laboratoriów optycznych do rąk biologów. Dostępne są komercyjne rozwiązania mikroskopowe dla trzech głównych wariantów osiągania optycznej superrozdzielczości: mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek (SMLM), mikroskopii z ugaszeniem emisji stymulowanej (STED) oraz mikroskopii z oświetleniem strukturalnym (SIM)1,2. Techniki SMLM, takie jak mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanych cząsteczek (PALM) i stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (STORM), stały się najpopularniejszymi metodami, głównie ze względu na prostotę układu optycznego i obietnicę wysokiej rozdzielczości przestrzennej, sięgającej nawet 20 nm. Jednak mikroskopia superrozdzielcza poprzez lokalizację pojedynczych cząsteczek wiąże się z immanentnym kompromisem: osiągalna rozdzielczość przestrzenna zależy od zgromadzenia wystarczającej liczby lokalizacji poszczególnych fluoroforów, co ogranicza rozdzielczość czasową. Obrazowanie procesów dynamicznych w żywych komórkach staje się zatem problematyczne, ponieważ należy odpowiednio próbkować ruch badanej struktury, aby zapobiec artefaktom ruchowym, jednocześnie rejestrując w tym czasie wystarczającą liczbę zdarzeń lokalizacji, aby zrekonstruować obraz. Aby spełnić te wymagania, w demonstracjach SMLM na żywych komórkach uzyskano niezbędny wzrost szybkości przełączania fotochromowego fluoroforów poprzez znaczne zwiększenie mocy wzbudzenia, co z kolei prowadzi do fototoksyczności i stresu oksydacyjnego, ograniczając tym samym czas przeżycia próbek i ich znaczenie biologiczne3.
Wyraźną zaletą STED nad SIM i SMLM jest możliwość obrazowania z nadrozdzielczością w grubych próbkach; na przykład rozdzielczość boczna rzędu 60 nm została osiągnięta w organotypowych skrawkach mózgu na głębokościach do 120 µm4. Obrazowanie na tak dużych głębokościach przy użyciu implementacji SMLM lub SIM z jednym obiektywem jest niewykonalne, ale staje się możliwe dzięki mikroskopii arkuszowej światła pojedynczych cząsteczek lub mikroskopii arkuszowej światła sieciowego (lattice light sheet microscopy)5. Wykazano również możliwość stosowania STED z częstotliwością wideo i wykorzystano go do mapowania mobilności pęcherzyków synaptycznych, choć do tej pory ograniczało się to do obrazowania małych pól widzenia6.
W zastosowaniach w biologii komórki oraz w reakcjach molekularnego samoorganizowania7-12, które wymagają obrazowania z wysoką rozdzielczością czasową w wielu punktach czasowych, mikroskopia z oświetleniem strukturalnym (SIM) może być bardzo odpowiednia, ponieważ nie zależy ona od właściwości fotofizycznych konkretnej sondy fluorescencyjnej. Pomimo tej wrodzonej zalety SIM, do tej pory jej zastosowanie ograniczało się głównie do obrazowania utrwalonych komórek lub powolnych procesów. Wynika to z ograniczeń komercyjnie dostępnych systemów SIM: szybkość akwizycji klatek w tych instrumentach była ograniczona przez prędkość obrotową siatek używanych do generowania wymaganych sinusoidalnych wzorów oświetlenia, a także przez optykę utrzymującą polaryzację. Najnowsza generacja komercyjnych instrumentów SIM umożliwia szybkie obrazowanie, jednak ich cena jest zaporowa dla wszystkich poza centralnymi ośrodkami obrazowania.
Niniejszy protokół stanowi przewodnik po budowie elastycznego systemu SIM do obrazowania szybkich procesów w cienkich próbkach oraz w pobliżu powierzchni bazalnej żywych komórek. Wykorzystuje on fluorescencję całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do generowania wzoru oświetlenia, który wnika w próbkę na głębokość nie większą niż około 150 nm13, co znacząco redukuje sygnał tła poza ogniskiem. Idea połączenia SIM z TIRF jest niemal tak stara jak samo SIM14, lecz nie została zrealizowana eksperymentalnie przed 2006 rokiem15. Pierwsze obrazy in vivo uzyskane za pomocą TIRF-SIM zostały opisane w 2009 roku16, osiągając częstotliwość odświeżania klatek na poziomie 11 Hz w celu wizualizacji dynamiki tubuliny i kinezyny; przedstawiono również dwukolorowe systemy TIRF-SIM17,18. Niedawno zaprezentowano przewodnik po budowie i zastosowaniu jednobarwnego, dwuwiązkowego systemu SIM, charakteryzującego się częstotliwością odświeżania klatek do 18 Hz19,20.
Układ przedstawiony w niniejszej pracy umożliwia obrazowanie superrozdzielcze SIM z częstotliwością 20 Hz w trzech kolorach, z czego dwa mogą być wykorzystane w trybie TIRF-SIM. Cały system został zbudowany w oparciu o ramę mikroskopu odwróconego i wykorzystuje zmotoryzowany stół translacyjny xy ze sceną z sterowaną piezoelektrycznie. W celu generowania sinusoidalnych wzorów wzbudzenia wymaganych dla TIRF-SIM, zaprezentowany system wykorzystuje ferroelektryczny modulator światła przestrzennego (SLM). Na SLM wyświetlane są binarne wzory siatek, a powstałe rzędy dyfrakcyjne ±1 są filtrowane, przesyłane i ogniskowane w pierścieniu TIR obiektywu. Niezbędne przesunięcia fazowe i obroty siatek są realizowane poprzez zmianę wyświetlanego obrazu na SLM. Niniejszy protokół opisuje sposób budowy i wyrównania takiej ścieżki wzbudzenia, szczegółowo omawia wyrównanie ścieżki emisji oraz przedstawia próbki testowe służące do zapewnienia optymalnej kalibracji. Opisano w nim również problemy i wyzwania specyficzne dla szybkiego obrazowania TIRF-SIM w zakresie kontroli polaryzacji oraz synchronizacji komponentów.
Założenia i ograniczenia projektowe
Przed montażem systemu TIRF-SIM przedstawionego w niniejszym protokole należy rozważyć kilka ograniczeń projektowych, które determinują wybór komponentów optycznych. Wszystkie skróty dotyczące komponentów optycznych odnoszą się do Rysunku 1.
Przestrzenny modulator światła (SLM)
W tym układzie zastosowano binarny ferroelektryczny SLM, ponieważ umożliwia on przełączanie wzorów w czasie krótszym niż milisekunda. Można zastosować nematyczne SLM w skali szarości, lecz oferują one znacznie dłuższe czasy przełączania. Każdy piksel w stanie włączonym lub wyłączonym w binarnym SLM fazowym nadaje padającej płaskiej fali czołowej przesunięcie fazowe wynoszące odpowiednio π lub 0, zatem w przypadku wyświetlenia na SLM okresowego wzoru siatki, będzie on działał jako dyfrakcyjna siatka fazowa.
Całkowite wewnętrzne odbicie (TIR)
Aby uzyskać całkowite wewnętrzne odbicie (TIR) i wytworzyć pole ewanescentne, kąt padania wiązek wzbudzenia na granicy szkło-próbka musi być większy niż kąt krytyczny <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq1.jpg" />. Wyznacza to minimalny wymagany kąt padania, a tym samym maksymalny odstęp, czyli okres, wzoru oświetlenia ewanescentnego. Maksymalny kąt padania <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq2.jpg" /> (kąt akceptacji) jest ograniczony przez aperturę numeryczną (NA) obiektywu, którą można obliczyć z definicji <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq3.jpg" />. Określa to minimalny możliwy do uzyskania odstęp wzoru zgodnie z formułą Abbego <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq4.jpg" />, która wiąże NA i długość fali <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq5.jpg" /> z minimalnym odstępem wzoru <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq6.jpg" />. W praktyce obiektyw TIRF z imersją olejową o NA 1,49 zapewnia maksymalny kąt padania wynoszący około 79° i minimalny okres wzoru na próbce wynoszący 164 nm przy zastosowaniu długości fali wzbudzenia 488 nm. Te dwa kąty definiują pierścień w tylnej aperturze obiektywu, w obrębie którego instrument uzyskuje oświetlenie TIR (tj. pierścień TIR), a w którym dwie ogniska wzbudzenia muszą być dokładnie rozmieszczone i precyzyjnie obracane w celu wygenerowania każdego wzoru oświetlenia.
Rekonstrukcja obrazów TIRF-SIM wymaga pozyskania minimum trzech przesunięć fazowych na każdy obrót wzoru, dlatego okres wzoru SLM musi być podzielny przez 3 (patrz Rycina 1). Na przykład okres wynoszący 9 pikseli dla oświetlenia 488 nm oraz 12 pikseli dla oświetlenia 640 nm. Kompleksową dyskusję na temat projektowania wzorów SLM, w tym optymalizacji odstępów wzorów w skali subpikselowej z wykorzystaniem siatek ścinanych, przedstawiono w poprzednich pracach Kner et al.16 oraz Lu-Walther et al.20 Położenie dwóch ognisk wzbudzenia musi znajdować się wewnątrz pierścienia TIR dla wszystkich długości fal, jednak kąt dyfrakcji dla rzędów ±1 z SLM jest zależny od długości fali. W przypadku standardowego SIM obrazowanie wielokolorowe można osiągnąć poprzez optymalizację okresu siatki dla najdłuższej długości fali, akceptując spadek wydajności w kanałach o krótszych długościach fal. Jednak w przypadku TIRF-SIM optymalizacja dla jednej długości fali sprawia, że ogniska dla pozostałych długości fal nie znajdują się już wewnątrz pierścienia TIR. Na przykład zastosowanie okresu siatki wynoszącego 9 pikseli jest wystarczające do zapewnienia TIRF dla 488 nm, ponieważ ogniska znajdują się na poziomie 95% średnicy tylnej apertury i wewnątrz pierścienia TIR, ale dla 640 nm taki okres spowodowałby umieszczenie ognisk poza aperturą. Z tego powodu dla każdej długości fali wzbudzenia należy stosować różne odstępy wzorów pikselowych.
Ustawienie ścieżki wzbudzenia TIRF-SIM jest niezwykle wrażliwe na niewielkie zmiany pozycji lustra dichroicznego (DM4 na Rys.&#160;1) w korpusie mikroskopu, znacznie bardziej niż w konwencjonalnym SIM. Nie zaleca się stosowania obrotowej wieżyczki z kostkami filtrów; zamiast tego należy użyć pojedynczego, wielopasmowego lustra dichroicznego, które znajduje się w stałej pozycji i jest zaprojektowane specjalnie dla stosowanych długości fal wzbudzenia. Niezbędne jest stosowanie wyłącznie najwyższej jakości luster dichroicznych. Wymagają one grubych podłoży o grubości co najmniej 3 mm i są często określane przez producentów jako „imaging flat”. Wszystkie pozostałe podłoża prowadzą do niedopuszczalnej aberracji i degradacji obrazu w TIRF-SIM.
Kontrola polaryzacji
Aby uzyskać TIRF-SIM, niezbędne jest obracanie stanu polaryzacji światła wzbudzenia w synchronizacji ze wzorem oświetlenia w taki sposób, aby pozostawało ono spolaryzowane azymutalnie w płaszczyźnie źrenicy obiektywu względem osi optycznej (t.j. spolaryzowane s). Ustawienie optyki sterującej polaryzacją zależy od zastosowanego konkretnego elementu optycznego, na przykład komórki Pockelsa21 lub płytki ćwierćfalowej w zmotoryzowanym stole obrotowym22. W niniejszym protokole zastosowano niestandardowy ciekłokrystaliczny zmienny opóźniacz (LCVR), zaprojektowany tak, aby zapewnić opóźnienie pełnofalowe (2π) w zakresie długości fal od 488 do 640 nm, co umożliwia szybkie przełączanie (~msek). W przypadku stosowania opóźniacza ciekłokrystalicznego niezbędne jest użycie komponentu wysokiej jakości: standardowe komponenty zazwyczaj nie są wystarczająco stabilne, aby zapewnić stałe opóźnienie przez cały czas naświetlania kamery, co prowadzi do rozmycia wzoru oświetlenia i niskiego kontrastu modulacji. Opóźniacze ciekłokrystaliczne są również silnie zależne od temperatury i wymagają wbudowanej kontroli temperatury.
Synchronizacja
Lasery muszą być zsynchronizowane z SLM. Binarne ferroelektryczne SLM są wewnętrznie równoważone poprzez przełączanie między stanem włączonym (on) a stanem wyłączonym (off). Piksele działają jako płytki ćwierćfalowe wyłącznie w stanie włączonym lub wyłączonym, a nie w czasie przełączania między klatkami. W związku z tym lasery powinny być włączane tylko w stanach on/off za pomocą sygnału LED Enable z SLM, aby zapobiec spadkowi kontrastu wzorca wynikającemu ze stanu pośredniego pikseli. Alternatywnie, jeśli lasery nie mogą być modulowane cyfrowo, jako szybka migawka może zostać zastosowany modulator akustyczno-optyczny (AOM).
Wybór obiektywów
Na podstawie tych ograniczeń można określić wymaganą demagnifikację płaszczyzny SLM na płaszczyznę próbki w celu wytworzenia pożądanych wzorów oświetlenia. Pozwala to na obliczenie ogniskowych dwóch soczewek L3 i L4 w teleskopie przekaźnikowym obrazu oraz soczewki kondensatora wzbudzenia L5. W tym układzie przy wzbudzeniu 488 nm i 640 nm zastosowano obiektyw imersyjny olejowy 100X/1.49NA, zatem użyto ogniskowych 300 mm i 140 mm dla L4 i L3 oraz 300 mm dla L5, co daje całkowitą demagnifikację 357X, odpowiadającą rozmiarowi piksela SLM wynoszącemu 38 nm w płaszczyźnie próbki. Przy zastosowaniu tej kombinacji soczewek okresy siatki SLM wynoszące 9 pikseli dla oświetlenia 488 nm i 12 pikseli dla 640 nm dają odstępy wzorów 172 nm i 229 nm w próbce, co odpowiada kątom padania odpowiednio 70° i 67°. Dla granicy szkło-woda kąt krytyczny wynosi 61° i jest niezależny od długości fali, zatem te dwa odstępy wzorów umożliwiają wzbudzenie TIRF dla obu długości fal. Obiektyw wyposażony w pierścień korekcyjny jest użyteczny do korekcji aberracji sferycznych wprowadzanych przez różnice w grubości szkiełka podstawowego lub w przypadku pracy w temperaturze 37 °C.
Rekonstrukcja obrazu
Po pozyskaniu surowych danych SIM, wygenerowanie obrazów o superrozdzielczości odbywa się w dwuetapowym procesie obliczeniowym. Po pierwsze, dla każdego obrazu należy wyznaczyć wzór oświetlenia, a po drugie, komponenty widma SIM muszą zostać oddzielone i odpowiednio ponownie połączone, aby podwoić efektywny zakres OTF (patrz Rysunek 6, wstawki).
Precyzyjna wiedza na temat projektowanych wzorów oświetlenia jest kluczowa, ponieważ superrozdzielcze składowe częstotliwości muszą zostać rozdzielone jak najdokładniej, aby zapobiec powstawaniu artefaktów spowodowanych pozostałościami nakładających się składowych. Parametry wzoru oświetlenia wyznaczamy a posteriori z surowych danych obrazowych zgodnie z procedurą wprowadzoną przez Gustafssona et al.23 W skrócie, dla każdego z <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq7.jpg" /> wzorów wzbudzenia <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq8.jpg" /> należy znaleźć zestaw parametrów oświetlenia opisujący znormalizowaną dwuwymiarową sinusoidę:
<img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq9.jpg" />
Powyższe <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> oraz <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq11.jpg" /> opisują odpowiednio kontrast prążków i początkową fazę wzoru dla każdego poszczególnego obrazu m. Składowe wektora falowego, <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq12.jpg" /> i <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq13.jpg" />, zmieniają się jedynie przy różnych orientacjach <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq14.jpg" /> wzoru i można założyć, że w pozostałych przypadkach są stałe. Aby wstępnie wyznaczyć składowe wektora falowego, wykonuje się korelację wzajemną widm obrazów surowych, którą następnie doprecyzowuje się poprzez zastosowanie przesunięć subpikselowych dla jednego z korelujących obrazów w celu optymalizacji pokrycia. Odbywa się to poprzez mnożenie gradientów fazy w przestrzeni rzeczywistej <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq15.jpg" />, które indukują przesunięcie subpikselowe w przestrzeni częstotliwości. Należy zauważyć, że przed właściwym wyznaczeniem wzoru użyteczne jest posiadanie dobrego oszacowania wektorów falowych, co można osiągnąć poprzez obrazowanie warstwy kulek fluorescencyjnych.
Ponieważ krok fazowy między przesuniętymi wzorami wynosi <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq16.jpg" />, t.j. <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq17.jpg" />, rozdzielenie składowych częstotliwości można przeprowadzić za pomocą transformaty Fouriera wzdłuż „osi fazy”. Globalną fazę <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq18.jpg" /> oraz kontrast prążków <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/53988/53988eq10.jpg" /> można następnie wyznaczyć, stosując zespoloną regresję liniową różnych składowych. Indywidualnie rozdzielone składowe są następnie łączone przy użyciu uogólnionego filtru Wienera. Szczegółowy opis zarówno ekstrakcji parametrów, jak i implementacji uogólnionego filtru Wienera odsyłamy do pracy Gustafsson et al.23, w której zastosowano ten sam algorytm.

<table><tbody><tr><td>Laser 488 nm</td><td>Toptica</td><td>iBeam SMART</td><td>z modulacją cyfrową</td></tr><tr><td>Laser 561 nm</td><td>Coherent</td><td>OBIS LS</td><td>z modulacją cyfrową</td></tr><tr><td>Laser 640 nm</td><td>Cobolt</td><td>MLD</td><td>z modulacją cyfrową</td></tr><tr><td>Zwierciadła dichroiczne długoprzepustowe&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td></td><td>do łączenia wiązek wzbudzających</td></tr><tr><td>Czteropasmowe zwierciadło dichroiczne</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>o grubości 3 mm, płaskie obrazowanie TIRF, zamontowane w kostce filtracyjnej Olympus BX</td></tr><tr><td>Czteropasmowe lustro dichroiczne</td><td>Chroma</td><td>ZT405/488/561/640rpc</td><td>Z tej samej partii co powyżej, 25 x 25 mm</td></tr><tr><td>1" kwadratowy montaż kinematyczny</td><td>Edmund Optics</td><td>58-860</td><td></td></tr><tr><td>Kalcyt Glan-Taylor Polaryzatory</td><td>Thorlabs</td><td>GT5-A</td><td>Do wyrównania LCVR</td></tr><tr><td>Montaż Glan-Taylor</td><td>Thorlabs</td><td>SM05PM5</td><td></td></tr><tr><td>Achromatyczna płyta półfalowa</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP05M-600</td><td>400-800 nm</td></tr><tr><td>Obrotowe mocowanie klatki</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>Do HWP</td></tr><tr><td>Ciekłokrystaliczny zmienny retarder</td><td>Meadowlark Optics</td><td>SWIFT</td><td>Zbudowany na zamówienie, aby zapewnić pełną odporność falową w zakresie od 488 do 640 nm.</td></tr><tr><td>Kontroler LCVR</td><td>Meadowlark Optics</td><td>D3060HV</td><td>Dwukanałowy sterownik wysokiego napięcia do opóźniaczy ciekłokrystalicznych</td></tr><tr><td>Achromatyczna płyta ćwierćfalowa</td><td>Meadowlark Optics</td><td>AQM-100-0545</td><td></td></tr><tr><td>Obrotowe mocowanie klatki</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1P/M</td><td>Do</td></tr><tr><td>dubletu achromatycznego QWP 10 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC080-010-A-ML</td><td>Do ekspandera wiązki</td></tr><tr><td>200 mm achromatyczny dublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-200-A-ML</td><td>Do ekspandera wiązki</td></tr><tr><td>Klatka XY Translatory</td><td>Thorlabs</td><td>CXY1</td><td></td></tr><tr><td>Ferroelektryczny przestrzenny modulator światła</td><td>Czwarty wymiar Wyświetlacze</td><td>M0787-00249&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>SXGA-3DM (IFF) Mikrowyświetlacz typu M249, 1 280 x 1 024 pikseli, z płytą sterownika</td></tr><tr><td>Rama montażowa SLM</td><td>Forth Dimension Displays</td><td>M0787-10014</td><td>Mocowana do niestandardowego aluminiowego uchwytu</td></tr> <tr><td>i Oslash; 50,8 mm Uchwyt do lustra gimbala</td><td>Thorlabs</td><td>GM200/M</td><td>Do montażu SLM</td></tr><tr><td>Dwuosiowy liniowy stolik translacyjny z obrotową platformą</td><td>Thorlabs</td><td>XYR1/M</td><td>Do montażu SLM</td></tr><tr><td>Nośnik szynowy</td><td>Newport</td><td>M-PRC-3</td><td>Do montażu SLM</td></tr><tr><td>Precyzyjna szyna optyczna</td><td>Newport</td><td>PRL-6</td><td>Do montażu SLM</td></tr><tr><td>300 mm achromatyczny podwójny obiektyw</td><td>Qioptiq</td><td>G322 273 322&nbsp;</td><td>f = 300 mm, średnica 31,5 mm</td></tr><tr><td>Achromatyczny obiektyw dubletowy 140 mm</td><td>Qioptiq</td><td>G322 239 322</td><td>f=140 mm, średnica 31,5 mm</td></tr><tr><td>Precyzyjne mocowania translacyjne XY</td><td>Thorlabs</td><td>LM2XY Adaptery montażowe</td><td></td></tr><tr><td>obiektywu</td><td>Thorlabs</td><td>SM2AD32</td><td>Do montażu obiektywów 31,5 mm w mocowaniach 2"</td></tr><tr><td>Etapy translacji</td><td>Comar</td><td>12XT65</td><td>Dovetail, napęd boczny</td></tr><tr><td>XY Translator z napędami różnicowymi</td><td>Thorlabs</td><td>ST1XY-D/M</td><td>do filtra przestrzennego</td></tr><tr><td>Obrotowe mocowanie klatkowe</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1/M</td><td>do filtra przestrzennego</td></tr><tr><td>300 mm achromatyczny dublet</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-300-A-ML</td><td>Soczewka rurki wzbudzenia</td></tr><tr><td>Zautomatyzowany stolik XY z górną płytą Z-piezo</td><td>ASI</td><td>PZ-2150-XYFT-PZ-IX71&nbsp;</td><td>ze sterownikiem MS-2000</td></tr><tr><td>Odwrócona ramka mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UAPON100XOTIRF</td><td>100X/1.49NA</td></tr><tr><td>Szybkie koło filtrów</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110A</td><td>z kontrolerem Prior ProScan III</td></tr><tr><td>Filtry emisji pasmowoprzepustowej</td><td>Kamera sCMOS Semrock</td><td>FF01-525/30, FF01-676/29</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA Flash v4.0</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator stołowy</td><td>OKO Lab</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Do obrazowania komórek na żywo z regulatorami temperatury Bold Line i CO2</td></tr><tr><td>Słupki optyczne ze stali nierdzewnej</td><td>Seria Thorlabs</td><td>TR</td><td>do montażu elementów optycznych</td></tr><tr><td>Uchwyty</td> do słupków <td>Seria Thorlabs</td><td>PH</td><td>do montażu elementów optycznych</td></tr><tr><td>Mocowania lusterek kinematycznych</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>do montażu luster 1"</td></tr><tr><td>Interferometr ścinający</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>100 mikrosfery fluorescencyjne</td> Life <td>Technologies</td><td>T-7279</td><td>Tetraspeck</td></tr><tr><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83697-250MG</td><td></td>8-dołkowe</tr><tr><td>naczynia ze szklanym dnem</td><td>ibidi</td><td>80827</td><td>ze szkłem nakrywkowym #1.5 Szkło nakrywkowe</td></tr><tr><td>komorowe Nunc Lab-Tek II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td>ze szkłem nakrywkowym #1,5</td></tr><tr><td>Szkiełko siatkowe mikroskopu 0,01 mm</td><td>EMS</td><td>68039-22</td><td></td></tr><tr><td>CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10613</td><td></td></tr></tbody></table>

przewodnik po oświetleniu strukturalnym mikroskopia tirf z dużą prędkością i wieloma kolorami

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optyczne obrazowanie w superrozdzielczości z mikroskopią oświetlenia strukturalnego (SIM) jest kluczową technologią do wizualizacji procesów na poziomie molekularnym w naukach chemicznych i biomedycznych. Chociaż dostępne są komercyjne systemy SIM, systemy, które są projektowane na zamówienie w laboratorium, mogą przewyższać systemy komercyjne, przy czym te ostatnie są zwykle projektowane z myślą o łatwości obsługi i zastosowaniach ogólnych, zarówno pod względem wierności obrazu, jak i szybkości. W tym artykule przedstawiono szczegółowy przewodnik po budowie systemu SIM, który wykorzystuje oświetlenie całkowitego wewnętrznego odbicia (TIR) i jest w stanie obrazować z częstotliwością do 10 Hz w trzech kolorach w rozdzielczości sięgającej 100 nm. Dzięki połączeniu kart SIM i TIRF system zapewnia lepszy kontrast obrazu niż konkurencyjne technologie. Aby osiągnąć te specyfikacje, zastosowano kilka elementów optycznych, które umożliwiają automatyczną kontrolę stanu polaryzacji i struktury przestrzennej światła oświetleniowego dla wszystkich dostępnych długości fal wzbudzenia. Podano pełne informacje na temat implementacji i sterowania sprzętem w celu osiągnięcia synchronizacji między generowaniem wzoru światła wzbudzenia, długością fali, stanem polaryzacji i sterowaniem kamerą, z naciskiem na osiągnięcie maksymalnej liczby klatek na sekundę. Przedstawiono krok po kroku protokół dostrojenia i kalibracji systemu, a możliwa do osiągnięcia poprawa rozdzielczości jest weryfikowana na idealnych próbkach testowych. Zdolność do obrazowania w superrozdzielczości z szybkością wideo została zademonstrowana na żywych komórkach.

Ten artykuł zawiera szczegółowy przewodnik po montażu i obsłudze mikroskopu z oświetleniem strukturalnym działającym z pełnym wewnętrznym odbiciem fluorescencyjnym (TIRF-SIM) do obrazowania dynamicznych procesów biologicznych z optyczną superrozdzielczością w wielu kolorach.

Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Ogólnym celem tego protokołu jest skonstruowanie i wyrównanie strukturalnego mikroskopu oświetleniowego odpowiedniego do szybkiego obrazowania na żywo komórek w super rozdzielczości, zdolnego do pracy w trybach TIRF i sekcji optycznej z wieloma kolorami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, na które obecnie nie można odpowiedzieć przy użyciu standardowej mikroskopii TIRF z ograniczoną dyfrakcją. Główną zaletą tej techniki jest jej szybka rozdzielczość czasowa w porównaniu z innymi technikami mikroskopii superrozdzielczej, co sprawia, że dobrze nadaje się do obrazowania dynamicznych procesów w żywych komórkach.Chociaż protokół ten opisuje etapy budowy mikroskopu TIRF-SIM, konfiguracja jest elastyczna i łatwa do modyfikacji w celu wdrożenia modalności obrazowania, takich jak 3D-SIM, wieloogniskowa karta SIM i nieliniowa karta SIM. Aby ułożyć i wyrównać ścieżkę wzbudzenia dla strukturalnego mikroskopu oświetleniowego, zacznij od zaznaczenia pozycji elementów na stole optycznym, jak wskazano tutaj. Po włożeniu pierwszego zwierciadła dichroicznego, DM4, do wieżyczki sześcianu filtra ramy mikroskopu, włóż drugie zwierciadło dichroiczne, DM3, do jednocalowego kwadratowego mocowania zwierciadła kinematycznego i ustaw je o jedną ogniskową od soczewki kondensatora, L5. Następnie, aby dokładnie określić dostęp optyczny dla systemu, wyjmij soczewkę obiektywu, OB, z głowicy rewolwerowej i zamiast tego wkręć narzędzie do ustawiania.Następnie użyj zwierciadła dichroicznego DM3 i tymczasowego zwierciadła wyrównującego umieszczonego w przybliżonym ostatecznym położeniu SLM, aby skierować skolimowaną wiązkę odniesienia od lasera pierwszego przez środek otworów w dwóch tarczach wyrównujących. Używając trzech luster i lustra dichroicznego DM2, jak pokazano tutaj, skieruj wiązkę z lasera pierwszego na tymczasowe lustro. Po wyznaczeniu zgrubnej osi optycznej wyjmij narzędzie do wyrównywania.Następnie włóż tęczówkę do ścieżki wiązki, zanim wejdzie ona do korpusu mikroskopu i wyśrodkuj ją na wiązce. Przymocuj kawałek białej karty z małym otworem wyśrodkowanym na przysłony, a następnie ponownie włóż soczewkę obiektywu. Następnie dokonaj iteracyjnych regulacji kątowych lusterek DM3 i w pozycji SLM, aby wyśrodkować odbicie wsteczne na karcie z nadchodzącą wiązką.Następnie tymczasowo zdejmij soczewkę obiektywu i zaznacz plamkę lasera na suficie, aby utworzyć pozycję odniesienia. Włóż soczewkę tubusu, L5, mniej więcej o jedną ogniskową od obiektywu, montując ją na liniowym stoliku translacyjnym ustawionym tak, aby przesuwał się wzdłuż kierunku wiązki odniesienia. Dostosuj położenie i kąt soczewki tubusu tak, aby wiązka wychodząca z obiektywu była skolimowana i uderzała w punkt odniesienia na suficie.Sprawdź, czy obiektyw jest prostopadły do wiązki, ponownie sprawdzając odbicie wsteczne za pomocą przysłony i białej karty. Następnie zdejmij soczewkę obiektywu i włóż drugą soczewkę teleskopu przekaźnikowego, L4. Użyj stolika translacji liniowej, aby dostosować położenie i kąt tego obiektywu, aby utrzymać kolimację i upewnić się, że wiązka referencyjna nadal uderza w zaznaczone miejsce na suficie. Wymień soczewkę obiektywu i włóż pierwszą soczewkę teleskopu, L3. Dostosuj położenie i kąt tego obiektywu, aby zapewnić kolimację i brak ugięcia, jak opisano wcześniej.Po zamontowaniu układu SLM zgodnie z protokołem tekstowym, przy wyrównanych soczewkach, włóż SLM w miejsce lustra. Dostosuj położenie SLM tak, aby wiązka referencyjna znajdowała się w środku układu SLM i dostosuj kąt tak, aby wiązka przechodziła przez dwie soczewki przekaźnika. Następnie sprawdź, czy belka referencyjna jest nadal wyśrodkowana w zaznaczonym miejscu.Zamontuj ciekłokrystaliczny zwalniacz zmienny (LCVR) z jego szybką osią pod kątem 45 stopni do padającej polaryzacji. Następnie po zakończeniu ustawiania rotatora polaryzacji zgodnie z protokołem tekstowym, wykorzystując światło przepuszczane przez lornetki, skup się na siatce i ustaw soczewkę obiektywu w tej pozycji. Następnie przygotuj monowarstwę koralików fluorescencyjnych, rozprowadzając kroplę wielokolorowych koralików o wielkości 100 nanometrów na szkle nakrywkowym o numerze 1,5.Pozostaw koraliki do wyschnięcia, aby zaadsorbować je do szkła przed ponownym zanurzeniem w wodzie. Za pomocą olejku immersyjnego umieść próbkę koralików na obiektywie. Dokładnie dostosuj położenie aparatu, aby warstwa koralików fluorescencyjnych była ostra.Po wygenerowaniu binarnych wzorców siatki SIM jako plików bitmapowych i przesłaniu ich do SLM zgodnie z protokołem tekstowym, załaduj oprogramowanie sterujące SLM i kliknij Połącz. W zakładce Repertuar kliknij przycisk Załaduj", aby otworzyć plik z repertuarem i sprawdź liczbę uruchomionych zamówień zawartych w pliku. Kliknij Wyślij na tablicę", aby przesłać plik z repertuarem do SLM.Następnie wybierz zakładkę "Status" i wprowadź numer uruchomionego zamówienia. Kliknij Wybierz", aby zmienić kolejność jazdy na kratę wyrównującą. Włóż maskę przestrzenną lub SM zamontowaną na stoliku XY do ścieżki wiązki w pozycji ogniskowej L3 i przesuń jej położenie względem osi optycznej tak, aby przekazywane były tylko pożądane pierwsze zamówienia.Bezpośrednio za filtrem przestrzennym widoczne będą tylko dwie okrągłe belki. Sprawdź obraz warstwy koralików fluorescencyjnych w aparacie. Jeśli dwie okrągłe wiązki nie nakładają się na siebie, jak pokazano tutaj, zmień położenie płaszczyzny próbki, iteracyjnie dostosowując soczewkę obiektywu i pozycję kamery.Po dostrojeniu ostrości i ustawieniu płaszczyzny próbki zgodnie z protokołem tekstowym, potwierdź oświetlenie TIRF, obrazując na przykład roztwór 10-mikromolowego barwnika rodaminy 6G poprzez ustawienie ostrości barwnika. Jeśli dwie wiązki padną pod odpowiednim kątem TIRF, pojedyncze cząsteczki będą widoczne bez wysokiego tła, a krawędzie okrągłej apertury będą ostre. Precyzyjna regulacja położenia belek może być dokonana poprzez regulację lustra dichroicznego DM3.Aby zsynchronizować i skalibrować system, umieść próbkę jednowarstwową koralików na obiektywie i ustaw ostrość. Użyj oprogramowania sterującego SLM, aby zaprogramować SLM tak, aby wyświetlał każdy z trzech obrazów przesunięcia fazowego po kolei dla pierwszej orientacji wzoru. Następnie przełącz się na czwartą kolejność biegową z przykładowego repertuaru.W oprogramowaniu do akwizycji skonfiguruj kamerę na globalny okres ekspozycji, wybierając opcję Advanced Camera Properties (Zaawansowane właściwości kamery) i ustawiając Output Trigger Kind (Rodzaj wyzwalacza wyjściowego) 1" na wartość dodatnią i Output Trigger Kind (Rodzaj wyzwalacza wyjściowego) 2" na wartość ujemną. W okienku sekwencji w obszarze Scan Type (Typ skanowania) wybierz opcję Hard Disk Record (Rekord dysku twardego) i ustaw liczbę klatek na trzy. Następnie kliknij Start"aby uzyskać trzy klatki.Wzór SLM będzie się zmieniał przy każdej ekspozycji. Po skalibrowaniu systemu zgodnie z protokołem tekstowym, w oprogramowaniu sterującym SLM przełącz kolejność pracy SLM na pełną serię dziewięciu binarnych obrazów siatki wymaganych dla TIRF-SIM. Jest to kolejność zerowa w przykładowym repertuarze.Po uzyskaniu dziewięciu obrazów próbki koralików, w okienku sekwencji oprogramowania aparatu wybierz Zapis dysku twardego"jako typ skanowania i zmień liczbę klatek na dziewięć. Następnie kliknij Start"aby uzyskać obrazy. Na koniec w obszarze Zapisz buforowane obrazy wybierz TIFF jako typ obrazu i kliknij przycisk OK. Zrekonstruuj obraz w super rozdzielczości zgodnie z protokołem tekstowym.Pokazane tutaj wielokolorowe koraliki fluorescencyjne o średnicy 100 nanometrów zostały zobrazowane w celu porównania standardowego TIRF z TIRF-SIM. TIRF-SIM miał wyraźnie wyższą rozdzielczość boczną w porównaniu do TIRF. Szacowana rozdzielczość mikroskopu wynosi 90 nanometrów i 120 nanometrów odpowiednio dla 488 i 640 nanometrów TIRF-SIM.Odpowiada to dwukrotnej poprawie rozdzielczości poprzecznej dla obu długości fal w porównaniu z teoretycznym przypadkiem ograniczonym dyfrakcją. Jak widać tutaj, znakowane fluorescencyjnie fibryle amyloidowe zostały utworzone in vitro, a także wykorzystane jako próbka testowa w celu wykazania podwójnej rozdzielczości. Struktury subkomórkowe o wysokim kontraście, takie jak mikrotubule znakowane emGFP lub LifeAct-GFP, są idealne do obrazowania TIRF-SIM i dają obrazy o wysokim kontraście i super rozdzielczości.Obrazowanie TIRF-SIM z wykorzystaniem zademonstrowanej konfiguracji umożliwia obserwację subpopulacji mikrotubul zlokalizowanych w pobliżu kory podstawnokomórkowej, a polimeryzację i depolimeryzację mikrotubul można zaobserwować w czasie. Próbki o niskim kontraście bez dyskretnych struktur nie mają informacji o wysokiej rozdzielczości, z wyjątkiem krawędzi błony plazmatycznej, a zatem są nieoptymalne do obrazowania TIRF-SIM. Wreszcie, wysoki kontrast modulacyjny jest niezbędny do udanego obrazowania karty SIM.Jak pokazano tutaj, transformacja Fouriera zrekonstruowanego obrazu umożliwia wizualizację funkcji transferu optycznego SIM. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu około tygodnia, jeśli wszystkie niezbędne części zostały zdobyte. Podejmując próbę wykonania tej procedury, należy zdawać sobie sprawę z najważniejszych kwestii związanych z pomyślnym wdrożeniem TIRF-SIM.Po pierwsze, niezbędne jest precyzyjne wyrównanie belek. Może to być trudne, ponieważ muszą one znajdować się na krawędziach przysłony obiektywu. Po drugie, bardzo ważne jest, aby stan polaryzacji światła był współbieżny ze wzorem.Bez tego kontrast wzoru próbki będzie niski, a późniejsza budowa obrazu będzie niemożliwa. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć najważniejsze etapy budowy i ustawiania mikroskopu TIRF-SIM opartego na SLM. Nie zapominaj, że praca z laserami klasy 3B może być bardzo niebezpieczna.Moc lasera musi być utrzymywana na bezpiecznym dla oczu poziomie podczas wykonywania procesu ustawiania z założonym obiektywem TIRF.

a-guide-to-structured-illumination-tirf-microscopy-at-high-speed-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Źródło: Daniele, F.,  et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015). Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji,...

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Aby zbadać prędkości przepływu i kierunkowość aktyny nitkowatej w synapsie immunologicznej limfocytów T, obrazowanie super-rozdzielcze żywych komórek jest połączone z całkowitą fluorescencją wewnętrznego odbicia i określone ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazu.

Korowy przepływ aktyny w limfocytach T określony ilościowo za pomocą czasoprzestrzennej spektroskopii korelacji obrazów danych z mikroskopii oświetlenia strukturalnego

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Tutaj prezentujemy praktyczny przewodnik budowania zintegrowanego systemu mikroskopowego, który łączy konwencjonalne obrazowanie epi-fluorescencyjne, obrazowanie superrozdzielcze oparte na detekcji pojedynczej cząsteczki oraz wielokolorowe wykrywanie pojedynczych molekuł, w tym obrazowanie transferu energii rezonansu fluorescencji pojedynczej, w jeden zestaw w opłacalny sposób.

Prowadzenie wielu trybów obrazowania za pomocą jednego mikroskopu fluorescencyjnego

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Poznaj konstrukcję i ustawienie mikroskopu TIRF-SIM do szybkiego obrazowania superrozdzielczego żywych komórek w wielu kolorach. Ta metoda umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych z wysoką rozdzielczością czasową.

Przewodnik po oświetleniu strukturalnym Mikroskopia TIRF z dużą prędkością i wieloma kolorami

Przeglądaj więcej filmów