Name: Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę hodowli ex vivo organoidów jelitowych myszy i stymulacji receptorów rozpoznawania wzorców. Protokół obejmuje izolację krypt, utrzymanie kultur oraz analizę ekspresji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylanowi McDanielowi i Bettiny Heid za dyskusje techniczne. Autorzy dziękują dr Nandzie Nanthakumar za dostarczenie komórek Caco-2. Autorzy dziękują również Programowi Wielokulturowych Możliwości Akademickich (MAOP) w Virginia Tech. Prace te były wspierane przez National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (dla ICA). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Freshney, R. I., Freshney, M. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+epithelial+cells.+2nd+edn%22">Culture of epithelial cells. 2nd edn</a>. , Wiley-Liss. (2002).</li>
<li>Vachon, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+state-selective+roles+of+p38+isoforms+in+human+intestinal+epithelial+cell+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis.</a> Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).</li>
<li>Hynds, R. E., Giangreco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+relevance+of+human+stem+cell-derived+organoid+models+for+epithelial+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine.</a> Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).</li>
<li>Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+shaping+the+gastrointestinal+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment.</a> Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).</li>
<li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogenic+influence+of+human+R-spondin1+on+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium.</a> Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).</li>
<li>Allen, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRX1+protein+attenuates+inflammatory+responses+to+infection+by+interfering+with+the+RIG-I-MAVS+and+TRAF6-NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways.</a> Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).</li>
<li>Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella-infected+crypt-derived+intestinal+organoid+culture+system+for+host-bacterial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions.</a> Physiol Rep. 2 (9), (2014).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5, 1228(2014).</li>
<li>Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Succinate-Tetrazolium+Reductase+Systems.+Iii.+Points+of+Coupling+of+Four+Different+Tetrazolium+Salts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts.</a> Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).</li>
<li>Parry, M. F., Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-acetylcysteine+on+antibiotic+activity+and+bacterial+growth+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro.</a> J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Hodowla i utrzymanie organoidów jelitowych to procedura, którą może opanować każda osoba posiadająca odpowiednią technikę hodowli tkankowej. Istnieją subtelności w pasażowaniu w porównaniu z hodowlą komórek w bardziej konwencjonalnej monowarstwie, ale te subtelności nie są trudne do pokonania. Kluczowe etapy tej metody obejmują możliwość wyhodowania organoidów do wystarczająco dużej gęstości, aby zapewnić optymalny wysiew. Eksperymenty muszą być zmniejszone w przypadku organoidów, ponieważ duże gęstości wysiewu, które mo...

Zdolność do zbierania i hodowli pierwotnych organoidów została opisana dla jelita cienkiego, okrężnicy, trzustki, wątroby i mózgu i stanowi ekscytujący postęp w zrozumieniu bardziej fizjologicznie reprezentatywnych zjawisk dla biologii tkanek1-5. Pierwsze metody opisujące hodowlę i utrzymanie organoidów w jelicie cienkim zostały opisane przez Sato i wsp. z laboratorium Hansa Cleversa1. Przed tą metodą pobieranie i hodowla pierwotnych komórek nabłonka jelitowego okazywały się ograniczone i nieskuteczne w podtrzymywaniu wzrostu komórek nabłonka. Metody obejmowały dysocjację tkanki poprzez inkubację z enzymami, takimi jak kolagenaza i dyspaza, co ostatecznie doprowadziłoby do wzrostu mieszanych pierwotnych komórek fibroblastów6. Warunki te byłyby również ograniczone czasowo w utrzymaniu hodowli komórek nabłonkowych. Uformowałaby się minimalna lub żadna nisza komórek nabłonkowych, ponieważ komórki nabłonkowe weszłyby w apoptozę z powodu braku odpowiednich czynników wzrostu lub utraty integralności kontaktu, co określa się mianem anokis7. Pojawienie się systemu hodowli organoidów 3D zapewniło metodę hodowli pierwotnych komórek jelitowych zawierających spektrum typów komórek jelitowych w trwałej hodowli1. Te organoidy nabłonkowe mają przewagę nad liniami komórkowymi, ponieważ składają się z kilku zróżnicowanych komórek i lepiej naśladują narząd, z którego pochodzą in vivo8. Proces ostatecznie "wyhodowania mini jelita w naczyniu" okazał się cennym narzędziem do oceny reakcji nabłonka jelitowego na różne bodźce. Badanie interakcji pierwotnych komórek jelitowych z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami mikrobiologicznymi (PAMP) jest istotne dla dziedziny immunologii, ponieważ te wzorce molekularne mogą regulować różne reakcje zarówno gospodarza, jak i drobnoustroju9. Badacze mogą teraz nie tylko badać te interakcje z organoidami myszy, ale mogą być one również hodowane od ludzi2. Technologia ta ma potencjał, aby radykalnie zmienić medycynę spersonalizowaną i kuszące jest spekulowanie na temat postępów, które ta technika umożliwi w najbliższej przyszłości.
Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie protokołu do hodowli, ekspansji i leczenia organoidów jelitowych za pomocą różnych bodźców. Takie bodźce mogą ostatecznie obejmować szczepionki, bakteryjne PAMP, żywe patogeny, leki żołądkowo-jelitowe (GI) i przeciwnowotworowe. Izolacja i hodowla organoidów jelitowych myszy została zaadaptowana z Sato i wsp. Chociaż istnieją niewielkie odchylenia od oryginalnej metody, produkt końcowy, jakim jest kultura organoidowa, jest nadal osiągany przy przestrzeganiu tego protokołu. Metoda ta koncentruje się na opisie odpowiedniej techniki prawidłowej normalizacji podczas pracy z niejednorodnymi strukturami komórkowymi, co należy wziąć pod uwagę przy przeprowadzaniu testu na podstawie liczby komórek.

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td> <td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td> <td>(sekcja 1,3,6) Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo</td><td></td> <td>(sekcja 1,3)</td></tr> <tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td> <td>(sekcja 1,6) Do komórek Caco-2 i HEK293 Rspondin1</td></tr><tr><td>HEK293T-Linia komórkowa</td><td></td><td></td> <td>wydzielająca Rspondin1(Sekcja 1) Opisane i zmodyfikowane na podstawie Kim, K.A. et al. Cząstki lentiwirusowe zawierały cDNA RSPO1(NM_138683) ORF sklonowane do szkieletu pReceiver-Lv105 zamówionego i zakupionego w GeneCopoeia.&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówka stożkowa 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td> <td>(sekcja 1) Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>T-175</td><td>Kolba Corning</td><td>431079</td> <td>(sekcja 1) Lub równoważna marka&nbsp;</td></tr><tr><td>Białko Matrix</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>(Sekcja 2,3,4,5,6) Obniżony czynnik wzrostu Matrigel&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco's (DPBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td> <td>(sekcja 2,3)</td></tr> <tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td> <td>(sekcja 2,3) Zaawansowane płytki TC DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24 dołki</td><td>Corning</td><td>3524</td> <td>(sekcja 2)</td></tr> <tr><td>N2 Suplement 100x&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>(Sekcja 2)</td></tr><tr><td>B27 bez witaminy A 50x&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>12587-010&nbsp;</td><td>(Sekcja 2)</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026(</td><td>Sekcja 2)</td></tr><tr><td>Suplement glutaminy (Glutamax)</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>(Sekcja 2) Może łączyć się z Advanced DMEM/ F12</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>(sekcja 2) Może łączyć się z Advanced DMEM/ F12&nbsp;</td></tr><tr><td>10 ml Pipet serologiczny</td><td>Falcon</td><td>357551</td> <td>(sekcja 2) Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td> <td>(sekcja 2) Zapas = 100 mg / ml</td></tr><tr><td>N-acetylo-L-cysteiny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td> <td>(sekcja 2) Zapas = 1 m</td></tr><tr><td>rekombinowana mysz EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td>(<td>sekcja 2) Zapas = 500 mg / ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>(Sekcja 3)</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td> preparacyjne<td>(Sekcja 3)</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td>(Sekcja 3)</td></tr><tr><td>Szkiełka podstawowe</td><td></td><td></td><td>(Sekcja 3)</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td> preparacyjna<td>(Sekcja 3)</td></tr><tr><td>25 ml Serological Pipet</td><td>Falcon</td><td></td><td>(Sekcja 3)</td></tr><tr><td>EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td> <td>(sekcja 3) 0,5 m lub alternatywna</td></tr><tr><td>sterylna szalka Petriego EDTA klasy TC 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td> <td>(sekcja 3) Lub jednakowej wielkości naczynie TC</td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td> <td>(sekcja 4)</td></tr> <tr><td>Precyzyjna igła ślizgowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td> <td>(sekcja 4) 23G x 1 1/4 (0,6 mm x 30 mm)</td></tr> <tr><td>Wiciowiec z Bacillus subtilis</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&nbsp;</td><td>(Sekcja 5,6)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>(sekcja 5,6)&nbsp;( Murray&nbsp; et&nbsp;al.)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td> <td>(sekcja 5,6) Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>BBL Agar do infuzji serca</td><td>mózgu Becton Dickinson</td><td>211065</td> <td>(sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Napar do mózgu Bacto Becton</td><td>Dickinson</td><td>237500</td> <td>(sekcja 5)</td></tr> <tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td> <td>(sekcja 6)</td></tr> <tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200056</td> <td>(sekcja 6)</td></tr> <tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td> <td>(sekcja 6)</td></tr> <tr><td>Urządzenia molekularne</td><td></td> <td>SpectraMax M5</td> <td>(sekcja 6)</td></tr> <tr><td>96 Płytka testowa Corning</td><td></td><td>3603</td> <td>(sekcja 6) płytka, przezroczyste dno Technologia</td></tr><tr><td>barwienia jądrowego</td><td></td> z powłoką TC <td>H1399</td> <td>(sekcja 6) Kolba Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>(Sekcja 6) Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>15 ml stożkowa tubka</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>(Sekcja 1,3) Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>1,7 ml probówka polipropylenowa</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>Lub równoważna marka</td></tr><tr><td>TNF-alfa&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman</td></tr><tr><td>IL-6&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td> <td>(Mm 00446190_m1</td><td>Zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Zestaw</td> do <td>oznaczania ekspresji genów Mm 00434225_m1 Taqman</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Zestaw do oznaczania ekspresji genów Taqman</td></tr><tr><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus gradient Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Szybka optyczna 96-dołkowa płytka reakcyjna, 0,1 ml</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td></td><td></td>4346907</tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko R-spondyny 1 R&</td><td> D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Pierwotne organoidy jelitowe są cennym modelowym systemem, który ma potencjał, aby znacząco wpłynąć na dziedzinę immunologii błony śluzowej. Jednak złożoność charakterystyki wzrostu organoidów niesie ze sobą istotne zastrzeżenia dla badacza. W szczególności wzorce wzrostu każdego pojedynczego organoidu są bardzo zmienne i tworzą niejednorodną populację komórek nabłonkowych w hodowli. Przy takich zastrzeżeniach powszechnych praktyk hodowli tkankowych nie można po prostu zastosować do systemu organoidowego ze względu na złożoność struktury komórkowej. Liczenie i posiastanie wyłącznie na podstawie liczby komórek, co jest powszechne w przypadku indywidualnie oddzielonych komórek, takich jak linie komórkowe, nie jest niezawodną metodą dla organoidów, chyba że zastosuje się jakąś technikę normalizacji. Normalizacja do całkowitej zawartości białka jest złożona ze względu na rezydentną matrycę białkową. Te cechy pod względem liczby komórek, kształtu i typu komórek powinny być brane pod uwagę przy ocenie zawartości wydzielanej z masy organoidu. Protokół ten został opracowany w celu nakreślenia prostej procedury hodowli i leczenia organoidów jelita cienkiego patogenami mikrobiologicznymi i wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP). Podkreślono również techniki normalizacji, które należy zastosować, gdy analiza białek jest przeprowadzana po takim wyzwaniu.

Podczas stosowania niniejszego protokołu w celu hodowli organoidów jelitowych, po zbiorze obecne będą charakterystyczne organoidy o kształcie sfery. Codzienne dodawanie pożywki warunkowanej R-spondin1 zapoczątkuje wzrost i pączkowanie organoidów. Wzrost organoidów przedstawiono na rysunku 1A-F, który jest reprezentatywny dla organoidów jelitowych w dniach 1, 2, 4, 5, 6 oraz 14. Rysunek 1F obrazuje niejednorodne cechy wzro...

Tutaj opisany jest protokół zbierania, utrzymywania i leczenia organoidów jelita cienkiego myszy z wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP) i Listeria monocytogenes, a także nacisk na ekspresję genów i właściwe techniki normalizacji białka.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar efektów wywołanych przez patogeny w organoidach jelita cienkiego, ze szczególnym uwzględnieniem technik normalizacji względem całkowitej liczby komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii wrodzonej oraz śluzówkowej, dostarczając narzędzi do badania in vitro interakcji między patogenami bakteryjnymi a komórkami nabłonka jelitowego gospodarza. Kluczowym elementem tej procedury jest metoda normalizacji względem całkowitej liczby komórek, co jest niezbędne podczas pomiaru białek wydzielanych przez organoidy za pomocą technik takich jak ELISA. Aby wyizolować krypt jelita cienkiego myszy do hodowli organoidów, należy rozpocząć od delikatnego zeskrobania kosmków z powierzchni światła jelita cienkiego za pomocą sterylnego szkiełka przedmiotowego. Następnie, używając nożyczek sekcyjnych, należy pociąć tkankę na paski o długości 1-2 centymetrów. Paski należy umieścić w 50-mililitrowej probówce stożkowej zawierającej 10 mililitrów schłodzonego na lodzie PBS. Zawartość należy wymieszać poprzez delikatne odwracanie probówki i pozwolić tkankom opaść na dno. Następnie należy odessać PBS i przemyć paski jeszcze trz

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Processing of Lentivirus-Transduced Mouse Intestinal Organoids for Immunohistochemical Analysis

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Ulepszona technologia obrazowania pozwala na trójwymiarowe obrazowanie organów podczas rozwoju. W tym miejscu opisujemy cały system hodowli narządów, który umożliwia obrazowanie na żywo rozwijających się kosmków w jelicie płodu myszy.

System hodowli całego jelita moczowego u myszy płodu do manipulacji ex vivo szlakami sygnałowymi i trójwymiarowego obrazowania na żywo rozwoju kosmków

Organoidy kryptowe jelita cienkiego hodowane ex vivo dostarczają system hodowli tkankowej, który podsumowuje wzrost krypt zależny od komórek macierzystych i ich niszy. Opracowaliśmy metodę oznaczania profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w pierwotnych organoidach krypt myszy. Odkryliśmy, że organoidy zachowują właściwości fizjologiczne określone przez ich źródło.

Analiza profilu metabolicznego w czasie rzeczywistym w hodowlach organoidów ex vivo w krypcie jelitowej myszy

W tym protokole wideo krok po kroku wyjaśniamy transdukcję lentiwirusową w organoidach pierwotnego nabłonka jelitowego oraz przetwarzanie i dalszą analizę tych kultur za pomocą ilościowego RT-PCR, RNA-mikromacierzy i immunohistochemii.

Protokół transdukcji lentiwirusowej i dalszej analizy organoidów jelitowych

Hodowla narządów ex vivo pozwala na badanie procesów biologicznych w kontekście nienaruszonej architektury tkanki. Tutaj przedstawiamy metodę hodowli ex vivo okrężnicy myszy, którą można wykorzystać do badania odporności wrodzonej i obrony przeciwdrobnoustrojowej gospodarza w jelicie.

Hodowla narządów jelita grubego ex vivo i jej zastosowanie w badaniach nad obroną przeciwdrobnoustrojową gospodarza

Ten artykuł przedstawia unikalną metodę analizy interakcji gospodarz-mikrobiom przy użyciu nowatorskiego systemu hodowli narządów jelitowych do eksperymentów ex vivo.

System hodowli jelit i narządów do analizy interakcji między gospodarzem a mikrobiotą

Ten protokół oferuje szczegółowe instrukcje dotyczące tworzenia mysich organoidów jelita cienkiego, izolowania wrodzonych komórek limfoidalnych typu 1 od mysiej blaszki jelita cienkiego oraz ustanawiania trójwymiarowych (3D) kokultur między oboma typami komórek w celu zbadania dwukierunkowych interakcji między komórkami nabłonka jelitowego a wrodzonymi komórkami limfoidalnymi typu 1.

Współhodowla organoidów nabłonkowych mysiego jelita cienkiego z wrodzonymi komórkami limfoidalnymi

Obecny protokół opisuje ustanowienie systemu organoidów mysiego okrężnicy do badania aktywności i funkcjonowania komórek macierzystych okrężnicy w modelu nokautu klaudyny-7.

Trójwymiarowa hodowla mysich krypt okrężnicy w celu zbadania funkcji jelitowych komórek macierzystych ex vivo

Opisujemy protokół izolowania mysich krypt jelita cienkiego i hodowania organoidów 3D jelit z krypt. Dodatkowo opisujemy metodę generowania organoidów z pojedynczej jelitowej komórki macierzystej przy braku podnabłonkowej niszy komórkowej.

Hodowla 3D organoidów z krypt jelit mysich i pojedynczej komórki macierzystej do badań nad organoidami

Poznaj metodę hodowli ex vivo organoidów jelitowych myszy i stymulacji receptorów rozpoznawania wzorców. Protokół obejmuje izolację krypt, utrzymanie kultur oraz analizę ekspresji genów.

Hodowla ex vivo i stymulacja receptorów rozpoznawania wzorców organoidów jelitowych myszy

Przeglądaj więcej filmów