Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc
5 maja 2016
Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.
Ogólnym celem tej procedury jest skierowanie różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych, przy użyciu hodowli 3D ustawionej z bezkomórkowymi rusztowaniami płuc. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w obszarze rozwoju płuc, takie jak rola skurczów macierzy komórkowej i sygnalizacji czynnika wzrostu podczas różnicowania linii płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona system hodowli 3D w określonych warunkach wolnych od surowicy i osiąga silne różnicowanie nabłonka dróg oddechowych przy ograniczonym zanieczyszczeniu z innych linii endodermy. Po eutanazji dorosłego szczura wistar, zgodnie z protokołem tekstowym, przymocuj zwierzę do powierzchni preparcyjnej, mocując przednie łapy i tylne nogi, a następnie użyj 70% etanolu do spryskania klatki piersiowej i brzucha. Utwórz nacięcie tuż pod klatką piersiową. Przeciąć skórę i odsłonić membranę. Następnie wykonaj małe nacięcia przez przeponę, aby spowodować cofnięcie się płuc, zmniejszając ryzyko przebicia płuc. Następnie wykonaj pionowe nacięcie wzdłuż mostka i otwórz klatkę piersiową, aby uzyskać dostęp do serca i płuc. Następnie za pomocą szwu podwiązaj żyłę główną dolną i użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby umieścić małe nacięcie w lewym przedsionku. Za pomocą przygotowanej strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 25 wypełnioną heparynizowanym roztworem soli Hank's Balance, rozpocznij perfuzję płuc od wkłucia igły do prawej komory i przepchnij bufor przez krążenie płucne. Kontynuuj perfuzję, aż płuca staną się białe, a płyn wypływający z lewego przedsionka będzie czysty. Po perfuzji odsłoń tchawicę i wykonaj małe nacięcie w pobliżu chrząstki tarczycy w celu kanowacji. Następnie za pomocą plastikowego cewnika kanalizuj tchawicę i użyj szwu, aby zabezpieczyć ją na miejscu. Teraz skonfiguruj system perfuzji grawitacyjnej, mocując strzykawkę o pojemności 10 ml do stojaka na retortę i zacisku. Następnie wyjąć i wyrzucić tłok strzykawki. Zabezpiecz maksymalny punkt napełniania na cylindrze strzykawki na wysokości 20 cm nad płucami, a następnie przymocuj dwukierunkowy kran do końca strzykawki i długą plastikową rurkę do drugiego końca kranu. Delikatnie wyciągnij cewnik z tchawicy i przymocuj do końca plastikowej rurki. Następnie wlej roztwór decelularyzacyjny do strzykawki i pozwól, aby roztwór całkowicie wypełnił dołączoną plastikową rurkę i cewnik. Umieść cewnik wypełniony roztworem z powrotem w tchawicy i przepłucz płuca, napełniając je do całkowitej pojemności płuc na jedną minutę. Następnie wyjmij cewnik z tchawicy, aby płyn mógł wypłynąć z płuc. Powtórzyć płukanie płuc osiem razy roztworem do decelularyzacji, a następnie dziesięć płukań PBS. Płuca staną się białe po zakończeniu etapów płukania. Następnie wypreparuj tchawicę i płuca z szyi i klatki piersiowej. Usuń nadmiar tkanki z wypreparowanych płuc, w tym przełyku i serca, a następnie przenieś płuca do zimnego PBS do momentu przygotowania do przekroju wibratomowego. Aby przygotować grube kawałki, przygotuj około 15 ml agarozy o niskiej temperaturze topnienia i 4% w PBS i wystarczającą ilość 6% agarozy do osadzenia wszystkich płatów w małych prostokątnych blokach. Po przeniesieniu agarozy do probówek o pojemności 15 ml umieść probówki na bloku grzewczym i utrzymuj temperaturę powyżej 40 stopni Celsjusza, aby uniknąć żelowania. Za pomocą małych nożyczek rozetnij pozbawione komórek płuco na końcu każdego płata oskrzela i odłącz każdy płat. Następnie użyj arkuszy chłonnych, aby usunąć nadmiar PBS i przenieś płatki do 2% agarozy na bloku grzewczym na pięć minut, aby pokryć tkankę. Po przeniesieniu każdego płata na szalkę Petriego, umieść naczynie na zimnej płycie i pozwól powierzchni zżelować się przez minutę. Delikatnie umieść płatki w 4% agarozie, a po inkubacji przez pięć minut i schłodzeniu powtórz powlekanie 6% agarozą. Po pokryciu użyj metalowych form bazowych, aby osadzić każdy płat osobno w 6% agarozie, z co najmniej 3 ml agarozy otaczającej tkankę od krawędzi. Następnie za pomocą kleszczy zorientuj każdy płat, ustawiając największą płaską krawędź tkanki na powierzchni metalowej formy skierowanej w stronę eksperymentatora i zakończ osadzanie za pomocą plastikowych kaset. Pozostaw bloki do zżelowania na zimnej płytce przez co najmniej 30 minut przed cięciem wibratomem. Alternatywnie, przechowuj bloki w wilgotnej komorze do 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed sekcją wibratomową. Aby przygotować sekcje, ustaw wibratom, wypełniając komorę sekcyjną zimnym PBS. Ustaw otaczającą łaźnię lodową, aby utrzymać niską temperaturę podczas sekcji. Teraz usuń klocki z metalowych form i użyj żyletki, aby przyciąć nadmiar agarozy otaczającej płaty, zachowując około trzech milimetrów od krawędzi tkanki. Za pomocą kleju przymocuj tkankę do środka płytki próbki i zanurz płytkę w komorze sekcyjnej wypełnionej PBS. Załaduj ostrze sekcyjne na wibratome. Ustaw granice przekroju na wibratomie, wybierając odpowiednio następujące wartości prędkości, amplitudy i grubości. Podziel każdy płat całkowicie, a jeśli sekcje nie oddzielają się całkowicie od siebie, użyj małych nożyczek, aby ręcznie odciąć sekcje. Następnie delikatnie zbierz sekcje rusztowania i przenieś do zimnego PBS. Za pomocą kleszczy delikatnie uwolnij każdą sekcję z otaczającej agarozy. Aby odkazić sekcje rusztowania, po przeniesieniu ich z PBS do probówek mikrowirówek, dodaj 90 jednostek na mililitr nukleazy w PBS i inkubuj na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 12 do 24 godzin. Po przeniesieniu skrawków do nowych probówek do mikrowirówek, zgodnie z protokołem tekstowym, w sterylnych warunkach dodać roztwór przeciwdrobnoustrojowy i inkubować na rotatorze w temperaturze pokojowej przez sześć godzin. Następnie w sterylnych warunkach użyj PBS do dwukrotnego przepłukania rusztowań i przenieś je do pożywki wolnej od surowicy lub SFDM przed wysiewem komórek. Aby skonfigurować kulturę na granicy faz powietrze-ciecz, użyj sterylnych kleszczy, aby umieścić hydrofobowe membrany na szalce Petriego. Następnie przenieś każdą zdecelularną sekcję rusztowania z SFDM na membranę, upewniając się, że sekcje są równomiernie rozłożone na membranie. Przygotuj sześć lub dwanaście dołków, wypełniając dołki odpowiednio 1 ml lub 0,5 ml SFDM. Następnie delikatnie umieść membrany w studzienkach, pozwalając membranie unosić się na wierzchu podłoża, tworząc powietrzną kulturę cieczy. Aby wysadzić rusztowania 3D, po przygotowaniu komórek endodermy i sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją, w celu wzbogacenia w ostateczną endodermę, użyj hemocytometru do policzenia posortowanych komórek. Następnie wiruj komórki w temperaturze 400 G przez pięć minut. Za pomocą SFDM ponownie zawiesić granulowane komórki do około 100 000 komórek na 10
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół efektywnie kieruje pochodzące z mysich komórek macierzystych zarodkowych pochodne endoderma ostatecznego do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje 3-wymiarowe bezkomórkowe szkielety płuc do kierowania specyfikacji linii komórkowej płuc, w zdefiniowanym, pozbawionym surowicy środowisku hodowli.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Rozwijanie płuc
- Inżynieria tkankowa
Tło
- Mysie komórki macierzyste zarodkowe mogą różnicować się w różne typy komórek.
- Ostateczny endoderma jest prekursorem komórek nabłonka płuc.
- 3D szkielety mogą naśladować środowisko płuc dla lepszego różnicowania.
- Warunki hodowli bez surowicy są niezbędne dla kontrolowanego różnicowania.
Cel badania
- Opracowanie protokołu efektywnego różnicowania komórek macierzystych w komórki nabłonka płuc.
- Wykorzystanie bezkomórkowych szkieletó płuc do kierowania przeznaczeniem komórek.
- Ustanowienie zdefiniowanego środowiska hodowli dla różnicowania komórek macierzystych.
Stosowane metody
- Izolacja mysich komórek macierzystych zarodkowych.
- Hodowla komórek w mediach bez surowicy.
- Wykorzystanie 3D bezkomórkowych szkieletó płuc.
- Ocena różnicowania w komórki nabłonka dróg oddechowych.
Główne wyniki
- Skuteczna różnicowanie komórek macierzystych w dojrzałe komórki nabłonka dróg oddechowych.
- Charakterystyka zróżnicowanych komórek wykazała specyfikację linii komórek płuc.
- 3D szkielety zwiększyły efektywność procesu różnicowania.
- Zdefiniowane warunki hodowli poprawiły dojrzewanie komórek.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia niezawodną metodę wytwarzania komórek nabłonka płuc z komórek macierzystych.
- 3D szkielety są skuteczne w kierowaniu specyfikacją linii komórek płuc.
- Warunki bez surowicy są korzystne dla kontrolowanego różnicowania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Recapitulating lung epithelial differentiation in vitro remains a critical challenge for respiratory drug discovery and disease modeling. This protocol leverages decellularized lung scaffolds to generate mouse airway epithelial cells from embryonic stem cells, enabling defined, reproducible, and scalable production of disease-relevant airway models. The approach supports translational research and preclinical screening for airway pathologies such as cystic fibrosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of airway epithelial lineage commitment and cell-matrix interactions.
- Supports functional target validation in a physiologically relevant 3D context.
- Facilitates mechanistic de-risking for airway disease targets.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, serum-free airway epithelial system for compound screening.
- Enables quantitative assessment of drug effects on ciliated, club, and basal cell populations.
- Supports assay standardization and scalability for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Delivers disease-relevant airway epithelial models for translational biomarker studies.
- Bridges discovery and preclinical validation for airway-targeted therapeutics.
- Reduces biological ambiguity in preclinical efficacy and toxicity assessments.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a defined airway epithelial platform for target validation, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on airway lineage specification and cell-matrix signaling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in airway models.
- Analytics: Enables measurement of differentiation efficiency and cell-type composition.
- Translational Research: Aligns with disease modeling needs for airway pathologies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable airway epithelial differentiation workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in airway disease modeling and target validation.
- Operational Value: Promotes reproducibility, scalability, and cost efficiency in airway cell production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for airway-targeted drug candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of respiratory programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation and 3D tissue engineering.
- Needs access to decellularized lung scaffolds and air-liquid interface culture systems.
- Demands cross-team standardization for reproducible outputs.
- Adaptation to other species or disease models may require protocol optimization.
- Limited to airway epithelial populations; does not generate alveolar cells.
