Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Ogólnym celem tego zestawu procedur jest wygenerowanie trójwymiarowych kultur komórkowych, które będą funkcjonować jako surogaty raka piersi in vitro, oraz przedstawienie metody pomiaru wzrostu komórek w przekrojach histologicznych surogatów. Trójwymiarowa hodowla komórkowa jest bardziej istotną fizjologicznie metodą modelowania zachowania komórek in vitro niż dwuwymiarowa hodowla komórkowa. Zmieniając skład komórkowy w warunkach eksperymentalnych, ten zestaw procedur można dostosować do rozwiązywania różnych problemów biologicznych i oceny skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych.

W celu włączenia komórek do ECM, na lodzie, dodać komórki i pierwsze cztery powiązane składniki wymienione w tabeli pierwszej w dołączonym manuskrypcie do dwumilimetrowej probówki wirówkowej. Następnie delikatnie wymieszaj je pipetując i unikaj tworzenia się pęcherzyków. Monitoruj poziom pH za pomocą czerwieni fenolowej w 10XD MEM, aby upewnić się, że mieszanina ma pomarańczowo-różowy kolor, wskazujący pH siedem.

Jeśli mieszanina wydaje się żółta, a pH jest zbyt niskie, powoli dodawaj 7,5 procent wodorowęglanu sodu po jednej kropli na raz, aż do uzyskania odpowiedniego koloru. Pamiętaj, aby trzymać mieszaninę na lodzie i pracować szybko, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji ECM. W przypadku stałych kultur 3D należy trzymać szkiełko komory na lodzie, aby zapobiec przedwczesnej polimeryzacji ECM.

Powoli odpipetować 100 mikrolitrów mieszaniny ECM komórek do każdej studzienki szkiełka z ośmioma dołkami i pipetować mieszaninę ECM komórek wokół krawędzi studzienki, aby pomóc w lepszym rozprowadzeniu mieszaniny. Następnie inkubuj surogaty w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięciu procent CO2, przez 45 minut, aby umożliwić polimeryzację ECM. Po czterdziestu pięciu minutach dodaj 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej do każdego dołka i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2 przez czas trwania eksperymentu.

Zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa dni. Ograniczeniem hodowli 3D jest to, że dyfuzja tlenu i składników odżywczych do objętości może być niewystarczająca do wspierania żywotności komórek. Dodanie systemu bioreaktora może pomóc w przezwyciężeniu tego ograniczenia i przyspieszeniu wzrostu.

Aby obfitować kultury 3D w systemie bioreaktora, należy sterylnie przygotować i zmontować część systemu bioreaktora, w której znajdują się surogaty. W kapturze do hodowli komórkowej, za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 26, wstrzyknąć mieszaninę ECM komórki do obszaru bioreaktora perfuzyjnego przeznaczonego do przechowywania komórek i szybko przejść do następnego kroku. Aby zapewnić bardziej równomierne rozmieszczenie komórek w substytutach, umieść element bioreaktora, w którym znajdują się surogaty, w stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów.

Stale obracaj surogaty z prędkością 18 obr./min, inkubując w temperaturze 37 stopni Celsjusza w piecu do hybrydyzacji in situ lub inkubatorze przez 45 minut, aby umożliwić polimeryzację ECM. Po polimeryzacji i dodaniu pożywki podłączyć zespół bioreaktora do pompy. Rozpocznij perfuzję w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięć procent CO2.

Kontynuować perfuzję pożywki przez czas trwania doświadczenia i zmienić pożywkę zgodnie z wymaganiami dla konkretnego projektu doświadczalnego. Pod koniec eksperymentu zamknij surogaty w żelu do przetwarzania próbek, aby utrzymać surogaty w stanie nienaruszonym podczas przetwarzania i ułatwić cięcie histologiczne. W tym celu rozpuść żel do obróbki próbki w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.

Następnie odpipetować około 300 mikrolitrów żelu do przetwarzania próbek na dno oznakowanej krioformy. Za pomocą ostrza skalpela i kleszczy ostrożnie wyjmij surogat z bioreaktora lub z dołka szkiełka z ośmiodołkową komorą i umieść go w krioformach zawierających żel do przetwarzania próbek. Odpipetować około 300 mikrolitrów żelu do przetwarzania próbek, aby pokryć surogat w krioformie.

Następnie inkubuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Po zestaleniu się żelu do przetwarzania próbek należy usunąć żel do przetwarzania próbek zawierający surogat z kriomoldu i umieścić go w kasecie na tkanki. Jeżeli więcej niż jeden surogat ma być umieszczony w tej samej kasecie na tkanki, barwniki do znakowania tkanek mogą być używane do rozróżniania próbek po utrwaleniu i przetworzeniu.

Następnie umieść kasetę z tkankami zawierającą surogat w dziesięcioprocentowej neutralnej buforowej mieszance na dziesięć do dwunastu godzin w temperaturze pokojowej, aby umożliwić całkowite utrwalenie. Po utrwaleniu przenieś kasetę z tkanką zawierającą surogat do 70 procent etanolu. Utrwalony substytut jest teraz gotowy do przetworzenia na parafinę, a następnie do przekroju histologicznego.

Aby zmierzyć gęstość komórek i fotomikroskopowe obrazy wybarwionych skrawków H i E, otwórz plik obrazu surogatki. Używając narzędzia Wielokąt w ImageJ i krawędzi ECM jako prowadnicy, obrysuj obszar surogatu, przeciągając myszą i klikając, aby utworzyć punkty kontrolne. Po konspekcie wybierz pozycję Zmierz na karcie Analizowanie.

Następnie prześlij pliki obrazów używane do pomiaru obszaru zastępczego do programu Cell Profiler, przeciągając pliki obrazów na listę plików. Następnie przypisz nazwę do każdego importowanego obrazu w module Import nazw i typów i wybierz typ obrazu. Po wygenerowaniu potoku analizy uruchom tryb testowy i kliknij przycisk Uruchom w programie Cell Profiler.

Oceń przefiltrowane obiekty, aby upewnić się, że większość jąder na obrazie testowym jest odpowiednio zidentyfikowana, a optymalne parametry są dobrane do identyfikacji komórek. Zawarte jądra zostaną zakreślone na zielono. Następnie zapisz projekt, wyjdź z trybu testowego i kliknij przycisk Analizuj obrazy.

Pokazano tutaj reprezentatywny obraz wybarwionego H i E przekroju z perfuzyjnego surogatu hodowanego przez siedem dni. A to jest reprezentatywny obraz wybarwionej H i E sekcji z solidnego surogatu uprawianego przez siedem dni z podłożem zmienianym co dwa dni. Komórkowość jest znacznie niższa w stałych substytutach.

Ten wykres przedstawia porównanie średniej liczby komórek jądrzastych na obszar po siedmiu dniach wzrostu. Perfuzyjny i solidny surogat. Te dane liczbowe potwierdzają komórkowość na mikrofotografiach odcinków barwionych H i E.

Ten wykres pokazuje porównanie wskaźnika znakowania Ki-67, który jest miarą proliferacji komórek po siedmiodniowym wzroście perfundowanych i stałych substytutów. Dane te ponownie przemawiają za większym wzrostem liczby perfuzjonowanych surogatów. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak hybrydyzacja in situ i histochemia aminokwasów, na odcinkach histologicznych surogatów, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak ekspresja RNA i białka.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i przetwarzać trójwymiarowe substytuty tkanek in vitro oraz przeprowadzać analizę zastępczą na wycinkach histologicznych barwionych H i E.