Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Ogólnym celem tej procedury jest opisanie sposobu wykonywania nagrań typu patch-clamp dla całych komórek w świeżo wypreparowanych wycinkach mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób eksperymentalne manipulacje kontrolne zmieniają aktywność określonych neuronów w określonych regionach mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona pożywkę do identyfikacji preparatu X vivo długotrwałych zmian w funkcjach neuronów, które rozwinęły się u nienaruszonych obudzonych zwierząt.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcje neuronalne w wycinkach mózgu, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak komórki w hodowli i neurony in vivo. Procedurę zademonstruje Francisco Garcia-Oscos, student z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, za pomocą plastikowej pipety transferowej z końcówką do przycinania, delikatnie wyciągnij jeden wycinek mózgu z komory regeneracyjnej.

Umieść pipetę transferową w komorze rejestracyjnej i delikatnie wyciśnij plasterek z pipety na wyściółkę szkiełka nakrywkowego na dnie komory. Następnie, za pomocą obiektywu mikroskopowego 4x, ustaw plasterek tak, aby żądany obszar znajdował się dokładnie na środku komory nagrywającej. Po osiągnięciu żądanej pozycji zabezpiecz pozycję wycinka mózgu za pomocą dociśniętego wycinka, znanego również jako harfa.

Następnie przełącz się na obiektyw 40x i delikatnie opuść obiektyw, aż zetknie się z ACSF w komorze. Następnie użyj pokrętła do precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość tkanki. Gdy fokus znajduje się na poziomie tkanki, obserwuj komórki w docelowym regionie.

Teraz poszukaj komórki docelowej. Zaznacz go na ekranie komputera, aby ułatwić prowadzenie mikropipety rejestrującej. Podnieś soczewkę obiektywu, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca na umieszczenie mikropipety rejestrującej.

Na tym etapie za pomocą jednomililitrowej strzykawki, niemetalowej igły do mikrostrzykawki i dedykowanego filtra, napełnij mikropipetę przygotowanym wcześniej roztworem wewnętrznym. Upewnij się, że w mikropipecie nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie umieść mikropipetę w uchwycie elektrody, tak aby roztwór zetknął się z drutem elektrodowym pokrytym chlorkiem srebra.

Dokręcić nasadkę pipety tak, aby podkładka stożkowa utworzyła uszczelkę wokół mikropipety. Następnie należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem podłączonej do uchwytu pipety przed zanurzeniem mikropipety w ACSF, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do środka. Za pomocą mikromanipulatora poprowadź pipetę w dół do komory tak, aby znajdowała się mniej więcej pod środkiem zanurzonego obiektywu.

Przesuwając mikropipetę za pomocą mikromanipulatora ze średnią lub dużą prędkością, zlokalizuj mikropipetę na ekranie komputera i poprowadź mikropipetę w kierunku położenia celi na osi XY. W międzyczasie zmierz rezystancję mikropipety, stosując krok napięcia. Zastosuj nadciśnienie, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub inne ciała obce blokujące mikropipetę.

Po wyczyszczeniu mikropipety wykonaj przesunięcie napięcia, aby zmniejszyć prąd pipety do zera. Korzystając z pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości mikroskopu, zacznij ustawiać ostrość w dół, stopniowo opuszczając mikropipetę. Zawsze najpierw należy ustawić ostrość mikropipety w dół, a następnie opuścić ją do płaszczyzny ostrości, aby upewnić się, że końcówka mikropipety nie wniknie nagle w plasterek.

Gdy mikropipeta zetknie się z powierzchnią plasterka, zmniejsz prędkość mikromanipulatora do trybu średnio niskiego. Delikatnie zastosuj lekki nadciśnienie, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki. Następnie zbliż się do komórki, albo na przemian z pokrętłami sterującymi XYZ, albo zbliżając się po przekątnej, gdzie obie osie XZ są zmieniane wraz z obrotem pokrętła osi Z.

Gdy mikropipeta znajdzie się wystarczająco blisko komórki, na powierzchni komórki pojawi się wgłębienie. Teraz przyłóż słabe i krótkie ssanie przez rurkę, która jest podłączona do rurki ssącej uchwytu pipety, aby uzyskać uszczelnienie. Podczas tworzenia się giga-uszczelnienia użyj sterowanego komputerowo sterownika wzmacniacza, aby doprowadzić potencjał utrzymujący komórki do fizjologicznego potencjału spoczynkowego, aby zapobiec nagłym zmianom po pęknięciu błony.

Po uformowaniu się giga-seal skompensuj szybkie lub wolne pojemności. Tutaj bardzo ważne jest, aby zastosowane ssanie nie było zbyt silne. W przeciwnym razie membrana może pęknąć przed ustanowieniem uszczelki.

Jeśli uszczelka pozostaje stabilna i przekracza jeden gigaom, zastosuj krótkie i silne ssanie, aby rozerwać błonę plazmatyczną. Ssanie musi być krótkie i silniejsze niż ciśnienie wywierane podczas zakładania uszczelnienia. W celu prawidłowego pęknięcia błony i uzyskania stabilnej konfiguracji całej komórki.

Przełączając się w tryb ogniwa w teście membranowym, view różne parametry ogniwa, takie jak rezystancja wejściowa, rezystancja szeregowa i kapacitony membranowe. Po osiągnięciu konfiguracji całej komórki kontynuuj monitorowanie tych parametrów podczas nagrywania. Pokazany tutaj jest przykład wywołanego nachylenia EPSC od pojedynczego jądra półleżącego skorupy MSN.

Zwiększenie temperatury z 24 do 28 i do 32 stopni Celsjusza, zwiększa nachylenie wywoływanych EPSC. W tym przypadku amplituda wywołanych EPSC jest oceniana w trybie cęgów napięciowych na minus 80 miliwoltów. Wraz ze wzrostem rezystancji szeregowej amplituda wywołanego EPSCS maleje.

A oto przykład śladów z dwóch neuronów pokazujących wpływ oporu wejściowego na zdolność neuronu do generowania impulsów. Neurony są zaciśnięte prądem i utrzymywane na poziomie minus 80 miliwoltów. Wraz ze wzrostem rezystancji wejściowej zwiększa się również liczba potencjałów czynnościowych.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że generowanie zdrowych wycinków mózgu ma kluczowe znaczenie. Ważne jest również monitorowanie parametrów, które mogą wpływać na przebieg sygnału elektrycznego, takich jak rezystancja szeregowa, rezystancja wejściowa i temperatura. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć podstawowy aspekt techniki nagrywania całych komórek w wycinkach mózgu.