Name: Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj technikę zacisku krosowego całych komórek w świeżych wycinkach mózgu do badania aktywności elektrycznej neuronów. Ta metoda pozwala analizować funkcje neuronalne w intaktnych obwodach mózgowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez fundusze startowe UT Southwestern (SK).

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Cahalan, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques: an overview.</a> Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).</li>
<li>Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+properties+of+dentate+gyrus+granule+cells%3A+comparison+of+sharp+microelectrode+and+whole-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings.</a> J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).</li>
<li>Pusch, M., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rates+of+diffusional+exchange+between+small+cells+and+a+measuring+patch+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette.</a> Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).</li>
<li>Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+systems+biology+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The molecular and systems biology of memory.</a> Cell. 157 (1), 163-186 (2014).</li>
<li>Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKourrich%2C+S+%22Neurobiology+of+Mental+Illness.+4th+edn%22">Neurobiology of Mental Illness. 4th edn</a>. , Oxford University Press. (2013).</li>
<li>Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+synaptic+plasticity%3A+role+of+nonsynaptic+plasticity+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory.</a> Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).</li>
<li>Zhang, W., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+other+side+of+the+engram%3A+experience-driven+changes+in+neuronal+intrinsic+excitability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability.</a> Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).</li>
<li>Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+plasticity%3A+an+emerging+player+in+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).</li>
<li>Luscher, C., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-evoked+synaptic+plasticity+in+addiction%3A+from+molecular+changes+to+circuit+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling.</a> Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).</li>
<li>McEwen, B. S., Morrison, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+on+stress%3A+vulnerability+and+plasticity+of+the+prefrontal+cortex+over+the+life+course%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course.</a> Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).</li>
<li>Sandi, C., Haller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+the+social+brain%3A+behavioural+effects+and+neurobiological+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms.</a> Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).</li>
<li>Kim, S. J., Linden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+plasticity+and+memory+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous plasticity and memory storage.</a> Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).</li>
<li>Ganguly, K., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neural+plasticity+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside.</a> Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).</li>
<li>Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Plasticity of inhibition.</a> Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).</li>
<li>Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Space-clamp+problems+when+voltage+clamping+neurons+expressing+voltage-gated+conductances%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances.</a> J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).</li>
<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).</li>
<li>Defelice, L. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDefelice%2C+LJ+%22Electrical+Properties+of+Cells-Patch+Clamp+for+Biologists%22">Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists</a>. , Plenum Press. (1997).</li>
<li>Kornreich, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%3A+principles+and+technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique: principles and technical considerations.</a> J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).</li>
<li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMolleman%2C+A+%22Patch+Clamping%3A+An+Introductory+Guide+To+Patch+Clamp+Electrophysiology%22">Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).</li>
<li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Am%22%5BJournal%5D)">The patch clamp technique.</a> Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).</li>
<li>Richerson, G. B., Messer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+composition+of+experimental+solutions+on+neuronal+survival+during+rat+brain+slicing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing.</a> Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).</li>
<li>Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cutting+solutions+on+the+viability+of+GABAergic+interneurons+in+cerebral+cortical+slices+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).</li>
<li>Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+studies+in+the+CNS+illustrate+a+simple+new+method+for+obtaining+viable+neurons+in+rat+brain+slices%3A+glycerol+replacement+of+NaCl+protects+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons.</a> J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).</li>
<li>Kourrich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interaction+between+sigma-1+receptor+and+Kv1.2+shapes+neuronal+and+behavioral+responses+to+cocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine.</a> Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).</li>
<li>Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPAR-Independent+Effect+of+Striatal+aCaMKII+Promotes+the+Sensitization+of+Cocaine+Reward%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward.</a> J Neurosci. , (2012).</li>
<li>Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+experience+controls+bidirectional+synaptic+plasticity+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens.</a> J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).</li>
<li>Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+neurons%2C+opposite+adaptations%3A+psychostimulant+experience+differentially+alters+firing+properties+in+accumbens+core+versus+shell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell.</a> J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+novelty+causes+stress-like+adaptations+at+nucleus+accumbens+synapses%3A+implications+for+studying+addiction-related+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity.</a> Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).</li>
<li>Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+adaptations+in+the+nucleus+accumbens+caused+by+experiences+linked+to+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse.</a> Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+synapses+in+selectively+activated+nucleus+accumbens+neurons+following+cocaine+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization.</a> Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).</li>
<li>Conrad, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+accumbens+GluR2-lacking+AMPA+receptors+mediates+incubation+of+cocaine+craving%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving.</a> Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).</li>
<li>Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+patch+clamp%3A+nanotechnologies+for+intracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording.</a> Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale-targeted+patch-clamp+recordings+of+functional+presynaptic+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels.</a> Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Protokół ten opisuje podstawową procedurę przeprowadzania eksperymentów z klamrą krosową całej komórki na neuronach w wycinkach mózgu. Jednak złożoność, potencjał i wrażliwość tej techniki nie mogą być w pełni opisane w tym artykule. W tym miejscu staraliśmy się nakreślić najbardziej podstawowe kroki i podkreślić ważne parametry, które muszą być kontrolowane, aby osiągnąć udane i rygorystyczne nagrania całych komórek. W celu dalszej wiedzy teoretycznej opublikowano wiele książek i artykułów na temat zarówno zapisu krosów...

Technika patch-clamp, technika elektrofizjologiczna, która została opracowana pod koniec lat siedemdziesiątych1,2, jest podstawowym narzędziem do badania funkcji jednego lub wielu kanałów jonowych w żywej tkance. Wśród różnych konfiguracji łatek, które można uzyskać, nagrania z całych komórek pozwalają na badanie zachowania elektrycznego znacznej części neuronu. Klasycznie technika ta jest wykonywana in vitro na wycinkach mózgu, świeżo zdysocjowanych neuronach lub na modelach hodowli komórkowych3. Technika ta, wykonywana na neuronach w wycinkach mózgu, ma kilka zalet. W szczególności: (i) neurony są rejestrowane w stosunkowo zachowanych obwodach mózgowych, które do pewnego stopnia, w porównaniu z preparatami do hodowli komórkowych, zapewniają środowisko fizjologicznie istotne3. Pozwala to na wczesne, a nawet monitorowanie w czasie rzeczywistym zdarzeń komórkowych i molekularnych, które są wywoływane przez wszelkiego rodzaju ostre manipulacje farmakologiczne – rozdzielczość czasowa, której nie można osiągnąć w klasycznych warunkach in vivo; (ii) zdolność do wizualnej identyfikacji obszarów mózgu w wycinkach mózgu pozwala na wysoką swoistość regionalną 3 zarówno dla badanego regionu mózgu, jak i dla określonych neuronów, gdy wyrażają one markery fluorescencyjne; (iii) dostęp do przestrzeni wewnątrzkomórkowej komórki poprzez otwarcie znacznej części błony komórkowej (w przeciwieństwie do nakłuwania błony ostrą mikropipetą w przypadku zapisów wewnątrzkomórkowych)4. To z kolei pozwala na modyfikację zawartości lub stężenia określonych jonów wchodzących w skład roztworu wewnętrznego, dzięki czemu można badać cele molekularne lub mechanizmy komórkowe w różnych warunkach. Na przykład, po ustaleniu konfiguracji całej komórki, każdy specyficzny czynnik farmakologiczny (np. antagoniści), który można dodać do roztworu mikropipety rejestrującej (pipety z łatą), będzie bezpośrednio dyfundował do cytoplazmy i działał na jej domniemane cele wewnątrzkomórkowe bez zmiany funkcji docelowej w sąsiednich komórkach. Dodatkowo, w porównaniu z ostrym zapisem mikropipet, duży otwór na końcówce elektrody krosowej zapewnia niższą rezystancję, mniej konkurencyjnego hałasu, a tym samym lepszy dostęp elektryczny do wnętrza ogniwa4. Należy jednak pamiętać, że duży otwór na końcówce pipety może prowadzić do dializy komórek, a tym samym do utraty wewnątrzkomórkowej maszynerii molekularnej, która może mieć kluczowe znaczenie dla ekspresji badanych zjawisk biologicznych5,6. W takim przypadku bardziej odpowiednie mogą być nagrania z ostrymi elektrodami. Ten rodzaj zapisów wymaga mikropipet z porem znacznie mniejszym niż te używane do zapisów całych komórek, zapobiegając w ten sposób większości wymiany jonowej między przestrzenią wewnątrzkomórkową a wewnętrznym roztworem pipety.
Każda forma doświadczenia (ostra lub przewlekła), w tym uczenie się7-10, narażenie na narkotyki11,12, stres13,14, itd., może zmienić różne aspekty funkcji neuronalnych w określonych obszarach mózgu. Ponieważ zmiany te często wymagają czasu, aby się rozwinąć (od godzin do dni), zapisy całych komórek w wycinkach mózgu zwierząt, które przeszły określone doświadczenie, pozwalają naukowcom zidentyfikować te zmiany. Zasadniczo, wiele (jeśli nie wszystkie) komponenty, które uczestniczą w funkcjach neuronalnych (np. kanały jonowe aktywowane ligandem, kanały jonowe bramkowane napięciem, transportery neuroprzekaźników), a tym samym aktywność i zachowanie obwodów mózgu, może być zmienionych przez doświadczenie (plastyczność zależna od doświadczenia)10,15-17. Na poziomie neuronalnym aktywność obwodów mózgowych wynika ze stałych interakcji między czynnikami synaptycznymi (np. przekaźnictwo glutaminianu) a wewnętrznymi czynnikami pobudliwości komórkowej (np. aksosomatyczno-dendrytyczne kanały jonowe: sód, Na+; potas, K+; i wapń,Ca2+). W określonych warunkach przy użyciu technik elektrofizjologicznych typu patch-clamp dla całych komórek można wyizolować zmiany sygnału pochodzące konkretnie ze zmian w pobudliwości synaptycznej i wewnętrznej.
W większości przypadków pobudliwość synaptyczna jest oceniana za pomocą techniki zacisków napięcia całego ogniwa. Ten tryb rejestracji umożliwia pomiar prądów jonowych [np. za pośrednictwem receptorów kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (receptory AMPA) i receptorów kwasu N-metylo-D-asparaginowego (receptory NMDA)] przez błonę plazmatyczną neuronów przy jednoczesnym utrzymywaniu potencjału błonowego przy ustalonym napięciu. W tym przypadku eksperymentatorzy używają wewnętrznych roztworów mikropipet, które zawierają cez (Cs+), szeroki bloker kanałów K+ (kluczowe wewnętrzne czynniki pobudliwości). Po ustaleniu konfiguracji całej komórki, dyfuzja Cs+ w przestrzeni wewnątrzkomórkowej zablokuje kanały K+, a tym samym umożliwi zarówno stosunkowo efektywne zaciskanie przestrzeni, jak i zapobiegnie wpływowi wewnętrznych czynników pobudliwości na inne pomiary. Problemy z zaciskiem przestrzennym, tj. trudności z napięciem zacisku całej komórki, pojawiają się podczas rejestrowania komórek o nieregularnych kształtach (np. neuronów), a zwłaszcza neuronów z rozległym i złożonym trzpieniem dendrytycznym18,19. Ponieważ somatyczne cęgi napięciowe słabo kontrolują napięcie w drzewie dendrytycznym neuronów, różne aspekty badanych dendrytycznych sygnałów elektrycznych są zniekształcone w sposób dendrytyczny zależny od odległości. W połączeniu z narzędziami farmakologicznymi, takimi jak piprotoksyna (kwas gamma-aminomasłowy, antagonista receptora GABAA) lub kwas kynureninowy (szeroki bloker receptorów glutaminianu) rozpuszczony w roztworze zewnątrzkomórkowym (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy, ACSF), technika ta pozwala na pomiar odpowiednio prądów za pośrednictwem receptora glutaminianu i GABAAR.
Natomiast wewnętrzna pobudliwość jest zwykle oceniana w trybie nagrywania cęgowego. W przeciwieństwie do zapisu cęgowego napięcia, ten tryb zapisu umożliwia pomiar zmian potencjałów błonowych indukowanych przez prądy jonowe przepływające przez błonę plazmatyczną neuronów. Zazwyczaj zmiana wewnętrznej pobudliwości jest oceniana poprzez zmiany w zdolności neuronów do generowania potencjałów czynnościowych, co wymaga zarówno kanałów Na+, jak i K+. Dlatego podczas wykonywania nagrań cęgowych mikropipety są napełniane wewnętrznym roztworem, który zawiera K+ zamiast Cs+. W połączeniu ze środkami farmakologicznymi, które blokują prądy za pośrednictwem glutaminianu i receptora GABAA rozpuszczone w ACSF, ten eksperymentalny projekt pozwala na pomiar udziału czynników wewnętrznych (np. kanałów K+) w odpalaniu neuronów bez zanieczyszczenia potencjalnymi zmianami w czynnikach pobudliwości synaptycznej.
Ten artykuł opisze podstawowe niezbędne kroki proceduralne w celu (i) przygotowania zdrowych wycinków mózgu; (ii) osiągnąć konfigurację całej komórki oraz (iii) monitorować podstawowe parametry w celu oceny pobudliwości synaptycznej i wewnętrznej.

<table><tbody><tr><td>Izolowany generator bodźców impulsowych</td><td>A.M.P.I</td><td>Master-8</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka izolacyjna (ISO-Flex)</td><td>A.M.P.I</td><td>ISO-Flex</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz sterowany komputerowo&nbsp;</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Multiclamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy system akwizycji</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Grzałka komorowa i liniowa</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Slicer Leica&nbsp;</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Kamera obrazująca</td><td>Q Obrazowanie</td><td>QIClick-F-M-12</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do pipet Narishige PC-10</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>WPI</td><td>TW150F-3</td><td></td></tr><tr><td>Slice docisk (harfa)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0255</td><td></td></tr><tr><td>Slice Chamber</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26</td><td></td></tr><tr><td>Niemetalowa igła strzykawkowa</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>Pistolet do klejenia</td><td>Home Depot</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>rurki dyspersyjne gazu</td><td>Ace Glass Inc.</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>nożyczki do dekapitacji</td><td>Home Depot</td><td>100649198</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>Małe proste ostre końcówki Nożyczki</td><td>World Precision Instruments</td><td>14218</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do kanalikowania naczyń&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>500453</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze hemostatyczne</td> World <td>Precision Instruments</td><td>501288</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta ekonomiczna #3</td><td>World Precision Instruments</td><td>501976-6</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14357Q</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-747B</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Lab Depot</td><td>CFP1-110</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Solutions</td></tr><tr><td colspan="4">Cs-Glukonian roztwór wewnętrzny (pH 7,2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm)</silny></td></tr><tr><td>Kwas D-glukonowy 50%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cez-OH (CsOH) 50%&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 2.8 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0.4 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>tetraetyloamon-Cl, 5 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>T2265</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0.3 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>K-roztwór wewnętrzny glukonianu (pH 7,2&ndash; 7.3, 280&ndash; 290 mOsm)</mocny></td></tr><tr><td>K D-glukonian, 120 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>KCl, 20 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 10 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EGTA, 0,2 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Na2GTP, 0,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>MgATP, 2 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Standardowy sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF, osmolarność i asymp; 300-310 mOsm)</silny></td></tr><tr><td>KCl, 2,5 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, 119 mM</td><td>Sigma Aldrich/ różne</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&#8226; H2O, 1 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, 26,2 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>S8875</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, 11 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4-7H2O, 1,3 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2- 2H2O, 2.5 mM</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silne>Dodatkowe związki używane do przygotowania roztworów</td></tr><tr><td>KOH</td><td>różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas kynureninowy</td><td>Sigma Aldrich/różne</td><td>K3375</td><td></td></tr></tbody></table>

nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Zapis na całej komórce jest techniką elektrofizjologiczną, która pozwala na badanie właściwości elektrycznych znacznej części neuronu. W tej konfiguracji mikropipeta jest w ścisłym kontakcie z błoną komórkową, co zapobiega upływowi prądu, a tym samym zapewnia dokładniejsze pomiary prądu jonowego niż dotychczas stosowana wewnątrzkomórkowa metoda zapisu na ostrych elektrodach. Klasycznie, zapis całych komórek może być wykonywany na neuronach w różnych typach preparatów, w tym na modelach kultur komórkowych, zdysocjowanych neuronach, neuronach w wycinkach mózgu oraz u nienaruszonych znieczulonych lub obudzonych zwierząt. Podsumowując, technika ta w ogromnym stopniu przyczyniła się do zrozumienia biernych i aktywnych właściwości biofizycznych komórek pobudliwych. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona informacji o tym, w jaki sposób określone manipulacje (np. farmakologiczna, plastyczność wywołana przez eksperymentatora) mogą zmieniać określone funkcje lub kanały neuronalne w czasie rzeczywistym. Dodatkowo, znaczne otwarcie błony plazmatycznej pozwala na swobodną dyfuzję roztworu pipety wewnętrznej do cytoplazmy, zapewniając środki do wprowadzania leków, np. agonistów lub antagonistów określonych białek wewnątrzkomórkowych i manipulowania tymi celami bez zmiany ich funkcji w sąsiednich komórkach. W tym artykule skupimy się na zapisie całych komórek wykonywanym na neuronach w wycinkach mózgu, preparacie, który ma tę zaletę, że rejestruje neurony w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych, tj. w fizjologicznie istotnym kontekście. W szczególności, w połączeniu z odpowiednią farmakologią, technika ta jest potężnym narzędziem umożliwiającym identyfikację specyficznych neuroadaptacji, które wystąpiły po wszelkiego rodzaju doświadczeniach, takich jak uczenie się, narażenie na narkotyki i stres. Podsumowując, zapisy całokomórkowych klamer w wycinkach mózgu dostarczają środków do pomiaru w preparacie ex vivo długotrwałych zmian w funkcjach neuronalnych, które rozwinęły się u nienaruszonych obudzonych zwierząt.

Temperatura, czynnik łatwo kontrolowany przez eksperymentatora, wpływa na właściwości biofizyczne kanałów jonowych i receptorów, a tym samym na kształt prądów postsynaptycznych (PSC) (EPSC i IPSC) oraz zdolność neuronów do generowania potencjałów czynnościowych. Rycina 3 i Rysunek 4 wykazać wpływ temperatury odpowiednio na wyładowania neuronowe oraz nachylenie wywołanych prądów postsynaptycznych pobudzających (eEPSCs). Wzorzec wyładowań (Rycina 3<...

Ten protokół opisuje podstawowe kroki proceduralne do wykonywania nagrań z użyciem krosówek dla całej komórki. Technika ta pozwala na badanie zachowania elektrycznego neuronów, a gdy jest wykonywana w wycinkach mózgu, pozwala na ocenę różnych funkcji neuronalnych z neuronów, które są nadal zintegrowane w stosunkowo dobrze zachowanych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Ogólnym celem tej procedury jest opis sposobu wykonywania rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell w świeżo wypreparowanych skrawkach mózgu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, takie jak to, w jaki sposób eksperymentalne manipulacje kontrolne zmieniają aktywność konkretnych neuronów w określonych obszarach mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona identyfikację w preparacie ex vivo długotrwałych zmian w funkcjach neuronów, które rozwinęły się u nienaruszonych, czuwających zwierząt.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat funkcji neuronalnych w skrawkach mózgu, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak komórki w hodowli oraz neurony in vivo. Procedurę zaprezentuje Francisco Garcia-Oscos, student z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, za pomocą plastikowej pipety transferowej z przyciętą końcówką, delikatnie pobierz jeden skrawek mózgu z komory regeneracyjnej.Umieść pipetę transferową w komorze rejestracyjnej i delikatnie wyciśnij skibkę z pipety na szkiełko nakrywkę wyściełającą dno komory. Następnie, korzystając z obiektywu mikroskopu 4x, ustaw skibkę tak, aby wybr

whole-cell-patch-clamp-recordings-in-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje technikę zaciskania krostek na całej komórce w wycinku mózgu myszy. Technika ta ustanawia stabilne połączenie między mikropipetą a błoną neuronu, która jest dalej zakłócana w celu ustalenia konfiguracji całej komórki w celu zbadania zdrowia i reakcji fizjologicznych neuronu.

Ustalanie konfiguracji całej komórki za pomocą metody zacisku krosowego

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Ten film pokazuje umieszczanie pipety o cienkim czubku w pobliżu wycinków mózgu, tworząc pieczęć z komórką neuronalną. Zasysanie przerywa błonę komórkową, tworząc w ten sposób klamrę krosową całej komórki, która umożliwia pomiary prądu do eksperymentów elektrofizjologicznych.

Ustalenie konfiguracji cęgów napięciowych całej komórki dla zapisów elektrofizjologicznych w wycinkach mózgu

Ten film demonstruje procedurę wykonywania zapisów elektrofizjologicznych w neuronach istoty żelowej (SG) wycinków rdzenia kręgowego, przy użyciu technik całokomórkowych kropek do analizy wzorców uruchamiania neuronów. Metoda ta pozwala na badanie reakcji neuronalnych na bodźce w neuronach SG rdzenia kręgowego.

Zapis klamry krosowej całej komórki w neuronie istoty żelatynowej wycinka rdzenia kręgowego

Ten film demonstruje procedurę mapowania połączeń synaptycznych poprzez zabezpieczenie wycinka mózgu, ustawienie pipet w celu uzyskania konfiguracji całych komórek i stymulowanie neuronów presynaptycznych do rejestrowania odpowiedzi postsynaptycznych, wyjaśniając w ten sposób łączność neuronalną.

Zapis sparowanych połączeń neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Subcellular patch-clamp recordings dają możliwość zbadania funkcjonalnych właściwości dendrytów. Jednak te drobne struktury nie są łatwo dostępne ze względu na ich małą średnicę. Opisany tutaj protokół ma na celu ułatwienie zbierania stabilnych i wiarygodnych zapisów z dendrytów neuronów dopaminowych w wycinkach in vitro.

Subkomórkowe nagrania patch-clamp z domeny somatodendrycznej neuronów dopaminowych nigralnych

Technika zaciskania plastrów jest skuteczną metodą analizy wywołanych uczeniem się zmian wewnętrznych właściwości i plastyczności synaps pobudzających lub hamujących.

Technika Slice Patch Clamp do analizy plastyczności wywołanej uczeniem się

Tutaj prezentujemy protokół oceny funkcjonalnej wielości synaps za pomocą elektrofizjologii klamrów całokomórkowych w ostrych wycinkach mózgu.

Ocena liczebności synaps za pomocą elektrofizjologii patch-clamp całkowych

Tutaj prezentujemy protokół do wykonania klamry na całej komórce na wycinkach mózgu zawierających neurony kisspeptyny, głównego modulatora komórek hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH). Dodając wiedzę na temat aktywności neuronów kisspeptyny, to elektrofizjologiczne narzędzie posłużyło jako podstawa znaczących postępów w dziedzinie neuroendokrynologii w ciągu ostatnich 20 lat.

Podwzgórzowe neurony kisspeptyny jako cel dla nagrań patch-clamp dla całych komórek

Poznaj technikę zacisku krosowego całych komórek w świeżych wycinkach mózgu do badania aktywności elektrycznej neuronów. Ta metoda pozwala analizować funkcje neuronalne w intaktnych obwodach mózgowych.

Nagrania z użyciem zacisku krosowego całych komórek w wycinkach mózgu

Przeglądaj więcej filmów