Name: Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Poznaj metodę przygotowania wyrównanych i losowych żeli kolagenowych 3D do badania migracji komórek oraz procesów komórkowych w środowisku trójwymiarowym. Technika ta pozwala na kontrolowane badanie interakcji komórek z macierzą pozakomórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za sfinansowanie tej pracy o numerach grantów UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 i T32-GM008692-18. Dziękujemy również Jeremy'emu Bredfeltowi i Yumingowi Liu z LOCI za opracowanie i pomoc w analizie CT-FIRE.

1. Neutralizacja, rozcieńczanie i polimeryzacja roztworów kolagenu do badań 3D i testów skurczu komórkowego
<ol>
	<li>Na lodzie w sterylnym kapturze do hodowli tkanek zneutralizuj kolagen (1:1) za pomocą sterylnego, lodowatego 100 mM HEPES-u w 2x PBS, pH 7,4, w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dokładnie wymieszaj plastikową pipetą, aż roztwór będzie jednorodny, a zawijasy mieszania nie będą już widoczne. Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza podczas procesu mieszania. Przechowywać krótko na lodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć zneutralizowany kolagen do odpowiedniego stężenia za pomocą pożywki komórkowej (takiej jak RPMI, DMEM itp.).
	<ol>
		<li>Aby obliczyć ilość zneutralizowanego kolagenu wymaganą do uzyskania pożądanego stężenia kolagenu, użyj równania N = (D*V)/(S/2), gdzie N to wymagana ilość zneutralizowanego kolagenu, D to pożądane stężenie kolagenu, V to końcowa objętość pożądanego stężenia kolagenu, a S to początkowe stężenie kolagenu.</li>
		<li>Zwiększ ilość zneutralizowanego kolagenu do objętości poprzez dodanie roztworu pożywki komórkowej i komórkowej. Dokładnie wymieszaj i przechowuj na lodzie, aż będzie gotowy do rzucenia.
		<ol>
			<li>Przykład: W przypadku żelu o stężeniu 2 mg/ml w objętości żelu wynoszącej 1 ml (typowa objętość dla żelu odlewanego w płytce 6-dołkowej lub naczyniu o szklanym dnie o średnicy 50 mm), należy najpierw pomnożyć pożądane stężenie (2 mg/ml) przez żądaną objętość końcową (1 ml). Weź tę liczbę (2 mg) i podziel ją przez połowę stężenia podanego na butelce (9,49 mg/ml). W tym przypadku 0,42 ml zneutralizowanego kolagenu rozcieńcza się 0,58 ml mieszaniny pożywka/komórka.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odpipetować lodowatą mieszaninę kolagenu/komórki/pożywki do 6-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur nietkankowych lub do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 50 mm. Użyj końcówki pipety, aby równomiernie rozprowadzić roztwór. 
	UWAGA: Ważne jest, aby używać płytki niepoddanej hodowli tkankowej, aby zminimalizować przyczepianie się lub wzrost komórek na zewnątrz żelu kolagenowego.</li>
	<li>Pozostawić do polimeryzacji w temperaturze pokojowej na około 10 - 15 minut. Żele powinny stać się nieprzezroczyste po polimeryzacji.</li>
	<li>Po tym, jak stanie się nieprzezroczysty, przenieś płytkę lub naczynie do 37 °C na dodatkowe 45 - 60 minut, aby zakończyć polimeryzację.</li>
	<li>Po 45 - 60 minutach dodać 2 - 3 ml pożywki i uwolnić żele z boków studzienki, przesuwając końcówkę pipety p200 po obwodzie studzienki lub naczynia. Delikatnie zakręć naczyniem, aby uwolnić żel. Żel kolagenowy powinien unosić się w podłożu.</li>
</ol>
2. Western Blotting, morfogeneza komórkowa i test żelowy
<ol>
	<li>Aby ocenić poziom białka, morfologię lub kurczliwość komórkową w odniesieniu do sztywności ECM, zacznij od wlania żeli kolagenowych, zgodnie z 1,1 - 1,6, wysianych komórkami do testu 7 - 10 dni. Określ empirycznie szybkość wysiewu każdej linii komórkowej w zależności od szybkości wzrostu i konfluencji. W przypadku testu 10-dniowego gęstość wysiewu może wynosić od 20 000 do 100 000 komórek/żel.</li>
	<li>Aby zmierzyć kurczliwość komórek, mierz średnicę żelu za pomocą linijki lub kamery co 24 godziny lub w odpowiednim odstępie czasu. 
	Uwaga: Dodatkowo, odpowiednie obrazy zebrane z mikroskopu mogą być zbadane pod kątem cech morfologicznych charakterystycznych dla linii komórkowej zasianej w żelu, takich jak struktury podobne do akin, kanaliki nabłonkowe, wypukłości komórkowe i lameliapodia.</li>
	<li>Aby ocenić poziom białka, należy poddać żele lizie w buforze RIPA i przeprowadzić analizę Western blot interesujących białek, jak opisano w Wozniak i wsp. 17 oraz Gallagher i wsp. Rozdział 18.
	<ol>
		<li>WAŻNE: W porównaniach kurczliwości między liniami komórkowymi normalizuj kurczliwość do całkowitego DNA, które można wyekstrahować z żeli, jak opisano przez Lui i wsp.19, lub do niezmiennego, utrzymującego porządek białka (histony, GAPDH itp.) przez analizę Western blot, jak opisano w Wozniak et al. 17 oraz Gallagher i wsp. 18. Jeśli liczysz komórki w żelu za pomocą hemocytometru, upewnij się, że znormalizowałeś liczbę komórek do całkowitej powierzchni żelu, ponieważ kurczący się żel skoncentruje komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podawaj żele co 3-4 dni, usuwając 1 ml pożywki i zastępując ją 1 ml świeżej pożywki. Upewnij się, że podajesz żele po wykonaniu pomiaru, ponieważ dodanie świeżej pożywki/surowicy spowoduje skok kurczliwości.</li>
</ol>
3. Generowanie mikrokanałów PDMS do wyrównania włókien kolagenowych
Uwaga: Aby wygenerować wyrównane matryce kolagenowe, forma do mikrokanałów PDMS (rysunek 2A) wymaga wzorca krzemowego SU-8 wykonanego za pomocą miękkiej litografii15.
<ol>
	<li>Aby utworzyć kanały PDMS, dokładnie wymieszaj PDMS w jednorazowym kubku za pomocą patyczka rzemieślniczego. W przypadku 6-calowego wzorca silikonowego wymieszaj 20 g bazy elastomerowej z 2 g utwardzacza.</li>
	<li>Odgazować mieszaninę PDMS, umieszczając jednorazowy kubek w komorze próżniowej pod ciśnieniem podciśnienia 550 mm Hg. Odgazowywać przez 1 - 1,5 godziny.</li>
	<li>Podczas odgazowywania PDMS przygotuj silikonowy wzorzec do nalewania. Przygotuj się, umieszczając czysty arkusz przezroczystej folii na płycie grzejnej, a następnie silikonowy master. Upewnij się, że forma mikrokanałowa jest skierowana do góry. 
	UWAGA: Podczas odlewania i utwardzania PDMS mistrz silikonowy zostanie umieszczony między dwoma arkuszami przezroczystej folii.</li>
	<li>Po 1 - 1,5 godziny wyjmij odgazowany PDMS z komory próżniowej i powoli zalej silikon master. 
	WAŻNE: Unikaj pęcherzyków powietrza. Kontynuuj wlewanie środka głównego i pozwól, aby grawitacja rozprowadziła go równomiernie. 
	UWAGA: Upuszczenie PDMS nie musi sięgać aż do krawędzi urządzenia głównego.</li>
	<li>Po wylaniu PDMS na wzorzec nałóż drugi arkusz przezroczystej folii na wierzch silikonowego wzorca i PDMS. Ostrożnie zwiń drugi arkusz przezroczystości na wierzch PDMS/silikonowego wzorca, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Nie spiesz się. PDMS powinien być teraz równomiernie rozłożony na masterze.</li>
	<li>Delikatnie umieść gumowy arkusz na wierzchu przezroczystości, a następnie arkusz akrylowy 1/8".</li>
	<li>Dodaj trzy ciężarki o wadze 10 funtów na wierzchu arkusza akrylowego. Początkowo ciężarki będą "unosić się na wodzie". Pozwól im się uspokoić i ustabilizować, zanim przejdziesz dalej.</li>
	<li>Ustaw temperaturę płyty grzejnej na 70 °C i utwardzaj PDMS przez 4 godziny. Pozostaw do ostygnięcia na co najmniej 1 dodatkową godzinę przed zakłóceniem.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij górny arkusz przezroczystej folii od wafla i usuń kanały za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Przechowywać w naczyniu bezpyłowym, aż będzie gotowy do użycia.</li>
</ol>
4. Przygotowanie mikrokanałów PDMS do użycia
<ol>
	<li>Umieść kanały do góry nogami na nowej, czystej folii przezroczystej. Wyczyść wszystkie porty (Rysunek 2b) ruchami okrężnymi za pomocą ostrych kleszczyków. Usuń wszystkie fragmenty PDMS.</li>
	<li>Oczyść kanały, używając kawałka taśmy pakowej jako ściereczki do sczepiania. Przyklej taśmę do powierzchni ławki (lepką stroną do góry), a następnie ustaw kanał na wierzchu. Dociśnij kanały okrągłym końcem kleszczy, aby zapewnić dobry kontakt. Usuń i powtarzaj po obu stronach, aż widoczne zanieczyszczenia zostaną usunięte.</li>
	<li>Przenieś oczyszczone, przygotowane kanały PDMS do stożkowego o pojemności 50 ml z 70% EtOH. Wiruj z maksymalną prędkością przez 30 sekund. Wyrzuć EtOH i zastąp świeżym 70% EtOH. Przechowywać w 70% EtOH do momentu przygotowania do użycia.</li>
	<li>W kapturze do hodowli tkankowej i stosując techniki aseptyki, przenieś kanały PDMS do czystej i sterylnej szklanej szklanej szklanej pokrywy lub naczyń ze szklanym dnem. Połóż kanał stroną do góry i poddaj działaniu promieniowania UV, aż EtOH wyparuje.</li>
	<li>Po wyschnięciu odwróć PDMS tak, aby kanały były skierowane w dół w kierunku szkła nakrywkowego. Dociśnij kanał PDMS do szkła, aby uzyskać dobre uszczelnienie. Dodaj plaster sterylnego PDMS, aby zakryć/zamknąć środkowy port (port B, rysunek 2b). Pozostaw do całkowitego wyschnięcia przed kontynuowaniem.</li>
	<li>Wstępnie pokryj wnętrze kanału 10 μg/ml kolagenu w sterylnej wodzie. Aby pokryć, umieść kroplę o wielkości 100 μl na górze kanału i przeciągnij przez nią za pomocą próżni. Po 1 godzinie w temperaturze 37 °C przenieść kanały wypełnione roztworem powłoki kolagenowej do lodówki. Schładzać przez około 15 - 30 minut.</li>
	<li>Usunąć roztwór powlekający kolagen za pomocą aspiratora lub pipety i rozpocząć przygotowanie kolagenu.</li>
</ol>
5. Preparat kolagenowy do stosowania w mikrokanałach
<ol>
	<li>Na lodzie zneutralizuj kolagen (1:1) za pomocą lodowatego 100 mM HEPES-u w 2x PBS, pH 7,4. Dokładnie wymieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji (więcej szczegółów znajduje się w sekcji 1.1).</li>
	<li>Rozcieńczyć zneutralizowany kolagen do odpowiednich stężeń za pomocą pożywki komórkowej (więcej szczegółów w punkcie 1.2). Inkubować przez 15 minut na lodzie.</li>
	<li>W tym samym czasie chłodne kanały zamontowane na lodzie. 
	UWAGA: Celem jest, aby wszystkie komponenty procesu kanałowego miały temperaturę 4 °C lub niższą. Temperatura i czas zarodkowania kolagenu są kluczowymi parametrami procesu polimeryzacji i w razie potrzeby mogą być punktem wyjścia do dalszej optymalizacji.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemacytometru i ponownie zawiesić przy odpowiedniej gęstości wysiewu w tym czasie. Aby ułatwić obliczenia, należy zawiesić ponownie do 1 - 3 milionów komórek/ml (Aby uzyskać więcej informacji, patrz również sekcja 2.1).</li>
	<li>Po zliczeniu komórek i upływie 15 minut przystąp do nalewania kolagenu.</li>
</ol>
6. Wylewanie wyrównanych i losowych mikrokanałów kolagenowych
<ol>
	<li>Przed pobraniem kolagenu przez kanały wyreguluj i ustaw podciśnienie za pomocą wbudowanego regulatora podciśnienia. Podciśnienie zapewnia siłę do indukowania i kontrolowania szybkości przepływu kolagenu, która określa stopień wyrównania.
	<ol>
		<li>W przypadku matryc losowych lub niewyrównanych należy użyć szerokiego kanału (3 mm szerokości x 200 μm wysokości) o podciśnieniu 10 mm Hg lub mniejszym.</li>
		<li>W przypadku wyrównanych matryc należy użyć wąskiego kanału (1 mm szerokości x 200 μm wysokości) o podciśnieniu 60 mm Hg lub większym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij zamontowany kanał z lodu i umieść na czystej, odkażonej powierzchni okapu z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Pracuj szybko i załaduj 120 - 150 μl zneutralizowanego kolagenu do portu A (ryc. 2b).</li>
	<li>Pobrać kolagen przez kanał, umieszczając pipetę o pojemności 25 ml podłączoną do przewodu próżniowego nad portem c (Rysunek 2b). Wciągnij kolagen jednym, jednostajnym ruchem. WAŻNE: W przypadku matryc losowych lub niewyrównanych powoli narysuj kolagen w poprzek kanału (około 0,5 - 1 mm na sekundę) i zatrzymaj się, gdy dotrze do końca. W przypadku wyrównanych matryc przeciągnij kolagen szybciej, ale uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Ostrożnie usuń nadmiar kolagenu z obszaru portu za pomocą pipetmana lub aspiratora p200.</li>
	<li>Umieść sterylne plastry PDMS na obu portach A i C. Wszystkie porty powinny być teraz pokryte.</li>
	<li>Po 2 - 3 minutach usuń środkową łatkę PDMS (port B) i dodaj 2 - 3 μl komórek (5 - 10 tys. komórek) do środkowego portu. Pozostawić do częściowej polimeryzacji (zmętnienia) w temperaturze pokojowej przez kolejne 10 - 15 minut.</li>
	<li>Po 10 - 15 minutach przenieść do 37 °C na dodatkowe 15 - 30 minut do zakończenia polimeryzacji. Zdejmij pokrywy PDMS i dodaj pożywkę, aby w razie potrzeby całkowicie zakryć kanał i komórki hodowli. Komórki można karmić, usuwając ml starej pożywki i zastępując ją ml nowej pożywki.</li>
</ol>

<ol><li>Conklin, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+collagen+is+a+prognostic+signature+for+survival+in+human+breast+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma.</a> Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, 38(2006).</li>
<li>Riching, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+collagen+alignment+limits+protrusions+to+enhance+breast+cancer+cell+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence.</a> Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).</li>
<li>Even-Ram, S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+in+3D+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell migration in 3D matrix.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolarized+signaling+reveals+two+distinct+modes+of+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration.</a> J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).</li>
<li>Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK-generated+contractility+regulates+breast+epithelial+cell+differentiation+in+response+to+the+physical+properties+of+a+three-dimensional+collagen+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix.</a> J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype%2C+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li>
<li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+Rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).</li>
<li>Guo, C., Kaufman, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+and+magnetic+field+induced+collagen+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Flow and magnetic field induced collagen alignment.</a> Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).</li>
<li>Sung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+3-dimensional+collagen+matrix+polymerization+for+reproducible+human+mammary+fibroblast+cell+culture+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices.</a> Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).</li>
<li>Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+alignment+of+collagen+fibers+for+in+vitro+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture.</a> Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).</li>
<li>Wozniak, M. A., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+three-dimensional+collagen+gels+to+study+mechanotransduction+in+T47D+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proced+Online%22%5BJournal%5D)">Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells.</a> Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGallagher%2C+S+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).</li>
<li>Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+X+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22">Current protocols in molecular biology</a>. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).</li>
<li>Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+mechanical+properties+of+three-dimensional+type+I+collagen+extracellular+matrices+with+varied+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech+Eng%22%5BJournal%5D)">Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure.</a> J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).</li>
<li>Bredfeldt, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+segmentation+of+collagen+fibers+from+second-harmonic+generation+images+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer.</a> J Biomed Opt. 19, 16007(2014).</li>
<li>Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+model+of+ductal+carcinoma+in+situ+with+3D%2C+organotypic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure.</a> BMC Cancer. 15, 12(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Żele kolagenowe 3D są cennym dodatkiem do naszego zestawu narzędzi, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki interpretują i reagują na swoje lokalne mikrośrodowisko. Ten manuskrypt dostarczył bardzo podstawowy protokół osadzania komórek w matrycy kolagenowej 3D i powtarzalnego generowania matryc z losowymi lub wyrównanymi włóknami kolagenowymi. Oba protokoły działają jako adaptowalne platformy, w których różne izoformy kolagenu, środki sieciujące lub inne białka macierzy mogą być potencjalnie dodawane w czasie polimeryzacji....

Wiele procesów komórkowych zostało dogłębnie zbadanych w 2 wymiarach, tworząc w ten sposób zbiorową wiedzę o podstawowych mechanizmach sygnalizacji komórkowej. Badania te zaniedbują jednak ważne wskazówki komórkowe otrzymane z właściwości strukturalnych i mechanicznych lokalnego mikrośrodowiska komórkowego i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób komórki oddziałują na siebie w kontekście fizjologicznym, ważne jest badanie ich w testach trójwymiarowych (3D). ECM dla tych testów 3D może być pochodzenia komórkowego lub odtworzony z oczyszczonych białek. Niezależnie od źródła ECM, testy matrycowe 3D okazały się nieocenione w zrozumieniu, w jaki sposób komórki poruszają się i wchodzą w interakcje w świecie fizjologicznym. Na przykład komórki hodowane w matrycach 3D wykazują różne tryby lokomocji, które zależą od mechanicznej natury otaczającego je ECM, które nie są obserwowane w eksperymentach 2D4-6. Co więcej, komórki hodowane w 3D mają również mniej i mniej wyraźnych włókien naprężeniowych i zrostów ogniskowych niż ich odpowiedniki hodowane na twardych powierzchniach, takich jak szkło lub plastik7. 
Znaczenie kontekstowych testów 3D nie ogranicza się jednak do migracji komórek. Niektóre inne zdarzenia sygnalizacji komórkowej można zbadać tylko za pomocą testów 3D. Podczas różnicowania tkanek i komórek sztywność środowiska zewnątrzkomórkowego i ECM dostarcza sygnałów, które mogą wpływać na zdarzenia morfogenne. Na przykład kanalika nabłonkowe sutka występują tylko w matrycach 3D o niskiej sztywności, ale nie w matrycach sztywnych ani na podłożach2D 8,9. Podczas hodowli w sztywnych matrycach 3D, te same komórki nabłonkowe przyjmują nieprawidłowy fenotyp ze zwiększoną proliferacją i wypukłościami błony komórkowej napędzanymi przez zmienioną sygnalizację FAK i ERK10. Wiadomo, że na wiele innych szlaków sygnałowych i procesów komórkowych w podobny sposób wpływa sztywność lokalnego środowiska komórkowego, a te kaskady sygnałowe podkreślają znaczenie badania zdarzeń sygnalizacyjnych i fenotypu komórkowego w kontekście odpowiednich lokalnych właściwości mechanicznych ECM 3D. 
Kolagen I jest szczególnie istotnym białkiem do wykorzystania w badaniach in vitro, ponieważ jest najobficiej występującym składnikiem ECM i odpowiada za wiele właściwości mechanicznych mikrośrodowiska komórkowego. Chociaż pierwotnie uważano je jedynie za białko strukturalne, obecnie wiadomo, że jego rola jest znacznie bardziej złożona. Skład włókien kolagenowych, architektura, orientacja, gęstość i sztywność zapewniają skoncentrowane środowisko informacji sygnalizacyjnych5. Podczas postępu niektórych chorób, takich jak przewlekłe zapalenie i nowotworzenie , sieć kolagenowa ulega dramatycznej przebudowie2,11. Mówiąc dokładniej, w przypadku raka piersi zwiększone odkładanie kolagenu i sztywność tkanek towarzyszą i prawdopodobnie przyczyniają się do progresji guza. W tych wczesnych nowotworach usztywniona sieć kolagenowa wydaje się napięta i bardziej wyrównana, tak że większość włókien otacza rosnący guz2. W miarę postępu guza kolagen kontynuuje reorganizację, a obszary sieci fibrylarnej orientują się prostopadle do granicy guza2,12. Ustawienie prostopadłe służy jako biomarker prognostyczny tam, gdzie ci pacjenci mają gorszą progresję choroby i przeżycie całkowite1. Jednym z wyjaśnień tej korelacji jest to, że słabe wyniki są konsekwencją zwiększonego rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych poprzez trwałą migrację komórek w wyrównanych sieciach kolagenowych3. 
Aby zrozumieć, jak komórki reagują na wyrównanie i organizację, które obserwuje się w progresji guza, konieczne jest wygenerowanie zarówno losowych, jak i wyrównanych matryc kolagenowych 3D do eksperymentów. Istnieją trzy podstawowe metodologie indukowania wyrównania w sieciach fibrylarnych. Pierwsza technika wykorzystuje urządzenie wywołujące napięcie, w którym kolagen między dwoma punktami jest kurczony lub rozciągany w celu wytworzenia wyrównania. Włókna równoległe do osi siły są naciągane, podczas gdy włókna prostopadłe do osi są ściskane i wyginane. Podczas gdy techniki wywołane naprężeniami zazwyczaj zapewniają doskonałe wyrównanie, takie podejście wymaga nieporęcznego sprzętu, którego nie można łatwo dostosować do wielu platform3,13. Alternatywnie, szczep indukowany komórkami można wytworzyć, umieszczając zlokalizowane czopy komórek, które następnie kurczą się i wyrównują kolagen13. Ta metoda ma problem z tym, że jest zmienna, ponieważ wiele parametrów może ulec zmianie. Druga metoda wykorzystuje kulki magnetyczne i pole magnetyczne podczas polimeryzacji w celu wywołania wyrównania kolagenu13,14. Dobre wyniki można uzyskać tą metodą przy użyciu niewyrafinowanego sprzętu, ale wymaga ona użycia przeciwciał lub innej metody namagnesowania polimeru. Dlatego może być nieco drogi w użyciu, a sztywność żelu kolagenowego jest potencjalnie modyfikowana przez zwiększone połączenia w sieci. Co więcej, kulki magnetyczne używane w tym procesie są często autofluorescencyjne, co jest problematyczne w eksperymentach obrazowych. Wreszcie, wyrównanie może być generowane przez kanały mikroprzepływowe PDMS3,15,16. W tej metodzie wyrównanie kolagenu uzyskuje się poprzez przepływ polimeryzującego kolagenu przez małe kanały mikroprzepływowe. Te kanały mikroprzepływowe mogą być wykonane w wielu wersjach i można je łatwo dostosować do wielu platform. Ponadto są bardzo ekonomiczne, ponieważ ze względu na ich niewielkie rozmiary stosuje się bardzo małe ilości kolagenu i innych odczynników.
Dostępny jest prosty protokół osadzania komórek w trójwymiarowym, fibrylarnym hydrożelu kolagenowym. Ponadto zapewniona jest również bardziej zaawansowana technika, w której kanały mikroprzepływowe PDMS są wykorzystywane do kontrolowania organizacji i wyrównania macierzy kolagenowej. Protokół ten można łatwo dostosować do wielu platform i może odtwarzalnie generować zarówno wyrównane, jak i losowe matryce kolagenowe do badania migracji komórek, podziału komórek i innych procesów komórkowych w trójwymiarowym, fizjologicznym mikrośrodowisku.

<table><tbody><tr><td>Kolagen o wysokim stężeniu Rat Tail</td> Zestaw <td></td> elastomerów <td>Corning</td> 354249 <td></td></tr><tr><td>SylGard184</td><td>Corning</td><td>NC9285739</td><td>Elastomer do kanałów PDMS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310</td><td>Do buforu neutralizującego HEPES</td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP366</td><td>Do buforu neutralizacyjnego HEPES</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>BP362</td><td>Do bufora neutralizującego HEPES</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S374</td><td>Do buforu neutralizacyjnego HEPES</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358</td><td>Do bufora neutralizacyjnego HEPES</td></tr><tr><td>Levy Ulepszony hemacytometr Neubauer</td><td>Fisher</td><td>15170-208</td><td>zliczanie komórek</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli nietkankowej&nbsp;</td><td>Corning</td><td>351146</td><td></td></tr><tr><td>50 mm szklane naczynie dolne</td><td>MatTek</td><td>P50g-1.5-30-f</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy eksykator próżniowy Bel-Art</td><td>Bel-Art</td><td>F4200-2021</td><td>Komora odgazowująca do</td></tr><tr><td>folii przezroczystej PDMS&nbsp;</td><td>3M</td><td>pp2950</td><td>Folia z tworzywa sztucznego do nalewania kanałów pdms</td></tr><tr><td>ThermoScientific CimaRec</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>HP141925</td><td>Płyta grzejna do utwardzania mikrokanalików PDMS</td></tr><tr><td>Regulator podciśnienia</td><td>Precision Medical</td><td>PM3100</td><td>Regulator podciśnienia do mikrokanalików kolagenowych</td></tr><tr><td>Arkusz gumowy 8 "x 8"</td><td>Amazon - Silikon kauczukowy</td> - arkusz gumowy <td>60A</td><td>do nalewania mikrokanału PDMS</td></tr><tr><td>Arkusz akrylowy 8 "x 8" x 0,125 "</td><td>Amazon</td><td>Arkusze pleksi</td><td>do nalewania mikrokanalików PDMS</td></tr><tr><td>Ciężarki 10 funtów</td><td>Amazon</td><td>CAP Sztanga</td><td>do nalewania mikrokanalików PDMS</td></tr><tr><td>15 ml Rurki stożkowe</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurki stożkowe</td><td>Fisher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Pipety plastikowe</td><td>Dot Scientific</td><td>229202B, 229206B i 667225B</td><td>2&nbsp; ml, 5&nbsp; ml oraz 25&nbsp; ml</td></tr><tr><td>70% EtOH</td><td>Fisher</td><td>NC9663244</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie żeli kolagenowych 3d i mikrokanalików do badania oddziaływań 3d in vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historycznie rzecz biorąc, większość procesów komórkowych była badana tylko w 2 wymiarach. Chociaż badania te dostarczyły informacji na temat ogólnych mechanizmów sygnalizacji komórkowej, zaniedbują ważne wskazówki komórkowe otrzymane z właściwości strukturalnych i mechanicznych lokalnego mikrośrodowiska i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Aby zrozumieć, w jaki sposób komórki oddziałują w fizjologicznym ECM, ważne jest badanie ich w kontekście testów trójwymiarowych. Migracja komórek, różnicowanie komórek i proliferacja komórek to tylko kilka procesów, na które, jak wykazano, mają wpływ lokalne zmiany właściwości mechanicznych 3-wymiarowego ECM. Kolagen I, rdzeń fibrylarnego składnika ECM, jest czymś więcej niż prostym elementem strukturalnym tkanki. W normalnych warunkach mechaniczne sygnały z sieci kolagenowej kierują morfogenezą i utrzymują struktury komórkowe. W chorobowych mikrośrodowiskach, takich jak mikrośrodowisko guza, sieć kolagenowa jest często dramatycznie przebudowana, wykazując zmieniony skład, zwiększone odkładanie i zmienioną organizację włókien. W raku piersi stopień wyrównania włókien jest ważny, ponieważ wzrost wyrównanych włókien prostopadłych do granicy guza jest skorelowany z gorszym rokowaniem pacjenta1. Wyrównane matryce kolagenowe powodują zwiększone rozprzestrzenianie się komórek nowotworowych poprzez trwałą migrację2,3. Poniżej znajduje się prosty protokół osadzania komórek w trójwymiarowym, fibrylarnym hydrożelu kolagenowym. Protokół ten można łatwo dostosować do wielu platform i może odtwarzalnie generować zarówno wyrównane, jak i losowe matryce kolagenowe do badania migracji komórek, podziału komórek i innych procesów komórkowych w dostrajanym, trójwymiarowym, fizjologicznym mikrośrodowisku.

Chociaż testy 3D można przeprowadzać w żelu kolagenowym o tej samej sztywności, zmiana sztywności żelu może posłużyć do określenia, jak komórki zareagują na zmiany mechaniczne w swoim mikrośrodowisku komórkowym. Sztywny hydrożel kolagenowy to taki żel, w którym osadzone komórki nie są w stanie lokalnie skurczyć otaczającego je kolagenu. Wewnętrzna zdolność do skurczu różnych typów komórek jest unikalna, dlatego najlepiej rozpocząć od prostej krzywej kurczliwości, aby ustalić stężenie kola...

Kolagen jest kluczowym składnikiem ECM i dostarcza niezbędnych wskazówek dla kilku procesów komórkowych, począwszy od migracji, a skończywszy na różnicowaniu i proliferacji. Poniżej przedstawiono protokół osadzania komórek w hydrożelach kolagenowych 3D oraz bardziej zaawansowaną technikę generowania losowych lub wyrównanych matryc kolagenowych przy użyciu mikrokanałów PDMS.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie uporządkowanych (wyrównanych) oraz losowych trójwymiarowych macierzy kolagenowych w celu obserwacji migracji komórek lub innych procesów komórkowych w kontekście środowiska 3D. Metoda ta została opracowana, aby odtworzyć cechy kolagenu występujące w tkankach rzeczywistych, co może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania, takie jak mechanizmy wykorzystywane przez komórki do rozpoznawania uporządkowanej lub losowej macierzy pozakomórkowej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość manipulowania organizacją środowiska 3D oraz obrazowania w nim znajdujących się komórek w sposób kosztowo efektywny, przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności z powodu niewystarczającego wymieszania roztworu kolagenu z buforem neutralizującym oraz niespójnego wprowadzania kolagenu do kanałów. Procedurę tę zaprezentuje Brian Burkel, starszy naukowiec w moim laboratorium. Na początek należy dokładnie wymieszać kolagen z buforem HEPES przed dodaniem komórek i pożywki, aby zapewnić właściwą neutralizację kolagenu.Następnie dodać komórki oraz pożywkę do zneutralizowanej mieszaniny kolagenu i

preparation-3d-collagen-gels-microchannels-for-study-3d-interactions

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Tworzenie mikrotkanek przy użyciu cylindrycznych żeli kolagenowych, nazywanych modułami, które zawierają zatopione komórki, a ich powierzchnia jest pokryta komórkami śródbłonka.

Wytwarzanie mikrotkanek z wykorzystaniem modułów żelu kolagenowego zawierającego komórki

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji komórek odpornościowych osadzonych w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenowej za pomocą mikroskopii świetlnej. Protokół ten wyjaśnia również, jak śledzić migrację komórek w 3D. Protokół ten można zastosować do innych typów komórek zawiesinowych w matrycy 3D.

Mikroskopia arkuszowa światła do trójwymiarowej wizualizacji ludzkich komórek odpornościowych

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Ten protokół demonstruje użycie kanału mikroprzepływowego o zmieniającej się geometrii wzdłuż kierunku przepływu płynu do generowania naprężeń rozciągających (rozciągających) w celu wyrównania włókien w hydrożelu kolagenowym 3D (&lt;250 μm grubości). Wynikowe wyrównanie rozciąga się na kilka milimetrów i ma na nie wpływ szybkość odkształcania rozciągającego.

Mikroinżynieryjne hydrożele kolagenowe 3D z wyrównaniem włókien dalekiego zasięgu

Tutaj prezentujemy protokół hodowli komórek IDG-SW3 w trójwymiarowej (3D) macierzy zewnątrzkomórkowej.

Hodowla komórkowa IDG-SW3 w trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej

Poznaj metodę przygotowania wyrównanych i losowych żeli kolagenowych 3D do badania migracji komórek oraz procesów komórkowych w środowisku trójwymiarowym. Technika ta pozwala na kontrolowane badanie interakcji komórek z macierzą pozakomórkową.

Przygotowanie żeli kolagenowych 3D i mikrokanalików do badania oddziaływań 3D in vivo

Przeglądaj więcej filmów