Izolacja i profilowanie egzosomów zawierających mikroRNA z ludzkiej żółci

Ogólnym celem tej metody jest izolacja egzosomów z ludzkiej żółci do dalszych analiz, w tym profilowania mikroRNA. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie chorób wątroby, takie jak wykrywanie konkretnego markera w żółci dla cholangiokarcinom lub innych chorób dróg żółciowych. Główną zaletą tej techniki jest jej solidność i powtarzalność.

Aby przeprowadzić endoskopową retrogradną cholangiopankreatografię (ERCP), należy rozpocząć od ułożenia pacjenta w pozycji na plecach. Po intubacji i przeprowadzeniu duodenoskopu przez jamę ustną pacjenta, należy wprowadzić go do drugiej części dwunastnicy i zidentyfikować brodawkę wielką. Następnie należy selektywnie zakanulować przewód żółciowy wspólny, wprowadzając trójlumenowy sfinkterotom z uprzednio załadowanym hydrofilowym drutem prowadzącym o średnicy 0,35 cala lub 0,9 mm.

Pod kontrolą fluoroskopii wprowadź drut prowadzący do lewego przewodu wątrobowego, a następnie przesuń sfinkterotom do przewodu żółciowego na głębokość pięciu centymetrów, aby uzyskać stabilną pozycję. Po wyjęciu drutu prowadzącego podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do portu drutu prowadzącego poprzez dolną blokadę i wykorzystaj 10 ml podciśnienia, aby aspirować żółć. Usuń strzykawkę zawierającą żółć, a po ponownym wprowadzeniu drutu prowadzącego wstrzyknij środek kontrastowy przez port wtryskowy, aby uwidocznić drzewo żółciowe.

Następnie zebraną żółć przenieść do probówki o pojemności 15 ml w lodzie, a w przypadku przechowywania na później, odwirować próbkę przy 500 ×g i 4°C przez 10 minut przed zamrożeniem w temperaturze -80°C. Aby niezwłocznie przystąpić do izolacji egzosomów, przenieść 400 µL żółci do probówki do mikrowirówki i odwirować przy 300 ×g i 4°C przez 10 minut w celu zebrania komórek i szczątków komórkowych. Aby dodatkowo oczyścić supernatant, przenieść roztwór do nowych probówek do mikrowirówki i odwirować próbki przy 16 500 ×g i 4°C przez 20 minut.

Następnie w komorze z laminarem pobierz nadsącz do strzykawki i przefiltruj go przez membranowy filtr z polietersulfonu o porach 0,2 µm, aby usunąć pozostałe cząsteczki większe niż 200 nm. Przenieś przefiltrowany nadsącz do probówek do ultrawirowania i dopełnij je PBS do co najmniej dwóch trzecich objętości, aby zapobiec zapadnięciu się probówek podczas wirowania. Wydziel egzosomy poprzez ultrawirowanie przy 120 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 70 minut.

Mały, żółty osad będzie zawierał egzosomy. Usuń nadsącz poprzez ostrożne odlanie i zdezynfekuj odpady, dodając wybielacz do końcowego stężenia 10% obj. obj. Następnie pozostaw go na 20 minut.

Do dalszych eksperymentów należy albo przetworzyć osady w niewielkiej objętości odpowiedniego roztworu, albo ponownie zawiesić je w 50 do 100 µL PBS i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Po przygotowaniu siatek z kontrastowo barwionymi pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi, czyli EV, zgodnie z protokołem tekstowym, należy wykonać obrazy za pomocą mikroskopu elektronowego, stosując napięcie przyspieszenia 80 kV, zaczynając od powiększenia 20 000 X i zwiększając je do 100 000 X podczas określania wielkości cząstek. Egzosomy są zbyt małe, aby można było je wykryć za pomocą zwykłej mikroskopii lub cytometrii przepływowej; jednak niniejsza figura przedstawia wyniki typowej analizy śledzenia nanocząstek, czyli NTA, egzosomów, która mierzy stężenie i rozkład wielkości, który w tej izolowanej próbce ludzkiej żółci wynosił średnio 97 nm.

Mikroskopia elektronowa może być również wykorzystana do potwierdzenia wielkości wyizolowanych cząsteczek w żółci ludzkiej, a rysunek ten przedstawia typowy wynik EM w transmisji. Te analizy western blot zostały poddane detekcji białek wzbogaconych w egzosomach, takich jak tetraspanina CD63 i Tsg101. Ten wykres amplifikacji w czasie rzeczywistym pokazuje różnorodne gatunki mikroRNA wyekstrahowane z egzosomów z żółci ludzkiej.

Ponieważ egzosomy nie posiadają niezawodnych standardów, takich jak rybosomalny RNA 18S lub 28S czy geny housekeepingowe, dodanie syntetycznego mikroRNA jest istotne dla procesu normalizacji. Technika izolacji egzosomów może zostać przeprowadzona w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pozyskiwania i przetwarzania żółci od pacjentów lub zwierząt w celu izolacji i analizy pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

Podczas powtarzania tej procedury należy pamiętać o odwirowaniu próbki przy 500 G i temperaturze czterech stopni przed zamrożeniem w minus 80, jeśli nie można przeprowadzić ultrawirowania. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak badania microRNA, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące profili microRNA. Należy pamiętać, że praca z żółcią może być niezwykle niebezpieczna, ponieważ może ona zawierać wirusy zapalenia wątroby, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań nad cholangiocarcinoma w celu zbadania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych jako potencjalnych biomarkerów w żółci pacjentów z problemami dróg żółciowych, takimi jak niedrożność PSA.