Name: Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Poznaj model zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u Danio rerio do badania regeneracji hepatocytów. Ta metoda umożliwia przeprowadzanie ekonomicznych badań przesiewowych chemicznych in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty z GTEC (2731336 i 1411318), NIH (K01DK081351) i NSF (1354837) dla C. H. S. Dziękujemy Alemowi Giorgisowi za krytyczną lekturę rękopisu.

Danio pręgowany został wyhodowany i wyhodowany przy użyciu standardowego protokołu, który spełnia kryteria National Institutes of Health i został zatwierdzony przez Georgia Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee. 
1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować 20 l wody z jaj (używanej zamiennie z "pożywką dla zarodków") w celu utrzymania zarodka/larwy danio pręgowanego. Rozpuść 1,5 gCaSO4 i 6 g rozpuszczalnej soli oceanicznej w 250 ml wody destylowanej. Wlać do gąsiora wypełnionego 20 l wody destylowanej i wymieszać.</li>
	<li>Przygotować 1 l roztworu podstawowego 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) (20x). Rozpuścić 0,6 g proszku PTU w 1 l wody destylowanej. Dodać 1 ml roztworu podstawowego na 20 ml pożywki zarodkowej do końcowego stężenia 0,003% jako roztwór roboczy. 
	UWAGA: PTU może powodować toksyczność ogólnoustrojową po narażeniu przez drogi oddechowe lub skórę. Przygotować i stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Przygotować 1 l roztworu podstawowego metanosulfonianu 3-aminobenzoesanu etylu (trikainy) (20x). Rozpuść 4 g trikainy w proszku w wodzie destylowanej. Doprowadzić pH do 7, dodając 1 M bufor Tris (pH 9) i doprowadzić końcową objętość do 1 l wodą destylowaną. Podwielokrotność rozpuścić w 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozmrozić przed użyciem. 
	UWAGA: Trikaina może powodować utratę czucia. Przygotować i stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Przygotować 100 ml larwalnego roztworu roboczego metronidazolu (MTZ). Przygotować świeży 15 mM roztwór MTZ, rozpuszczając 0,25 g proszku MTZ w 0,1% dimetylosulfotlenku (DMSO) w 100 ml pożywki zarodkowej. Całkowicie rozpuść proszek MTZ przez energiczne potrząsanie. Przygotuj świeży roztwór MTZ i użyj folii aluminiowej, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji MTZ. 
	UWAGA: MTZ może powodować podrażnienia. Przygotować i stosować zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się z produktem.</li>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu roboczego etanolu z larw/metronidazolu (EtOH/MTZ). Przygotuj świeży roztwór MTZ i użyj folii aluminiowej, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji MTZ. Dodać 1,5 ml 100% etanolu do 100 ml roztworu MTZ do końcowego stężenia 1,5% tuż przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować 500 ml roztworu roboczego MTZ dla dorosłych. Przygotować świeży roztwór MTZ o stężeniu 10 mM, rozpuszczając 0,83 g proszku MTZ w 0,1% DMSO w 500 ml wody systemowej. Całkowicie rozpuść proszek MTZ przez energiczne potrząsanie. Przygotuj świeży roztwór MTZ i użyj folii aluminiowej, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji MTZ.</li>
	<li>Przygotować 1 l buforu PEM. Rozpuść 30,2 g FAJKI, 0,74 g EGTA i 0,12 gMgSO4 w wodzie destylowanej. Dostosuj pH do 7 za pomocą NaOH. Doprowadzić końcową objętość do 1 l wodą destylowaną.</li>
</ol>
2. Przygotowanie larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Ustaw kojarzenie [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11]15,17 dorosłe danio pręgowane z Tg(hand2:EGFP)pd24 13 dorosłych zebry w zbiornikach godowych. Użyj dzielników, aby przeprowadzić krycie na czas.</li>
	<li>Usuń przegrodę następnego ranka i pozwól rybom łączyć się w pary bez zakłóceń. Zbierz zarodki 2 godziny później, odcedzając wodę systemową i przenosząc zarodki na 100-milimetrowe szalki Petriego z pożywką dla zarodków.</li>
	<li>Trzymaj nie więcej niż 100 zarodków na szalce Petriego. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń niezapłodnione jaja za pomocą szklanej pipety. Hodować zarodki w temperaturze 28 °C i dodać fenylotiomocznik (PTU) do końcowego stężenia 0,003% po 10 godzinach po zapłodnieniu (hpf), aby zahamować rozwój pigmentu.</li>
</ol>
3. Leczenie etanolem, metronidazolem i regeneracja wątroby u larw danio pręgowanego
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór EtOH, dodając etanol do pożywki zarodkowej do końcowego stężenia 1,5%. Nie dodawaj PTU.</li>
	<li>Traktować zarodki 20 ml roztworu etanolu na szalkę Petriego od 56 do 80 hpf. Przykryj szalki Petriego folią, aby zapobiec parowaniu etanolu.</li>
	<li>Sortuj [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mWiśnia)jh11; Larwy Tg(hand2:EGFP)pd24] o podobnej wielkości wątroby, określonej przez ekspresję CFP, przy 80 hpf. Nie należy używać trikainy podczas sortowania larw poddanych działaniu EtOH, ponieważ spowoduje to wysoką śmiertelność przy kolejnym leczeniu EtOH/MTZ. Utrzymuj posortowane larwy w zagęszczeniu 30 zarodków na szalkę Petriego.</li>
	<li>Przygotować świeże 15 mM MTZ w pożywce zarodkowej w 0,1% DMSO. Dodaj odpowiednią ilość EtOH do roztworu MTZ, aby uzyskać końcowe stężenie 1,5%. Inkubować larwy w 20 ml roztworu EtOH/MTZ na szalkę Petriego przez 24 godziny w temperaturze 28 °C. Przykryć szalki Petriego folią w celu utrzymania stężenia EtOH oraz folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.</li>
	<li>Pod koniec leczenia należy usunąć roztwór EtOH/MTZ, przenosząc larwy na nowe szalki Petriego ze świeżą pożywką dla zarodków. Umyj larwy 3 razy pożywką dla zarodków i trzymaj je w 20 ml pożywki dla zarodków bez PTU.</li>
	<li>Aby oddzielić larwy z prawie całkowitą ablacją hepatocytów, obserwuj fluorescencję pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem CFP przy powiększeniu 80X. Udana ablacja skutkuje minimalną fluorescencją CFP w wątrobie i znacznie zmniejszoną objętością wątroby.</li>
	<li>Aby uniknąć śmierci larw poddanych działaniu EtOH/MTZ, nie należy używać Trikainy do sortowania. Utrwalić larwy do barwienia immunologicznego (patrz sekcja 5) lub przechowywać posortowane larwy na szalkach Petriego w temperaturze 28 °C w celu dalszych analiz.</li>
</ol>
4. Ekrany chemiczne u larw danio pręgowanego leczonych EtOH/MTZ
<ol>
	<li>Przynieść 96-dołkowe płytki zawierające 10 mM zapasów chemicznych do DMSO (szczegółowe informacje na temat komercyjnych bibliotek chemicznych znajdują się na liście materiałów) z zamrażarki w temperaturze -80 °C. Przykryj folią aluminiową, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji chemikaliów. Rozmrozić roztwory podstawowe w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc.</li>
	<li>Przygotować roztwory chemiczne, rozcieńczając 10 mM roztwory podstawowe z pożywką zarodkową do końcowego stężenia 50 μM (na płytkach 96-dołkowych: badanie wstępne; w probówkach 1,5 ml: ponowne badanie). Larwy kontrolne traktowano równymi stężeniami DMSO w pożywce zarodkowej. </li>
	<li>Przenieś larwy z prawie całkowitą ablacją hepatocytów, które potraktowano 1,5% EtOH / 15 mM MTZ i posortowano w sposób opisany powyżej, na 96-dołkowe (wstępne badanie) lub 24-dołkowe (ponowne testowanie) płytki wstępnie wypełnione pożywką zarodkową o gęstości 5 larw na dołek. Użyj zduplikowanych studzienek dla każdej substancji chemicznej.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z zarodków i dodać 250 μl (płytki 96-dołkowe) lub 500 μl (płytki 24-dołkowe) roztworów chemicznych do każdego dołka. Przykryj płytki folią aluminiową i traktuj larwy przez 50 godzin w temperaturze 28 °C. Codziennie sprawdzaj larwy nasączone chemikaliami i usuwaj martwe larwy z poszczególnych studzienek.</li>
	<li>Pod koniec obróbki chemicznej należy obserwować liczbę i/lub intensywność hepatocytów wykazujących ekspresję CFP pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem CFP w powiększeniu 80X. Sfotografować żywe larwy wykazujące zwiększoną lub zmniejszoną liczbę i/lub intensywność hepatocytów wykazujących ekspresję CFP za pomocą aparatu cyfrowego w celu dokumentacji.</li>
	<li>Zachować larwy przez wiązanie formaldehydu do obrazowania konfokalnego, jak opisano w punkcie 5.</li>
	<li>W celu ponownego zbadania substancji chemicznych ułatwiających regenerację hepatocytów w początkowym badaniu przesiewowym, należy zbadać ich siłę działania przy wyższych i niższych stężeniach, aby znaleźć najbardziej skuteczne stężenie zgodnie z procedurami opisanymi w punktach 4.1-4.5 ("ponowne badanie").</li>
</ol>
5. Fiksacja larw danio pręgowanego, barwienie immunologiczne i obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Znieczulenie larw należy dodać Trikainę do końcowego stężenia 0,02%. Przenieść 10-15 larw do probówki o pojemności 1,5 ml i przemyć raz solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usunąć PBS i dodać 1 ml świeżo przygotowanego 2% formaldehydu do buforu PEM w celu ustalenia O/N na poziomie 4 °C. 
	UWAGA: Formaldehyd powoduje podrażnienie i jest znany jako czynnik rakotwórczy dla ludzi. Uchwyt w dygestoriach chemicznych.</li>
	<li>Roztwór utrwalający należy odpowiednio wyrzucić, a następnie przemyć 3 razy PBS w temperaturze pokojowej (RT). Utrwalone larwy można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez okres do kilku dni. Szybkie przejście do następnego kroku daje lepsze wyniki barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Ostrożnie usuń żółtko i skórę pokrywającą obszar wątroby za pomocą kleszczy #55 pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Przepuszczalność i blokowanie larw w buforze blokowym (4% albuminy surowicy bydlęcej i 0,3% Triton X-100 w PBS) O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubować z króliczym przeciwciałem anty-Kolagen I w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy przez 15 minut za każdym razem buforem do przemywania (0,3% Triton X-100 w PBS).</li>
	<li>Inkubować z AlexaFluor 647 sprzężonym przeciwciałem przeciwko królikowi osła w rozcieńczeniu 1:200 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy przez 15 minut każdy z buforem do mycia. Następnie umyj raz PBS.</li>
	<li>Delikatnie przenieś larwy na szklane szkiełka za pomocą szklanej pipety i ustaw zamocowane larwy lewą boczną stroną skierowaną do góry. Usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczek Kimwipes. Dodaj kroplę podłoża montażowego i uszczelnij szkło nakrywkowe lakierem do paznokci. Zdecydowanie zaleca się natychmiastowe wykonanie obrazowania konfokalnego.</li>
	<li>Użyj systemu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejny 40X/1.3 do robienia zdjęć. Użyj siły lasera na poziomie 20-50%. Przechwytywanie obrazów stosu Z w odstępach co 1 μm.</li>
</ol>
6. Przygotowanie dorosłego danio pręgowanego
<ol>
	<li>Ustaw kojarzenie [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11]15,17 dorosłe danio pręgowane w zbiornikach godowych. Zbierz zarodki następnego ranka, odcedzając wodę systemową i przenosząc zarodki na 100-milimetrowe szalki Petriego z pożywką dla zarodków.</li>
	<li>Trzymaj nie więcej niż 100 zarodków na szalce Petriego. Pod mikroskopem stereoskopowym usuń niezapłodnione jaja za pomocą szklanej pipety. Hoduj zarodki w temperaturze 28 °C i dodaj PTU do końcowego stężenia 0,003% po 10 hpf, aby zahamować rozwój pigmentu.</li>
	<li>Przy 4 dpf użyj Trikainy do znieczulenia larw i sortowania [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11] larwy. Wypłucz Trikainę, kilkakrotnie zmieniając pożywkę na świeżą pożywkę zarodkową. Pozwolić larwom dojść do siebie w temperaturze 28 °C, aż osiągną normalną częstość akcji serca wynoszącą 120–180 uderzeń na minutę18.</li>
	<li>Podnieś posortowane larwy do wieku 6-12 miesięcy w oparciu o standardową procedurę19.</li>
</ol>
7. Etanol, leczenie metronidazolem i regeneracja wątroby u dorosłych danio pręgowanych
<ol>
	<li>Transfer w wieku 6-12 miesięcy [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11] dorosłego danio pręgowanego do krycia zbiorników za pomocą sieci. Utrzymuj ryby w zagęszczeniu nie większym niż 10 ryb na zbiornik.</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór EtOH, dodając EtOH do wody systemowej do końcowego stężenia 1%. Dorosłe ryby należy potraktować 500 ml roztworu EtOH w każdym zbiorniku i przechowywać w inkubatorze o temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Codziennie przenoś dorosłe ryby do świeżego roztworu EtOH, odpowiednio wyrzucaj martwe ryby jako zagrożenie biologiczne. Traktuj zwierzęta w sposób ciągły przez 72 godziny przed podaniem MTZ.</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór 10 mM MTZ w wodzie systemowej w 0,1% DMSO. Roztwór MTZ należy wstępnie ogrzać w inkubatorze o temperaturze 28 °C. Potraktuj ryby 500 ml roztworu MTZ w 1 litrowym zbiorniku krzyżowym przez 8 godzin w temperaturze 28 °C, chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.</li>
	<li>Podczas zabiegu należy przestrzegać co godzinę i natychmiast usuwać martwe ryby. Usuń martwe ryby w odpowiedni sposób jako zagrożenie biologiczne. Pod koniec zabiegu MTZ należy wypłukać MTZ, dwukrotnie przenosząc zwierzęta do świeżej wody z układu.</li>
	<li>Pozwolić zwierzętom na powrót do zdrowia i utrzymać je w inkubatorze w temperaturze 28 °C. Ryby należy codziennie karmić i przenosić do wody w systemie słodkim, aż do momentu przeprowadzenia analiz.</li>
</ol>
8. Fiksacja wątroby dorosłego danio pręgowanego, barwienie immunologiczne i obrazowanie konfokalne 
<ol>
	<li>Dorosłe ryby znieczulić 0,02% trikainą i poddać eutanazji w lodowatej wodzie przez 15 minut. Osusz rybę na ręczniku papierowym i połóż na macie sekcyjnej.</li>
	<li>Odsłoń narządy żołądkowo-jelitowe, usuwając skórę i mięśnie, jak opisano wcześniej20. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę i leżący pod nią mięsień wzdłuż brzucha od płetwy odbytowej do wieczka, a następnie z tyłu wzdłuż boku ryby z powrotem do płetwy odbytowej.</li>
	<li>Umieść rybę w stożkowej tubie o pojemności 15 ml i umyj raz PBS. Usunąć PBS i dodać 4 ml świeżo przygotowanego 2% formaldehydu do buforu PEM w celu ustalenia O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Roztwór utrwalający należy właściwie wyrzucić i przemyć 3 razy PBS w temperaturze pokojowej at. Utrwalone próbki można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka dni. Natychmiastowe przejście do następnego kroku daje lepsze wyniki barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Wypreparuj całe jelito z wątrobą z jamy ciała ryby, przecinając przełyk. Osadź narządy żołądkowo-jelitowe z 4% niskotopliwą agarozą w formie do cięcia.</li>
	<li>Użyj wibratomu, aby pociąć próbki na przekroje poprzeczne w odstępach 50 μm w lodowatym PBS, zaczynając od przedniego końca. Przenieś skrawki na 6-dołkową płytkę z PBS za pomocą pędzla #1.</li>
	<li>Przepuszczalność i blokowanie odcinków w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Inkubować z króliczym przeciwciałem anty-Kolagen I w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy po 15 minut buforem do mycia.</li>
	<li>Inkubować z AlexaFluor 647 sprzężonym przeciwciałem przeciwko królikowi osła w rozcieńczeniu 1:200 w buforze blokowym O/N w temperaturze 4 °C. Przemyć 5 razy po 15 minut buforem Wash i raz PBS.</li>
	<li>Delikatnie przenieś skrawki na szkiełka za pomocą pędzla #1. Usuń nadmiar PBS za pomocą chusteczek Kimwipes, dodaj kroplę podłoża montażowego i uszczelnij szkło nakrywkowe lakierem do paznokci. Zdecydowanie zaleca się natychmiastowe wykonanie obrazowania konfokalnego.</li>
	<li>Użyj systemu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejny 40X/1.3 do robienia zdjęć. Użyj siły lasera na poziomie 20-50%. Przechwytywanie obrazów stosu Z w odstępach co 1 μm.</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem cells and liver regeneration.</a> Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).</li>
<li>Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).</li>
<li>Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of liver fibrosis.</a> Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).</li>
<li>Bataller, R., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis.</a> J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).</li>
<li>Kisseleva, T., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fibrogenic+strategies+and+the+regression+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).</li>
<li>Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+liver+fibrosis+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modeling liver fibrosis in rodents.</a> Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).</li>
<li>Gabele, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+interactive+effects+of+alcohol+and+high-fat+diet+on+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).</li>
<li>Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fatty+liver%3A+its+pathogenesis+and+mechanism+of+progression+to+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis.</a> Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Jang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+an+alcoholic+fatty+liver+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio).</a> Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+animal+model+for+alcoholic+liver+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish.</a> Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li>
<li>Parsons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-responsive+cells+initiate+the+secondary+transition+in+larval+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas.</a> Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).</li>
<li>Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+%27pacemaker%27+current+%28Ih%29+in+a+zebrafish+mutant+with+a+slow+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+structural+evolution+of+the+early+proliferating+oval+cells+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver.</a> Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).</li>
<li>Turner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).</li>
<li>Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+notch+signaling+in+the+development+of+intrahepatic+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts.</a> Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).</li>
<li>Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibration+and+metabolism+of+ethanol+in+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish.</a> Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).</li>
<li>Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+zebrafish+chemical+screening+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in zebrafish chemical screening technologies.</a> Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).</li>
<li>Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zebraflash+transgenic+lines+for+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+stem+cells+and+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).</li>
<li>Westhoff, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+automated+imaging+pipeline+for+the+analysis+of+the+zebrafish+larval+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney.</a> PLoS One. 8 (12), e82137(2013).</li>
<li>Perlman, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+drug+profiling+by+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multidimensional drug profiling by automated microscopy.</a> Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).</li>
<li>Chu, J., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+school+in+liver+development%3A+lessons+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">New school in liver development: lessons from zebrafish.</a> Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure%2C+enzyme+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+liver+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).</li>
<li>Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+the+fibrotic%2Fcirrhotic+rat+liver+by+transplanted+hepatic+stem%2Fprogenitor+cells+and+mature+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes.</a> Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Zaobserwowaliśmy regenerację hepatocytów za pośrednictwem HPC w regenerujących wątrobach leczonych EtOH / MTZ, co sugeruje, że nawet w obecności znacznej ilości białek ECM, w tym fibrylarnego kolagenu typu I, HPC zachowują swoją zdolność do regeneracji jako hepatocyty. Leczenie wyłącznie MTZ nie zwiększyło znacząco odkładania się białek ECM, podczas gdy leczenie tylko EtOH nie indukowało aktywacji HPC15. Wykorzystując skojarzone leczenie EtOH/MTZ, byliśmy w stanie zbadać regenerację zwłóknieniowej wątroby ster...

Pomimo niezwykłej zdolności regeneracyjnej hepatocytów1, które są głównym typem komórek miąższowych wątroby, przewlekła niewydolność wątroby upośledza tę zdolność, prowadząc do regeneracji zależnej od komórek progenitorowych wątroby (HPC)2.
Przewlekłe uszkodzenie wątroby jest głównie wynikiem nadużywania alkoholu, przewlekłego zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV)3 i niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD)4. Prowadzi to do trwałego zwłóknienia wątroby, które jest związane z gromadzeniem się białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Utrzymująca się akumulacja ECM zniekształca nienaruszoną architekturę wątroby poprzez tworzenie włóknistej tkanki bliznowatej5, co w konsekwencji prowadzi do marskości wątroby z wysoką zachorowalnością i śmiertelnością. Podjęto wiele prób złagodzenia odpowiedzi zwłóknieniowej, głównie poprzez skupienie się na hamowaniu cytokin profibrogennych i aktywowanych miofibroblastów6. Ten ostatni pochodzi głównie z komórek gwiaździstych wątroby (HSC), głównych komórek wątrobowych niemiąższowych odpowiedzialnych za tworzenie blizn wątrobowych4. Niemniej jednak terapie regeneracyjne, które stymulują endogenne źródła komórkowe, w tym HPC, do regeneracji hepatocytów w obecności utrzymujących się urazów fibrogennych, czekają na dalsze badania.
Wiele eksperymentalnych modeli zwłóknienia wątroby zostało opisanych u ssaków. Powtarzające się wstrzykiwanie czterochlorku węgla (CCl4) jest szeroko stosowane do wywoływania zwłóknienia wątroby w modelach mysich i szczurzych7. W połączeniu z dietą wysokotłuszczową (HF), alkohol doprowadził do znacznego zwiększenia ekspresji genów profibrogennych i zwłóknienia wątroby8. Podczas gdy stłuszczenie (nagromadzenie lipidów) wynika z ostrej ekspozycji na alkohol, sprawia, że wątroba jest podatna na cięższe uszkodzenie wątroby9.
Danio rerio, danio pręgowany, stał się nieocenionym modelem kręgowców do badania regeneracji. Chociaż inne niższe kręgowce, takie jak traszki i aksolotle, mają niezwykłą zdolność do regeneracji, danio pręgowany ma przewagę nad innymi systemami modelowymi w odniesieniu do manipulacji genami i strategii wizualizacji potrzebnych do manipulowania potencjalnymi czynnikami regeneracyjnymi10. Danio pręgowany stanowi również atrakcyjny model kręgowców do badania alkoholowej choroby wątroby (ALD) poprzez proste dodanie etanolu (EtOH) do ich wody. Ostra ekspozycja na EtOH larw i dorosłych danio pręgowanych powodowała stłuszczenie wątroby11-13. Gdy dorosłe danio pręgowane otrzymały przedłużoną ekspozycję na EtOH, zaobserwowano odkładanie się kolagenu z regulacją w górę genów związanych ze zwłóknieniem14. Istnieje jednak potrzeba opracowania modeli do badania regeneracji wątroby w odpowiedzi na EtOH jako bodziec fibrogenny.
Ostatnio opracowaliśmy model zwłóknieniowej wątroby indukowanej przez EtOH u danio pręgowanego15. Połączyliśmy system ablacji genetycznej specyficzny dla hepatocytów z leczeniem EtOH u larw i dorosłych danio pręgowanych. Wygenerowaliśmy dwie linie transgeniczne, Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1 i Tg(fabp10a:mCherry-NTR)gt2, w których nitroreduktaza E.coli (NTR) jest połączona odpowiednio z cyjanem i białkiem fluorescencyjnym mCherry, pod kontrolą specyficznego dla hepatocytów białka wiążącego kwasy tłuszczowe 10a, zasady wątroby (fabp10a) promotora. W tym systemie NTR przekształca nietoksyczny prolek metronidazol (MTZ) w czynnik sieciujący między niciami DNA16, indukując jawną śmierć hepatocytów. Korzystając z tego modelu, wykazaliśmy, że populacja komórek wątrobowych, które reagują na sygnalizację Notch, przekształciła się w hepatocyty w przypadku prawie braku hepatocytów i w nadmiarze ECM. Oznaczyliśmy te komórki jako HPC. Ponadto, za pomocą chemicznych badań przesiewowych, zidentyfikowaliśmy małocząsteczkowe aktywatory sygnalizacji Wnt i inhibitory sygnalizacji Notch, które wspomagają regenerację hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie. Dlatego nasz zwłóknieniowy model wątroby u danio pręgowanego stanowi doskonały system badań przesiewowych w porównaniu z systemem badań przesiewowych opartym na hodowlach komórkowych lub ssakach. Jest to system in vivo, który przynosi znaczne korzyści w zakresie oszczędności kosztów i czasu. Tutaj opisujemy szczegółowe procedury tworzenia zwłóknienionego modelu wątroby indukowanego przez EtOH oraz wykonywania chemicznych badań przesiewowych przy użyciu tego modelu u danio pręgowanego. Ponadto przeprowadzono analizy przebiegu w czasie, aby zbadać, w jaki sposób zachodzi regeneracja hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie. Protokół ten będzie stanowił nieocenione narzędzie do badania mechanizmów i strategii poprawy regeneracji hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie.

<table><tbody><tr><td>Siarczan wapnia półwodny (CaSO4)</td><td>Acros</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu (MgSO4)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 1,4-piperazynodienonesulfonowy (PIPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(eter 2-aminoetylowy)- N,N,N&prime;,N&prime; Kwas -tetraoctowy (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200-proof</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol (MTZ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (Trikaina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>Rozpuścić jedną tabletkę w 100 ml wody destylowanej</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Niskotopliwy Agaroza&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka związków sygnalizacyjnych komórek macierzystych</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&nbsp; Kolba mM w bibliotece DMSO</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&nbsp; Zapas mM w DMSO</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>Rozpuścić w DMSO do 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>Rozpuścić w DMSO do 10&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-kolagenowe I</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>Stosować w stosunku 1:100 do barwienia immunologicznego, reaguje z rybami</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Sondy molekularne przeciw królikom IgG (H+L) osła</td><td></td> <td>A31573</td><td>Stosować w stosunku 1:200 do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Podłoża montażowe (Vectorshield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa talerz</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>Szkło osłonowe</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>Folia plastikowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Wibrotom</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Confocol</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Trwałe zwłóknienie wątroby z kontynuacją nagromadzenia białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) powoduje utratę kompetencji komórkowych wątroby, co prowadzi do marskości wątroby z dysfunkcją komórek wątroby. Wśród wielu urazów wątroby, nadużywanie alkoholu może prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, w tym niewydolności wątroby i raka wątrobowokomórkowego. Niemniej jednak tożsamość endogennych źródeł komórkowych, które regenerują hepatocyty w odpowiedzi na alkohol, nie została odpowiednio zbadana. Co więcej, niewiele badań skutecznie modelowało regenerację hepatocytów na podstawie uszkodzeń wywołanych alkoholem. Niedawno informowaliśmy o ustaleniu modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem (EtOH) u danio pręgowanego, u którego komórki progenitorowe wątroby (HPC) spowodowały powstanie hepatocytów po prawie całkowitej utracie hepatocytów w obecności bodźca fibrogennego. Co więcej, dzięki badaniom chemicznym wykorzystującym ten model zidentyfikowaliśmy wiele małych cząsteczek, które usprawniają regenerację hepatocytów. Tutaj szczegółowo opisujemy procedury mające na celu opracowanie zwłóknieniowego modelu wątroby indukowanego przez EtOH oraz przeprowadzenie chemicznych badań przesiewowych przy użyciu tego modelu u danio pręgowanego. Protokół ten będzie kluczowym narzędziem do nakreślenia molekularnych i komórkowych mechanizmów regeneracji hepatocytów w zwłókniejącej wątrobie. Co więcej, metody te ułatwią potencjalne odkrycie nowych strategii terapeutycznych w przewlekłych chorobach wątroby in vivo.

Rysunek 1 przedstawia rozwój modelu włóknienia wątroby indukowanego EtOH u larw zebrafish. Aby zoptymalizować protokół ekspozycji larw zebrafish na EtOH, najpierw oceniono toksyczność EtOH. Larwy w 2,5 dniu po zapłodnieniu (dpf) poddano działaniu EtOH w stężeniach 1%, 1,5% lub 2% przez 24 h, po czym zastosowano jednoczesną 24-godzinną terapię EtOH/MTZ. Ekspozycja na 2% EtOH spowodowała wysoką śmiertelność, natomiast niemal wszystkie larwy poddane działaniu 1% EtOH lub mni...

Trwałe zwłóknienie z odkładaniem się nadmiernej ilości białek macierzy zewnątrzkomórkowej prowadzi do marskości wątroby. Nadużywanie alkoholu jest jedną z głównych przyczyn ciężkich chorób wątroby. Stworzyliśmy model zwłóknienia wątroby danio pręgowanego indukowanego etanolem, aby zbadać mechanizmy i strategie promowania regeneracji hepatocytów po uszkodzeniu wywołanym alkoholem.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie modelu włóknienia wątroby indukowanego etanolem u rybek zebrafish oraz przeprowadzenie przesiewów chemicznych z wykorzystaniem tego modelu. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu regeneracji wątroby, takie jak molekularne i komórkowe mechanizmy regeneracji hepatocytów w wątrobie objętej procesem włóknienia.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona efektywna kosztowo i oszczędza czas podczas przesiewania chemicznego in vevo. Ponadto, dzięki wizualizacji pojedynczej komórki, można przeprowadzić szczegółową analizę przebiegu czasowego. Procedurę zademonstrują Mianbo Huang, postdoc, oraz Jin Xu, doktorant z laboratorium.Po przygotowaniu odczynników zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować zbiorniki do rozrodu z przegrodami, wykorzystując dorosłe transgeniczne danio pręgowane zawierające białko wiążące kwasy tłuszczowe 10a:CFP-NTR z Tp1:mCherry oraz danio pręgowane Tg(hand2:EGFP). Następnego ranka, dwie godziny po usunięciu przegród, należy zebrać zarodki poprzez przefiltrowanie wody z układu i przeniesienie zarodków do 100 milimetrowych szalek Petri zawierających pożywkę dla zarodków. W 56 godzinach po zapłodnieniu, czyli HPF, należy dodać do zarodków 1,5 procent etanolu.Przykryć płytki folią spożywczą, aby zapobiec odparowywaniu etanolu. Następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez 24 godziny. Przygotować świeży roztwór MTZ o stężeniu 15 mM oraz pożywkę dla embrionów z 0,1% DMSO i dodać etanol do stężenia końcowego 1,5%.Następnie, w 80 HPF, potraktuj posortowane embriony 20 mililitrami roztworu MTZ w etanolu na każdą szalkę Petriego. Przykryj szalki folią spożywczą, aby zapobiec odparowywaniu etanolu, a następnie owiń folią aluminiową, aby chronić je przed światłem. Inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 24 godziny.Następnego dnia obserwuj embriony pod mikroskopem epifluorescencyjnym, używając filtra CFP i powiększenia 80x, aby wyselekcjonować larwy z niemal całkowitą ablacją hepatocytów. W celu przeprowadzenia przesiewów chemicznych wyjmij z zamrażarki do -80°C płytki 96-dołkowe zawierające 10 mM zapasy związków chemicznych w DMSO. Przykryj płytki folią aluminiową, aby zapobiec fotokatalitycznej degradacji związków, a następnie rozmroź je, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej.W probówkach o pojemności 1,5 ml przygotować roztwory chemiczne poprzez rozcieńczenie 5 µL roztworów stokowych o stężeniu 10 mM w 1 ml pożywki dla embrionów do stężenia końcowego 50 µM. Następnie przenieść po pięć larw z niemal całkowitą ablacją hepatocytów do studzienek płytek 24-dołkowych wypełnionych pożywką dla embrionów. Po tym usunąć pożywkę dla embrionów i dodać 500 µL roztworów chemicznych do każdej studzienki.Przykryj płytki folią aluminiową i inkubuj larwy w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 50 godzin. Po inkubacji określ liczbę i/lub intensywność hepatocytów wykazujących ekspresję CFP za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 80x. Wykonaj zdjęcia żywych larw o zwiększonej lub zmniejszonej liczbie i/lub intensywności hepatocytów wykazujących ekspresję CFP.Przeprowadź krzyżowanie transgenicznych danio pręgowanych zawierających białko wiążące kwasy tłuszczowe 10a:CFP-NTR z TP1:mCherry i hoduj wyselekcjonowane larwy do wieku od sześciu do 12 miesięcy. Użyj siatki, aby przenieść dorosłe transgeniczne danio pręgowane do zbiorników do rozrodu. Przygotuj świeży jeden procentowy roztwór etanolu w wodzie systemowej, a następnie użyj 500 milliliters tego roztworu, aby zastąpić wodę systemową w zbiornikach do rozrodu.Inkubować zbiorniki w temperaturze 28°C przez 72 godziny, codziennie przenosząc ryby do świeżego roztworu etanolu i usuwając martwe osobniki podczas inkubacji. Przygotować świeży roztwór MTZ o stężeniu 10 mM w wodzie systemowej z 0,1% DMSO, a następnie dodać 500 ml uprzednio ogrzanego roztworu MTZ do ryb w jednolitrowych zbiornikach tarłowych. Przykryć zbiorniki folią aluminiową.Inkubować w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez osiem godzin i analizować zgodnie z protokołem tekstowym. Po znieczuleniu zgodnie z protokołem tekstowym odsłonić narządy przewodu pokarmowego, używając nożyczek do przecięcia skóry i mięśni podskórnych wzdłuż brzucha od płetwy odbytowej do pokrywy skrzelowej. Następnie wykonać cięcie w kierunku tylnym wzdłuż boku ryby z powrotem do płetwy odbytowej.Umieść rybę w piętnastomililitrowej probówce stożkowej i przemyj raz roztworem PBS. Następnie usuń PBS i dodaj cztery mililitry świeżo przygotowanej trzyprocentowej formaldehydy w buforze PEM. Inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsius overnight w celu utrwalenia ryby.Następnego dnia, po przemyciu próbek zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeciąć przełyk, aby wypreparować cały przewód pokarmowy wraz z wątrobą z jamy ciała. Następnie narządy układu pokarmowego należy umieścić w formie do sekcjonowania i zatopić tkankę w 4% niskotopliwej agarozie. Następnie blok należy przyciąć do kształtu trapezu i przykleić do podstawy.Następnie, używając wibrotomu i zaczynając od wewnętrznego końca tkanki, należy pociąć próbki w przekroje poprzeczne w odstępach 50 µm do lodowatego PBS. Użyj pędzla numer 1, aby przenieść przekroje do płytki 6-dołkowej z PBS. Po przeprowadzeniu immunostainingu przekrojów zgodnie z protokołem tekstowym, użyj pędzla numer 1, aby delikatnie przenieść przekroje na szkiełka przedmiotowe.Użyj chusteczek Kimwipes, aby usunąć nadmiar PBS, a następnie dodaj kroplę medium montażowego i nałóż szkiełko nakrywkowe. Następnie użyj laku do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe. Na koniec, korzystając z systemu konfokalnego wyposażonego w obiektyw olejowy 40x 1,3 NA, wykonaj obrazy Z-Stack przy mocy od 20 do 50% i w odstępach 1 µm.Rysunek ten pokazuje, że larwy traktowane etanolem i MTZ rozwijają wygięcie tułowia i ogona ku górze, obrzęk osierdzia oraz brak możliwości napompowania pęcherza pławnego. Jak widać, wątroby kontrolne traktowane DMSO nie wykazały włóknistego odkładania kolagenu typu I. Natomiast w wątrobach traktowanych etanolem i MTZ stwierdzono zwiększone gromadzenie kolagenu typu I w 25. i 50. godzinie po ablacji.Ponadto, w porównaniu z kontrolnymi wątrobami traktowanymi DMSO, w regenerujących się wątrobach traktowanych etanolem i MTZ zaobserwowano zwiększenie liczby komórek HSC, które przybrały kształt przypominający myofibroblasty i utraciły wypustki cytoplazmatyczne. Rysunek ten przedstawia rozwój modelu włóknienia wątroby indukowanego etanolem u dorosłych rybek Zebrafish traktowanych jedno procentowym etanolem, a następnie MTZ. Z analiz przebiegu czasowego wynika, że w regenerujących się wątrobach traktowanych etanolem i MTZ, w drugim, trzecim i czwartym dniu po ablacji, odnotowano znacząco zwiększone odkładanie kolagenu typu I w porównaniu z wątrobami traktowanymi DMSO.W tym eksperymencie przesiewowym z użyciem substancji chemicznych hepatocyty usunięto w obecności 1,5% etanolu i 15 mM MTZ. Następnie larwy eksponowano na działanie substancji chemicznych przez 50 godzin. Liczne agoniści szlaku Wnt, takie jak inhibitory kinazy syntazy glikogenu-3 oraz aktywator Wnt, promowały regenerację hepatocytów w porównaniu z grupą DMSO.Dane te sugerują, że ten model trwałego włóknienia stanowi nieocenione narzędzie do odkrywania małych cząsteczek zwiększających regenerację hepatocytów. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego tygodnia. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby dążyć do niemal całkowitej ablacji hepatocytów oraz utrzymywać stałe stężenie etanolu przez cały czas trwania procesu.Po zastosowaniu tej procedury można przetestować skuteczność zidentyfikowanych związków chemicznych w modelach uszkodzeń wątroby ssaków. Po rozwinięciu ta technika może otworzyć nowe możliwości w dziedzinie terapii regeneracji komórkowej w celu zbadania potencjału odkrycia nowych strategii terapeutycznych dla pacjentów z przewlekłą niewydolnością wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak opracować model zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u rybek Zebrafish oraz jak przeprowadzać przesiewy chemiczne.Należy pamiętać, że praca z formaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i posługiwanie się odczynnikiem w dygestorium chemicznym.

development-an-ethanol-induced-fibrotic-liver-model-zebrafish-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji1. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Pamięć metaboliczna to zjawisko, dzięki któremu powikłania cukrzycowe utrzymują się i postępują bez przeszkód, nawet po osiągnięciu euglikemii farmaceutycznie. W tym miejscu opisujemy model danio pręgowanego z cukrzycą, który jest wyjątkowy, ponieważ pozwala na badanie mitotycznie przenoszonych składników epigenetycznych pamięci metabolicznej in vivo.

Model danio pręgowanego cukrzycy i pamięci metabolicznej

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem.  W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Ten protokół opisuje analizy histologiczne wątroby larw danio pręgowanego, które były leczone 2% etanolem przez 24 godziny. Takie ostre leczenie etanolem powoduje stłuszczenie wątroby i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Tutaj demonstrujemy metodę ilościowego określania wielkości wątroby u larw danio pręgowanego, umożliwiając ocenę wpływu manipulacji genetycznych i farmakologicznych na wzrost i rozwój wątroby.

Kwantyfikacja wielkości wątroby u larw danio pręgowanego za pomocą mikroskopii jasnego pola

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy, jak wygenerować model danio pręgowanego związanego z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD) w celu zbadania wpływu nadwyżki cholesterolu na mikrośrodowisko wątroby i krajobraz komórek odpornościowych.

Analiza mikrośrodowiska wątroby we wczesnej progresji niealkoholowego raka wątrobowokomórkowego związanego z stłuszczeniową chorobą wątroby u danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Poznaj model zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u Danio rerio do badania regeneracji hepatocytów. Ta metoda umożliwia przeprowadzanie ekonomicznych badań przesiewowych chemicznych in vivo.

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie modelu zwłóknienia wątroby indukowanego etanolem u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji hepatocytów za pośrednictwem komórek progenitorowych

Przeglądaj więcej filmów