Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie modelu włóknienia wątroby indukowanego etanolem u rybek zebrafish oraz przeprowadzenie przesiewów chemicznych z wykorzystaniem tego modelu. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu regeneracji wątroby, takie jak molekularne i komórkowe mechanizmy regeneracji hepatocytów w wątrobie objętej procesem włóknienia.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona efektywna kosztowo i oszczędza czas podczas przesiewania chemicznego in vevo. Ponadto, dzięki wizualizacji pojedynczej komórki, można przeprowadzić szczegółową analizę przebiegu czasowego. Procedurę zademonstrują Mianbo Huang, postdoc, oraz Jin Xu, doktorant z laboratorium.

Po przygotowaniu odczynników zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować zbiorniki do rozrodu z przegrodami, wykorzystując dorosłe transgeniczne danio pręgowane zawierające białko wiążące kwasy tłuszczowe 10a:CFP-NTR z Tp1:mCherry oraz danio pręgowane Tg(hand2:EGFP). Następnego ranka, dwie godziny po usunięciu przegród, należy zebrać zarodki poprzez przefiltrowanie wody z układu i przeniesienie zarodków do 100 milimetrowych szalek Petri zawierających pożywkę dla zarodków. W 56 godzinach po zapłodnieniu, czyli HPF, należy dodać do zarodków 1,5 procent etanolu.

Przykryć płytki folią spożywczą, aby zapobiec odparowywaniu etanolu. Następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez 24 godziny. Przygotować świeży roztwór MTZ o stężeniu 15 mM oraz pożywkę dla embrionów z 0,1% DMSO i dodać etanol do stężenia końcowego 1,5%.

Następnie, w 80 HPF, potraktuj posortowane embriony 20 mililitrami roztworu MTZ w etanolu na każdą szalkę Petriego. Przykryj szalki folią spożywczą, aby zapobiec odparowywaniu etanolu, a następnie owiń folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny.

Następnego dnia obserwuj embriony pod mikroskopem epifluorescencyjnym, używając filtra CFP i powiększenia 80x, aby wyselekcjonować larwy z niemal całkowitą ablacją hepatocytów. W celu przeprowadzenia przesiewów chemicznych wyjmij z zamrażarki do -80°C płytki 96-dołkowe zawierające 10 mM zapasy związków chemicznych w DMSO. Przykryj płytki folią aluminiową, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji związków, a następnie rozmroź je, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej.

W probówkach o pojemności 1,5 ml przygotować roztwory chemiczne poprzez rozcieńczenie 5 µL roztworów stokowych o stężeniu 10 mM w 1 ml pożywki dla embrionów do stężenia końcowego 50 µM. Następnie przenieść po pięć larw z niemal całkowitą ablacją hepatocytów do studzienek płytek 24-dołkowych wypełnionych pożywką dla embrionów. Po tym usunąć pożywkę dla embrionów i dodać 500 µL roztworów chemicznych do każdej studzienki.

Przykryj płytki folią aluminiową i inkubuj larwy w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 50 godzin. Po inkubacji określ liczbę i/lub intensywność hepatocytów wykazujących ekspresję CFP za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 80x. Wykonaj zdjęcia żywych larw o zwiększonej lub zmniejszonej liczbie i/lub intensywności hepatocytów wykazujących ekspresję CFP.

Przeprowadź krzyżowanie transgenicznych danio pręgowanych zawierających białko wiążące kwasy tłuszczowe 10a:CFP-NTR z TP1:mCherry i hoduj wyselekcjonowane larwy do wieku od sześciu do 12 miesięcy. Użyj siatki, aby przenieść dorosłe transgeniczne danio pręgowane do zbiorników do rozrodu. Przygotuj świeży jeden procentowy roztwór etanolu w wodzie systemowej, a następnie użyj 500 milliliters tego roztworu, aby zastąpić wodę systemową w zbiornikach do rozrodu.

Inkubować zbiorniki w temperaturze 28°C przez 72 godziny, codziennie przenosząc ryby do świeżego roztworu etanolu i usuwając martwe osobniki podczas inkubacji. Przygotować świeży roztwór MTZ o stężeniu 10 mM w wodzie systemowej z 0,1% DMSO, a następnie dodać 500 ml uprzednio ogrzanego roztworu MTZ do ryb w jednolitrowych zbiornikach tarłowych. Przykryć zbiorniki folią aluminiową.

Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez osiem godzin i analizować zgodnie z protokołem tekstowym. Po znieczuleniu zgodnie z protokołem tekstowym odsłonić narządy przewodu pokarmowego, używając nożyczek do przecięcia skóry i mięśni podskórnych wzdłuż brzucha od płetwy odbytowej do pokrywy skrzelowej. Następnie wykonać cięcie w kierunku tylnym wzdłuż boku ryby z powrotem do płetwy odbytowej.

Umieść rybę w piętnastomililitrowej probówce stożkowej i przemyj raz roztworem PBS. Następnie usuń PBS i dodaj cztery mililitry świeżo przygotowanej trzyprocentowej formaldehydy w buforze PEM. Inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsius overnight w celu utrwalenia ryby.

Następnego dnia, po przemyciu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeciąć przełyk, aby wypreparować cały przewód pokarmowy wraz z wątrobą z jamy ciała. Następnie narządy układu pokarmowego należy umieścić w formie do sekcjonowania i zatopić tkankę w 4% niskotopliwej agarozie. Następnie blok należy przyciąć do kształtu trapezu i przykleić do podstawy.

Następnie, używając wibrotomu i zaczynając od wewnętrznego końca tkanki, należy pociąć próbki w przekroje poprzeczne w odstępach 50 µm do lodowatego PBS. Użyj pędzla numer 1, aby przenieść przekroje do płytki 6-dołkowej z PBS. Po przeprowadzeniu immunostainingu przekrojów zgodnie z protokołem tekstowym, użyj pędzla numer 1, aby delikatnie przenieść przekroje na szkiełka przedmiotowe.

Użyj chusteczek Kimwipes, aby usunąć nadmiar PBS, a następnie dodaj kroplę medium montażowego i nałóż szkiełko nakrywkowe. Następnie użyj laku do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe. Na koniec, korzystając z systemu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy 40x 1,3 NA, wykonaj obrazy Z-Stack przy mocy od 20 do 50% i w odstępach 1 µm.

Rysunek ten pokazuje, że larwy traktowane etanolem i MTZ rozwijają wygięcie tułowia i ogona ku górze, obrzęk osierdzia oraz brak możliwości napompowania pęcherza pławnego. Jak widać, wątroby kontrolne traktowane DMSO nie wykazały włóknistego odkładania kolagenu typu I. Natomiast w wątrobach traktowanych etanolem i MTZ stwierdzono zwiększone gromadzenie kolagenu typu I w 25. i 50. godzinie po ablacji.

Ponadto, w porównaniu z kontrolnymi wątrobami traktowanymi DMSO, w regenerujących się wątrobach traktowanych etanolem i MTZ zaobserwowano zwiększenie liczby komórek HSC, które przybrały kształt przypominający myofibroblasty i utraciły wypustki cytoplazmatyczne. Rysunek ten przedstawia rozwój modelu włóknienia wątroby indukowanego etanolem u dorosłych rybek Zebrafish traktowanych jedno procentowym etanolem, a następnie MTZ. Z analiz przebiegu czasowego wynika, że w regenerujących się wątrobach traktowanych etanolem i MTZ, w drugim, trzecim i czwartym dniu po ablacji, odnotowano znacząco zwiększone odkładanie kolagenu typu I w porównaniu z wątrobami traktowanymi DMSO.

W tym eksperymencie przesiewowym z użyciem substancji chemicznych hepatocyty usunięto w obecności 1,5% etanolu i 15 mM MTZ. Następnie larwy eksponowano na działanie substancji chemicznych przez 50 godzin. Liczne agoniści szlaku Wnt, takie jak inhibitory kinazy syntazy glikogenu-3 oraz aktywator Wnt, promowały regenerację hepatocytów w porównaniu z grupą DMSO.

Dane te sugerują, że ten model trwałego włóknienia stanowi nieocenione narzędzie do odkrywania małych cząsteczek zwiększających regenerację hepatocytów. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego tygodnia. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby dążyć do niemal całkowitej ablacji hepatocytów oraz utrzymywać stałe stężenie etanolu przez cały czas trwania procesu.

Po zastosowaniu tej procedury można przetestować skuteczność zidentyfikowanych związków chemicznych w modelach uszkodzeń wątroby ssaków. Po rozwinięciu ta technika może otworzyć nowe możliwości w dziedzinie terapii regeneracji komórkowej w celu zbadania potencjału odkrycia nowych strategii terapeutycznych dla pacjentów z przewlekłą niewydolnością wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak opracować model zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u rybek Zebrafish oraz jak przeprowadzać przesiewy chemiczne.

Należy pamiętać, że praca z formaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i posługiwanie się odczynnikiem w dygestorium chemicznym.