Name: Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Poznaj metodę generowania trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro z wykorzystaniem bioreaktora perfuzyjnego. Technika umożliwia ocenę gęstości komórkowej i testowanie kandydatów terapeutycznych w fizjologicznie trafnym modelu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

University of Alabama w Birmingham Center for Metabolic Bone Disease przeprowadziło przetwarzanie histologiczne i sekcję surogatów. Firma Southern Research (Birmingham, AL) zapewniła wsparcie w produkcji systemu bioreaktora. Finansowanie zostało zapewnione przez Program Badań nad Rakiem Piersi (BC121367) Departamentu Obrony Stanów Zjednoczonych.

<ol><li>Hakanson, M., Textor, M., Charnley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+3D+environments+to+elucidate+the+effect+of+environmental+parameters+on+drug+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Engineered 3D environments to elucidate the effect of environmental parameters on drug response in cancer.</a> Integr Biol (Camb). 3 (1), 31-38 (2011).</li>
<li>Horning, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+tumor+model+for+in+vitro+evaluation+of+anticancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs.</a> Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).</li>
<li>Dhiman, H. K., Ray, A. R., Panda, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+chitosan+scaffold-based+MCF-7+cell+culture+for+the+determination+of+the+cytotoxicity+of+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional chitosan scaffold-based MCF-7 cell culture for the determination of the cytotoxicity of tamoxifen.</a> Biomaterials. 26 (9), 979-986 (2005).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Mao, Y., Keller, E. T., Garfield, D. H., Shen, K., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+in+tumor+microenvironment+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 303-315 (2013).</li>
<li>Paulsson, J., Micke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+cancer-associated+fibroblasts+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of cancer-associated fibroblasts in human cancer.</a> Semin Cancer Biol. 25, 61-68 (2014).</li>
<li>Roskelley, C. D., Desprez, P. Y., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix-dependent+tissue-specific+gene+expression+in+mammary+epithelial+cells+requires+both+physical+and+biochemical+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix-dependent tissue-specific gene expression in mammary epithelial cells requires both physical and biochemical signal transduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 12378-12382 (1994).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2008).</li>
<li>Ivascu, A., Kubbies, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+single-tumor+spheroids+for+high-throughput+cell+function+and+toxicity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of single-tumor spheroids for high-throughput cell function and toxicity analysis.</a> J Biomol Screen. 11 (8), 922-932 (2006).</li>
<li>Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+culture+techniques+for+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery.</a> Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).</li>
<li>Bergamaschi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+signature+identifies+breast+cancer+subgroups+with+different+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix signature identifies breast cancer subgroups with different clinical outcome.</a> J Pathol. 214 (3), 357-367 (2008).</li>
<li>Oskarsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+breast+cancer+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Breast%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in breast cancer progression and metastasis.</a> The Breast. 22, S66-S72 (2013).</li>
<li>Kelley, L. C., Lohmer, L. L., Hagedorn, E. J., Sherwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traversing+the+basement+membrane+in+vivo%3A+A+diversity+of+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22JBC%22%5BJournal%5D)">Traversing the basement membrane in vivo: A diversity of strategies.</a> JBC. 204 (3), 291-301 (2014).</li>
<li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+fibroblasts+modulate+epithelial+cell+proliferation+in+three-dimensional+in+vitro+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast fibroblasts modulate epithelial cell proliferation in three-dimensional in vitro co-culture.</a> Breast Cancer Res. 4, (2004).</li>
<li>Wendt, D., Marsano, A., Jakob, M., Heberer, M., Martin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+perfusion+of+cell+suspensions+through+three-dimensional+scaffolds+enhances+cell+seeding+efficiency+and+uniformity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Oscillating perfusion of cell suspensions through three-dimensional scaffolds enhances cell seeding efficiency and uniformity.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (2), 205-214 (2003).</li>
<li>Marshall, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-perfusion+bioreactor+system+for+engineered+breast+cancer+surrogates+to+be+used+in+preclinical+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Flow-perfusion bioreactor system for engineered breast cancer surrogates to be used in preclinical testing.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2015).</li>
<li>Calcagnile, P., Fragouli, D., Mele, E., Ruffilli, R., Athanassiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+foams+with+functional+nanocomposite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Polymeric foams with functional nanocomposite cells.</a> RSC Adv. 4, 19177-19182 (2014).</li>
<li>Naba, A., Clauser, K. R., Lamar, J. M., Carr, S. A., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+signatures+of+human+mammary+carcinoma+identify+novel+metastasis+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix signatures of human mammary carcinoma identify novel metastasis promoters.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+constituents+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix constituents in breast cancer.</a> Semin Cancer Biol. 6 (3), 165-173 (1995).</li>
<li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+HistoGel-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Diagn+Invest%22%5BJournal%5D)">Evaluation of HistoGel-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> J Vet Diagn Invest. 24 (4), 710-715 (2012).</li>
<li>Varsegi, G. M., Shidham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Block+Preparation+from+Cytology+Specimen+with+Predominance+of+Individually+Scattered+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell Block Preparation from Cytology Specimen with Predominance of Individually Scattered Cells.</a> J Vis Exp. (29), e1316(2009).</li>
<li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Breast+Fibroblasts+Inhibit+Growth+of+the+MCF10AT+Xenograft+Model+of+Proliferative+Breast+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Human Breast Fibroblasts Inhibit Growth of the MCF10AT Xenograft Model of Proliferative Breast Disease.</a> Am J Pathol. 170 (3), (2007).</li>
<li>Otali, D., He, Q., Stockard, C. R., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+immunorecognition+by+transferring+cells+from+10%25+neutral+buffered+formalin+to+70%25+ethanol%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Preservation of immunorecognition by transferring cells from 10% neutral buffered formalin to 70% ethanol.</a> Biotech Histochem. 88 (0), 170-180 (2013).</li>
<li>Webster, S. S., Jenkins, L., Burg, K. J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+Techniques+for+Porous%2C+Absorbable%2C+Polymeric+Scaffolds%2C+Used+in+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Histological Techniques for Porous, Absorbable, Polymeric Scaffolds, Used in Tissue Engineering.</a> J Histotechnol. 26 (1), 57-65 (2003).</li>
<li>Troy, T. -C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+Paraffin+Sections+of+Mouse+Epidermis+Using+Fluorescent+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies.</a> J Vis Exp. (11), (2008).</li>
<li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Kwon, Y. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gli1+enhances+migration+and+invasion+via+up-regulation+of+MMP-11+and+promotes+metastasis+in+ERa+negative+breast+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Gli1 enhances migration and invasion via up-regulation of MMP-11 and promotes metastasis in ERa negative breast cancer cell lines.</a> Clin Exp Metastasis. (28), (2011).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+Immunohistochemistry+on+Cryosectioned+Rat+Brain+Tissue%3A+Example+Staining+for+Microglia+and+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons.</a> J Vis Exp. (99), e52293(2015).</li>
<li>Pal, A., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+dimensional+cultures%3A+a+tool+to+study+normal+acinar+architecture+vs.+malignant+transformation+of+breast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Three dimensional cultures: a tool to study normal acinar architecture vs. malignant transformation of breast cells.</a> J Vis Exp. (86), e51311(2014).</li>
<li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+High+Grade+Glioma+Cell+Culture+from+Surgical+Specimens+for+Use+in+Clinically+Relevant+Animal+Models+and+3D+Immunochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimization of High Grade Glioma Cell Culture from Surgical Specimens for Use in Clinically Relevant Animal Models and 3D Immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088(2014).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J Vis Exp. (51), e2720(2011).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Multi-organ+Chip+-+A+Microfluidic+Platform+for+Long-term+Multi-tissue+Coculture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture.</a> J Vis Exp. (98), e52526(2015).</li>
<li>Sadlonova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Molecular+Distinctions+Between+Normal+Breast-Associated+Fibroblasts+and+Breast+Cancer-Associated+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Identification of Molecular Distinctions Between Normal Breast-Associated Fibroblasts and Breast Cancer-Associated Fibroblasts.</a> Cancer Microenviron. 2, 9-21 (2009).</li>
<li>Wang, J. D., Douville, N. J., Takayama, S., ElSayed, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+molecular+absorption+into+PDMS+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of molecular absorption into PDMS microfluidic channels.</a> Ann Biomed Eng. 40 (9), 1862-1873 (2012).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosens Bioelectron. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Regehr, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+implications+of+polydimethylsiloxane-based+microfluidic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Biological implications of polydimethylsiloxane-based microfluidic cell culture.</a> Lab Chip. 9 (15), 2132-2139 (2009).</li>
<li>Burdett, E., Kasper, F. K., Mikos, A. G., Ludwig, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+tumors%3A+a+tissue+engineering+perspective+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering tumors: a tissue engineering perspective in cancer biology.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (3), 351-359 (2010).</li>
<li>Caruso, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+coagulative+necrosis+in+malignant+epithelial+tumors+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of coagulative necrosis in malignant epithelial tumors (Review).</a> Oncol Lett. 8 (4), 1397-1402 (2014).</li>
<li>Elmore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+A+Review+of+Programmed+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death.</a> Toxicol Pathol. 35 (4), 495-516 (2007).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146 (1), 3-15 (1995).</li>
<li>Ogino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathological+epidemiology+of+epigenetics%3A+emerging+integrative+science+to+analyze+environment%2C+host%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathological epidemiology of epigenetics: emerging integrative science to analyze environment, host, and disease.</a> Mod Pathol. 26 (4), 465-484 (2013).</li>
<li>Otali, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+formalin+fixation+and+tissue+processing+on+immunorecognition%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Combined effects of formalin fixation and tissue processing on immunorecognition.</a> Biotech Histochem. 84 (5), 223-247 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszym artykule opisano metodę hodowli 3D, która obejmuje składniki mikrośrodowiska tkankowego, w tym macierz zewnątrzkomórkową (ECM) i ludzkie fibroblasty zrębu, w objętości, która dokładniej modeluje ludzkiego raka piersi, aby umożliwić rozwój rekapitulacyjnej morfologii 3D. Opisana metoda hodowli 3D jest bardziej reprezentatywna dla choroby ludzkiej niż tradycyjna hodowla komórkowa 2D, ponieważ wiele typów komórek jest włączanych do objętości 3D ECM. Zauważono, że parametry te (tj. wiele typów komórek, ...

Trójwymiarowe (3D) modele hodowli, które dokładniej naśladują architekturę i mikrośrodowisko guza in vivo, są istotne dla badań mających na celu analizę złożonych oddziaływań między komórkami a ich mikrośrodowiskiem oraz testowanie skuteczności potencjalnych terapii. Wymiarowość guza wpływa na gradienty tlenu i składników odżywczych, jednorodność ekspozycji na leki, ciśnienie śródmiąższowe/przepływ krwi oraz architekturę 3D1-4. Obecność odpowiedniego mikrośrodowiska zrębowego przyczynia się do wymiarowości guza i wpływa na sygnalizację komórka-ECM oraz sygnalizację paracrynną między komórkami zrębu a złośliwymi komórkami nabłonka. Wpływ wymiarowości guza i mikrośrodowiska na funkcje komórkowe jest dobrze udokumentowany, a oba te czynniki zmieniają odpowiedź na leki1,3,5-8. Ponadto kinetyka wzrostu komórek, tempo metabolizmu i sygnalizacja komórkowa różnią się pomiędzy hodowlą dwuwymiarową (2D) a hodowlą 3D, co wpływa na odpowiedź komórkową1,3,8-10.
In vitro mikrośrodowisko zastępcze guza można modyfikować poprzez wprowadzenie reprezentatywnych składników ECM oraz populacji komórek zrębu. Komórki nabłonka złośliwego pod wpływem ECM i komórek zrębu związanych z nowotworem mogą reagować w sposób synergistyczny/ochronny, promując progresję guza, lub w sposób supresyjny, hamując jego dalszy rozprzestrzenianie się5,6,10. W obu przypadkach zrąb może wpływać na odpowiedź terapeutyczną i dostarczanie leków poprzez sygnalizację parakrynną i/lub poprzez zwiększanie ciśnienia śródmiąższowego w guzie, co skutkuje zmniejszeniem dostarczania leku1,6. Dlatego dodanie ECM i komórek zrębu do modeli przedklinicznych pomoże odtworzyć aspekty guza, których nie można dobrze wymodelować w hodowli 2D.
W niniejszym opracowaniu opisano metodę tworzenia substytutów raka piersi, które w objętości 3D zawierają odtworzone mikrośrodowisko, w tym składniki ECM i komórki zrębowe. W raku piersi populacja komórek zrębowych składa się głównie z fibroblastów związanych z nowotworem (CAF), a zrębowe ECM składa się w przeważającej mierze z kolagenu typu I, z mniejszym udziałem komponentów macierzy występujących w błonie podstawnej, w tym lamininy i kolagenu typu IV1,4,11-13. W związku z tym składniki te mikrośrodowiska raka piersi (tj. CAF, kolagen I oraz błonę podstawną) włączono do substytutów. Metoda ta może być stosowana do generowania litych, nieperfundowanych substytutów 3D (Rycyna 1A) lub może zostać dostosowana do perfuzji medium przez substytut za pomocą systemu bioreaktora (Rycina 1B). Oba podejścia zostały tutaj opisane. Metodę tę można również zmodyfikować, aby uwzględnić inne elementy zrębu, takie jak makrofagi związane z nowotworem, lub aby modelować inne guzy lite poprzez odpowiednie dostosowanie komponentów komórkowych i ECM.
W przypadku opisanego tutaj modelu zastępczego raka piersi wykorzystaliśmy linię komórek raka piersi MDA-MB-231 (231), CAF wcześniej wyizolowane z ludzkiego raka piersi14 oraz ECM składającą się z 90% kolagenu I (6 mg/ml) i 10% materiału błony podstawnej o zredukowanej zawartości czynników wzrostu (BM). Model zastępczy jest hodowany albo w szkiełku z komorami 8-dołkowymi (model stały), albo z wykorzystaniem systemu bioreaktora w celu zapewnienia ciągłej perfuzji składników odżywczych (model perfuzyjny). Można użyć dowolnego systemu bioreaktora perfuzyjnego, który pomieści objętość ECM zawierającą komórki15. Jako przykład opisujemy przygotowanie modeli tkanek w naszym systemie bioreaktora. System ten został opracowany wewnętrznie i nie jest dostępny w sprzedaży. Ponieważ skupiamy się tutaj na przygotowaniu i analizie trójwymiarowych modeli tkanek, nie wchodzimy w szczegóły dotyczące specyfiki produkcji i montażu naszego systemu bioreaktora. Szczegółowy opis tego systemu oraz jego rozwoju został jednak opublikowany16. W tym systemie bioreaktora do pomieszczenia modelu zastępczego wykorzystuje się kanał przepływowy z polidimetylosiloksanu (PDMS), który jest wspierany przez piankę PDMS (wykonaną metodami podobnymi do tych opisanych przez Calcagnile et al.17). Objętość ta jest przeniknięta przez 4 mikrokanały (każdy o średnicy 400 µm), które są stale perfundowane pożywką za pomocą pompy mikrofizjologicznej w celu dostarczenia tlenu i składników odżywczych do modelu zastępczego.
Właściwa analiza substytutów jest kluczowa dla uzyskania istotnych informacji na temat funkcji komórkowych w odpowiedzi na leczenie lub inne manipulacje. Substytuty można analizować różnymi metodami, w tym poprzez bezpośrednie obrazowanie nienaruszonych substytutów z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej lub innych środków obrazowania nieinwazyjnego, pośrednią analizę komórkową poprzez badanie pożywki kondycjonowanej lub perfuzatu pod kątem produktów wydzielniczych, a także analizę na skrawkach histologicznych po utrwaleniu i zatopieniu w parafinie. Jednym z parametrów, które można ocenić na skrawkach histologicznych, jest gęstość komórek. Przedstawiamy podejście do pomiaru gęstości komórek (t.j. liczby komórek z jądrem na powierzchnię skrawka) z wykorzystaniem półautomatycznych technik przetwarzania obrazu zastosowanych do fotomikrografii histologicznych skrawków substytutu barwionych hematoksyliną i eozyną (H&amp;E). Gęstość komórek może służyć jako wskaźnik względnej zmiany liczby komórek w czasie lub zmiany wynikającej z różnych warunków wzrostu i metod leczenia.
<img alt="Układy lite i perfuzowane w hodowli komórkowej; kanał przepływowy, schemat doświadczalny; analiza tkanki." src="/files/ftp_upload/54004/54004fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Objętość 3D i system bioreaktora. A) Schemat procesu generowania litych substytutów 3D. Góra: schemat objętości 3D zawierającej ECM (różowy), komórki raka nabłonkowego (żółty) oraz CAF (pomarańczowy); Dół: widok z góry na szkiełko z komorą 8-dołkową zawierającą substytuty. B) Schemat procesu generowania perfuzowanych substytutów 3D. Góra: schemat objętości 3D z kanałami umożliwiającymi perfuzję pożywki, zawierającej ECM (różowy), komórki raka nabłonkowego (żółty) oraz CAF (pomarańczowy); Środek: obraz kanału przepływowego z PDMS zawierającego piankę PDMS (czarna strzałka), do której wstrzyknięto komórki+ECM i przez którą przebiegają powlekane polimerem druty ze stali nierdzewnej (różowa strzałka) o średnicy 400 µm; Dół: obraz kanału przepływowego z PDMS zawierającego substytut i podłączonego do systemu bioreaktora w celu zapewnienia ciągłej perfuzji pożywki (pompa perystaltyczna i zbiornik z pożywką nie są pokazane). C) Obrazy etapów przetwarzania zarówno litych, jak i perfuzowanych substytutów po hodowli. Lewo: obraz formy kriogenicznej zawierającej żel do przetwarzania próbek i substytut; Środek: obraz bloku parafinowego zawierającego utrwalony i przetworzony substytut; Prawo: obraz szkiełka przedmiotowego z histologicznym przekrojem substytutu barwionym H&amp;E. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54004/54004fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagel Medium 1x (DMEM)</td><td>Corning CellGro</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna + 2,21&nbsp; mM EDTA 1x</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych, 100&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229620</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>płytki do hodowli tkankowych, 35&nbsp; mm</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229638</td><td>Do tworzenia piany PDMS&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipeta szklana 9"</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>13-678-20D</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>pipeta 10 ml</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229210B</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>1,000 &micro; l końcówki do pipet</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-166</td><td>Sterylne filtrowane</td></tr><tr><td>200 i mikro; l końcówki do pipet</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-141</td><td>Sterylne filtrowane</td></tr><tr><td>10 i mikro; l końcówki do pipet</td><td>FisherBrand</td><td>02-717-158</td><td>Sterylne probówki</td></tr><tr><td>stożkowe 15 ml</td> z filtrem <td>CellTreat Scientific Products</td><td>229410</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>probówki stożkowe 50 ml</td><td>CellTreat Scientific Products</td><td>229422</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>FisherBrand</td><td>05-408-129</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>niebieski trypan</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td>sterylny</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>24236-10</td><td>Elastomer PDMS i utwardzacz. Używany w naszym wewnętrznym bioreaktorze.</td></tr><tr><td>Pianka</td><td></td><td></td> PDMS <td>Produkowana we własnym zakresie do użytku w naszym wewnętrznym bioreaktorze.</td></tr><tr><td>Kolagen bydlęcy o wysokim stężeniu</td><td>Zaawansowany Biomatrix</td> typu I <td>5133-A</td><td>FibriCol ~ 10 mg / ml</td></tr><tr><td>Zredukowany czynnik wzrostu Matrigel (membrana podstawna)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Materiał membrany podstawnej</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna klasy wodnej</td><td>Fisher</td><td>BP2819-1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 10x&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2429</td><td></td></tr><tr><td>System prowadnic komorowych Nunc Lab-Tek&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>177402</td><td>8-dołkowy</td></tr><tr><td>bioreaktor</td><td></td><td></td><td>wykonany we własnym zakresie.</td></tr><tr><td>Sprężyna ze stali nierdzewnej 304&mdash; Pokryte polimerem PTFE</td><td>McMaster-Carr</td><td>1749T19</td><td>Druty ze stali nierdzewnej do generowania mikrokanalików w naszym wewnętrznym systemie bioreaktorów. Rurka</td></tr><tr><td>silikonowa utwardzana platyną BioPharm Plus</td> o średnicy 0,016", L/S 14 <td>Masterflex</td><td>EW-96440-14</td><td>Do stosowania w naszym wewnętrznym systemie bioreaktorów. Średnica wewnętrzna wężyka: 1.6 mm, Rozmiar króćca węża: 1/16 in.</td></tr><tr><td>Zestawy przewodów z 2 odpływami, PVC niekielichowe, 1.52&nbsp; mm ID</td><td>Cole-Parmer&nbsp;</td><td>EW-74906-36</td><td>Do stosowania w naszym wewnętrznym systemie bioreaktorów (z pompą mikroperystalityczną).&nbsp;</td></tr><tr><td>Sześciokanałowa precyzyjna mikropompa perystaltyczna</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-74906-04</td><td>Do użytku z naszym wewnętrznym systemem bioreaktorów</td></tr><tr><td>Strzykawki tuberkulinowe</td><td>BD Medical</td><td>309625</td><td>26 gauge 3/8 cala igły; Sterylne</td></tr><tr><td>kleszcze do tkanek preparacyjnych</td><td>FisherBrand</td><td>13-812-36</td><td>5,5-calowy</td></tr><tr><td>mini rotator rurkowy</td><td>Boekel Scientific</td><td>260750</td><td>Opcja wyposażenia do rotacji zastępczej. Używany z karuzelą do probówek 50 ml (numer modelu 260753)</td></tr><tr><td>Karuzela w probówkach 50 ml</td><td>Boekel Scientific</td><td>260753</td><td>Używany z rotatorem mini probówek</td></tr><tr><td>Bambino&nbsp; Piec do hybrydyzacji</td><td>Boekel Scientific</td><td>230301</td><td>Opcja wyposażenia do rotacji surogatów</td></tr><tr><td>HistoGel Żel do przetwarzania próbek</td><td>Thermo Scientific</td><td>HG-4000-012</td><td>Żel do przetwarzania próbek opisany w kroku 5.2</td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>Andwin Scientific</td><td>4566</td><td>15 mm x 15 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Znakowanie tkanek Dye</td><td>Cancer Diagnostics, inc.&nbsp;</td><td>03000P</td><td>Może być używany do oznaczania surogatów,&nbsp; umożliwiając włączenie wielu próbek do jednej kasety na tkanki&nbsp;</td></tr><tr><td>Kasety na chusteczki higieniczne na zawiasach&nbsp;</td><td>FisherBrand</td><td>22-272-416</td><td></td></tr><tr><td>Formalin</td><td>Fisher</td><td>23-245-685</td><td></td></tr><tr><td>GoldSeal Zwykłe szklane szkiełka</td><td>Thermo Scientific</td><td>3048-002</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof (100%), USP</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2805M</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7211</td><td></td></tr><tr><td>Clarifier</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7401</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do niebieszczenia</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>7111</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL media</td><td>Thermo Scientific Richard-Allan Scientific</td><td>83124</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Preparation and Analysis of In Vitro Three Dimensional Breast Carcinoma Surrogates

Hodowla trójwymiarowa (3D) jest bardziej fizjologicznie istotną metodą modelowania zachowania komórek in vitro niż hodowla dwuwymiarowa. Raki, w tym rak piersi, to złożone tkanki 3D złożone z komórek nabłonka raka i składników zrębu, w tym fibroblastów i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Jednak większość modeli raka piersi in vitro składa się tylko z komórek nabłonka raka, z pominięciem zrębu, a tym samym architektury 3D guza in vivo. Odpowiednie modelowanie 3D raka jest ważne dla dokładnego zrozumienia biologii, zachowania i odpowiedzi na terapię guza. Jednak czas trwania hodowli i objętość modeli 3D jest ograniczony dostępnością tlenu i składników odżywczych w kulturze. W tym miejscu pokazujemy metodę, w której komórki nabłonkowe raka piersi i fibroblasty zrębu są włączane do ECM w celu wygenerowania substytutu 3D raka piersi, który obejmuje zrąb i może być hodowany jako stała struktura 3D lub przy użyciu systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po przygotowaniu i początkowym okresie wzrostu, surogaty mogą być używane do przedklinicznych testów leków. Alternatywnie, komponenty komórkowe i macierzowe surogatu mogą być modyfikowane w celu rozwiązania różnych problemów biologicznych. Po posiewie surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę, w sposób podobny do postępowania z klinicznymi próbkami raka piersi, w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości obecnych komórek, gdzie systemy oprogramowania do analizy obrazu ImageJ i CellProfiler są stosowane do mikrofotografii przekrojów histologicznych surogatów w celu ilościowego określenia liczby komórek jądrzastych na obszarze. Można to wykorzystać jako wskaźnik zmiany liczby komórek w czasie lub zmiany liczby komórek wynikającej z różnych warunków wzrostu i leczenia.

Zarówno lite, jak i perfuzowane 3D substytuty raka piersi zostały przygotowane zgodnie z powyższym opisem i hodowane przez 7 dni. Następnie substytuty utrwalono, zatopiono w parafinie, pocięto na skrawki i zabarwiono hematoksyliną i eozyną, zgodnie z powyższym opisem. Zmierzono liczbę komórek jądrzastych na jednostkę powierzchni (zarówno komórek 231, jak i CAF) dla każdego substytutu. Jak widać na Rysunku 12, reprezentatywne mikrofotografie skrawków zabarwionych H&amp;E w...

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Three dimensional (3D) culture is a more physiologically relevant method to model cell behavior in vitro than two dimensional culture. Carcinomas, ...

Ogólnym celem tego zestawu procedur jest wygenerowanie trójwymiarowych kultur komórkowych pełniących funkcję in vitro substytutów raka piersi oraz przedstawienie metody pomiaru wzrostu komórek w przekrojach histologicznych tych substytutów. Trójwymiarowa hodowla komórkowa jest metodą modelowania zachowania komórek in vitro bardziej istotną fizjologicznie niż dwuwymiarowa hodowla komórkowa. Poprzez zmianę składu komórkowego w warunkach eksperymentalnych, ten zestaw procedur może zostać dostosowany do odpowiedzi na różnorodne pytania biologiczne oraz do oceny skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych.Aby włączyć komórki do ECM, należy w temperaturze lodu dodać komórki oraz pierwsze cztery powiązane składniki wymienione w tabeli 1 towarzyszącego manuskryptu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów. Następnie należy je delikatnie wymieszać za pomocą pipetowania, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Poziom pH należy monitorować, wykorzystując czerwień fenolową w 10XD MEM, aby upewnić się, że mieszanina ma kolor pomarańczowo-różowy, co wskazuje na pH równą siedmiu.Jeśli mieszanina przybierze żółty kolor, a pH jest zbyt niskie, należy powoli dodawać 7,5

preparation-analysis-vitro-three-dimensional-breast-carcinoma

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Opracowaliśmy oparty na kolagenie test in vitro, który stymuluje proliferację i inwazję w próbkach wszystkich podtypów raka piersi. Do wizualizacji i kwantyfikacji ekspansji guza wykorzystano optyczną tomografię projekcyjną, będącą techniką mikroskopii trójwymiarowej. Test ten może być wykorzystywany do ilościowej oceny odpowiedzi na leki w poszczególnych próbkach guzów.

Długoterminowa hodowla próbek raka piersi u ludzi i ich analiza z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej

W tym filmie opisujemy metodę wspólnego hodowania zwojów korzenia grzbietowego i komórek rakowych na błonie kosmówkowo-omoczniowej kurcząt lub CAM w celu zbadania inwazji okołonerwowej.

Błona kosmówkowo-omocznaniowa piskląt lub model guza CAM: metoda in ovo do symulacji okołonerwowej inwazji komórek nowotworowych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Ta praca wstępnie ustawia zaawansowany protokół do dokładnej oceny obciążenia guza poprzez detekcję zielonego białka fluorescencyjnego i sygnałów bioluminescencji, a także integrację ilościowej techniki wykrywania molekularnego.

Badanie potrójnie ujemnego raka piersi przy użyciu ortotopowego modelu raka piersi

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Ten artykuł wymienia kroki wymagane do zasiewu linii komórek neuroblastoma na wcześniej opisanych trójwymiarowe szkieletach opartych na kolagenie, utrzymanie wzrostu komórek przez określony czas i odzyskanie szkieletów do kilku analiz wzrostu komórek i zachowania komórek oraz zastosowań wtórnych, przystosowanych do zaspokojenia szerokiego zakresu celów eksperymentalnych.

Trójwymiarowy in vitro biomimetyczny model neuroblastomu z wykorzystaniem rusztowań na bazie kolagenu

Wzajemne oddziaływanie między komórkami nabłonka sutka a komórkami śródbłonka przyczynia się do progresji raka piersi, wzrostu guza i przerzutów. W tym badaniu sferoidy zostały wykonane z komórek raka piersi wraz z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych i/lub limfatycznych i wykazują ich przydatność jako systemu in vitro do badań nad rakiem piersi.

Sferoidy komórek nabłonka i śródbłonka sutka jako potencjalny funkcjonalny model in vitro do badań nad rakiem piersi

Poznaj metodę generowania trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro z wykorzystaniem bioreaktora perfuzyjnego. Technika umożliwia ocenę gęstości komórkowej i testowanie kandydatów terapeutycznych w fizjologicznie trafnym modelu.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Przeglądaj więcej filmów