Name: Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj izolację egzosomów z ludzkiej żółci wraz z profilowaniem mikroRNA. Ta niezawodna metoda ERCP umożliwia wykrywanie biomarkerów w chorobach wątroby i dróg żółciowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte nagrodą K08 Award (DK090154-01) od National Institutes of Health (NIH; dla F.M.S.).

Pobieranie żółci od pacjentów za pomocą endoskopowej cholangiopankreatografii wstecznej (ERCP) wymaga zatwierdzenia protokołu badania na ludziach przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną. Wszystkie przedstawione tu prace zostały zatwierdzone przez Johns Hopkins University Institutional Review Board.
1. Izolacja egzosomu od żółci
<ol>
	<li>Wykonaj endoskopową cholangiopankreatografię wsteczną (ECPW). Ułóż pacjenta w pozycji leżącej na plecach i zaintubuj.
	<ol>
		<li>Przełóż duodenoskop przez usta pacjenta i włóż go do drugiej części dwunastnicy i zidentyfikuj brodawkę główną.</li>
		<li>Selektywnie kaniuluj wspólny przewód żółciowy, wprowadzając zwieracz o potrójnym prześwicie wstępnie obciążony hydrofilowym prowadnikiem o średnicy 0,035 cala (0,9 mm).</li>
		<li>Przesuń prowadnik pod kierunkiem fluoroskopowym do lewego przewodu wątrobowego, ponieważ czasami może być trudno odróżnić przewód torbielowaty od prawego przewodu wątrobowego, a następnie przesunąć zwieracz o 5 cm do przewodu żółciowego, aby uzyskać stabilną pozycję.</li>
		<li>Usunąć prowadnik, podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml do portu prowadnika przez śluzę Luer i zassać żółć za pomocą 10 ml podciśnienia.</li>
		<li>Wyjąć strzykawkę zawierającą żółć, aby przystąpić do ECPW, ponownie wkładając prowadnik i wstrzykując środek kontrastowy przez port iniekcji w celu zmętnienia żółci</li>.
		<li>Pobraną żółć przenieść do 15 ml probówki na lodzie i trzymać na lodzie do momentu, gdy będzie gotowa do rozpoczęcia etapu wirowania. 
		Uwaga: Noś rękawice, aby chronić siebie i próbki! Traktuj żółć jako potencjalne źródło infekcji, ponieważ może zawierać cząsteczki wirusa zapalenia wątroby typu A!</li>
		<li>Próbkę (próbki) należy przechowywać na lodzie. Przejść do kroku 1.2 lub odwirować przy 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut, a następnie zamrozić w temperaturze -80 °C do dalszego użycia. 
		Uwaga: Próbki przechowywane w ten sposób przez kilka lat były rutynowo wykorzystywane z dobrymi wynikami19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść 400 μl żółci do probówki do mikrowirówki i zebrać komórki i resztki komórek przez odwirowanie przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą pipetowania, przenieść do świeżej probówki do mikrowirówki i odwirować próbkę(-i) o masie 16 500 x g przez kolejne 20 minut w temperaturze 4 °C w celu oczyszczenia supernatantu z dalszych zanieczyszczeń. Wyrzuć rurki do odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne. Alternatywnie, zamiast tego należy odwirować próbki w ultrawirówce.</li>
	<li>Zebrać supernatant i przefiltrować go w komorze bezpieczeństwa biologicznego za pomocą strzykawki przez filtr membranowy z polieterosulfonu (PES) o grubości 0,2 μm, który ma dobre prędkości przepływu i niskie wiązanie z białkami, aby usunąć wszelkie pozostałe cząstki większe niż 200 nm.</li>
	<li>Odpipetować przefiltrowany supernatant do probówek ultrawirówek i dodać PBS tak, aby probówki były wypełnione w więcej niż 2/3. Jeśli probówki zawierają mniej płynu, probówki zapadną się podczas wirowania! Probówki można myć, sterylizować w autoklawie i używać ponownie.</li>
	<li>Osadzać egzosomy przez ultrawirowanie w temperaturze 120 000 x g przez 70 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu spójrz na dno probówki ultrawirówki, aby czasami zobaczyć małe żółte granulki; To są egzosomy.</li>
	<li>Usunąć sklarowany osad przez ostrożne odlanie i zdezynfekować odpady, dodając wybielacz do końcowego stężenia 10% v/v i odstawić na 20 minut.</li>
	<li>W przypadku dalszych doświadczeń należy albo przetworzyć granulkę(i) w małej objętości odpowiedniego roztworu (tj. buforu do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) do izolacji białka, buforu do lizy RNA do izolacji miR) lub ponownie zawiesić go w 50–150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), która może być przechowywana w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości (ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) lub ekstrakcja białek itp.) lub stosowany do charakterystyki preparatu egzosomu za pomocą TEM lub analizy optycznej nanocząstek.</li>
</ol>
2. Identyfikacja egzosomów za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) lub CryoEM
<ol>
	<li>Zawiesić pęcherzyki zewnątrzkomórkowe w 100 μl PBS przez pipetowanie. Najlepiej używać egzosomów, które nie były przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C, zwłaszcza gdy wykonujesz izolację po raz pierwszy.</li>
	<li>Adsorbować 20 μl podwielokrotności (około 2 μg) do 400 siatek miedzianych Parlodion powlekanych węglem przez 2 minuty i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Utrwalić egzosom w 1% (v/v) aldehydzie glutarowym (klasa EM) przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ostrożnie umieszczając krople na wysuszonym preparacie.</li>
	<li>Umyj kratki dwukrotnie wodą przez 5 minut, a następnie porównuj plamy EV z 1% kwasem fosfowolframowym (PTA) przez 30 sekund.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu elektronowego o napięciu przyspieszenia 80 kilowoltów, zaczynając od powiększenia 20 000x i zwiększając do 100 000X podczas określania wielkości cząstek. 
	Uwaga: Możliwe są również inne przygotowania, takie jak nakładanie warstw na powlekane węglem siatki miedziane lub niklowe Formvar o siatce 200 oraz barwienie kontrastowe, takie jak 1% lub 2% octan uranylu przez 10-15 minut.</li>
	<li>W przypadku CryoEM należy zmieszać 20 μl podwielokrotności (około 2 μg) z 60 μl białka G gold 10 nm (stosunek 1:3). Pomoże to określić średnicę egzosomu.</li>
	<li>Przenieść próbki na rozżarzone, płaskie, dziurawe siatki węglowe typu C i usunąć nadmiar cieczy przez osuszenie. Zamroź kratki, zanurzając je natychmiast w ciekłym etanie.</li>
	<li>Zamontuj kratki w uchwycie kriogenicznym w ciekłym azocie.</li>
	<li>Rejestruj obrazy przy napięciu 200 kV z powiększeniami 20 000x i 100 000x.</li>
</ol>
3. Identyfikacja egzosomów za pomocą wieloparametrowej analizy optycznej nanocząstek
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić wyizolowane egzosomy w 100 μl PBS przez pipetowanie.</li>
	<li>Rozcieńczyć egzosomy w 600 μl PBS w kilku różnych proporcjach (np. 1:50, 1:100, 1:300, 1:600 i 1:1,200).</li>
	<li>Wizualizacja egzosomów poprzez rozpraszanie światła laserowego za pomocą odpowiedniego instrumentu i oprogramowania w czasie rzeczywistym zgodnie z protokołem producenta20.</li>
	<li>Zwiększ poziom aparatu w trybie przechwytywania, aż cząsteczki staną się widoczne, a następnie dostosuj ostrość, aby cząsteczki wyglądały na gładkie.</li>
	<li>W trybie standardowym zmniejsz kamerę do najniższego poziomu, do którego cząstki są nadal widoczne, w razie potrzeby dostosuj migawkę aparatu i wzmocnienie, aby to osiągnąć.</li>
	<li>Sprawdź wzrokowo, czy na ekranie widocznych jest 20-100 cząstek, jeśli nie, przepłucz urządzenie i dostosuj rozcieńczenie w PBS.</li>
	<li>Następnie dostosuj czas przechwytywania do 30-60 sekund. Po przechwyceniu wideo dostosuj parametry przetwarzania, aż wszystkie cząstki zostaną zidentyfikowane na ekranie i przetwórz plik wideo.</li>
</ol>
4. Charakterystyka egzosomu za pomocą Western Blot
<ol>
	<li>Lizować granulki egzosomów z 2-5 ml żółci w 100 μl lodowatego buforu testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) z inhibitorem proteazy, dokładnie pipetując w górę iw dół, a następnie energicznie mieszać lizaty przez 30 sekund w wirze, aby skutecznie rozpuścić białka.</li>
	<li>Chociaż w większości przypadków nie jest to konieczne, należy zastosować pulsacyjne sonikowanie próbek na lodzie z 2 impulsami przez 10 sekund każdy, aby zapewnić pełną lizę.</li>
	<li>Materiał nierozpuszczalny w granulkach przez odwirowanie w temperaturze 15 000 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i przenieść supernatant do czystej probówki.</li>
	<li>Określić stężenie białka za pomocą wybranej metody (tj. kwas bicinchoninowy (BCA), Coomassie, zmodyfikowany test Lowry'ego, test białka 660 nm itp.) zgodnie z protokołem producenta. Metoda nie jest tak ważna, o ile ta sama metoda jest konsekwentnie stosowana w celu uzyskania wyników, które można porównać między eksperymentami.</li>
	<li>Załadować 50 μg białka na próbkę do buforu Laemmli po podgrzaniu próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut do studzienki z żelem poliakrylamidowym do elektroforezy (PAGE).</li>
	<li>Próbki na żelach PAGE należy poddać elektroforezie przez 1,5 godziny i przenieść oddzielone białka na nylonową membranę.</li>
	<li>Zablokować błonę (błony) 5% mlekiem beztłuszczowym w soli fizjologicznej buforowanej trisem z 0,1% Tween 20 (TBS-T) przez 1 godzinę, a następnie inkubować z przeciwciałami specyficznymi dla egzosomów, takimi jak anty-CD63 i anty-TSG-101 w rozcieńczeniu 1:500, najlepiej O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć błony TBS-T 3 x 10 min, a następnie inkubować z odpowiednim, pasującym przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP w 5% mleku beztłuszczowym w TBS-T przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć membranę (membrany) 3 x 5 minut TBS-T i wykryć określone białka za pomocą odczynników chemiluminescencyjnych zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zobrazuj membrany za pomocą kliszy lub cyfrowego systemu obrazowania zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
5. Izolacja mikroRNA z izolowanych egzosomów
Uwaga: Izolacja miRNA z egzosomów żółciowych odbywa się za pomocą zmodyfikowanej izolacji miRNA opartej na komercyjnie dostępnym zestawie, ale każda inna metoda izolacji RNA może być użyta lub dostosowana.
<ol>
	<li>Dodać 300 μl buforu do lizy/budowania do osadu egzosomu (wyizolowanego z 400 μl żółci), odwirować, pipetować lub przepuścić przez igłę/strzykawkę, aby całkowicie zlizować egzosomy w celu uzyskania jednorodnego lizatu.</li>
	<li>Dodać 1/10 (30 μl) objętości dodatku homogenatu miRNA i dobrze wymieszać, kilkakrotnie wirując lub odwracając probówkę.</li>
	<li>Inkubuj mieszankę przez 10 minut na lodzie.</li>
	<li>Dodać objętość kwasowo-fenolowo-chloroform równą początkowemu homogenatowi (300 μl).</li>
	<li>Dodać 5 μl z 5 fmol/μl cel-miR 39 i wirować przez 30-60 sekund.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze pokojowej w celu oddzielenia fazy wodnej (górnej) i organicznej (dolnej).</li>
	<li>Ostrożnie odessać górną fazę przez pipetowanie i przenieść do świeżej probówki, zwracając uwagę na przenoszoną objętość. Wyrzuć fazę organiczną do odpowiedniego pojemnika na odpady organiczne.</li>
	<li>Aby wzbogacić małe RNA, dodaj 1/3 objętości 100% etanolu do odzyskanej fazy wodnej i wymieszaj, dokładnie wirując lub kilkakrotnie odwracając probówkę.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę lizatu i etanolu na wkład filtra, jednorazowo do 700 μl.</li>
	<li>Odwirować wkłady przez 15 sekund przy maksymalnej sile 10 000 x g lub zastosować podciśnienie, aby przepuścić mieszaninę przez filtr.</li>
	<li>Zebrać filtrat i jeśli mieszanina lizatu i etanolu przekracza 700 μl, przenieść przepływ do świeżej probówki i powtórzyć procedurę w celu zebrania wszystkich filtratów. Filtr ten zawiera frakcje RNA pozbawione małych RNA i może być używany do odzyskiwania tych większych RNA.</li>
	<li>Dodać 2/3 objętości RT 100% etanolu do całkowitego filtratu i dokładnie wymieszać przez wirowanie.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę filtratu/etanolu na drugi wkład filtracyjny. Tak jak poprzednio, maksymalna objętość, którą można nałożyć jednorazowo, to 700 μl.</li>
	<li>Wirować przez 15 sekund przy 10 000 x g lub zastosować próżnię zgodnie z opisem w kroku 5.10.</li>
	<li>Odrzucić przepływ i powtarzać tę czynność, aż cała mieszanina filtratu/etanolu zostanie przefiltrowana.</li>
	<li>Nałożyć 700 μl miRNA Wash Solution 1 na wkład filtra, odwirować przez 5-10 sekund lub zastosować próżnię i wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Umyj filtr 500 μl roztworu myjącego 2/3, jak to opisano w kroku 5.16.</li>
	<li>Powtórzyć płukanie po raz drugi z 500 μl roztworu płuczącego 2/3, jak w kroku 5.16, wyrzucić przepływ i umieścić filtr z powrotem w probówce zbiorczej.</li>
	<li>Obracaj wkład filtra przez 1 minutę przy 10 000 x g, aby usunąć wszystkie resztki płynu z filtra.</li>
	<li>Przenieść wkład filtra do świeżej probówki zbiorczej i nanieść 100 μl gorącej (95 °C) wody wolnej od nukleaz na środek filtra.</li>
	<li>Obracaj zespoły przez 20-30 sekund z maksymalną prędkością, aby odzyskać RNA.</li>
	<li>Zebrać eluat i zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li>
<li>Aushev, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+microRNA+patterns+in+plasma+before+and+after+tumor+removal+reveal+new+biomarkers+of+lung+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma.</a> PLoS One. 8 (10), e78649(2013).</li>
<li>Ben-Dov, I. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urine+microRNA+as+potential+biomarkers+of+autosomal+dominant+polycystic+kidney+disease+progression%3A+description+of+miRNA+profiles+at+baseline%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline.</a> PLoS One. 9 (1), e86856(2014).</li>
<li>Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+current+knowledge+of+their+composition%2C+biological+functions%2C+and+diagnostic+and+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).</li>
<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+mechanisms+and+intercellular+transfer+of+microRNAs+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells.</a> J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).</li>
<li>Mittelbrunn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+transfer+of+microRNA-loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells.</a> Nat. Commun. 2, 282(2011).</li>
<li>Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+miRNAs+exploiting+the+endosomal-exosomal+pathway+for+intercellular+cross-talk+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).</li>
<li>Bessho, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+candidate+microRNAs+for+pathogenesis+of+experimental+biliary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia.</a> BMC Syst. Biol. 7, (2013).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).</li>
<li>Collins, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+microRNA+profile+distinguishes+cholangiocarcinoma+from+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+polycistron+as+a+potential+human+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A microRNA polycistron as a potential human oncogene.</a> Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).</li>
<li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li>
<li>Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA%3A+a+diagnostic+marker+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer.</a> Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+recognition+assay+reveals+prostasomes+as+promising+plasma+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer.</a> Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bile+contains+microRNA-laden+extracellular+vesicles+that+can+be+used+for+cholangiocarcinoma+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis.</a> Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).</li>
<li>Gabriel, D. A., Giordano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microparticle+sizing+and+counting+using+light+scattering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Thromb.+Hemost%22%5BJournal%5D)">Microparticle sizing and counting using light scattering methods.</a> Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).</li>
<li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis%2C+secretion%2C+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby niezawodnie wykorzystać egzosomy wyizolowane z żółci, ważne jest stosowanie spójnych, wysokiej jakości metod izolacji, aby w zamian uzyskać próbki wysokiej jakości. Metodologia zdefiniowana w tym artykule jest dobrze znanym sposobem izolowania egzosomów i miRNA z ludzkiej żółci. Podkreśla kilka kluczowych etapów w charakterystyce izolowanych egzosomów, które powinny obejmować co najmniej mikroskopię elektronową lub analizę optyczną nanocząstek i plamy zachodnie.
Najważniejszym krokiem w iz...

Podobnie jak inne płyny biologiczne, np. mleko matki, osocze lub mocz, żółć zawiera egzosomy, pęcherzyki bogate w lipidy1-4. Egzosomy mogą indukować lub zmieniać funkcje biologiczne w komórkach biorcy5, 6, formę komunikacji komórka-komórka, która może być częścią ich normalnej funkcji4, 7-9. Egzosomy mogą zawierać gatunki miRNA, które mogą stanowić cenne źródło biomarkerów do diagnozy10. Profile miRNA zyskały w ostatnich latach dużą uwagę jako markery diagnostyczne i prognostyczne dla różnych chorób11-14.
miRNA samo w sobie można znaleźć w płynach biologicznych, prawdopodobnie uwalniane przez martwe komórki, a na ilość utraconych komórek może mieć duży wpływ choroba podstawowa. Profil miRNA egzosomów niekoniecznie odzwierciedla profil miRNA komórkiźródłowej 6, 10, 15-17, ale egzosomy mogą przenosić sygnatury miRNA, które mogą być charakterystyczne dla komórki rodzicielskiej, takiej jak komórka nowotworowa. Egzosomy pochodzące z guza zostały zidentyfikowane w osoczu pacjentów z gruczolakorakiem płuc, rakiem prostaty i innymi nowotworami8, 16, 18.
Celem tej metody jest niezawodna i solidna izolacja egzosomów od próbek ludzkiej żółci, w dużej mierze niezależnie od ich wcześniejszych procedur obchodzenia się z nimi. Został opracowany w celu wykorzystania żółci jako wiarygodnego źródła miRNA do potencjalnej diagnozy chorób dróg żółciowych, takich jak rak dróg żółciowych19. Składa się z kilku etapów wirowania ze zwiększającymi się prędkościami w celu wyizolowania egzosomów i może mieć zastosowanie do innych płynów biologicznych.

<table><tbody><tr><td>0,2 &mikro; m Filtr membranowy z polieterosulfonu (PES)</td><td></td> Cienkościenne probówki ultrawirówkowe z polialomeru <td>Corning</td> 431229<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Redlica Beckman 331374</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti Rotor</td><td>Redlica</td><td></td><td></td>Beckman</tr><tr><td>LM10-HS&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)&nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny inhibitor proteazy</td><td>Roche dystrybuowany przez Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-CD63</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>Anty-TSG101</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikrorna z ludzkiej żółci

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Badania egzosomów w ciągu ostatnich trzech lat znacznie rozszerzyły zakres identyfikacji i charakterystyki biomarkerów oraz ich zastosowań terapeutycznych.
Ostatnio wykazano, że egzosomy zawierają mikroRNA (miR). MiR same w sobie stały się cennymi biomarkerami do celów diagnostycznych. Ponieważ pobieranie próbek w klinikach i szpitalach jest dość zmienne, izolacja miRNA z całej żółci różni się znacznie. Uzyskanie solidnych, dokładnych i powtarzalnych profili miRNA z pobranych próbek żółci w prosty sposób wymagało opracowania wysokiej jakości protokołu izolowania i charakteryzowania egzosomów z żółci. Metoda wymaga kilku wirowań i etapu filtracji z końcowym etapem ultrawirowania w celu osadzenia izolowanych egzosomów. Mikroskopia elektronowa, plamy zachodnie, cytometria przepływowa i wieloparametrowa analiza optyczna nanocząstek, jeśli są dostępne, są kluczowymi etapami charakterystyki w celu walidacji jakości egzosomów. W celu wyizolowania miRNA z tych egzosomów, wzbogacenie lizatu niespecyficznym, syntetycznym miRNA z gatunku takiego jak Caenorhabditis elegans, tj. Cel-miR-39, jest ważne dla normalizacji wydajności ekstrakcji RNA. Wyizolowanie egzosomu z płynu żółciowego zgodnie z tą metodą pozwala na pomyślne profilowanie miRNA z próbek żółci przechowywanych przez kilka lat w temperaturze -80 °C.

Ponieważ egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą zwykłej mikroskopii lub cytometrii przepływowej, konieczne jest zastosowanie mikroskopii elektronowej lub optycznej analizy nanocząsteczek. Analiza optyczna nanocząsteczek ma tę przewagę nad mikroskopią elektronową, że jest również ilościowa i pozwala wyznaczyć rozkład wielkości oraz stężenie. Urządzenie wprowadza precyzyjnie skupioną wiązkę lasera przez pryzmat szklany do próbki. Ruchy Browna wyizolowanych pęcherzyków są ...

Płyn żółciowy jest cennym źródłem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów, które zawierają potencjalnie ważne biomarkery. Protokół ten stanowi solidną metodę izolowania egzosomów z ludzkiej żółci w celu dalszych analiz, w tym profilowania miRNA.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Ogólnym celem tej metody jest izolacja egzosomów z ludzkiej żółci do dalszych analiz, w tym profilowania mikroRNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób wątroby, takie jak wykrywanie konkretnego markera w żółci dla cholangiokarcinom lub innych chorób dróg żółciowych. Główną zaletą tej techniki jest jej solidność i powtarzalność.Aby przeprowadzić endoskopową retrogradną cholangiopankreatografię (ERCP), należy rozpocząć od ułożenia pacjenta w pozycji na plecach. Po intubacji i przeprowadzeniu duodenoskopu przez jamę ustną pacjenta, należy wprowadzić go do drugiej części dwunastnicy i zidentyfikować brodawkę wielką. Następnie należy selektywnie zakanulować przewód żółciowy wspólny, wprowadzając trójlumenowy sfinkterotom z uprzednio załadowanym hydrofilowym drutem prowadzącym o średnicy 0,35 cala lub 0,9 mm.Pod kontrolą fluoroskopii wprowadź drut prowadzący do lewego przewodu wątrobowego, a następnie przesuń sfinkterotom do przewodu żółciowego na głębokość pięciu centymetrów, aby uzyskać stabilną pozycję. Po wyjęciu drutu prowadzącego podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do portu drutu prowadzącego poprzez dolną blokadę i wykorzystaj 10 ml podciśnienia, aby aspirować żółć. Usuń strzykawkę zawierającą żółć, a po ponownym wprowadzeniu drutu prowadzącego wstrzyknij środek kontrastowy przez port wtryskowy, aby uwidocznić drzewo żółciowe.Następnie zebraną żółć przenieść do probówki o pojemności 15 ml w lodzie, a w przypadku przechowywania na później, odwirować próbkę przy 500 ×g i 4°C przez 10 minut przed zamrożeniem w temperaturze -80°C. Aby niezwłocznie przystąpić do izolacji egzosomów, przenieść 400 µL żółci do probówki do mikrowirówki i odwirować przy 300 ×g i 4°C przez 10 minut w celu zebrania komórek i szczątków komórkowych. Aby dodatkowo oczyścić supernatant, przenieść roztwór do nowych probówek do mikrowirówki i odwirować próbki przy 16 500 ×g i 4°C przez 20 minut.Następnie w komorze z laminarem pobierz nadsącz do strzykawki i przefiltruj go przez membranowy filtr z polietersulfonu o porach 0,2 µm, aby usunąć pozostałe cząsteczki większe niż 200 nm. Przenieś przefiltrowany nadsącz do probówek do ultrawirowania i dopełnij je PBS do co najmniej dwóch trzecich objętości, aby zapobiec zapadnięciu się probówek podczas wirowania. Wydziel egzosomy poprzez ultrawirowanie przy 120 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 70 minut.Mały, żółty osad będzie zawierał egzosomy. Usuń nadsącz poprzez ostrożne odlanie i zdezynfekuj odpady, dodając wybielacz do końcowego stężenia 10% obj. obj. Następnie pozostaw go na 20 minut.Do dalszych eksperymentów należy albo przetworzyć osady w niewielkiej objętości odpowiedniego roztworu, albo ponownie zawiesić je w 50 do 100 µL PBS i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Po przygotowaniu siatek z kontrastowo barwionymi pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, czyli EV, zgodnie z protokołem tekstowym, należy wykonać obrazy za pomocą mikroskopu elektronowego, stosując napięcie przyspieszenia 80 kV, zaczynając od powiększenia 20 000 X i zwiększając je do 100 000 X podczas określania wielkości cząstek. Egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą zwykłej mikroskopii lub cytometrii przepływowej; jednak niniejsza figura przedstawia wyniki typowej analizy śledzenia nanocząstek, czyli NTA, egzosomów, która mierzy stężenie i rozkład wielkości, który w tej izolowanej próbce ludzkiej żółci wynosił średnio 97 nm.Mikroskopia elektronowa może być również wykorzystana do potwierdzenia wielkości wyizolowanych cząsteczek w żółci ludzkiej, a rysunek ten przedstawia typowy wynik EM w transmisji. Te analizy western blot zostały poddane detekcji białek wzbogaconych w egzosomach, takich jak tetraspanina CD63 i Tsg101. Ten wykres amplifikacji w czasie rzeczywistym pokazuje różnorodne gatunki mikroRNA wyekstrahowane z egzosomów z żółci ludzkiej.Ponieważ egzosomy nie posiadają niezawodnych standardów, takich jak rybosomalny RNA 18S lub 28S czy geny housekeepingowe, dodanie syntetycznego mikroRNA jest istotne dla procesu normalizacji. Technika izolacji egzosomów może zostać przeprowadzona w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pozyskiwania i przetwarzania żółci od pacjentów lub zwierząt w celu izolacji i analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.Podczas powtarzania tej procedury należy pamiętać o odwirowaniu próbki przy 500 G i temperaturze czterech stopni przed zamrożeniem w minus 80, jeśli nie można przeprowadzić ultrawirowania. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak badania microRNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące profili microRNA. Należy pamiętać, że praca z żółcią może być niezwykle niebezpieczna, ponieważ może ona zawierać wirusy zapalenia wątroby, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań nad cholangiocarcinoma w celu zbadania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako potencjalnych biomarkerów w żółci pacjentów z problemami dróg żółciowych, takimi jak niedrożność PSA.

isolation-profiling-microrna-containing-exosomes-from-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsza praca przedstawia metody izolacji, oczyszczania i detekcji egzosomów, a także techniki analizy ich zawartości molekularnej. Metody te można dostosować do izolacji egzosomów zarówno z pożywek hodowli komórkowych, jak i z płynów biologicznych; poza analizą zawartości molekularnej mogą one być również przydatne w badaniach funkcjonalnych.

Izolacja i charakterystyka egzosomów zawierających RNA

Obecność stabilnych mikroRNA (miRNA) w egzosomach wzbudziła ogromne zainteresowanie jako nowy sposób komunikacji międzykomórkowej, ze względu na ich potencjalną użyteczność jako biomarkery i jako droga do interwencji terapeutycznej. Tutaj demonstrujemy oczyszczanie egzosomów z krwi i pożywek hodowlanych, a następnie ilościowy PCR w celu identyfikacji transportowanych miRNA.

Oczyszczanie i profilowanie mikroRNA egzosomów pochodzących z krwi i pożywek hodowlanych

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

Opisano techniki opisujące gradientową procedurę oddzielania egzosomów od cząsteczek ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV). Procedura ta została wykorzystana do wyizolowania egzosomów z dala od cząstek HIV w ludzkim osoczu od osób zakażonych wirusem HIV. Wyizolowane egzosomy analizowano pod kątem zawartości cytokin/chemokin.

Izolacja egzosomów z osocza osób zakażonych wirusem HIV-1

Ten protokół opisuje możliwość przeprowadzenia profilowania miRNA w egzosomach, uwalnianych w osoczu pacjentów z NSCLC, za pomocą komercyjnego zestawu do izolacji egzosomów z terapią proteinazą K i RNAza, w celu uniknięcia zanieczyszczenia krążącymi miRNA i oceny ich cech biomarkerów w NSCLC.

Egzosomalna analiza miRNA w osoczu pacjentów z niedrobnokomórkowym rakiem płuca (NSCLC) za pomocą qPCR: wykonalne narzędzie do płynnej biopsji

MikroRNA odgrywają ważną rolę regulacyjną i stają się nowymi celami terapeutycznymi dla różnych chorób ludzkich. Wykazano, że miRNA są przenoszone w lipoproteinach o dużej gęstości. Opracowaliśmy uproszczoną metodę szybkiego izolowania oczyszczonego HDL nadającego się do analizy miRNA z ludzkiego osocza.

Szybka i uproszczona metoda wysokoprzepustowej izolacji miRNA z wysoko oczyszczonej lipoproteiny o wysokiej gęstości

Ten protokół opisuje izolację i kwantyfikację małych RNA lipoprotein o dużej gęstości.

Izolacja lipoprotein o dużej gęstości do niekodującej kwantyfikacji małego RNA

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe obecne we krwi zostały zasugerowane jako nowe biomarkery różnych chorób. W tym miejscu przedstawiamy protokół izolacji dużych mikropęcherzyków pochodzących z błony plazmatycznej z próbek krwi obwodowej i ich późniejszej analizy za pomocą konwencjonalnej cytometrii przepływowej i Western Blotting.

Izolacja i charakterystyka mikropęcherzyków z krwi obwodowej

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania egzosomów zarówno z osocza, jak i surowicy z redukcją kooczyszczania nieegzosomalnych białek krwi. Zoptymalizowany protokół obejmuje ultrafiltrację, leczenie proteazą i chromatografię wykluczania wielkości. Ulepszone oczyszczanie egzosomów przynosi korzyści w dalszych analizach, w tym dokładniejszej kwantyfikacji pęcherzyków i charakterystyce proteomicznej.

Trawienie białek, ultrafiltracja i chromatografia wykluczania wielkości w celu optymalizacji izolacji egzosomów z ludzkiego osocza krwi i surowicy

Ten protokół pokazuje, jak oczyszczać zewnątrzkomórkowe mikroRNA z pożywek do hodowli komórkowych w celu budowy małych bibliotek RNA i sekwencjonowania nowej generacji. Opisano różne punkty kontrolne kontroli jakości, aby umożliwić czytelnikom zrozumienie, czego można się spodziewać podczas pracy z próbkami o niskim poziomie wejściowym, takimi jak exRNA.

Izolowanie, sekwencjonowanie i analiza zewnątrzkomórkowych mikroRNA z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Egzosom to nowa generacja nośników leków. Opracowaliśmy protokół izolacji egzosomów o wysokiej wydajności i czystości dostarczania siRNA. Otorbiliśmy również znakowane fluorescencyjnie niespecyficzne siRNA do egzosomów i zbadaliśmy wychwyt komórkowy egzosomów obciążonych siRNA w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Poznaj izolację egzosomów z ludzkiej żółci wraz z profilowaniem mikroRNA. Ta niezawodna metoda ERCP umożliwia wykrywanie biomarkerów w chorobach wątroby i dróg żółciowych.

Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Przeglądaj więcej filmów