Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Ogólnym celem tego protokołu jest ustanowienie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego i przeprowadzenie chemicznych badań przesiewowych przy użyciu tego modelu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji wątroby. Takich jak molekularne i komórkowe mechanizmy regeneracji hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona opłacalna i oszczędza czas w badaniach przesiewowych chemicznych vevo. Ponadto można przeprowadzić szczegółową analizę przebiegu czasowego poprzez wizualizację pojedynczej komórki. Procedurę zademonstrują Mianbo Huang, doktor habilitowany, i Jin Xu, doktorant z laboratorium.

Po przygotowaniu odczynników zgodnie z protokołem tekstowym należy założyć zbiorniki godowe z przegrodami przy użyciu dorosłego transgenicznego danio pręgowanego zawierającego białko wiążące kwasy tłuszczowe 10a: CFP-NTR z Tp1: mCherry i Tg (ręka2: EGFP) Danio pręgowany. Następnego ranka, dwie godziny po usunięciu przegródek, zbierz zarodki, odcedzając wodę systemową i przenosząc zarodki na 100-milimetrowe szalki Petriego zawierające pożywkę dla zarodków. Po 56 godzinach od zapłodnienia (HPF) dodaj 1,5 procent etanolu do zarodków.

Użyj plastikowej folii do przykrycia płyt, aby zapobiec parowaniu etanolu. Następnie inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Przygotuj świeże 15-milimolowe MTZ i pożywkę zarodkową z 0,1 procentowym DMSO i dodaj etanol do końcowego stężenia 1,5 procent.

Następnie, w temperaturze 80 HPF, potraktuj posortowane zarodki 20 mililitrami roztworu etanolu MTZ na szalkę Petriego. Użyj folii plastikowej, aby przykryć płytki, aby zapobiec parowaniu etanolu i przykryj folią, aby chronić przed światłem. Następnie inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia obserwuj zarodki pod mikroskopem epifluorescencyjnym przy użyciu filtra CFP i powiększenia 80x, aby uporządkować larwy z prawie całkowitą ablacją hepatocytów. Aby przeprowadzić badania przesiewowe chemiczne, wyjmij 96 płytek dołkowych zawierających dziesięć milimolowych zapasów chemicznych w DMSO z zamrażarki o ujemnej temperaturze 80 stopni. Użyj folii aluminiowej do przykrycia płyt, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji chemikaliów i rozmrozić z delikatnym kołysaniem w temperaturze pokojowej.

W probówkach o pojemności 1,5 mililitra przygotuj roztwory chemiczne, rozcieńczając pięć mikrolitrów dziesięciomilimolowych roztworów podstawowych jednym mililitrem pożywki zarodkowej do końcowego stężenia 50 mikromolowych. Następnie przenieś pięć larw na studzienkę z prawie całkowitą ablacją hapatocytów do 24-dołkowych płytek wypełnionych pożywką zarodkową. Następnie usuń pożywkę zarodkową i dodaj 500 mikrolitrów roztworów chemicznych do każdej studzienki.

Folią aluminiową przykryj płytki i wysiaduj larwy w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 50 godzin. Po inkubacji obserwować liczbę i/lub intensywność hepatocytów wykazujących ekspresję CFP pod mikroskopem epifluoesentowym przy 80-krotnym powiększeniu. Obraz żywych larw ze zwiększoną lub zmniejszoną liczbą i/lub intensywnością hapatocytów wykazujących ekspresję CFP.

Stwórz krycia transgenicznych danio pręgowanego zawierających białko wiążące kwasy tłuszczowe 10a:CFP-NTR z TP1:mCherry i podnieś posortowane larwy do wieku od sześciu do 12 miesięcy. Użyj siatki, aby przenieść dorosłego transgenicznego danio pręgowanego do zbiorników godowych. Przygotuj świeży jeden procent etanolu w wodzie systemowej, a następnie użyj 500 mililitrów roztworu, aby zastąpić wodę systemową w współpracujących zbiornikach.

Inkubować zbiorniki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 72 godziny, przenosząc ryby do świeżego roztworu etanolu i usuwając martwe ryby codziennie podczas inkubacji. Przygotuj świeży dziesięciomilimolowy roztwór MTZ w wodzie systemowej z 0,1 procentowym DMSO, a następnie dodaj 500 mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu MTZ do ryb w jednolitrowych zbiornikach godowych. Użyj folii aluminiowej do przykrycia zbiorników.

Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez osiem godzin i analizować zgodnie z protokołem tekstowym. Po znieczuleniu zgodnie z protokołem tekstowym należy odsłonić narządy przewodu pokarmowego za pomocą nożyczek do przecięcia skóry i podkreślenia mięśni wzdłuż brzucha od płetwy odbytowej do wieczka. Następnie przeciąć z tyłu wzdłuż boku ryby z powrotem do płetwy odbytowej.

Umieść rybę w piętnastomililitrowej stożkowej rurce i użyj PBS do jednokrotnego umycia. Następnie usuń PBS i dodaj cztery mililitry świeżo przygotowanego trzyprocentowego formaldehydu do buforu PEM. Inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby utrwalić rybę.

Następnego dnia, po umyciu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeciąć przełyk, aby wypreparować całe jelito z wątrobą z jamy ciała. Następnie umieść narządy żołądkowo-jelitowe w formie do cięcia i użyj czteroprocentowej agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby zatopić tkankę. Następnie przytnij blok do kształtu trapezu i przyklej go do podstawy.

Następnie użyj wibratomu i zaczynając od wewnętrznego końca tkanki, pokrój próbki na poprzeczne odcinki w odstępach pięćdziesięciu mikrometrów do lodowatego PBS. Użyj pędzla numer jeden, aby przenieść sekcje na sześciodołkową płytkę z PBS. Po barwieniu immunologicznym skrawków zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą pędzla numer jeden delikatnie przenieś skrawki na szkiełka.

Użyj chusteczek kimwipe, aby usunąć nadmiar PBS przed dodaniem kropli podłoża montażowego i szkiełka nakrywkowego. Następnie użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkło nakrywkowe. Wreszcie, korzystając z systemu konfokalnego wyposażonego w soczewkę olejową 40x 1,3 NA, rejestruj obrazy Z-Stack z siłą od 20 do 50 procent i w odstępach jednego mikroamperometru.

Rysunek ten pokazuje, że larwy poddane działaniu etanolu MTZ rozwijają krzywiznę tułowia i ogona w górę, paricardialidema i brak napompowania pęcherza pławnego. Jak widać tutaj, wątroby kontrolne leczone DMSO nie wykazały odkładania się kolagenu typu 1 strzałkowego. Podczas gdy wątroby leczone etanolem MTZ wykazywały podwyższoną akumulację kolagenu typu pierwszego po 25 i 50 godzinach od ablacji.

Ponadto, w porównaniu z wątrobami kontrolowanymi leczonymi DMSO, HSC zwiększyła się i przyjęła kształt podobny do miofibrylblastu bez procesów cytoplazmatycznych w regenerujących wątrobach leczonych etanolem MTZ. Rysunek ten pokazuje rozwój modelu zwłóknienionej wątroby indukowanej etanolem u dorosłych danio pręgowanych, którym podawano jeden procent etanolu, a następnie MTZ. Na podstawie tych analiz przebiegu czasowego zaobserwowano znacznie podwyższone odkładanie się kolagenu typu pierwszego w regenerujących się wątrobach leczonych etanolem MTZ po dwóch, trzech i czterech dniach od ablacji, w porównaniu z wątrobami leczonymi DSMO.

W tym chemicznym eksperymencie przesiewowym hepatocyty poddano ablacji w obecności 1,5 procent etanolu i 15 milimolowych MTZ. Larwy były następnie wystawione na działanie chemikaliów przez 50 godzin. Szereg agonistów wint, takich jak inhibitory kinazy syntazy glikogenu-3 i aktywator wint, sprzyjało regeneracji hepatocytów w porównaniu z DMSO.

Dane te sugerują, że ten trwały model zwłóknienia stanowi nieocenione narzędzie do odkrywania małych cząsteczek, które usprawniają regenerację hepatocytów. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o osiągnięciu niemal całkowitej ablacji hepatocytów i utrzymaniu stężenia etanolu przez cały czas trwania zabiegu.

Po tej procedurze można przetestować skuteczność zidentyfikowanych związków chemicznych w modelach uszkodzeń wątroby u ssaków. Po opracowaniu, technika ta może otworzyć nowe możliwości w dziedzinie terapii regeneracji komórkowej w celu zbadania potencjalnego odkrycia nowych strategii terapeutycznych dla pacjentów z przewlekłą niewydolnością wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak opracować model zwłóknienia wątroby indukowanej etanolem u danio pręgowanego i jak wykonywać badania chemiczne.

Nie zapominaj, że praca z formaldehydem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i obchodzenie się z odczynnikiem w dygestoriach chemicznych.