Name: Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę bioluminescencyjnego obrazowania in vivo w celu wykrywania późnego stadium zakażenia Trypanosoma brucei w ośrodkowym układzie nerwowym myszy. Skróć czas oceny leków z 180 do 90 dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Johnowi Kelly'emu i Martinowi Taylorowi (London School of Hygiene & Tropical Medicine) za dostarczenie T. b. brucei GVR35-VSL-2 oraz dr Andrei Zelmer (LSHTM) za porady dotyczące obrazowania in vivo. Praca ta była wspierana przez Globalny Program Zdrowia Fundacji Billa i Melindy Gatesów (grant numer OPPGH5337).

Etyka 
Wszystkie prace zostały przeprowadzone za zgodą brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych ds. Zwierząt (Procedury Naukowe) z 1986 r. oraz Komisji ds. Dobrostanu Zwierząt i Etyki London School of Hygiene & Tropical Medicine. W niniejszym raporcie przestrzegane są wytyczne ARRIVE.
1. Przejście in vivo bioluminescencyjnego Trypanosoma brucei brucei 
<ol>
	<li>Usunąć kriokonserwowany wywar (określany jako stabilat) szczepu T. b. brucei GVR35-VSL-2 (dostępny u profesora Johna Kelly'ego w London School of Hygiene & Tropical Medicine za pośrednictwem MTA)9 z ciekłego azotu i pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć stabilat do 2 x 104 trypanosomów/ml w sterylnym roztworze soli fizjologicznej glukozy buforowanej fosforanami (PBS-G) pH 8,0 (1 l PBS + 15 g glukozy)10, 
	Uwaga: T. b. brucei GVR35-VSL-2 nie jest zakaźny dla ludzi i wymaga obiektów licencjonowanych przez SAPO do przeprowadzania eksperymentów.</li>
	<li>Wstrzyknąć 20-25 g samicy myszy CD1 z 0,2 ml rozcieńczonych trypanosomów drogą dootrzewnową (i.p.) za pomocą igły 25 G. To jest "mysz dawcy". Umieść zakażoną mysz w klatce wolnej od specyficznych patogenów (SPF) i karm ad libitum. 
	Uwaga: Myszy CD1 są szczepem niekrewniaczym, a infekcje T. b. brucei GVR35 są dobrze scharakteryzowane w tym szczepie. Jednak protokół ten ma również zastosowanie do szczepów wsobnych lub genetycznie zmodyfikowanych, ale ważne jest, aby pamiętać, że kolor futra może mieć wpływ na czułość obrazowania6,9.</li>
	<li>Monitoruj parazytemię obwodową poprzez pobieranie próbek krwi. Umieść mysz w plastikowym ograniczniku i pobierz 5 μl krwi z ogona przez nakłucie żyły igłą 21 G lub żyłką i wymieszaj 1/10 z 0,85% sterylnego chlorku amonu, aby zlizować czerwone krwinki i umożliwić łatwiejsze liczenie.</li>
	<li>Policz rozcieńczoną krew w hemocytometrze Neubauera.
	<ol>
		<li>Załaduj rozcieńczoną krew do obu komór. Policz całą centralną siatkę jednej komory, aby uzyskać n trypanosomów. Stężenie trypanosomów we krwi = n x 104 trypanosomy/ml, dostosować do dowolnego współczynnika rozcieńczenia i obliczyć średnią z dwóch komór. 
		Uwaga: Po około 5-7 dniach od zakażenia parazytemia obwodowa powinna wzrosnąć na tyle, aby przeprowadzić infekcję w stężeniu 2 x 104 trypanosomów/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy poziom trypanosomów jest wystarczająco wysoki dla wymaganej liczby myszy, przejdź do kroku 1.6. Poziom parazytemii wynoszący 6 x 104 trypanosom/ml u jednej myszy dawcy jest wystarczający do zakażenia 10 myszy. 
	Uwaga: W przypadku statystycznie istotnych wielkości grup potrzebne jest n = 6 dla każdej grupy myszy poddanej działaniu substancji8. W przypadku innych modeli infekcji konieczne byłoby zastosowanie obliczeń mocy w celu określenia odpowiedniej wielkości grup.</li>
	<li>Umieść myszy w pojemniku grzewczym (w temperaturze 28-30 °C przez około 5-10 minut), aby umożliwić rozszerzenie żył ogonowych. W celu wywołania znieczulenia końcowego należy podać 20 mg/kg pentobarbitalu dożylnie za pomocą igły 25 G. Upewnij się, że mysz jest znieczulona, delikatnie naciskając podnóżki, aby upewnić się, że nie ma odruchu odstawienia.</li>
	<li>Heparynizacja igły 21 G poprzez porcjowanie 5 ml heparyny w stężeniu 5 000 jednostek USP / ml do probówki Bijou i dwukrotne zasysanie igły dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Weź heparynizowaną igłę 21 G i strzykawkę o pojemności 1 ml i wykonaj nakłucie serca znieczulonej myszy pasażowej, wkładając igłę centralnie pod klatkę piersiową (kropla krwi będzie gromadzić się u podstawy igły) i delikatnie pociągnij tłok, aby nie zapaść komory serca. Pobrać co najmniej 0,7 ml krwi.</li>
	<li>Rozcieńczyć zakażoną krew, aby uzyskać inokulum 2 x 104 trypanosomów/ml w PBS-G pH 8,0, jak krok 1.1 powyżej. 
	Uwaga: W tym momencie pozostałą krew można poddać krioprezerwacji w celu wytworzenia stabilatu poprzez zmieszanie z 8% glicerolu, 20% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcej płodu (hi-FCS) i 72% zakażoną krwią. Powoli zamrażać w temperaturze -80 °C za pomocą pojemnika do zamrażania o spowolnionym zamrażaniu, aby osiągnąć szybkość chłodzenia -1 °C/min, przed przeniesieniem do ciekłego azotu.</li>
</ol>
2. Zakażenie myszy doświadczalnych
<ol>
	<li>Umieść samice myszy CD1 (~21-25 g) w pudełku grzewczym, aby delikatnie się ogrzać i rozszerzyć żyły. Umieść rozgrzane myszy w plastikowym ograniczniku i wstrzyknij dożylnie 0,2 ml rozcieńczonego inokulum za pomocą igły 25 G do żyły ogonowej, co odpowiada 4000 trypanosomów na mysz. Następnie należy uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie. 
	Uwaga: Zakażenie dootrzewnowe jest ważną drogą zakażenia i było stosowane w poprzednich badaniach10, ale stwierdziliśmy, że jest to mniej powtarzalne niż droga dożylna.</li>
	<li>Losowo dobieraj zakażone myszy i klatkę w grupach po 3 w klatkach wentylowanych przez SPF. Jako kontrolę, wstrzyknąć samicom myszy CD1 niebioluminescencyjnego pasożyta typu dzikiego, T. b. brucei GVR35 (n = 3).</li>
	<li>Monitorowanie zakażenia za pomocą mikroskopii filmu krwi
	<ol>
		<li>Pobrać 5 μl krwi z nakłucia żyły lub wenesekcji na szkiełku podstawowym i wykonać rozmaz krwi (za pomocą drugiego szkiełka delikatnie przepchnąć kroplę krwi przez szkiełko, aby uzyskać cienki film). Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Utrwalić rozmaz krwi 100% metanolem i zabarwić preparatem Giemsa przez 10 minut, a następnie spłukaćdH2O i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Poniżej celu 100X policz liczbę trypanosomów w 10 polach widzenia (f.o.v.). 
		Uwaga: Filmowanie krwi przeprowadza się wraz z nieinwazyjnym obrazowaniem całego zwierzęcia już jednego dnia po zakażeniu. Podczas przetwarzania wielu zwierząt ta metoda oznaczania ilościowego trypanosomów jest preferowana w stosunku do liczenia hemocytometru, ponieważ próbki mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej i liczone później.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie bioluminescencyjne do śledzenia infekcji
Uwaga: Do monitorowania infekcji można użyć nieinwazyjnego obrazowania całego zwierzęcia.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy D-lucyferyny, substratu lucyferazy świetlika, w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco w stężeniu 30 mg/ml. Przefiltrować, wysterylizować i zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C. 
	Uwaga: D-Lucyferyna jest wrażliwa na światło, dlatego należy chronić ją przed światłem, owijając porcje w folię. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj wielokrotnie lucyferyny, ponieważ może to wpływać na aktywność11.</li>
	<li>Podgrzej porcję D-lucyferyny do temperatury pokojowej. Wyjąć każdą mysz z klatki (w tym myszy kontrolne zakażone niebioluminescencyjnym szczepem pasożyta typu dzikiego) i wstrzyknąć 150 mg/kg podgrzanej D-lucyferyny (rozcieńczonej w DPBS) dootrzewnowo za pomocą igły 25 G. Umieść myszy w komorze izofluorowej na około 5 minut, aby wywołać znieczulenie 2% mieszanką izofluoranu/O2 w tempie 2,5 l/min. 
	Uwaga: Myszy stają się nieruchome, gdy są pod narkozą. W przypadku zastosowanego tutaj imagera można przetwarzać 3 myszy jednocześnie. Jeśli myszy są znieczulone dłużej niż 30 minut, można zastosować okulistyczną maść na sztuczne łzy, aby zapobiec wysuszeniu oczu myszy.</li>
	<li>W przypadku opisanego tutaj imagera otwórz oprogramowanie i zainicjuj urządzenie za pomocą oprogramowania zgodnie z instrukcjami producenta. Rejestruj obrazy, gdy kamera i podgrzewana płyta osiągną temperaturę. 
	Uwaga: Ten przyrząd zwykle nie jest wyłączany, dzięki czemu urządzenie może wykonywać kalibracje w tle przez noc. W przypadku, gdy konieczne jest ponowne uruchomienie, należy najpierw przeprowadzić kontrolę kalibracji.</li>
	<li>Umieścić znieczulone myszy w imagerze (patrz 3.5). Użyj dużych czarnych separatorów między myszami, aby zminimalizować przebijanie jasnego sygnału bioluminescencyjnego. Obrazuj myszy przy użyciu zestawu czasów ekspozycji; 1, 3, 10, 30, 60 i 180 s, ze średnim binningiem, 1 przysłonie i otwartym filtrem oraz polem widzenia E (12,5 x 12,5 cm2). 
	Uwaga: Myszy kontrolne zakażone niebioluminescencyjnymi pasożytami GVR35 typu dzikiego zapewniają wartość bioluminescencji tła. Z eksperymentu kinetyki lucyferyny (ryc. 6) z tym modelem stwierdziliśmy, że sygnał bioluminescencji osiąga szczyt po 10 minutach od podania, a obrazowanie trwa około 5 minut dla 3 myszy. Weź tę skalę czasową pod uwagę podczas znieczulania i obrazowania myszy.</li>
	<li>Aby zapewnić dokładne obrazowanie myszy, obróć, aby uzyskać widok brzuszny, grzbietowy i boczny. Zachowaj spójność w kolejności orientacji dla obrazowania między sekwencyjnymi zwierzętami.</li>
	<li>Po obrazowaniu pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu pod obserwacją przed powrotem do klatki SPF.</li>
	<li>Kontynuuj obrazowanie myszy co 7 dni do 21 dnia po zakażeniu. Sygnał bioluminescencji powinien stale wzrastać na całym zwierzęciu.</li>
	<li>W D21 obraz i film krwi myszy należy wykonać zgodnie z powyższym opisem, a myszom podać aceturację diminazenu w dawce 40 mg/kg dootrzewnowo. Lek ten usunie parazytemię obwodową, ale nie przekroczy bariery krew-mózg, a zatem umożliwia lepszą wizualizację infekcji OUN. 
	Uwaga: Octan diminazenu jest dobrze znanym lekiem stosowanym w leczeniu trypanosomatozy zwierzęcej we wczesnym stadium.</li>
	<li>Kontynuuj obrazowanie i monitorowanie w D28 i D35.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie zakażenia CNS
<ol>
	<li>W D35 zobrazuj myszy zgodnie z powyższym opisem (kroki 3.1-3.4).</li>
	<li>Po obrazowaniu pozwól myszom dojść do siebie po znieczuleniu i wykrwawić myszy, jak opisano w kroku 1.6-1.8, pobierając krew do dalszej analizy.</li>
	<li>Po nakłuciu serca należy wykonać perfuzję myszy z 20 ml PBS (opcjonalnie: dodać 3 mg / ml lucyferyny do roztworu perfuzyjnego) przez serce, aby usunąć krew z narządów i ponownie wprowadzić etykietę lucyferyny, która mogła zostać usunięta z obszaru mózgu w przedziale czasu od kroku 4.1.</li>
	<li>Delikatnie usuń mózg za pomocą zakrzywionych nożyczek, odcinając od podstawy wokół obwodu czaszki i podnosząc górną część czaszki, aby umożliwić delikatne wyniesienie mózgu za pomocą zakrzywionych kleszczy.</li>
	<li>Umieścić wycięty mózg na odcinku czarnego plastiku i zapipetować 50 μl 15 mg / ml lucyferyny nad narządem przed obrazowaniem, aby upewnić się, że odpowiednia lucyferyna została dodana do wyciętego mózgu. Obraz przy użyciu ustawień jak wyżej. To wykaże lokalizację infekcji w półkulach mózgowych. 
	Uwaga: Dalsza kwantyfikacja parazytemii na wyciętym mózgu może być przeprowadzona za pomocą qPCR, jak opisano wcześniej8. Inne alternatywne zastosowania mogą obejmować histologię lub immunohistochemię w celu identyfikacji pasożytów w tkance mózgowej po utrwaleniu.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja obrazowania bioluminescencyjnego
Uwaga: Bioluminescencja może być określona ilościowo za pomocą obszaru zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania do obrazowania i skorygowana o bioluminescencję tła.
<ol>
	<li>Korzystając z narzędzia ROI, utwórz prostokątny ROI dla oceny ilościowej całego zwierzęcia i umieść go nad obrazem myszy, aby zakryć czubek nosa do podstawy ogona myszy. Użyj pudełka o tym samym rozmiarze dla każdego zwierzęcia i każdego punktu czasowego. Patrząc na ROI dla mózgu, użyj okrągłego ROI w ten sam sposób, umieszczając go nad obszarem głowy myszy na obrazie.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj obrazy tak, aby pojawiały się w tym samym spektrum, aby uzyskać wizualną reprezentację infekcji. 
	Uwaga: Użyte tutaj oprogramowanie generuje mapę kolorów dla każdego obrazu, automatycznie dostosowaną do minimalnej i maksymalnej liczby fotonów. Aby umożliwić wizualne porównanie serii obrazów, skala kolorów musi być ustawiona na te same wartości dla wszystkich obrazów.
	<ol>
		<li>Korzystając z obrazu o najwyższej bioluminescencji i zakładki "Dopasowanie obrazu" na palecie narzędzi, wybierz skalę logarytmiczną oraz odpowiednią minimalną i maksymalną skalę kolorów (do wyznaczenia empirycznego). Zastosuj tę skalę do wszystkich obrazów w całym eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).</li>
<li>Rodgers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosomiasis+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosomiasis and the brain.</a> Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).</li>
<li>Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+pharmacological+re-engagement+with+a+neglected+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease.</a> Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).</li>
<li>Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in human African trypanosomiasis.</a> Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).</li>
<li>Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+duration+of+infection+with+Trypanosoma+brucei+in+mice+and+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy.</a> Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).</li>
<li>Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+studies+of+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).</li>
<li>Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+reproducible+in+vivo+imaging+mouse+model+for+evaluation+of+drugs+against+late-stage+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis.</a> J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).</li>
<li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+%27red-shifted%27+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571(2013).</li>
<li>Jennings, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+potential+therapeutic+benefits+of+an+alternative+suramin+and+melarsoprol+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen.</a> Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+chemotherapy+with+a+substance+P+receptor+antagonist+%28aprepitant%29+and+melarsoprol+in+a+mouse+model+of+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis.</a> Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).</li>
<li>Kamerkar, S., Davis, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+on+the+brain%3A+understanding+host-pathogen+interactions+in+chronic+CNS+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection.</a> J. Parasitol. Res. 2012, 589295(2012).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).</li>
<li>Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+Toxoplasma+gondii+to+immunoprivileged+organs+and+role+of+Toll%2Finterleukin-1+receptor+signalling+for+host+resistance+assessed+by+in+vivo+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging.</a> Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+chronic+Trypanosoma+cruzi+infections+reveals+tissue-specific+parasite+dynamics+and+heart+disease+in+the+absence+of+locally+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection.</a> Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowanie bioluminescencyjnego szczepu T. b. brucei GVR35 pozwala na wizualizację infekcji trypanosomem od wczesnego do późnego stadium. Poprzednie modele infekcji nie były w stanie wykryć późnego stadium, kiedy pasożyty znajdują się w mózgu, w czasie rzeczywistym na podstawie mikroskopii filmu krwi i wymagało uboju i usunięcia mózgów zakażonych myszy w celu określenia obciążenia pasożytami12. Bioluminescencja zmniejsza zmienność między myszami, ponieważ pojedyncza mysz może być śledzona przez cały ...

Ludzka afrykańska trypanosomatoza (HAT), czyli śpiączka, jest wywoływana przez przenoszone przez wektory pasożyty pierwotniaków Trypanosoma brucei spp1. Szacuje się, że obecna liczba zachorowań wynosi mniej niż 7 tysięcy rocznie, a prawie 70 milionów ludzi jest narażonych na ryzyko zakażenia pasożytem na kontynencie afrykańskim. Choroba, która nie jest leczona, jest najczęściej śmiertelna, obejmuje wczesne stadium hemolimfyfy, w którym pasożyty są obecne we krwi, przechodząc do późnego stadium, gdy pasożyty atakują ośrodkowy układ nerwowy (OUN) i nie są już podatne na leczenie lekami trypanosomalnymi we wczesnym stadium2. Obecne terapie lekowe w późnym stadium HAT charakteryzują się zarówno złożonymi, długotrwałymi schematami leczenia, jak i poważnymi skutkami niepożądanymi, a także zgłaszaną opornością, dlatego konieczne są badania nad nowymi terapiami lekowymi3,4. 
Badanie późnego stadium ludzkiej trypanosomatozy afrykańskiej (HAT) w tradycyjnych modelach mysich jest długotrwałe i złożone, a usunięcie tkanki mózgowej jest wymagane do monitorowania obciążenia pasożytniczego5. Zwierzęcy szczep zakaźny T. b. brucei jest używany jako model badawczy trypanosomatozy, której późne stadium pojawia się 21 dni po zakażeniu (dpi). Aby monitorować zakażenie pasożytem niebioluminescencyjnym typu dzikiego w modelu mysim, jedynymi metodami określania obciążenia pasożytami są błony krwi obwodowej lub ilościowy PCR. W przypadku obciążenia pasożytami w mózgu, mysz musi zostać poddana ubojowi, wycięciu mózgu i przeprowadzeniu qPCR na tkankach, co uniemożliwia śledzenie pasożytów przez wiele punktów czasowych w późnym stadium infekcji. Powoduje to niemożność śledzenia w czasie rzeczywistym infekcji w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). 
Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo (BLI) może zapewnić bardzo czułe, nieinwazyjne wykrywanie rozprzestrzeniania się pasożytów i progresji choroby w modelu mysim, które można śledzić u pojedynczego zwierzęcia przez cały eksperyment6. BLI opiera się na emisji światła w widmie widzialnym wytwarzanego w reakcji katalizowanej lucyferazą. Emitowane fotony są następnie wykrywane przez kamerę z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD)7. W tym celu patogen jest genetycznie modyfikowany w celu ekspresji białka lucyferazy, a substrat, lucyferyna, jest wprowadzany w punktach zainteresowania przez wstrzyknięcie. Główną zaletą tej metody jest możliwość przeprowadzania badań podłużnych, w których to samo zwierzę można obrazować kilkakrotnie przy minimalnych skutkach ubocznych. Uzyskany sygnał bioluminescencyjny można określić ilościowo, wskazując w ten sposób obciążenie patogenem.
Optymalizacja i walidacja bioluminescencyjnego T. b. brucei z przesunięciem ku czerwieni umożliwiła badanie późnego stadium infekcji za pomocą nieinwazyjnych procedur, wykrywając pasożyty wcześniej niż mikroskopia filmu krwi i znacznie redukując czas, koszt i liczbę zwierząt potrzebnych do badania infekcji OUN i badań przesiewowych leków w późnym stadium trypanosomatozy8,9. W tym protokole pokazujemy zakażenie myszy bioluminescencyjnymi trypanosomami i sposób wizualizacji pasożytów in vivo w celu ilościowego określenia progresji choroby i penetracji OUN.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>P4417</td><td>tabletki pH 7,4</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>G8270</td><td>99,5% (molekularny)</td></tr><tr><td>chlorek amonu</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>A9434</td><td>99,5% (molekularny) stopień</td></tr><tr><td>Heparyna (sól litu)</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco, Life Technologies, Wielka Brytania</td><td>10500-064</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>D4031</td><td>Sterylny filtrowany</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferin</td><td>Perkin Elmer, Wielka Brytania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octan diminazenu</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>D7770</td><td>Klasa analityczna</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer, Wielka Brytania</td><td></td><td>inne bioimagery dostępne np. firmy Bruker, Kodak</td></tr><tr><td>Living Image v. 4.2</td><td>Perkin Elmer, brytyjskie</td><td></td><td>zastrzeżone oprogramowanie dla instrumentów Perkin Elmer IVIS; inne instrumenty mogą mieć własną</td></tr><tr><td>strzykawkę 1 ml</td><td>Fisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>10142104</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 20 ml</td><td>Fisher Scientific, Wielka Brytania</td><td>10743785</td><td></td></tr><tr><td>Igły</td> <td>25 GGreiner Bio-one</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 G Igły</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>Podwójnie matowy szkiełko mikroskopowe</td><td>VWR, Wielka Brytania</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówka do mikrowirówek</td><td>StarLab, Wielka Brytania</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>7 ml Probówka Bijou</td><td>StarLab, Wielka Brytania</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik myszy</td><td>Sigma, Wielka Brytania</td><td>Z756903</td><td>Nasz ogranicznik został wykonany we własnym zakresie, jest to podobny model</td></tr></tbody></table>

obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Ludzka trypanosomatoza afrykańska (HAT) jest wieloetapową chorobą, która objawia się w dwóch etapach; wczesnym stadium krwi i późnym stadium, gdy pasożyt atakuje ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Badania in vivo na późnym etapie były ograniczone, ponieważ tradycyjne metodologie wymagają usunięcia mózgu w celu określenia obecności pasożytów.
Obrazowanie bioluminescencyjne to nieinwazyjna, bardzo czuła forma obrazowania optycznego, która umożliwia wizualizację patogenu transfekowanego lucyfekazą w czasie rzeczywistym. Stosując transfekowany szczep trypanosomu, który ma zdolność do wywoływania późnego stadium choroby u myszy, jesteśmy w stanie badać kinetykę infekcji OUN u jednego zwierzęcia w trakcie infekcji, a także obserwować ruch i rozprzestrzenianie się infekcji ogólnoustrojowej.
Tutaj opisujemy solidny protokół do badania infekcji OUN za pomocą bioluminescencyjnego modelu afrykańskiej trypanosomatozy, dostarczając nieinwazyjne obserwacje w czasie rzeczywistym, które mogą być dalej analizowane za pomocą opcjonalnych metod dalszych działań.

Niniejszy protokół demonstruje sposób monitorowania progresji choroby po zakażeniu myszy T. b. brucei, będącej modelem ludzkiej trypanosomiazy afrykańskiej. Rysunek 1 przedstawia oś czasu protokołu eksperymentalnego, wskazując harmonogram kroków terapeutycznych i obrazowania. Rysunek 2 pokazuje typowe pole widzenia w utrwalonym i barwionym metodą Giemsy rozmazie krwi użytym do ilościowego oznaczania pasożytemii obwodowej, z widocznymi trypanosoma...

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykorzystanie obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym do śledzenia infekcji trypanosomami, wizualizując wczesne stadia zakażenia krwi oraz późne stadia zakażenia mózgu u myszy, co naśladuje kliniczny przebieg śpiączki afrykańskiej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii trypanosom, identyfikując potencjalne nowe metody terapeutyczne oraz oceniając ich skuteczność przeciwko infekcji. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że ocena leków może zostać przeprowadzona w ciągu 90 dni, w przeciwieństwie do 180 dni wymaganych w poprzednim modelu tego typu.Niniejszy protokół może dostarczyć wiedzy na temat ludzkiej afrykańskiej trypanosomozy, ale ma zastosowanie również do innych modeli chorób zakaźnych, takich jak gruźlica czy choroba Chagasa. Należy rozpocząć od umieszczenia samic myszy CD1 o masie od 21 do 25 g w termostacie w celu rozszerzenia żył ogonowych. Następnie ogrzane myszy należy umieszczać pojedynczo w plastikowym stabilizatorze i za pomocą igły 25 G wstrzyknąć dożylnie do żyły ogonowej 0,2 ml rozcieńczonego inokulum trypanosome brucei GVR35VSL2, natychmiast po iniekcji wywierając ucisk w miejscu wkłucia, aby zahamować krwawienie.Aby monitorować infekcję za pomocą mikroskopii rozmazów krwi, nanieś 5 µL krwi na szkiełko przedmiotowe. Używając drugiego szkiełka, delikatnie rozmaż kroplę po pierwszym szkiełku, tworząc cienką warstwę. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, a następnie utrwal krew w 100% methanol, po czym inkubuj przez 10 minut w barwniku Giemsa.Po zakończeniu inkubacji należy wypłukać preparaty wodą destylowaną i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Następnie należy policzyć liczbę trypanosomów w 10 polach widzenia przy użyciu obiektywu 100x. Aby monitorować infekcję za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, należy ogrzać alikwot D-lucyferyny do temperatury pokojowej.Następnie, używając igły o rozmiarze 25 gauge, wstrzyknij każdemu zwierzęciu dootrzewnowo 150 mg/kg ogrzanej lucyferyny. Następnie uruchom urządzenie za pomocą oprogramowania obrazującego zgodnie z instrukcjami producenta. Gdy kamera i płyta grzewcza osiągną odpowiednie temperatury, umieść duże czarne przegrody pomiędzy znieczulonymi zwierzętami, aby zminimalizować przenikanie jasnego sygnału bioluminescencyjnego.Wykonaj obrazowanie myszy, stosując serię czasów ekspozycji przy średnim binningu, jednej wartości przysłony i otwartym filtrze, przy polu widzenia E wynoszącym 12,5 na 12,5 centymetrów. Aby zapewnić dokładne obrazowanie myszy, obróć zwierzęta w celu uzyskania widoków brzusznego, grzbietowego i bocznego. W dniu 21. wykonaj obrazowanie oraz rozmaz krwinek myszy zgodnie z prezentacją.Następnie podaj zwierzętom dożowo 40 mg/kg aceturatu diminazyny, aby wyeliminować pasożyty z krwiobiegu obwodowego. Po obrazowaniu zwierząt w 35. dniu, umieść wycięte mózgi na fragmencie czarnego tworzywa sztucznego i nanieś pipetą 50 µL lucyferyny w stężeniu 15 mg/mL na tkanki. Następnie wykonaj obrazowanie mózgu, korzystając z tych samych ustawień, które zaprezentowano podczas obrazowania całego organizmu.Aby określić stopień bioluminescencji w określonych obszarach zainteresowania (ROI), należy wybrać narzędzie ROI w oprogramowaniu do obrazowania i utworzyć prostokątny obszar ROI do ilościowej analizy całego zwierzęcia. Należy umieścić ROI na obrazie myszy, od czubka nosa do nasady ogona, a następnie, stosując ramkę o tym samym rozmiarze dla każdego zwierzęcia i każdego punktu czasowego, zmierzyć całkowity strumień. Aby ocenić ROI samego mózgu, należy utworzyć okrągły obszar ROI i umieścić go nad obszarem głowy zwierzęcia.Powtórz procedurę dla każdego zwierzęcia i zmierz całkowity strumień. Następnie, korzystając z obrazu o najwyższej bioluminescencji oraz karty dostosowywania obrazu (image adjust) na palecie narzędzi, wybierz skalę logarytmiczną oraz odpowiednie minimum i maksimum skali kolorów dla obrazu, a następnie zastosuj tę skalę do wszystkich obrazów w ramach eksperymentu. Rozwój infekcji można monitorować in vivo poprzez sekwencyjne pomiary bioluminescencji, aby określić stopień zakażenia zwierząt w przebiegu eksperymentu.W miarę postępu infekcji w ciągu pierwszych 21 dni u wszystkich zwierząt można zaobserwować wzrost bioluminescencji, przy czym sygnał staje się bardziej rozproszony i intensywny, a najwyższe poziomy bioluminescencji są widoczne w obszarze śledziony. W 21. dniu, po przeprowadzeniu obrazowania, myszy są leczone diminazyną aceturatu, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, co skutkuje obecnością jedynie niskich poziomów bioluminescencji w mózgu do 28. dnia, gdy infekcja obwodowa zostaje wyeliminowana. W 35. dniu sygnał jest nie tylko nadal obecny w obszarze głowy, ale stał się również bardziej intensywny, co wskazuje na możliwą infekcję mózgu.Ilościowe oznaczenie zarówno obwodowej parasitemii, jak i bioluminescencji pozwala na ocenę kinetyki choroby. Na przykład w niniejszym eksperymencie w 7. dniu zaobserwowano wysoki sygnał bioluminescencji wynoszący 1 × 10⁸ fotonów na sekundę, podczas gdy stwierdzona parasitemia w rozmazach krwi wykonanych w tym samym dniu była bardzo niska. W 28. dniu parasitemia stała się niewykrywalna w rozmazach krwi z powodu podania aceturatu diminazenu w 21. dniu, podczas gdy bioluminescencja pozostawała powyżej poziomów tła aż do 35. dnia, co odpowiadało bioluminescencji zaobserwowanej w obszarze głowy i potwierdziło wyższą czułość analizy bioluminescencji w porównaniu do badania rozmazów krwi.Obrazowanie bioluminescencyjne samego mózgu ujawnia różnice w obciążeniu infekcją pomiędzy zwierzętami, która nie wydaje się lokalizować w konkretnych obszarach anatomicznych tkanki. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby uzyskać odpowiedni zakres czasów naświetlania w celu zapewnienia wysokiej jakości danych obrazowych, ponieważ prześwietlenie, na przykład, negatywnie wpływa na istotne szczegóły lokalizacji. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody analityczne, takie jak ilościowy PCR oraz immunohistochemia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące obciążenia mózgu pasożytami oraz ich lokalizacji.Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii trypanosom do przeprowadzania oceny leków w ciągu 90 dni od zakażenia, dzięki zwiększonej czułości wykrywania nawrotów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać obrazowanie bioluminescencyjne zakażenia TB brucei do śledzenia progresji choroby z krwi do późnego stadium zakażenia mózgu.

bioluminescence-imaging-to-detect-late-stage-infection-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Wykorzystanie lucyferazy oraz systemów obrazowania in vivo (IVIS) jako nowej metody identyfikacji punktów końcowych choroby przed wystąpieniem objawów klinicznych. IVIS pozwolił nam na wizualizację w czasie rzeczywistym inwazji wirusów zapalenia mózgu przez wiele dni, co zapewnia dokładniejszy model choroby do przyszłych badań. Pozwoliło to również na szybszą identyfikację potencjalnych właściwości ochronnych leków przeciwwirusowych i szczepionek niż w przypadku obecnie stosowanych modeli...

Wykrywanie neuroinwazyjnego wirusa zapalenia mózgu za pomocą systemów obrazowania In Vivo (IVIS)

Źródło: de Vries, C. R. i in., A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (2020).Ten film demonstruje bioluminescencyjną technikę obrazowania monitorującego postęp infekcji bakteryjnej na żywym modelu myszy. Bakterie patogenne opracowane z systemem raportu luxABCDE emitują światło w miejscu zakażenia, umożliwiając wizualizację bakterii aktywnych przemianownie. Obrazując mysz w czasie, naukowcy mogą nieinwazyjnie śledzić dynamikę infekcji i...

Bioluminescencja zakażeń bakteryjnych u myszy

Dynamika glikosomów w afrykańskich trypanosomach jest trudna do zbadania za pomocą tradycyjnych technik biologii komórki, takich jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna.  Jako sposób obserwacji dynamicznego zachowania organelli, zastosowano system reporterowy fluorescencyjno-organelli w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

Ten protokół opisuje stworzenie mysiego modelu z guzem do monitorowania progresji guza i angiogenezy w czasie rzeczywistym za pomocą podwójnego obrazowania bioluminescencyjnego.

Podwójne obrazowanie bioluminescencyjne progresji guza i angiogenezy

Protokół tutaj opisuje szczegółowe kroki do przeprowadzenia badań skuteczności leków w bioluminescencyjnym modelu zakażenia Trypanosoma cruzi, z naciskiem na pozyskiwanie, analizę i interpretację danych. Dostępne są również procedury rozwiązywania problemów i kontroli jakości w celu zminimalizowania problemów technicznych.

Demistyczne obrazowanie bioluminescencyjne in vivo mysiego modelu choroby Chagasa do badań skuteczności leków

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Terapia antyretrowirusowa w leczeniu HIV/AIDS jest monitorowana na szeroką skalę w RPA. Cytometria przepływowa jest łączona z badaniami hematologicznymi (CD45), immunologicznymi (CD4) oraz analizą CD38 powiązaną z wiremią. Metody te, zarejestrowane w laboratoriach NHLS-SA w Johannesburgu, są nowoczesne, kostu-efektywne i charakteryzują się wzmocnioną lokalną kontrolą jakości, stanowiąc wzór dla diagnostyki w warunkach ograniczonych zasobów.

Kompleksowy i efektywny kosztowo monitoring laboratoryjny HIV/AIDS: afrykański wzór do naśladowania

Oksydaza NADPH jest głównym źródłem reaktywnych form tlenu (ROS) w fagocytach. Ze względu na efemeryczną naturę ROS, pomiar i monitorowanie poziomu ROS u żywych zwierząt jest trudne. Opisano mało inwazyjną metodę seryjnego oznaczania ilościowego ROS u żywych myszy.

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywnościy oksydazy NADPH w różnych modelach zwierzęcych

Poznaj metodę bioluminescencyjnego obrazowania in vivo w celu wykrywania późnego stadium zakażenia Trypanosoma brucei w ośrodkowym układzie nerwowym myszy. Skróć czas oceny leków z 180 do 90 dni.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Przeglądaj więcej filmów