Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ukierunkowanie różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w dojrzałe komórki nabłonka dróg oddechowych, przy użyciu układu hodowli 3D z decelularyzowanymi rusztowaniami płucnymi. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju płuc, takie jak rola skurczów macierzy komórkowej i sygnalizacji czynników wzrostu podczas różnicowania linii płucnej. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie systemu hodowli 3D w zdefiniowanym środowisku wolnym od surowicy oraz uzyskanie stabilnego różnicowania nabłonka dróg oddechowych przy ograniczonej kontaminacji innymi liniami endodermy. Po uśmierceniu dorosłego szczura rasy Wistar, zgodnie z protokołem tekstowym, unieruchom zwierzę na powierzchni sekcyjnej, mocując przednie łapy i tylne kończyny, a następnie spryskaj klatkę piersiową i brzuch 70% ethanol. Wykonaj nacięcie tuż poniżej klatki piersiowej. Przetnij skórę i odsłoń przeponę. Następnie wykonaj niewielkie nacięcia w przeponie, aby spowodować zapadnięcie się płuc, co zmniejszy ryzyko ich przebicia. Następnie wykonaj nacięcie pionowe wzdłuż mostka i otwórz jamę klatki piersiowej, aby uzyskać dostęp do serca i płuc. Następnie za pomocą szwu podwiąż żyłę główną dolną i za pomocą małych nożyczek sekcyjnych wykonaj niewielkie nacięcie w lewym przedsionku. Używając przygotowanej strzykawki 10ml z igłą 25 G wypełnionej heparynowanym roztworem soli Hank's Balance salt solution, rozpocznij perfuzję płuc, wkładając igłę do prawej komory i wprowadzając bufor do krążenia płucnego. Kontynuuj perfuzję do momentu, aż płuca staną się białe, a płyn wypływający z lewego przedsionka będzie przejrzysty. Po perfuzji odsłoń tchawicę i wykonaj niewielkie nacięcie w pobliżu chrząstki tarczowatej w celu kaniulacji. Następnie za pomocą plastikowego cewnika zakaniuluj tchawicę i zabezpiecz go na miejscu za pomocą szwu. Teraz przygotuj system perfuzji grawitacyjnej, mocując strzykawkę 10ml do statywu z zaciskiem. Następnie wyjmij i wyrzuć tłok strzykawki. Ustaw maksymalny punkt napełnienia cylindra strzykawki na wysokości 20 cm nad płucami, następnie do końca strzykawki przymocuj dwudrożny kurek, a do drugiego końca kurka długą plastikową rurkę. Delikatnie wyciągnij cewnik z tchawicy i podłącz go do końca plastikowej rurki. Następnie wlej roztwór do decelularyzacji do strzykawki i pozwól, aby roztwór całkowicie wypełnił przymocowaną plastikową rurkę i cewnik. Włóż wypełniony roztworem cewnik z powrotem do tchawicy i wypłucz płuca, napełniając je do całkowitej pojemności płuc przez jedną minutę. Następnie wyjmij cewnik z tchawicy, aby umożliwić wypłynięcie płynu z płuc. Powtórz płukanie płuc osiem razy roztworem do decelularyzacji, a następnie dziesięć razy PBS. Po zakończeniu etapów płukania płuca będą miały biały kolor. Następnie wypreparuj tchawicę i płuca z okolicy szyi i jamy klatki piersiowej. Usuń nadmiar tkanki z wypreparowanych płuc, w tym przełyk i serce, a następnie przenieś płuca do zimnego PBS do czasu przygotowania do sekcjonowania w wibratomie. Aby przygotować grube przekroje, sporządź około 15ml 2% i 4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (low melting point agarose) w PBS oraz wystarczającą ilość 6% agarozy do zatopienia wszystkich płatów w małych prostokątnych blokach. Po przelaniu agarozy do probówek 15ml, umieść probówki na bloku grzejnym i utrzymuj temperaturę powyżej 40 °C, aby uniknąć żelowania. Używając małych nożyczek, rozetnij decelularyzowane płuco na końcu każdego oskrzela płatowego i oddziel każdy płat. Następnie użyj arkuszy chłonnych, aby usunąć nadmiar PBS i przenieś płaty do 2% agarozy na bloku grzejnym na pięć minut w celu pokrycia tkanki. Po przeniesieniu każdego płata do szalki Petriego, umieść szalkę na płycie chłodzącej i pozwól powierzchni żelować przez jedną minutę. Delikatnie umieść płaty w 4% agarozie i po inkubacji przez pięć minut i schłodzeniu powtórz pokrywanie 6% agarozą. Po pokryciu, użyj form o metalowej podstawie, aby osobno zatopić każdy płat w 6% agarozie, tak aby tkankę z każdej strony otaczało co najmniej 3ml agarozy. Następnie pęsetą zorientuj każdy płat, ustawiając największą płaską krawędź tkanki na powierzchni metalowej formy skierowanej w stronę operatora, i zakończ zatapianie za pomocą plastikowych kaset. Pozostaw bloki do żelowania na płycie chłodzącej przez co najmniej 30 minut przed sekcjonowaniem w wibratomie. Alternatywnie przechowuj bloki w komorze nawilżanej do 12 godzin w temperaturze 4 °C przed sekcjonowaniem w wibratomie. Aby przygotować przekroje, przygotuj wibratom, wypełniając komorę sekcyjną zimnym PBS. Przygotuj otaczającą kąpiel lodową, aby utrzymać niską temperaturę przez cały proces sekcjonowania. Teraz wyjmij bloki z metalowych form i użyj żyletki, aby odciąć nadmiar agarozy otaczającej płaty, pozostawiając około trzech milimetrów od krawędzi tkanki. Używając kleju, przymocuj tkankę do środka płytki z próbką i zanurz płytkę w wypełnionej PBS komorze sekcyjnej. Załaduj ostrze sekcyjne do wibratomu. Ustaw granice sekcjonowania w wibratomie, wybierając odpowiednio następujące wartości prędkości, amplitudy i grubości. W całości wysekcjonuj każdy płat, a jeśli przekroje nie oddzielają się w pełni od siebie, użyj małych nożyczek, aby ręcznie je odciąć. Następnie delikatnie zbierz przekroje rusztowania i przenieś je do zimnego PBS. Używając pęsety, delikatnie uwolnij każdy przekrój z otaczającej go agarozy. Aby odkazić przekroje rusztowania, po przeniesieniu ich z PBS do probówek do mikrocentryfugi, dodaj 90 jednostek na mililitr nukleazy w PBS i inkubuj na rotatorze w temperaturze pokojowej przez 12 do 24 godzin. Po przeniesieniu przekrojów do nowych probówek do mikrocentryfugi, zgodnie z protokołem tekstowym, w warunkach sterylnych dodaj roztwór przeciwdrobnoustrojowy i inkubuj na rotatorze w temperaturze pokojowej przez sześć godzin. Następnie w warunkach sterylnych przepłucz rusztowania dwa razy PBS i przenieś je do pożywki wolnej od surowicy, SFDM, przed zasiewaniem komórkami. Aby przygotować hodowlę na granicy faz powietrze-ciecz (air liquid interface), użyj sterylnej pęsety, aby umieścić hydrofobowe membrany na szalce Petriego. Następnie przenieś każdy decelularyzowany przekrój rusztowania z SFDM na membranę, upewniając się, że przekroje są równomiernie rozłożone na membranie. Przygotuj płytki szecio- lub dwunastodołkowe, wypełniając dołki odpowiednio 1ml lub 0,5ml SFDM. Następnie delikatnie umieść membrany w dołkach, pozwalając im unosić się na powierzchni pożywki, co stworzy układ hodowli na granicy faz powietrze-ciecz. Aby zasiać rusztowania 3D, po przygotowaniu komórek endodermalnych i sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu wzbogacenia o endodermę definitywną, użyj hemocytometru do policzenia posortowanych komórek. Następnie odwiruj komórki przy 400 G przez pięć minut. Używając SFDM, resuspenduj osad komórkowy do stężenia około 100 000 komórek w 10