Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Ogólnym celem tej procedury jest zmierzenie wpływu patogennej prowokacji na organoidy jelita cienkiego, z naciskiem na techniki normalizacji w stosunku do całkowitej liczby komórek. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii wrodzonej i błony śluzowej, dostarczając środków do badania interakcji bakterii z komórkami nabłonka jelitowego między patogenami gospodarza in vitro. Zasadnicze znaczenie dla tej procedury ma metoda normalizacji w stosunku do całkowitej liczby komórek, co jest niezbędne przy pomiarze białek wydzielanych przez organoidy za pomocą technik takich jak ELISA.To zbieranie krypt jelita cienkiego myszy w celu hodowli organoidów, zacznij od użycia sterylnego szkiełka podstawowego, aby delikatnie zeskrobać kosmki z powierzchni światła jelita cienkiego. Następnie za pomocą nożyczek preparacyjnych pokrój tkankę na paski o długości 1-2 centymetrów. I umieść paski w stożkowej tubie o pojemności 50 mililitrów zawierającej 10 mililitrów lodowatego PBS. Wymieszaj zawartość przez delikatne odwrócenie i pozwól, aby zawartość tkanki osiadła na dnie tuby. Następnie odessać PBS i umyć paski jeszcze trzy razy w 10 mililitrach świeżego PBS, za każdym razem w ten sam sposób. Pod koniec końcowego prania umieść rurkę na lodzie na dziesięć minut. Następnie zastąp PBS 25 mililitrami PBS uzupełnionymi 2 milimolowym EDTA w wiaderku z lodem na platformie bujanej przez 45 minut. Pod koniec inkubacji pozwól paskom tkanek osiąść na dnie probówki i zastąp PBS-EDTA 10 mililitrami PBS uzupełnionymi 10% FBS. Energicznie potrząśnij rurką ręcznie dziesięć razy. Następnie pozwól tkance osiąść na dnie probówki i przenieś supernatant do 15-mililitrowej stożkowej probówki oznaczonej jako Frakcja 1.Wymieszaj tkanki w PBS FBS jeszcze pięć razy. Przenoszenie supernatantu do nowej probówki z frakcją za każdym razem. Po ostatnim wymieszaniu odwirować wszystkie próbki i ponownie zawiesić granulki w pięciu mililitrach wstępnie podgrzanego DMEM/F12 bez dodatku czynników wzrostu. Teraz ponownie odwiruj próbki i odessaj cztery mililitry supernatantu z każdej probówki. Ponownie zawiesić granulki w ostatnim mililitrze pozostałego podłoża i użyć 20 mikrolitrowych porcji z każdej frakcji, aby uwidocznić krypty i szczątki na szkiełkach podstawowych. Po zebraniu odpowiednich frakcji w celu osiągnięcia największego procentowego stosunku krypt do szczątków, odwirować połączone frakcje i odessać wszystkie oprócz ostatnich 50-100 mikrolitrów supernatantów. Trzymając probówki na lodzie, dodaj 1 mililitr matrycy białkowej do połączonych frakcji, powoli pipetując w górę iw dół, aby zapobiec dodawaniu się pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny matrycy białkowej/krypty do środka każdej studzienki z 37