Name: Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Poznaj protokół różnicowania mysich komórek macierzystych w nabłonek dróg oddechowych przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc w trójwymiarowej kulturze. Ta metoda wspiera badania nad rozwojem płuc i inżynierią tkankową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Dr. Rossantowi i Dr. Bilodeau za ESC Nkx2-1mcherry użyty w eksperymentach przedstawionych na rysunkach 1-3. FACS wykonano w Zakładzie Cytometrii Przepływowej SickKids-UHN. Prace te były wspierane przez granty operacyjne z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem oraz grant infrastrukturalny (CSCCD) z Kanadyjskiej Fundacji Innowacji.

Doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami Instytutu Badawczego Szpitala dla Chorych Dzieci.
1. Przygotowanie rusztowania
<ol>
	<li>Decelularyzacja płuc
	<ol>
		<li>Eutanazja dorosłych szczurów rasy Wistar za pomocą komory CO2 . Umieść zwierzę w komorze i rozpocznij 100% ekspozycję na CO2 z szybkością napełniania 10-30% objętości komory na minutę.
		<ol>
			<li>Obserwuj zwierzę pod kątem utraty przytomności; nastąpi to po około 2-3 minutach. Jeśli w tym czasie nie dojdzie do utraty przytomności, sprawdź szybkość napełniania i uszczelnienie komory. Po utracie przytomności obserwuj zwierzę pod kątem wyblakłego koloru oczu i braku oddychania. Jeśli oba zostaną zaobserwowane, utrzymuj wypełnienie CO2 przez 1-2 minuty, a następnie wyjmij zwierzę z komory w celu przeprowadzenia zabiegu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przymocuj zwierzę do powierzchni preparcyjnej, mocując przednie łapy i tylne nogi, a następnie spryskaj klatkę piersiową i brzuch 70% etanolem. Uzyskaj dostęp do serca i płuc, otwierając klatkę piersiową za pomocą pionowego nacięcia wzdłuż mostka.</li>
		<li>Najpierw wykonaj małe nacięcia przez przeponę, aby spowodować cofnięcie się płuc, zmniejszając ryzyko przebicia płuc. Podwiązać żyłę główną dolną za pomocą szwu i umieścić małe nacięcie w lewym przedsionku za pomocą małych nożyczek preparacyjnych.</li>
		<li>Za pomocą przygotowanej strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o pojemności 25 g wypełnionej heparynizowanym roztworem soli Hanka (HBSS) (10 j./ml heparyny w HBSS), należy rozpocząć perfuzję płuc od wprowadzenia igły do prawej komory, aby przepchnąć bufor przez krążenie płucne (szybkość 2 ml/min). Kontynuuj tę procedurę, aż płuca staną się białe, a płyn wypływający z lewego przedsionka będzie czysty.</li>
		<li>Po perfuzji odsłoń tchawicę i kanulację za pomocą plastikowego cewnika w pobliżu chrząstki tarczycy i zabezpiecz na miejscu szwem.</li>
		<li>Skonfiguruj system perfuzji grawitacyjnej, mocując strzykawkę o pojemności 10 ml do stojaka na retortę i zacisku. Wyjąć i wyrzucić tłok strzykawki. Zabezpieczyć maksymalny punkt napełniania na cylindrze strzykawki na wysokości 20 cm nad płucami. Podłącz dwukierunkowy kran do końca strzykawki, a długą plastikową rurkę do drugiego końca kranu w celu dostarczenia roztworu decelularyzacyjnego do kaniulowanej tchawicy. Wlać roztwór do strzykawki i pozwolić, aby roztwór wypełnił dołączoną plastikową rurkę i cewnik.
		<ol>
			<li>Przepłukać płuca, napełniając je do całkowitej pojemności płuc (około 12 ml) przez 1 minutę i usunąć plastikowy cewnik z tchawicy, aby umożliwić przepływ płynu z płuc. Nie napełniać strzykawki więcej niż 10 ml podczas płukania płuc, aby utrzymać ciśnienie poniżej 20 cmH2O.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórzyć płukanie płuc osiem razy roztworem decelularyzacyjnym, a następnie 10 płukań solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
		<li>Wyciąć tchawicę i płuca z szyi i klatki piersiowej i usunąć je ze zwierzęcia. Przechowywać tkankę w zimnym PBS w temperaturze 4 °C do czasu przygotowania do cięcia wibratomem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie grubych przekrojów
	<ol>
		<li>Przygotuj około 15 ml agarozy 2% i 4% (w/v) agarozy oraz tyle 6% (w/v) agarozy, aby osadzić wszystkie płaty w małych prostokątnych blokach. Rozpuść proszek agarozy o niskiej temperaturze topnienia w PBS w kuchence mikrofalowej. Przenieść agarozę do probówek o pojemności 50 ml na bloku grzewczym i utrzymywać temperaturę powyżej 40 °C, aby uniknąć żelowania.</li>
		<li>Wypreparuj pozbawione komórek płuco na końcu każdego płata oskrzelowego, aby odłączyć każdy płat (czaszkowy, środkowy, dodatkowy i ogonowy prawy płat oraz lewy płat) za pomocą małych nożyczek. Osusz każdy płatek za pomocą chłonnych arkuszy, aby usunąć nadmiar PBS i umieść w środku 2% (w/v) agarozy na bloku grzewczym.</li>
		<li>Usuń każdy płatek po 5 minutach powlekania agarozą, umieść na szalce Petriego i pozwól powierzchni żelować przez 1 minutę na zimnej płytce.</li>
		<li>Delikatnie umieść płatki z powrotem w 4% (w/v) agarozie, ostudź po 5 minutach i powtórz ponowne powlekanie 6% (w/v) agarozy.</li>
		<li>Po sekwencyjnym pokryciu każdego płata, należy zanurzyć każdy płat osobno w 6% (w/v) agarozie za pomocą metalowych form bazowych z co najmniej 3 mm agarozy otaczającej tkankę od krawędzi. Zorientuj każdy płat za pomocą kleszczy, umieszczając największą płaską krawędź płata na powierzchni metalowej formy skierowanej w stronę eksperymentatora. Ta krawędź będzie stroną przymocowaną do płytki próbki w celu przekrojenia wibratomowego.</li>
		<li>Pozostaw bloki do żelowania na zimnej płytce przez co najmniej 30 minut przed cięciem za pomocą wibratomu. Przechowuj bloki w wilgotnej komorze do 12 godzin w temperaturze 4 °C przed sekcją wibratomową.</li>
		<li>Ustaw wibratom, wypełniając komorę sekcyjną zimnym PBS12. Utrzymuj niską temperaturę przez cały okres przekroju z otaczającą kąpielą lodową. Usuń bloki z metalowych form i użyj żyletki, aby przyciąć nadmiar agarozy otaczającej płaty, zachowując około 3 mm od krawędzi tkanki.</li>
		<li>Przymocuj tkankę do środka płytki próbki za pomocą kleju i zanurz płytkę w komorze sekcyjnej wypełnionej PBS. Ustaw granice przekrojów na wibratomie, wybierając odpowiednio następujące wartości prędkości, amplitudy i grubości: 0,2 mm/s, 1,85 mm i 350 μm, 
		Uwaga: Dopuszczalne są zarówno wzdłużne, jak i poprzeczne przekroje orientacji płata.</li>
		<li>Całkowicie przeciąć każdy płat. Ręcznie odetnij sekcje za pomocą małych nożyczek, jeśli sekcja nie jest całkowicie oddzielona ostrzem na końcu sekwencji sekcji. Delikatnie zbierz sekcje rusztowania i trzymaj w PBS na lodzie do następnego kroku. 
		Uwaga: Wygenerowane skrawki będą obejmować zarówno proksymalny, jak i dystalny obszar płuc i oba źródła można wykorzystać do recelularyzacji; Jednak większość powierzchni obejmie dystalne płuco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dekontaminacja sekcji rusztowań
	<ol>
		<li>Przenieś sekcje rusztowania o grubości 350 mikronów z PBS do probówek mikrowirówek (do 30 sekcji/probówkę) i potraktuj nukleazą (90 U/ml w PBS) (patrz Lista materiałów) przez 12 - 24 godziny w temperaturze pokojowej, na rotatorze.</li>
		<li>Po leczeniu nukleazą przenieść skrawki za pomocą kleszczy do nowych probówek do mikrowirówek i potraktować roztworem przeciwdrobnoustrojowym (200 j./ml penicyliny, streptomycyny i 25 μg/ml amfoterycyny B w PBS) w sterylnych warunkach przez 6 godzin w temperaturze pokojowej, na rotatorze. 
		Uwaga: Rusztowania można przechowywać w roztworze przeciwdrobnoustrojowym do tygodnia w temperaturze 4 °C przed użyciem.</li>
		<li>Po etapie odkażania roztworem przeciwdrobnoustrojowym należy dwukrotnie przepłukać rusztowania PBS w sterylnych warunkach i przenieść do pożywki różnicującej wolnej od surowicy (SFDM) przed wysiewem komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek endodermalnych
<ol>
	<li>Ostateczna indukcja endodermy
	<ol>
		<li>Utrzymuj linie ESC myszy w hodowli wolnej od karmnika, bez surowicy, używając warunków 2i13. Rozpocznij indukcję endodermy od usunięcia komórek z przylegającej hodowli pluripotencjalnej przez trypsynizację.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki w SFDM i wysiewać z gęstością 20 000 komórek/ml na płytkach o niskiej przyczepności przez trzy dni bez zmiany podłoża, aby umożliwić utworzenie EB.</li>
		<li>Po trzech dniach delikatnie przenieś EBs do stożkowych probówek o pojemności 50 ml za pomocą pipety o pojemności 10 ml i pozwól im zebrać się na dnie przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Ostrożnie odessać pożywkę i dodać świeżą pożywkę SFDM uzupełnioną 50 ng/ml aktywiny A.</li>
		<li>Komórki nasienne umieszcza się z powrotem na płytkach o niskiej przyczepności w gęstości 1:2 i hoduje przez trzy dodatkowe dni, aby uzyskać ostateczne różnicowanie endodermy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostateczne wzbogacenie endodermy
	<ol>
		<li>Zbierz EB z dnia 6, dysocjuj trypsyną i znakuj ekspresję c-KIT i CXCR4 za pomocą sprzężonych przeciwciał fluorescencyjnych14.</li>
		<li>Sortuj znakowane komórki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu ekspresji obu markerów, aby uzyskać wzbogaconą ostateczną populację endodermy15.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustawienia recelularyzacji
<ol>
	<li>Konfiguracja kultury międzyfazowej powietrze-ciecz
	<ol>
		<li>Przenieś każdą pozbawioną komórek sekcję rusztowania (krok 1.2.9) z SFDM na hydrofobową pływającą membranę (wielkość porów 8 μm) za pomocą sterylnych kleszczy. Upewnij się, że sekcje rusztowania są równomiernie rozłożone na membranie.</li>
		<li>Przygotować płytki 6- lub 12-dołkowe, wypełniając dołki odpowiednio 1 lub 0,5 ml SFDM. Delikatnie umieść membrany w studzienkach, pozwalając membranie unosić się na podłożu, tworząc konfigurację hodowli powietrzno-cieczowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Siew rusztowań 3D
	<ol>
		<li>Po FACS w celu uzyskania ostatecznych markerów endodermy (krok 2.2.2) policz posortowane komórki za pomocą hemocytometru, wiruj z prędkością 400 x g przez 5 minut i ponownie zawieś w SFDM. Ponownie zawiesić komórki, aby uzyskać objętość zawierającą około 100 000 komórek/10 μl/rusztowanie.</li>
		<li>Aby przeprowadzić recelularyzację rusztowań, należy pipetować 10 μl komórek bezpośrednio na każdy przygotowany fragment z kroku 3.1.2.</li>
		<li>Wymieniaj pożywki SFDM w kulturach co 48 godzin. Zasysaj stare podłoża, trzymając płytkę pod lekkim nachyleniem, aby uniknąć zakłócenia hodowli. Powoli dodawaj świeże SFDM do kultury wzdłuż boku studni, aby zapobiec zapadaniu się pływającej membrany.</li>
		<li>Utrzymuj kultury powietrzno-płynne przez okres do 21 dni, aby osiągnąć różnicowanie wysianych komórek w dojrzałym nabłonku dróg oddechowych. 
		Uwaga: Skrawki recellularne mogą być przetwarzane do barwienia tkanek i mikroskopii immunofluorescencyjnej (IF) w dowolnym momencie hodowli komórkowej16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+Factors%2C+Matrices%2C+and+Forces+Combine+and+Control+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dynamics+in+development+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine.</a> J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).</li>
<li>Ghaedi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-derived+alveolar+epithelium+repopulates+lung+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix.</a> J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).</li>
<li>Huang, S. X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+lung+and+airway+epithelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).</li>
<li>Jensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+lung+de-cellularization+protocol+supports+embryonic+stem+cell+differentiation+in+vitro+and+following+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation.</a> Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+purified+lung+and+thyroid+progenitors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+mature+airway+epithelia+expressing+functional+CFTR+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).</li>
<li>Gilpin, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Lung+Epithelial+Specification+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+on+Decellularized+Lung+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Annal.+Thorac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix.</a> Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).</li>
<li>Cortiella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Acellular+Natural+Lung+Matrix+on+Murine+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation+and+Tissue+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).</li>
<li>Princivalle, M., De Agostini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+roles+of+heparan+sulfate+proteoglycans%3A+a+comparative+review+in+Drosophila%2C+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human.</a> Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).</li>
<li>Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+in+lung+morphogenesis%3A+The+elephant+in+the+room%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+Part+C%2C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room.</a> Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).</li>
<li>Zimmermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+reproducibility+in+preparing+precision-cut+liver+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices.</a> Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).</li>
<li>Ying, Q. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Fox, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Culture+and+FGF+Signaling+Drive+Differentiation+of+Murine+Pluripotent+Cells+to+Distal+Lung+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells.</a> Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> J. Vis. Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Shojaie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+lung+scaffolds+direct+differentiation+of+endoderm+to+functional+airway+epithelial+cells%3A+requirement+of+matrix-bound+HS+proteoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans.</a> Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).</li>
<li>Kubo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).</li>
<li>Longmire, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Derivation+of+Purified+Lung+and+Thyroid+Progenitors+from+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells.</a> Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).</li>
<li>Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mouse+embryo+atlas+based+on+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT.</a> Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).</li>
</ol>

Nie ma żadnych sprzecznych interesów finansowych, które można by zadeklarować.

Opisany tutaj protokół generuje dojrzały nabłonek dróg oddechowych pochodzący z ESC przy użyciu wyłącznie naturalnych rusztowań płuc do bezpośredniego różnicowania bez żadnej innej suplementacji. Ta konfiguracja hodowli jest zdefiniowana, nie zawiera surowicy, jest niedroga i powtarzalna. Nie jest wymagana suplementacja czynnika wzrostu pożywki różnicującej zasady. Wcześniej opublikowane metody generowania komórek nabłonka płuc pochodzących z komórek macierzystych wykorzystywały dwuwymiarowe strategie z suplementacją czy...

Ukierunkowane różnicowanie komórek pluripotencjalnych do linii płuc zależy od precyzyjnych zdarzeń sygnalizacyjnych w mikrośrodowisku 1,2. Ze względu na dynamiczny charakter tego procesu trudno było odtworzyć dokładne zdarzenia organogenezy płuc in vitro. W ostatnich doniesieniach zastosowano stopniowe strategie ograniczania linii z suplementacją rozpuszczalnym czynnikiem wzrostu dwuwymiarowych kultur w celu osiągnięcia różnicowania płuc3-8. W protokołach różnicowania krokowego komórki pluripotencjalne, niezależnie od tego, czy były to embrionalne komórki macierzyste (ESC), czy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, zostały najpierw zróżnicowane do ostatecznej warstwy zarodkowej endodermy. Komórki endodermalne zostały następnie wepchnięte do przedniego losu endodermy, a następnie do komórek progenitorowych płuc, co zidentyfikowano na podstawie ekspresji czynnika transkrypcyjnego NKX2-1 zawierającego homeodomenę. Te komórki progenitorowe płuc były dalej różnicowane do bliższych (dróg oddechowych) lub dystalnych (pęcherzyków płucnych) komórek nabłonka płuc z ciągłą suplementacją czynnika wzrostu. Takie dwuwymiarowe strategie odniosły pewien sukces w generowaniu komórek nabłonka płuc, jednak istnieje kilka ograniczeń, w tym niejasna wydajność, możliwe zanieczyszczenie z innych linii endodermalnych, brak trójwymiarowej (3D) struktury, a w niektórych przypadkach stosowanie niezdefiniowanych kultur z suplementacją surowicy. Hodowla komórek pluripotencjalnych lub zróżnicowanych na bezkomórkowych rusztowaniach płuc jest coraz częściej stosowana jako test do oceny potencjału regeneracyjnego komórek nasiennych w tworzeniu struktur nabłonka płuc3,5,6,8,9. Takie raporty hodują komórki nasienne na rusztowaniach z ciągłą suplementacją czynnikiem wzrostu lub surowicy.
Rozwój płuc obejmuje podział, migrację, ekspresję genów i różnicowanie poszczególnych komórek w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest siatką glikoprotein, która oprócz zapewniania wsparcia strukturalnego, kieruje morfogenezą tkanek poprzez integrację i regulację tych procesów10,11. Wykorzystując rusztowanie ECM płuc jako naturalną platformę do hodowli endodermy, aby lepiej naśladować środowisko rozwoju płuc in vivo, wygenerowaliśmy komórki nabłonka dróg oddechowych pochodzące z komórek macierzystych w określonych warunkach hodowli 3D z wysoką wydajnością i powtarzalnością.
Rusztowania ECM płuc szczurów zostały wygenerowane przez decelularyzację, jak również wygenerowano komórki endodermalne pochodzące z mysich komórek ESC, które następnie zostały umieszczone na tych rusztowaniach. Podwójna ekspresja białek CXCR4 i c-KIT wskazuje na ostateczną tożsamość komórek endodermy, a komórki dodatnie zarówno pod względem ekspresji SOX2, jak i NKX2-1 są identyfikowane jako komórki progenitorowe dróg oddechowych (bliższych płuc). Ostateczne komórki endodermy hodowano na granicy faz powietrza i cieczy (ALI) przez okres do trzech tygodni w celu wytworzenia funkcjonalnych komórek nabłonka dróg oddechowych in vitro.
Ten protokół promuje różnicowanie linii płuc ostatecznej endodermy już po 7 dniach, obserwowane wraz z pojawieniem się NKX2-1+/SOX2+ wczesnych proksymalnych progenitorów płuc. W 14 i 21 dniu hodowli pojawiają się dojrzałe populacje komórek nabłonka dróg oddechowych, w tym komórki rzęskowe (TUBB4A+), klubowe (SCGB1A1+) i podstawne (TRP63+, KRT5+) o morfologicznym i funkcjonalnym podobieństwie do natywnych dróg oddechowych myszy. Protokół ten pokazuje znaczenie mikrośrodowiska macierzy 3D dla osiągnięcia silnego różnicowania do komórek nabłonka dróg oddechowych.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór perfuzyjny</td><td>Sigma</td><td>H0777</td><td>10 U/ml heparyny</td></tr><tr><td>Roztwór perfuzyjny</td><td>Gibco</td><td>14170112</td><td>rozpuszczony w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS-)</td></tr><tr><td>Roztwór do decelularyzacji</td><td>BioShop</td><td>CHA003</td><td>8&nbsp; mM CHAPS</td></tr><tr><td>Rozwiązanie do decelularyzacji</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td>25&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>Roztwór do decelularyzacji</td><td>BioShop</td><td>SOD002</td><td>1&nbsp; M NaCl</td></tr><tr><td>Roztwór decelularyzacyjny</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>rozpuszczony w PBS</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Novagen</td><td>70664-3</td><td>90&nbsp; U/ml Nukleaza benzonazy&nbsp;</td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>rozcieńczona w PBS</td></tr><tr><td>Roztwór przeciwdrobnoustrojowy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>200&nbsp; U/ml penicyliny streptomycyny</td></tr><tr><td>Roztwór przeciwbakteryjny&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290</td><td>25&nbsp; &mu; g/ml amfoterycyny B</td></tr><tr><td>Roztwór przeciwdrobnoustrojowy&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>rozcieńczony w PBS</td></tr><tr><td>Trypsynizacja&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td>TrypLE</td></tr><tr><td>Surowe pożywki różnicujące wolne od surowicy (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>IMDM 2440-053, F12 11765-054</td><td>stosunek 3:1 IMDM i szynki' s zmodyfikowane podłoże F12</td></tr><tr><td>Pożywki do różnicowania bez surowicy (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>Suplement B27 (50x rozcieńczenie)</td></tr><tr><td>Pożywki do różnicowania bez surowicy (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Suplement N2 (100x rozcieńczenie)</td></tr><tr><td>Pożywki do różnicowania wolne od surowicy (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>0,05% (frakcja V) albumina surowicy bydlęcej</td></tr><tr><td>Pożywka do różnicowania wolna od surowicy (SFDM)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>200&nbsp; mM Glutamax</td></tr><tr><td>Serum wolne od pożywek różnicujących (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>4&nbsp; &mu; M monotioglicerol</td></tr><tr><td>Pożywka różnicująca wolna od surowicy (SFDM)</td><td>Sigma</td><td>A4403&nbsp;</td><td>0,05&nbsp; mg/ml kwas askobinowy</td></tr><tr><td>Indukcja endodermy</td><td>R& D</td><td>338-AC/CF</td><td>Aktywina A</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDH1</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td>Mysz, niesprzężona, 1:100</td></tr><tr><td>C-KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>558163</td><td>Szczur, PE-Cy7, 1:100</td></tr><tr><td>CXCR4</td><td>BD Biosciences</td><td>558644</td><td>Szczur, APC, 1:100</td></tr><tr><td>KRT5</td><td>Abcam</td><td>ab24647</td><td>Królik, niesprzężony, 1:1,000</td></tr><tr><td>NKX2-1</td><td>Abcam</td><td>ab76013</td><td>Królik, niesprzężony, 1:200</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td>Królik, niesprzężony, 1:200</td></tr><tr><td>SCGB1A1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9772&nbsp;</td><td>Koza, niesprzężona, 1:1,000</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>R& D Systems</td><td>AF2018&nbsp;</td><td>Koza, niesprzężona, 1:400</td></tr><tr><td>TRP63</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8431</td><td>Mysz, niesprzężona, 1:200</td></tr><tr><td>Mysz TUBB4A</td><td>BioGenex</td><td>MU178-UC</td><td>, niesprzężona, 1:500</td></tr><tr><td>Kozia IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>Osioł, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Mysz IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21202</td><td>Osioł, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Mysz IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31571</td><td>Osioł, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td>IgG królika</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>Osioł, Alexa Fluor 488, 1:200</td></tr><tr><td>Królik IgG&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-31573</td><td>Osioł, Alexa Fluor 647, 1:200</td></tr><tr><td><mocny>Inne materiały</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki o niskiej przyczepności</td><td>Nunc</td><td>Z721050&nbsp;</td><td>Płytki wiążące o niskiej zawartości komórek,&nbsp; 6 dołków&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Membrany interfejsu powietrze-ciecz&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>110614</td><td>Hydrofobowa błona nukleoporowa, 8&nbsp; &mu; m rozmiar porów</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S&nbsp;</td><td>Leica Vibratome</td></tr><tr><td>Klej do tkanek</td><td>Ted Pella</td><td>10033</td><td>Klej do tkanek Pelco</td></tr></tbody></table>

generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z esc przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Różnicowanie linii płuc wymaga integracji złożonych sygnałów środowiskowych, które obejmują sygnalizację czynnika wzrostu, interakcje komórka-komórka i interakcje komórka-macierz. Ze względu na tę złożoność, rekapitulacja rozwoju płuc in vitro w celu promowania różnicowania komórek macierzystych do komórek nabłonka płuc była wyzwaniem. W tym protokole bezkomórkowe rusztowania płuc są używane do naśladowania trójwymiarowego środowiska płuc i generowania komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzących z komórek macierzystych. Embrionalne komórki macierzyste myszy są najpierw różnicowane do linii endodermy przy użyciu metody hodowli ciała zarodkowego (EB) z aktywiną A. Komórki endodermy są następnie wysiewane na rusztowaniach bezkomórkowych i hodowane na granicy powietrze-ciecz przez okres do 21 dni. Technika ta sprzyja różnicowaniu się komórek nasiennych do funkcjonalnych komórek nabłonka dróg oddechowych (komórki rzęskowe, komórki klubowe i komórki podstawne) bez dodatkowej suplementacji czynnikiem wzrostu. Ta konfiguracja hodowli jest zdefiniowana, nie zawiera surowicy, jest niedroga i powtarzalna. Chociaż w hodowli występuje ograniczone zanieczyszczenie z linii endodermy innych niż płuca, protokół ten generuje tylko populacje nabłonka dróg oddechowych i nie powoduje powstania komórek nabłonka pęcherzyków płucnych. Nabłonek dróg oddechowych wygenerowany za pomocą tego protokołu może być wykorzystany do badania interakcji komórka-macierz podczas organogenezy płuc oraz do modelowania chorób lub platform odkrywania leków w patologiach związanych z drogami oddechowymi, takich jak mukowiscydoza.

Zgodnie z opisem w niniejszym protokole, skuteczną różnicowanie definitywnej endodermy w dojrzałe komórki nabłonka dróg oddechowych można osiągnąć poprzez przedłużoną hodowlę zasianych komórek na przekrojach zdecelularyzowanego rusztowania płucnego. Przed wykorzystaniem rusztowań do różnicowania zaleca się ich charakterystykę w celu upewnienia się, że (1) komórki gospodarza zostały całkowicie usunięte oraz (2) białka macierzy pozakomórkowej zostały zachowane. Decelularyzację można ocenić ...

Ten protokół skutecznie kieruje endodermę pochodzącą z embrionalnych komórek macierzystych myszy do dojrzałych komórek nabłonka dróg oddechowych. Ta technika różnicowania wykorzystuje trójwymiarowe, zdecelularizowane rusztowania płuc do kierowania specyfikacją linii płuc w zdefiniowanych, wolnych od surowicy warunkach hodowli.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ukierunkowanie różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w dojrzałe komórki nabłonka dróg oddechowych, przy użyciu układu hodowli 3D z decelularyzowanymi rusztowaniami płucnymi. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu rozwoju płuc, takie jak rola skurczów macierzy komórkowej i sygnalizacji czynników wzrostu podczas różnicowania linii płucnej. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie systemu hodowli 3D w zdefiniowanym środowisku wolnym od surowicy oraz uzyskanie stabilnego różnicowania nabłonka dróg oddechowych przy ograniczonej kontaminacji innymi liniami endodermy. Po uśmierceniu dorosłego szczura rasy Wistar, zgodnie z protokołem tekstowym, unieruchom zwierzę na powierzchni sekcyjnej, mocując przednie łapy i tylne kończyny, a następnie spryskaj klatkę piersiową i brzuch 70% ethanol. Wykonaj nacięcie tuż poniżej klatki piersiowej. Przetnij skórę i odsłoń przeponę. Następnie wykonaj niewielkie nacięcia w przeponie, aby spowodować zapadnięcie się płuc, co zmniejszy ryzyko ich przebicia. Następnie wykonaj nacięcie pionowe wzdłuż mostka i otwórz jamę klatki piersiowej, aby uzyskać dostęp do ser

generation-esc-derived-mouse-airway-epithelial-cells-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opracowaliśmy zdecelularyzowaną macierz zewnątrzkomórkową płuca oraz nowatorski bioreaktor biomimetyczny, które mogą być wykorzystywane do generowania funkcjonalnej tkanki płucnej. Poprzez zasiewanie komórek do macierzy i ich hodowlę w bioreaktorze, otrzymujemy tkankę wykazującą efektywną wymianę gazową po krótkotrwałym przeszczepieniu in vivo.

Procedura inżynierii płuc

W tym filmie pokazujemy przygotowanie bezkomórkowego rusztowania przełyku świni, z zachowaną jego biochemiczną architekturą i składem, do zastosowań w inżynierii tkankowej.

Bezkomórkowe przygotowanie rusztowania przełyku świni: technika generowania rusztowania bezkomórkowego z przełyku świni

Decelularyzacja całego narządu tworzy naturalne biologiczne rusztowania, które mogą być wykorzystane w medycynie regeneracyjnej. Przedstawiono opis modelu regeneracji płuc u naczelnych u zwierząt innych niż człowiek, w którym całe płuca są decelularyzowane, a następnie wysiewane dorosłymi komórkami macierzystymi i komórkami śródbłonka w bioreaktorze ułatwiającym krążenie naczyniowe i wentylację płynnych mediów.

Decelularyzacja i recelularyzacja płuc naczelnych przy użyciu specjalistycznego bioreaktora wielkonarządowego

Ten protokół ma na celu decelularyzację serca i płuc myszy. Powstałe w ten sposób rusztowania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) mogą być barwione immunologicznie i obrazowane w celu zmapowania lokalizacji i topologii ich elementów.

Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego

Ten protokół opisuje metodę generowania powtarzalnych, małych tkanek płuc, poprzez ponowne zaludnienie decelularyzowanych, precyzyjnie wyciętych wycinków płuc komórkami nabłonka pęcherzyków płucnych typu 2, fibroblastami i komórkami śródbłonka.

Zmodyfikowane tkanki płuc przygotowane z bezkomórkowych plastrów płuc

Protokół opisuje bioreaktor z obsługą obrazowania, który pozwala na selektywne usuwanie endogennego nabłonka z tchawicy szczura i jednorodne rozmieszczenie komórek egzogennych na powierzchni światła, a następnie długoterminową hodowlę in vitro konstruktu komórka-tkanka.

Bioreaktor sterowany obrazowaniem do generowania bioinżynieryjnych tkanek dróg oddechowych

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji regionalnej decelularyzowanej tkanki płucnej. Protokół ten zapewnia potężne narzędzie do badania złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej i interakcji komórka-macierz.

Rozwarstwienie i izolacja specyficznej dla regionu bezkomórkowej tkanki płucnej

Ten artykuł opisuje generowanie złożonego, wielokomórkowego modelu bariery dróg oddechowych, składającego się z nabłonka płuc pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), mezenchymów, komórek śródbłonka i makrofagów w hodowli na granicy powietrza i cieczy.

Hodowla komórek nabłonkowych, mezenchymalnych, śródbłonkowych i odpornościowych pochodzących z iPSC w celu modelowania integralności bariery dróg oddechowych w zdrowiu i chorobie płuc

Ten artykuł opisuje, jak stworzyć bioinżynieryjne płuca myszy za pomocą metod decelularyzacji i recelularyzacji. Zawiera również szczegółowe informacje na temat późniejszego ortotopowego przeszczepu płuc.

Przeszczep bioinżynieryjnego płuca przy użyciu pozbawionych komórek płuc myszy i pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka

Poznaj protokół różnicowania mysich komórek macierzystych w nabłonek dróg oddechowych przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc w trójwymiarowej kulturze. Ta metoda wspiera badania nad rozwojem płuc i inżynierią tkankową.

Generowanie komórek nabłonka dróg oddechowych myszy pochodzących z ESC przy użyciu bezkomórkowych rusztowań płuc

Przeglądaj więcej filmów