Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie egzosomów z ludzkiej żółci w celu przeprowadzenia dalszych analiz, w tym profilowania mikroRNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób wątroby, takie jak wykrywanie określonego markera żółciowego dla raka dróg żółciowych lub innych chorób dróg żółciowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest solidna i powtarzalna.

Aby wykonać endoskopową cholangiopankreatografię wsteczną lub ECPW, należy rozpocząć od ułożenia pacjenta w pozycji leżącej. Po intubacji i przepuszczeniu duodenoskopu przez usta pacjenta, należy wprowadzić go do drugiej części dwunastnicy i zidentyfikować brodawkę główną. Selektywnie kaniuluj wspólny przewód żółciowy, wprowadzając zwieracz o potrójnym prześwicie wstępnie obciążony hydrofilowym prowadnikiem o średnicy 0,35 cala lub 0,9 milimetra.

Pod kontrolą fluoroskopową przesuń prowadnik do lewego przewodu wątrobowego, a następnie przesuń zwieracz o pięć centymetrów do przewodu żółciowego, aby uzyskać stabilną pozycję. Po wyjęciu prowadnika przymocuj 10-milimetrową strzykawkę do portu prowadnika przez dolny zamek i użyj 10 mililitrów podciśnienia do zassania żółci. Wyjąć strzykawkę z żółcią i po ponownym włożeniu prowadnika wstrzyknąć środek kontrastowy przez port iniekcyjny w celu zmętnienia żółci.

Następnie przenieś zebraną żółć do 15-mililitrowej probówki na lodzie i jeśli przechowujesz ją na później, odwiruj próbkę w temperaturze 500 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut przed zamrożeniem w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby natychmiast przystąpić do izolacji egzosomów, przenieś 400 mikrolitrów żółci do probówki mikrowirówki i wiruj w temperaturze 300 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby zebrać komórki i szczątki komórek. W celu dalszego oczyszczenia supernatantu należy przenieść roztwór do świeżych probówek do mikrowirówek i odwirować próbki w temperaturze 16 500 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.

Następnie w komorze bezpieczeństwa biologicznego zebrać supernatant do strzykawki i przefiltrować go przez filtr membranowy z polieterosulfonu o średnicy 0,2 mikrometra, aby usunąć wszelkie pozostałe cząstki większe niż 200 nanometrów. Przefiltrowany supernatant należy przenieść do probówek ultrawirówek i użyć PBS, aby doprowadzić probówki do napełnienia do co najmniej dwóch trzecich, aby zapobiec zapadaniu się probówek podczas wirowania. Osadzaj egzosomy przez ultrawirowanie w temperaturze 120 000 razy g i czterech stopniach Celsjusza przez 70 minut.

Mały, żółty granulek będzie zawierał egzosomy. Wyrzucić sklarowany osad przez ostrożne dekantowanie i zdezynfekować odpady, dodając wybielacz do końcowego stężenia 10% objętości na objętość. Następnie odstaw na 20 minut.

W przypadku dalszych eksperymentów, albo przetworzyć granulki w małej objętości odpowiedniego roztworu, albo ponownie zawiesić je w 50 do 100 mikrolitrach PBS i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Po przygotowaniu siatek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych zabarwionych kontrastem lub EV, zgodnie z protokołem tekstowym, uzyskaj obrazy za pomocą mikroskopu elektronowego przy użyciu napięcia przyspieszenia 80 kilowoltów, zaczynając od powiększenia 20 000 X i zwiększając się do 100 000 X, przy określaniu wielkości cząstek. Egzosomy są zbyt małe, aby można je było wykryć za pomocą zwykłej mikroskopii lub cytometrii przepływowej; jednak rysunek ten pokazuje wyniki typowej analizy śledzenia nanocząstek lub NTA egzosomów, które mierzą stężenie i rozkład wielkości, które wynosiły średnio 97 nanometrów w tej izolowanej próbce ludzkiej żółci.

Mikroskopia elektronowa może być również wykorzystana do potwierdzenia wielkości wyizolowanych cząstek w ludzkiej żółci, a rysunek ten pokazuje typowy wynik transmisji EM. Te western blot badano pod kątem białek wzbogaconych w egzosomy, takie jak tetraspanina CD63 i Tsg101. Ten wykres amplifikacji w czasie rzeczywistym pokazuje różne gatunki mikroRNA wyekstrahowane z egzosomów ludzkiej żółci.

Ponieważ egzosomy nie mają wiarygodnych standardów, takich jak rybosomalne RNA 18S lub 28S lub geny porządkowe, wystrzelenie syntetycznego mikroRNA jest ważne dla normalizacji. Technikę izolacji EXOS można wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak pozyskiwać i przetwarzać żółć od pacjentów lub zwierząt w celu wyizolowania i analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Podczas odwoływania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o odwirowaniu próbki w temperaturze 500 G i czterech stopniach przed zamrożeniem w temperaturze minus 80, jeśli nie można kontynuować ultrawirowania. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak badania mikroRNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak profile mikroRNA. Nie zapominaj, że praca z żółcią może być bardzo niebezpieczna, ponieważ może zawierać zapalenie wątroby, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie raka dróg żółciowych w celu zbadania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako potencjalnego biomarkera żółci u pacjentów z problemami z drogami żółciowymi, takimi jak niedrożność PSA.