Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie wyrównanych i losowych matryc kolagenowych 3D w celu obserwacji migracji komórek lub innych procesów komórkowych w kontekście środowiska 3D. Metoda ta ma na celu uchwycenie cech kolagenu, które znajdujemy w prawdziwych tkankach, co może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak mechanizmy, których komórki używają do rozpoznawania wyrównanej lub losowej macierzy zewnątrzkomórkowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można manipulować organizacją środowiska 3D, obrazować komórki w środku i można to zrobić w sposób opłacalny za pomocą powszechnie dostępnego sprzętu.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą walczyć, ponieważ nie mieszają wystarczająco dobrze roztworu kolagenu i buforu neutralizującego i niekonsekwentnie przeciągają kolagen przez kanały. Tę procedurę zademonstruje Brian Burkel, który jest starszym naukowcem w moim laboratorium. Na początek dokładnie wymieszaj kolagen i bufor HEPES przed dodaniem komórek i pożywki, aby zapewnić prawidłową neutralizację kolagenu.

Następnie dodaj komórki i pożywkę do zneutralizowanej mieszaniny kolagenu i umieść ją na lodzie, jak opisano w dołączonym protokole tekstowym. Odpipetuj lodowatą mieszaninę na sterylną powierzchnię niepoddaną hodowli tkankowej, aby zminimalizować przyczepianie się i wzrost komórek poza żelem kolagenowym. Użyj pipety, aby równomiernie rozprowadzić roztwór.

Pozostaw żel do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez około 10 do 15 minut. Następnie przykryj żele i przenieś je do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkowe 45 do 60 minut, aby zakończyć polimeryzację. Po polimeryzacji żel stanie się nieprzezroczysty.

Po polimeryzacji dodaj od dwóch do trzech mililitrów pożywki. Następnie uwolnij żele z boków studzienki, przesuwając pipetę 200 po obwodzie studzienki. Delikatnie zakręć naczyniem, aby uwolnić żel z dolnej powierzchni.

W celu stworzenia mikrokanalików PDMS do wyrównania matryc kolagenowych. Najpierw przygotuj wzorzec krzemowy SuA, używając standardowych technik miękkiej litografii opisanych w innym miejscu. Następnie za pomocą patyczka rzemieślniczego dokładnie wymieszaj 20 gramów bazy elastomerowej z 2 gramami utwardzacza w jednorazowym kubku.

Po dokładnym wymieszaniu odgazuj mieszaninę PDMS, umieszczając jednorazowy kubek w komorze próżniowej pod ciśnieniem podciśnienia 550 milimetrów słupa rtęci. Odgazowuje mieszaninę przez około jedną do półtorej godziny. Podczas odgazowywania PDMS przygotuj silikonowy master, umieszczając czysty arkusz przezroczystej folii na gorącej płycie, a następnie silicon master.

Upewnij się, że forma mikrokanałowa jest skierowana do góry. Po jednej do półtorej godziny wyjmij odgazowany PDMS z komory próżniowej. Powoli wlej PDMS do środka wzorca i pozwól, aby grawitacja rozprowadziła go równomiernie.

Następnie ostrożnie zwiń drugi arkusz przezroczystej folii na wierzch silikonowego wzorca i PDMS, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Delikatnie umieść arkusz gumy na wierzchu przezroczystości, a następnie arkusz akrylu 1/8 cala, a następnie dodaj pierwszy z trzech dziesięciofuntowych ciężarków na wierzchu arkusza akrylowego. Początkowo pierwszy ciężarek będzie unosił się na wodzie, pozwoli mu się osiąść i ustabilizować przed przystąpieniem do dwóch pozostałych płytek obciążnikowych.

Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, ustaw gorącą płytę na 70 stopni Celsjusza i utwardzaj PDMS przez cztery godziny. Po utwardzeniu pozwól PDMS ostygnąć przez co najmniej jedną dodatkową godzinę, a następnie ostrożnie oderwij górną przezroczystą folię na wafel. Na koniec usuń kanały za pomocą kleszczy.

Umieść kanały do góry nogami na nowej, czystej przezroczystej folii i wyczyść wszystkie porty okrężnymi ruchami ostrymi kleszczami. Usuń wszelkie poluzowane fragmenty PDMS. Następnie przyłóż kawałek taśmy pakowej do ławki lepką stroną do góry i połóż kanał PDMS stroną do dołu na wierzchu taśmy.

Dociśnij kanały okrągłym końcem kleszczy, aby zapewnić dobry kontakt. Usuń kanały i powtarzaj ten proces po obu stronach, aż wszystkie widoczne zanieczyszczenia zostaną usunięte. Następnie przenieś czyste, przygotowane kanały PDMS do 50-mililitrowej stożkowej rurki wypełnionej 70% etanolem.

Wiruj kanały z maksymalną prędkością przez 30 sekund, a następnie zastąp roztwór świeżym, 70% etanolem. Stosując techniki aseptyki, przenieś kanał PDMS stroną do góry, do czystego i sterylnego naczynia. Następnie kanały należy traktować promieniami UV, aż etanol odparuje.

Po wyschnięciu odwróć kanały na szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem i dociśnij je do szkła, aby uzyskać dobre uszczelnienie. Dodaj plaster sterylnego PDMS, aby przykryć i zamknąć środkową część kanałów i pozwól zestawowi dokładnie wyschnąć przed kontynuowaniem. Następnie umieść 100-mikrolitrową kroplę 10 mikrogramów na mililitr roztworu kolagenu na górze kanału i przeciągnij ją przez kanał za pomocą próżni

Inkubować kanały w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, a następnie przenieść kanały, nadal wypełnione roztworem powlekającym kolagen, do lodówki. Schłodź zestaw przez około 15 do 30 minut, a następnie użyj aspiratora lub pipety, aby usunąć roztwór powłoki kolagenowej z kanałów. Zacznij od zneutralizowania roztworu kolagenu, rozcieńczenia go pożywką komórkową i inkubacji na lodzie przez 15 minut.

Następnie umieść od 120 do 150 mikrolitrów roztworu kolagenu w porcie A wstępnie schłodzonego kanału. Następnie podłącz pipetę o pojemności 25 mililitrów do linii próżniowej i umieść ją nad portem C. Użyj jej, aby wciągnąć mieszaninę jednym jednostajnym ruchem, zatrzymując się, gdy kolagen dotrze do końca. Najważniejszym krokiem do wygenerowania losowych matryc jest powolne przeciąganie kolagenu przez kanał.

Jeśli zostanie przeciągnięty zbyt szybko, spowoduje to zwiększone wyrównanie w części kanału lub w całym kanale. Ostrożnie usuń nadmiar roztworu z obszarów portów, a następnie umieść sterylne plastry PDMS na obu portach, A i C. Po dwóch do trzech minutach usuń środkową łatkę PDMS zakrywającą port B i dodaj dwie do trzech mikro miotów komórek w stężeniu od jednego do trzech milionów komórek na mililitr do środkowego portu. Poczekaj, aż żel częściowo spolimeryzuje w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 do 15 minut, a następnie przenieś konciąg do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkowe 15 do 30 minut.

Po polimeryzacji zdejmij osłony portów PDMS i dodaj nośnik, aby całkowicie zakryć kanał. Tutaj 50 000 czterech komórek T one osadzono w żelu kolagenowym 2 mg / ml lub 3,5 mg / ml przez 5 dni. Cztery limfocyty T jedna linia jest wysoce kurczliwą linią raka Med Esthetic, ale jest w stanie skurczyć żel o wysokiej gęstości tylko o około 10%Przenośne żele o niskiej gęstości są kurczone 57% w tym samym czasie.

Stopień wyrównania kolagenu jest modulowany przez szybkość przepływu kolagenu, dzięki czemu wyższe tempo przepływu kolagenu zapewnia lepsze wyrównanie. Zastosowanie węższych kanałów w połączeniu z wyższymi ciśnieniami podciśnienia poprawia wyrównanie sieci kolagenowej, podczas gdy szerszy kanał stosowany w połączeniu z niskim ciśnieniem podciśnienia generuje losowe matryce. Po opanowaniu nalewanie żeli lub kanałów kolagenowych można wykonać w ciągu dwóch i pół godziny, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o skonfigurowaniu komponentów przed rozpoczęciem. Kiedy już zaczniesz pracować z kolagenem, musisz działać szybko. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii komórki 3D do badania adhezji, migracji i inwazji komórek w trójwymiarowych środowiskach zewnątrzkomórkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nalewać żele kolagenowe o różnej gęstości i jak generować zarówno losowe, jak i wyrównane matryce kolagenowe.