Name: Generowanie pożywek narządowych i aplikacje do badania specyficznych dla narządów wpływów na zachowanie przerzutowe raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę generowania pożywek narządowych z węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgu myszy do badania czynników rozpuszczalnych wpływających na zachowanie przerzutowe komórek raka piersi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, Canada Foundation for Innovation (nr 13199), oraz wsparcie darczyńców od Johna i Donny Bristol za pośrednictwem London Health Sciences Foundation (dla A.L.A.). Stypendium i stypendia zostały zapewnione przez program stypendialny dla absolwentów Ontario (prowincja Ontario, dla G.M.P. i J.E.C.), program Canada Graduate Scholarship-Master's (dla M.M.P.), Canadian Institutes of Health Research (CIHR)-Strategic Training Program (dla M.M.P., G.M.P i J.E.C.) oraz Pamela Greenaway-Kohlmeier Translational Breast Cancer Research Unit w London Regional Cancer Program (dla M.M.P., G.M.P., J.E.C. i Y.X.). Projekt A.L.A. jest wspierany przez CIHR New Investigator Award oraz Early Researcher Award przyznawaną przez Ministerstwo Badań i Innowacji Ontario.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Podkomitet ds. Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Zachodniego.
1. Izolacja narządów (płuca, mózg, kości, węzły chłonne)
<ol>
	<li>Przygotować cztery sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 ml (po jednej dla każdego narządu, który ma być wyizolowany) zawierające około 30 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zważ wstępnie każdą probówkę PBS za pomocą wagi elektronicznej.</li>
	<li>Poddaj eutanazji 6-12 tygodniową mysz przez wdychanie CO2 . Myszy należy pozostawić w komorze CO2 na około 1 - 2 minuty lub do momentu, gdy mysz przestanie się poruszać i oddychać. Udana eutanazja może być dodatkowo potwierdzona przez brak bicia serca, gdy zostanie sprawdzona ręcznie palcem. Unikaj zwichnięcia szyjki macicy, ponieważ ta metoda może spowodować pęknięcie naczyń krwionośnych szyi, co prowadzi do trudności w usuwaniu pachowych węzłów chłonnych. 
	Uwaga: Poprzednie prace dotyczyły zdrowych samic nagich myszy, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu13.</li>
	<li>W sterylnym kapturze do hodowli tkanek połóż mysz na plecach na podkładce z pianki polistyrenowej, rozłóż kończyny i użyj szpilek, aby utrzymać je na miejscu.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy i nożyczek przetnij skórę brzucha w linii środkowej przy genitaliach i przetnij w górę w kierunku ust. Delikatnie odciągnij skórę brzucha od mięśni brzucha i przypnij do podkładki z pianki polistyrenowej.</li>
	<li>Zlokalizuj węzły chłonne pachowe, ramienne i pachwinowe. 
	Uwaga: Węzły chłonne są zwykle otoczone tkanką tłuszczową. Pachwinowe węzły chłonne są najłatwiejsze do zlokalizowania, ponieważ znajdują się powierzchownie na styku dwóch naczyń krwionośnych na ściągniętej do tyłu skórze brzucha. Węzły chłonne pachowe i ramienne znajdują się głębiej w tkance i wymagają delikatnego manewrowania tkanką.
	<ol>
		<li>Po zlokalizowaniu węzłów chłonnych użyj nożyczek, aby delikatnie i ostrożnie odciąć węzły chłonne od skóry, tłuszczu i naczyń krwionośnych i usunąć je z myszy. Aby potwierdzić prawidłowe wypreparowanie, przetocz kleszcze po usuniętej tkance. Jeśli podczas toczenia kleszczy po tkance pojawi się twardy guzek, prawdopodobnie węzeł chłonny został pomyślnie usunięty.</li>
		<li>Umieść usunięte węzły chłonne w lodowatym PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek otwórz jamę brzuszną, przecinając odsłoniętą ścianę brzucha ruchem w górę w kierunku klatki piersiowej. Ostrożnie przeciąć mostek, odsłaniając klatkę piersiową.</li>
	<li>Zlokalizuj przeponę poniżej płuc i przetnij przeponę. Powinien ciągnąć w kierunku żeber z powodu napięcia.</li>
	<li>Podnieś płuca od spodu i przetnij leżącą pod spodem tkankę w kierunku tchawicy. Pozwala to na swobodne usuwanie płuc z jamy klatki piersiowej. Usuń serce i płuca en bloc i umieść w lodowatym PBS. Serce można usunąć z płuc tutaj lub tuż przed ważeniem w kroku 2.</li>
	<li>Usuń kołki, trzymając mysz na miejscu na podkładce z pianki polistyrenowej. Odwróć kursor myszy i przetnij skórę dolnej części pleców na całej długości od boku do boku.</li>
	<li>Używając sterylnego kawałka gazy do przytrzymania tułowia myszy, oderwij tylną skórę myszy od nóg i stóp myszy.</li>
	<li>Używając tego samego kawałka sterylnej gazy, przytrzymaj dolną część nogi na miejscu, ostrożnie przełam staw skokowy stopy myszy i oderwij skórę nad stawem proksymalnie w kierunku stawu kolanowego.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek usuń piszczel z stawu kolanowego i umieść w lodowatym PBS.</li>
	<li>Powtórz kroki od 1.11) do 1.12) z przeciwną kończyną.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przytrzymaj kość udową na miejscu, odetnij otaczającą tkankę mięśniową za pomocą nożyczek i usuń kość udową, umieszczając ją w lodowatym PBS.</li>
	<li>Powtórz krok 1.14) z przeciwną kończyną.</li>
	<li>Używając nowego kawałka sterylnej gazy, przytrzymaj głowę myszy na miejscu. Za pomocą kleszczy i nożyczek delikatnie usuń skórę, aby odsłonić czaszkę. Za pomocą nożyczek ostrożnie przetnij czaszkę potyliczną od góry środka w linii prostej i w dół, aby odsłonić tylną część mózgu.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zgarnij pod mózg w kierunku przednim i usuń cały mózg. Umieść mózg w lodowatym PBS.</li>
	<li>Powtórz kroki od 1.1) do 1.17) dla co najmniej czterech myszy.</li>
</ol>
2. Ważenie organów
<ol>
	<li>Po wyizolowaniu narządu zważ każdą probówkę PBS zawierającą tkankę płucną i mózgową za pomocą wagi elektronicznej.</li>
	<li>Obliczyć różnicę masy, odejmując masę sprzed izolacji (tylko PBS) od masy rurki PBS + narządów (płuca i mózg).</li>
	<li>Określ ilość podłoża potrzebną do ponownego zawieszenia fragmentów tkanek na podstawie obliczonej różnicy masy. 
	Uwaga: Tkanka płucna i mózgowa są normalizowane przez ponowne zawieszenie w stosunku 4:1 pożywka do tkanki (obj./wag.).</li>
</ol>
3. Generacja mediów kondycjonowanych przez płuca i mózg
<ol>
	<li>W sterylnym kapturze do hodowli tkanek odwróć trzykrotnie probówki PBS zawierające płuca lub mózg, aby usunąć resztki krwi z narządów i odessać PBS zawierające krew. Powtarzać ze świeżym, zimnym PBS, aż roztwór stanie się klarowny bez śladów krwi.</li>
	<li>Umieść płuca i mózgi w oddzielnych szklanych szalkach Petriego o średnicy 60 mm2. Używając dwóch sterylnych ostrzy skalpela, zmiel płuca lub mózgi, wielokrotnie krojąc tam iz powrotem, aż fragmenty tkanki osiągną rozmiar około ~ 1 mm3.</li>
	<li>Zawiesić fragmenty tkanek w odpowiedniej objętości (określonej wcześniej w kroku 2.3) zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM):F12 firmy Dulbecco uzupełnionego 1x skoncentrowanym suplementem mitogenu i penicyliną (50 μg/ml)/streptomycyną (50 μg/ml).</li>
	<li>Dodaj zawieszone fragmenty płuc lub tkanki mózgowej do jednego dołka 6-dołkowej płytki.</li>
	<li>Inkubować fragmenty tkanek w pożywkach przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po inkubacji zebrać kondycjonowane podłoże dla każdej tkanki i dalej rozcieńczyć, dodając trzy równoważne objętości świeżej pożywki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować przy 1 000 g w rozcieńczonym, kondycjonowanym podłożu dla każdego narządu w temperaturze 4 °C przez 15 minut w celu usunięcia dużych resztek tkanek. Zebrać supernatant pożywki i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,22 μm.</li>
	<li>Połącz kondycjonowane pożywki z każdego narządu (tj. płuca z płucem i mózgu z mózgiem) od wielu myszy, aby uwzględnić zmienność między myszami. Podwielokrotność i przechowywać kondycjonowane podłoże w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Wytwarzanie pożywek kondycjonowanych szpikulkiem kostnym
<ol>
	<li>W sterylnym kapturze do hodowli tkanek odetnij nadmiar tkanki z kości i usuń nasady (końcówki) z kości nożyczkami.</li>
	<li>Za pomocą igły 27 1/2 G przepłukać jamę szpikową kości, przepychając 1 ml PBS przez środek każdej kości. Umożliwi to pobranie komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) do świeżej probówki zawierającej PBS.</li>
	<li>Wirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i dwukrotnie przemyć BMSC PBS. Zawiesić komórki zrębu szpiku kostnego w 20 ml pożywki do wzrostu komórek zrębu kostnego (pożywka DMEM: F12 uzupełniona 1x skoncentrowanym suplementem mitogenu, penicyliną (50 μg / ml) / streptomycyną (50 μg / ml) i 10% surowicą płodową (FBS)).</li>
	<li>Płytka 10 ml zawieszonych komórek zrębu szpiku kostnego w jednej kolbie T75. 
	Uwaga: Połącz i płytkuj komórki z każdych 2 myszy w każdej kolbie T75; dla czterech myszy potrzebne są dwie kolby T75 (około 1 x 107 komórek/kolbę).</li>
	<li>Inkubować komórki zrębu szpiku kostnego w pożywce do wzrostu komórek zrębu kostnego przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po inkubacji usunąć pożywkę z obu kolb T75 i umieścić w nowej kolbie T75, oznaczyć tę kolbę jako "kolbę pływakową". Dodać świeżą pożywkę do wzrostu komórek zrębu kostnego do poprzednich 2 kolb i inkubować wszystkie 3 kolby w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po osiągnięciu przez komórki około 70% zbiegu (około 5 - 7 dni) komórki pasują. Aby to zrobić, usuń pożywkę i dwukrotnie przemyj komórki PBS (3 ml każde pranie). Usunąć PBS i dodać 3 ml roztworu trypsyny/EDTA, upewniając się, że trypsyna pokrywa całą powierzchnię kolby. Po zdjęciu komórek z kolby (~ 2 - 3 min) należy zatrzymać reakcję trypsynizacji, dodając 3 ml pożywki do wzrostu komórek zrębu kostnego). Odwirować 900 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić komórki w 10 ml świeżej pożywki do wzrostu komórek zrębu kostnego.</li>
	<li>Zebrać komórki ze wszystkich kolb i przejść w stosunku 1:5 do trzech nowych kolb T75 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Gdy komórki ponownie osiągną 70%, powtórz krok 4.6 i zbierz i przejdź przez wszystkie przylegające komórki po raz drugi. Ponownie pokryć wszystkie komórki czterema kolbami T75 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Na wszystkich etapach należy stosować pożywkę do wzrostu komórek zrębu kostnego.</li>
	<li>Pozwól komórkom osiągnąć zbieżność, umyj komórki trzykrotnie PBS i dodaj pożywkę do zbierania komórek zrębu kostnego (pożywka DMEM: F12 + 1x skoncentrowany suplement mitogenu + penicylina (50 μg / ml) / streptomycyna (50 μg / ml); 10 ml / T75), upewniając się, że ta pożywka jest wolna od FBS. Zebrać pożywkę kondycjonowaną szpikiem kostnym 72 godziny później, przefiltrować przez filtr 0,22 μm, pulę, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>W razie potrzeby potwierdź fenotyp izolowanych komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC) za pomocą przeciwciał przeciwko mysim Sca-1, CD105, CD29 i CD73, CD44, przy użyciu standardowych technik cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej13.</li>
</ol>
5. Wytwarzanie pożywek kondycjonowanych węzłami chłonnymi
<ol>
	<li>W sterylnym kapturze do hodowli tkanek odwróć trzykrotnie probówkę PBS zawierającą węzły chłonne, aby usunąć resztki krwi z węzłów chłonnych i odessać krwawy PBS. Powtarzać ze świeżym, zimnym PBS, aż roztwór stanie się klarowny bez śladów krwi.</li>
	<li>Umieść węzły chłonne w60 mm 2 szklanych szalkach Petriego. Używając dwóch sterylnych ostrzy skalpela, zmiel węzły chłonne, wielokrotnie krojąc tam iz powrotem, aż fragmenty tkanki osiągną rozmiar około 1 mm3.</li>
	<li>W stożkowej probówce ponownie zawiesić fragmenty tkanek w 10 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI1640) uzupełnionej penicyliną (50 μg/ml)/streptomycyną (50 μg/ml), 5 x 10-5 M sterylnym β-merkaptoetanolem (1,75 μl/500 ml podłoża) i 10% FBS.</li>
	<li>Wirować przy 900 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i ponownie zawiesić wszystkie komórki w pożywce o objętości 30 ml. Dodać 5 ml pożywki/basenik do płytki 6-dołkowej i inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Po 7-dniowej inkubacji wyrzucić pożywkę, przemyć przylegające komórki 5 ml ciepłego PBS i dodać 5 ml świeżej pożywki do każdej studzienki. Pozwól komórkom rosnąć do zbiegu (około 5 - 7 dni), spróbuj pampynizować, połącz wszystkie komórki i pasuj, jak opisano w kroku 4.6. Ponownie płytki komórek na płytce 6-dołkowej. Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Po trzech pasażach pozwól komórkom rosnąć do zbieżności, przemyj studzienki trzykrotnie PBS i dodaj 2 ml / studzienkę DMEM: F12 + 1x skoncentrowany suplement mitogenu i penicylinę (50 μg / ml) / streptomycynę (50 μg / ml), upewniając się, że ta pożywka jest wolna od FBS. Po 72 godzinach zebrać pożywkę kondycjonowaną przez węzły chłonne, rozlać, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>W razie potrzeby potwierdź fenotyp izolowanych komórek zrębu węzłów chłonnych (LNSC) za pomocą przeciwciał przeciwko mysim CD45 i gp38, stosując standardowe techniki cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej13.</li>
</ol>
6. Wykorzystanie pożywek narządowych do dalszych testów związanych z przerzutowym zachowaniem komórek rakowych
<ol>
	<li>Po wygenerowaniu pożywki kondycjonowanej przez narządy, jak opisano w krokach 1 - 5, użyj jej do przeprowadzenia różnych dalszych testów biologii komórkowej i molekularnej w celu określenia wpływu rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów na przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych. Przykłady standardowych testów (opisanych w innym miejscu w literaturze) obejmują macierze białkowe13, testy wzrostu komórkowego13, testy migracji komórkowej13, tworzenie guza14 i RT-PCR15. Jako kontrolę ujemną należy użyć oryginalnej pożywki bazowej używanej do wytwarzania pożywki kondycjonowanej przez narządy (tj. bezwarunkowej pożywki DMEM:F12 uzupełnionej 1x skoncentrowanym suplementem mitogenu i penicyliną (50 μg/ml)/streptomycyną (50 μg/ml).</li>
</ol>

<ol><li>Canadian Cancer Statistics. Canadian Cancer Society. , Toronto, ON. Available from: www.cancer.ca (2014).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2015.</a> CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).</li>
<li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organ+microenvironment+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">The organ microenvironment and cancer metastasis.</a> Differentiation. 70 (9-10), 498-505 (2002).</li>
<li>Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+growth+of+cancer+cells+in+metastatic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites.</a> Nat Rev Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> J Clin Oncol. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Ewing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoplastic+Diseases%3A+A+Treatise+on+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Neoplastic Diseases: A Treatise on Tumors.</a> Am J Med Sci. 176 (2), 278(1928).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast.+1889%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889.</a> Cancer Metastasis Rev. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Weiss, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comments+on+hematogenous+metastatic+patterns+in+humans+as+revealed+by+autopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Comments on hematogenous metastatic patterns in humans as revealed by autopsy.</a> Clin Exp Metastasis. 10 (3), 191-199 (1992).</li>
<li>Bos, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain.</a> Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).</li>
<li>Chu, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung-Derived+Factors+Mediate+Breast+Cancer+Cell+Migration+through+CD44+Receptor-Ligand+Interactions+in+a+Novel+Ex+Vivo+System+for+Analysis+of+Organ-Specific+Soluble+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lung-Derived Factors Mediate Breast Cancer Cell Migration through CD44 Receptor-Ligand Interactions in a Novel Ex Vivo System for Analysis of Organ-Specific Soluble Proteins.</a> Neoplasia. 16 (2), 180-IN127 (2014).</li>
<li>Pio, G., Piaseczny, M., Allan, A. The Role of Bone-Derived Osteopontin in the Migration and Stem-Like Behavior of Breast Cancer Cells. AACR. , 2015 (2015).</li>
<li>Deepak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+PCR%3A+Revolutionizing+Detection+and+Expression+Analysis+of+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Real-Time PCR: Revolutionizing Detection and Expression Analysis of Genes.</a> Curr Genomics. 8 (4), 234-251 (2007).</li>
<li>Hammerschmidt, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+mesenteric+lymph+node+cells+are+essential+for+the+generation+of+gut-homing+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Stromal mesenteric lymph node cells are essential for the generation of gut-homing T cells in vivo.</a> J Exp Med. 205 (11), 2483-2490 (2008).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Baddoo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+murine+bone+marrow+by+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection.</a> J Cell Biochem. 89 (6), 1235-1249 (2003).</li>
<li>Furger, K. A., Menon, R. K., Tuck, A. B., Bramwell, V. H., Chambers, A. F. The functional and clinical roles of osteopontin in cancer and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFurger%2C+KA+%22Curr+Mol+Med%22">Curr Mol Med</a>. 1 (5), 621-632 (2001).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+as+breast+cancer+drivers+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases as breast cancer drivers and therapeutic targets.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 20, 1144-1163 (2015).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-induced epithelial-mesenchymal transition in breast cancer.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 15 (2), 201-212 (2010).</li>
<li>Radisky, E. S., Radisky, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+induction+of+breast+cancer%3A+inflammation+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Endocr+Metab+Disord%22%5BJournal%5D)">Stromal induction of breast cancer: inflammation and invasion.</a> Rev Endocr Metab Disord. 8 (3), 279-287 (2007).</li>
<li>Kakinuma, T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines%2C+chemokine+receptors%2C+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokines, chemokine receptors, and cancer metastasis.</a> J Leukoc Biol. 79 (4), 639-651 (2006).</li>
<li>Zlotnik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Chemokines and cancer.</a> Int J Cancer. 119 (9), 2026-2029 (2006).</li>
<li>Schlesinger, M., Bendas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cell+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29--an+increasing+insight+into+its+role+in+tumorigenicity+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)--an increasing insight into its role in tumorigenicity and metastasis.</a> Int J Cancer. 136 (11), 2504-2514 (2015).</li>
<li>Cook, K. L., Shajahan, A. N., Clarke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+endocrine+resistance+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Anticancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Autophagy and endocrine resistance in breast cancer.</a> Expert Rev Anticancer Ther. 11 (8), 1283-1294 (2011).</li>
<li>Singh, P., Alex, J. M., Bast, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+%28IR%29+and+insulin-like+growth+factor+receptor+1+%28IGF-1R%29+signaling+systems%3A+novel+treatment+strategies+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF-1R) signaling systems: novel treatment strategies for cancer.</a> Med Oncol. 31 (1), 805(2014).</li>
<li>Lee, S. H., Jeong, D., Han, Y. S., Baek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+pathway+in+tumor+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Treat+Res%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of vascular endothelial growth factor pathway in tumor angiogenesis.</a> Ann Surg Treat Res. 89 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Erdmann, R. B., Gartner, J. G., Leonard, W. J., Ellison, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+functional+TSLP+receptors+mitigates+Th2+polarization+and+the+establishment+and+growth+of+4T1+primary+breast+tumours+but+has+different+effects+on+tumour+quantities+in+the+lung+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lack of functional TSLP receptors mitigates Th2 polarization and the establishment and growth of 4T1 primary breast tumours but has different effects on tumour quantities in the lung and brain.</a> Scand J Immunol. 78 (5), 408-418 (2013).</li>
<li>Chambers, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+tumor+metastasis%3A+new+concepts+from+intravital+videomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Steps in tumor metastasis: new concepts from intravital videomicroscopy.</a> Cancer Metastasis Rev. 14 (4), 279-301 (1995).</li>
<li>Chiang, A. C., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of metastasis.</a> N Engl J Med. 359 (26), 2814-2823 (2008).</li>
<li>Gupta, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+site-specific+metastasis+genes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Identifying site-specific metastasis genes and functions.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 70, 149-158 (2005).</li>
<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4195-4200 (2010).</li>
<li>Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+decellularized+lung+bioreactor+system+for+bioengineering+the+lung%3A+the+matrix+reloaded%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded.</a> Tissue Eng Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).</li>
<li>Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodelling+the+extracellular+matrix+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Remodelling the extracellular matrix in development and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (12), 786-801 (2014).</li>
<li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).</li>
<li>Psaila, B., Lyden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metastatic+niche%3A+adapting+the+foreign+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The metastatic niche: adapting the foreign soil.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 285-293 (2009).</li>
<li>Lee, R. H., Oh, J. Y., Choi, H., Bazhanov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+factors+secreted+by+mesenchymal+stromal+cells+and+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic factors secreted by mesenchymal stromal cells and tissue repair.</a> J Cell Biochem. 112 (11), 3073-3078 (2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Przerzuty to złożony proces, w którym seria zdarzeń komórkowych jest ostatecznie odpowiedzialna za inwazję tkanek i powstanie odległego guza4,30,31. Przedstawiony tutaj system modeli ex vivo może być wykorzystany do badania dwóch ważnych aspektów progresji przerzutów: naprowadzania komórek rakowych lub migracji do określonego narządu ("dotarcie tam") i wzrostu w tym narządzie ("dorastanie tam"). Wiele badań koncentrowało się wcześniej na identyfikacji kluczowych cech molekularnych związanych z samymi ...

Rak piersi jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u kobiet i drugą najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem1. Wysoka śmiertelność raka piersi wynika głównie z niepowodzenia konwencjonalnej terapii w łagodzeniu i eliminowaniu choroby przerzutowej; Około 90% zgonów związanych z rakiem jest spowodowanych przerzutami2. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw kaskady przerzutowej ma zasadnicze znaczenie dla opracowania skutecznych metod leczenia zarówno we wczesnym, jak i późnym stadium raka piersi.
Wcześniejsze badania pomogły wyjaśnić wieloetapową naturę przerzutów raka piersi i przypuszcza się, że wynik zarówno progresji raka, jak i przerzutów jest w dużej mierze zależny od interakcji między komórkami rakowymi a środowiskiem gospodarza3. Obserwacje kliniczne wskazują, że wiele nowotworów wykazuje tropizm narządowy, czyli skłonność do preferencyjnych przerzutów do określonych narządów. W przypadku raka piersi choroba pacjentki zwykle rozprzestrzenia się lub daje przerzuty do 5 głównych miejsc, w tym do kości, płuc, węzłów chłonnych, wątroby i mózgu4-6. Opracowano wiele teorii wyjaśniających ten proces, ale tylko kilka przetrwało próbę czasu. Teoria przerzutów Ewinga, zaproponowana w latach dwudziestych XX wieku, stawiała hipotezę, że rozkład przerzutów był ściśle spowodowany czynnikami mechanicznymi; w wyniku czego komórki nowotworowe są przenoszone po całym ciele przez normalnie zdefiniowane fizjologiczne wzorce przepływu krwi i po prostu zatrzymują się wpierwszym łożysku naczyń włosowatych, z którymi się zetkną7. W przeciwieństwie do tego, hipoteza Stephena Pageta z 1889 roku "ziarno i gleba" sugerowała, że dodatkowe interakcje molekularne są odpowiedzialne za przetrwanie i wzrost przerzutów, przy czym komórki rakowe ("nasiona") mogą się osiedlić i namnażać tylko w mikrośrodowiskach narządowych, które wytwarzają odpowiednie czynniki molekularne ("gleba")8. Prawie sto lat później Leonard Weiss podjął metaanalizę wcześniej opublikowanych danych z autopsji i potwierdził przewidywania Ewinga, że wiele guzów przerzutowych wykrytych w czasie autopsji stwierdzono w przewidywanych proporcjach, których można by się spodziewać, gdyby tropizm narządów przerzutowych był determinowany wyłącznie przez wzorce przepływu krwi. Jednak w wielu przypadkach w niektórych miejscach powstało mniej lub więcej przerzutów, niż można by się spodziewać po proponowanych przez Ewinga czynnikach mechanicznych9. Te opisy i teorie sugerują, że określone mikrośrodowiska narządowe odgrywają kluczową rolę we wzorcach rozprzestrzeniania się, a następnie wzroście i przeżywalności wielu nowotworów, w tym raka piersi.
Wcześniejsze wysiłki badawcze koncentrowały się głównie na czynnikach pochodnych komórek nowotworowych i ich udziale w tropizmie narządów obserwowanym w przerzutach raka piersi10-12, jednak niewiele badań dotyczyło czynników pochodzących z mikrośrodowiska narządu, które mogłyby stanowić korzystną niszę dla tworzenia przerzutów raka piersi. Jest to w dużej mierze związane z wyzwaniami technicznymi związanymi z badaniem składników mikrośrodowiska narządów in vitro. 
Obecny artykuł opisuje kompleksowy system modelowy ex vivo do badania wpływu rozpuszczalnych składników węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgu na przerzutowe zachowanie ludzkich komórek raka piersi. Wcześniejsze badania potwierdziły ten system modelowy, wykazując, że różne linie komórkowe raka piersi wykazują złośliwe zachowanie specyficzne dla linii komórkowej i narządu w odpowiedzi na pożywki kondycjonowane przez narządy, które odpowiadająich potencjałowi przerzutowemu in vivo. Ten system modelowy może być wykorzystany do identyfikacji i oceny określonych rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów, które mogą odgrywać rolę w przerzutowym zachowaniu komórek piersi i innych typów komórek rakowych, w tym wpływu na wzrost, migrację, zachowanie podobne do łodygi i ekspresję genów, a także identyfikacji potencjalnych nowych celów terapeutycznych dla raka. Jest to pierwszy system modelowy ex vivo, który można wykorzystać do szczegółowego badania specyficznych dla narządów zachowań przerzutowych oraz do oceny roli rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów w napędzaniu procesu przerzutów nowotworowych.

<table><tbody><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>Utrzymuj sterylność</td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>Utrzymuj sterylność</td></tr><tr><td>Nagie myszy</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>Stosować w wieku 6 - 12 tygodni</td></tr><tr><td>Podkładka z pianki polistyrenowej</td><td>N/A</td> N<td>/A N/A</td><td>Do tego celu można użyć wyrzuconej pokrywki (~ 4 x 8 cali lub większej) pojemnika transportowego z pianki polistyrenowej. Sterylizować, wycierając etanolem.</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Utrzymuj sterylność</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>Utrzymuj sterylne</td></tr><tr><td>gaziki</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>Utrzymuj sterylne</td></tr><tr><td>60 mm2 szklane szalki Petriego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td><td>Utrzymuj sterylność</td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>Utrzymuj sterylność</td></tr><tr><td>DMEM: F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem, zachowaj sterylność&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>Określany w manuskrypcie jako "skoncentrowany suplement mitogenu". Utrzymuj sterylną</td></tr><tr><td>penicylinę-streptomycynę (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>Utrzymuj sterylność</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem, zachowaj sterylność&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>Utrzymuj sterylny</td></tr><tr><td>roztwór trypsyny/EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>Ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem, zachowaj sterylność&nbsp;</td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>Przechowywać w sterylnych</td></tr><tr><td>proporcjach 0,22 &mu; m filtry strzykawkowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>Keep sterylne</td></tr><tr><td>kolby do hodowli tkanek T75</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>Zachowaj sterylność</td></tr><tr><td>Transwells</td><td>Sigma-Aldrich CLS3464</td><td></td><td>Zachowaj sterylność, używaj do testów migracji</td></tr><tr><td>Anty-mysie Sca-1</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB1226P</td><td>użyciu przy 10 i mikro; l/106 ogniwa</td></tr><tr><td>anty-mysie CD105</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB1320P</td><td>użyciu przy 10 i mikro; l/106 ogniwa</td></tr><tr><td>anty-mysie CD29</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB2405P-025</td><td>zastosowanie przy 10 &mikro; l/106 ogniwa</td></tr><tr><td>anty-mysie CD73</td><td>R& Systemy D</td><td>FAB4488P</td><td>użycia przy 10 &mikro; l/106 ogniwa</td></tr><tr><td>anty-mysie CD44</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB6127-SP</td><td>używają przy 0,25 &mikro; g/106 komórki</td></tr><tr><td>anty-mysie CD45</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>stosować przy 5 &mikro; l/106 komórki</td></tr><tr><td>Anty-mysie gp38</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>zastosowanie przy 10 &mikro; L/106 komórek</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&nbsp;</td><td>Utrzymuj sterylność</td></tr><tr><td>Macierze białkowe</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>Użyj 1 tablicy na warunki pożywki (w tym kontrolę ujemną), w trzech egzemplarzach</td></tr></tbody></table>

generowanie pożywek narządowych i aplikacje do badania specyficznych dla narządów wpływów na zachowanie przerzutowe raka piersi

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Rak piersi preferencyjnie daje przerzuty do węzłów chłonnych, kości, płuc, mózgu i wątroby u pacjentów z rakiem piersi. Wcześniejsze wysiłki badawcze koncentrowały się na identyfikacji czynników nieodłącznie związanych z komórkami raka piersi, które są odpowiedzialne za ten obserwowany wzorzec przerzutów (określany jako tropizm narządowy), jednak znacznie mniej wiadomo o czynnikach obecnych w określonych narządach, które przyczyniają się do tego procesu. Wynika to po części z braku systemów modelowych in vitro, które dokładnie odwzorowują mikrośrodowisko narządów. Aby rozwiązać ten problem, stworzono system modelowy ex vivo, który umożliwia badanie rozpuszczalnych czynników obecnych w różnych mikrośrodowiskach narządów. Model ten polega na generowaniu kondycjonowanych pożywek z narządów (węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgu) wyizolowanych od normalnych nagich myszy atymicznych. System modelowy został zwalidowany poprzez wykazanie, że różne linie komórkowe raka piersi wykazują złośliwe zachowanie specyficzne dla linii komórkowej i narządu w odpowiedzi na pożywki kondycjonowane przez narządy, które odpowiadają ich potencjałowi przerzutowemu in vivo. Ten system modelowy może być wykorzystany do identyfikacji i oceny określonych rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów, które mogą odgrywać rolę w przerzutowym zachowaniu komórek piersi i innych typów komórek rakowych, w tym wpływu na wzrost, migrację, zachowanie podobne do łodygi i ekspresję genów, a także identyfikacji potencjalnych nowych celów terapeutycznych dla raka. Jest to pierwszy system modelowy ex vivo, który można wykorzystać do szczegółowego badania specyficznych dla narządów zachowań przerzutowych i oceny roli określonych czynników rozpuszczalnych pochodzących z narządów w napędzaniu procesu przerzutów raka.

Przygotowanie pożywki warunkowanej przez organy
Ogólny schemat procesu izolacji organów i otrzymywania pożywek warunkowanych przedstawiono na Rysunku 1, a reprezentatywne zdjęcia z przebiegu procedury ukazano na Rysunku 2. Należy zauważyć, że podczas początkowego opracowywania tego protokołu w analizie uwzględniono wątrobę, ponieważ jest ona częstym miejscem przerzutów raka pier...

Ten manuskrypt opisuje model ex vivo składający się z narządowych pożywek pochodzących z węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgu myszy. Ten system modelowy może być wykorzystany do identyfikacji i badania rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów oraz ich wpływu na tropizm narządów i przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych.

Generowanie pożywek narządowych i aplikacje do badania specyficznych dla narządów wpływów na zachowanie przerzutowe raka piersi

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie pożywek warunkowanych z wykorzystaniem węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgów myszy w celu zidentyfikowania i zbadania rozpuszczalnych czynników pochodzenia organowego oraz ich wpływu na zachowanie przerzutne komórek nowotworowych. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przerzutów, takie jak: w jaki sposób czynniki specyficzne dla danego organu wpływają na wzrost, migrację i ekspresję genów komórek nowotworowych? Technika ta zapewnia prostą platformę ex vivo, reprezentatywną dla specyficznych dla organów rozpuszczalnych czynników in vivo, które wpływają na fenotyp i zachowanie komórek nowotworowych.Aby wyizolować węzły chłonne, należy umieścić mysz w wieku od sześciu do dwunastu tygodni na styropianowej podkładce w sterylnej komorze do hodowli tkanek, a następnie unieruchomić kończyny w pozycji wyprostowanej. Następnie za pomocą pęsety i nożyczek wykonać nacięcie w linii środkowej skóry brzusznej, od narządów płciowych w kierunku pyska. Po tym delikatnie oddzielić skórę od mięśni brzucha i przymocować ją szpilkami do podkładki sekcyjnej.Używając nożyczek, ostrożnie oddziel węzły chłonne od skóry, tkanki tłuszczowej i naczyń, umieszczając je w 30 mililitrach lodowatego PBS na bieżąco podczas pobierania. Po zebraniu wszystkich węzłów chłonnych, za pomocą pęsety i nożyczek ostrożnie przetnij odsłoniętą ścianę brzucha ruchem w górę w kierunku mostka, odsłaniając jamę klatki piersiowej. Przetnij przeponę.Podnieś płuca od spodu i przetnij tkankę podścielającą w kierunku tchawicy. Następnie przenieś płuca do nowego naczynia z lodowatym PBS. Serce można usunąć z płuc na tym etapie lub przed ważeniem organów.Aby pobrać kości kończyn dolnych, należy ułożyć mysz w pozycji brzusznej i rozciąć skórę w obrębie dolnego odcinka pleców od jednego boku do drugiego. Następnie, używając sterylnego kawałka gazy, należy uchwycić tułów oraz skórę pokrywającą nogi i stopy. Korzystając z tego samego kawałka gazy, należy przytrzymać dolną część nogi, ostrożnie złamać staw skokowy jednej stopy, a następnie odsunąć skórę nad stawem proksymalnie w kierunku kolana.Następnie, za pomocą nożyczek, oddziel kość piszczelową od stawu kolanowego i umieść kość kończyny w lodowatym PBS. Po pobraniu drugiej kości piszczelowej, przytrzymaj kość udową pęsetą i za pomocą nożyczek odetnij otaczającą tkankę mięśniową. Następnie umieść kość kończyny w lodowatym PBS.Aby pobrać mózg, należy użyć nowego kawałka sterylnej gazy do uchwycenia głowy, a następnie delikatnie usunąć skórę za pomocą nożyczek i pęsety, aby odsłonić czaszkę. Następnie za pomocą nożyczek należy ostrożnie wyciąć kość potyliczną od górnej części środkowej czaszki, prowadząc linię prosto w dół, aby odsłonić tylną część mózgu. Następnie, podbierając tkankę w kierunku przedniej części czaszki, należy przenieść cały mózg do lodowatego PBS.Aby przygotować pożywkę kondycjonowaną przez płuca, należy trzykrotnie odwrócić probówki z tkanką płucną, aby usunąć z organów pozostałości krwi. Następnie należy zastąpić płyn do płukania świeżym zimnym PBS i powtarzać tę czynność, aż sól fizjologiczna będzie wolna od krwi. Następnie płuca należy przenieść do szklanych szalek Petriego o wymiarach 60 mm² (jedna szalka na mysz) i za pomocą dwóch sterylnych ostrzy skalpela rozdrobić tkanki poprzez powtarzające się ruchy tnące w przód i w tył.Gdy fragmenty tkanki osiągną rozmiar około jednego milimetra sześciennego, zawiesić kawałki w odpowiedniej objętości pożywki DMEM:F12 uzupełnionej o antybiotyki i inkubować tkanki w jednej studzience płytki sześciodołkowej na jedną mysz w temperaturze 37 °C i przy pięciu procentach CO2. Po 24 godzinach przenieść całą zawartość każdej studzienki do oddzielnych stożkowych probówek o pojemności 50 mL i rozcieńczyć warunkowaną pożywkę trzykrotnie objętością świeżej pożywki DMEM:F12 w każdej probówce. Odwirować probówki, aby usunąć wszelkie duże fragmenty resztek tkankowych.Następnie połącz kondycjonowane media, przepuszczając je przez filtr strzykawkowy 0,22 µm do jednej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Aby przygotować kondycjonowane medium z szpiku kostnego, przenieś kości pod sterylną komorę do hodowli tkanek i odetnij nadmiar tkanki z kości. Za pomocą nożyczek usuń nasady.Następnie, używając igły o rozmiarze 27,5 G, przepłucz każdą jamę szpikową kości 1 ml PBS do probówki zawierającej świeży PBS. Po zebraniu wszystkich mezenchymalnych komórek szpiku kostnego, przemyj komórki trzykrotnie w PBS. Po ostatnim przemyciu resuspenduj osad w 20 ml pożywki do hodowli komórek macierzystych szpiku kostnego z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej i zaszczep 10 ml zawiesiny komórkowej na każdą kolbę T75.Gdy komórki osiągną około 70% konfluencji, przemyj hodowle dwukrotnie trzema mililitrami PBS. Następnie odklej komórki za pomocą trzech mililitrów 0,025% roztworu trypsyny/EDTA, dbając o to, aby trypsyna pokryła całą powierzchnię kolby. Po dwóch do trzech minutach przerwij reakcję enzymatyczną, dodając trzy mililitry pożywki do wzrostu komórek macierzystych szpiku kostnego, a następnie przenieś komórki do probówki o pojemności 50 mililitrów.Odwirować komórki. Następnie zawiesinę w osadzie resuspender w 10 mililitrach świeżej pożywki. Przenieść hodowle w stosunku jeden do pięciu do trzech nowych kolb T75 i inkubować do momentu osiągnięcia 70% konfluencji.Następnie trzy razy przemyj komórki buforem PBS, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, i dostarcz do kultur bezserumowe medium do hodowli komórek zrębowych kości, uzupełnione o mitogen i antybiotyki, na okres 72 godzin. Po trzecim dniu hodowli zbierz pożywki, przeciskując je przez sito o oczkach 0,22 mikrona. Komórki zrębowe powinny przylegać do podłoża w hodowli; w kulturach komórek zrębowych węzłów chłonnych powinna być obserwowana morfologia wydłużona i fibroblastyczna, natomiast w kulturach komórek zrębowych szpiku kostnego morfologia powinna być mniejsza i bardziej zaokrąglona.Analiza cytometryczna przepływowa potwierdza, że komórki zrębu węzłów chłonnych są w przeważającej mierze CD45 negatywne i gp38 pozytywne. Komórki zrębu szpiku kostnego powinny być pozytywne dla CD-44 i CD-29, słabo pozytywne dla CD-105 i Sca-1 oraz negatywne dla CD-73. Komórki raka piersi u ludzi o różnych podłożach genetycznych wykazują zróżnicowane wzorce migracji i wzrostu w zależności od specyficznych warunków organu.Na przykład w tym reprezentatywnym eksperymencie wariant 231-BoM, wykazujący powinowactwo do kości, migruje preferencyjnie do pożywki kondycjonowanej szpikiem kostnym, w porównaniu z pożywkami kondycjonowanymi mózgiem i płucami. Analogicznie, wariant 231-LM2, wykazujący powinowactwo do płuc, migruje preferencyjnie do pożywki kondycjonowanej płucami, w porównaniu z pożywkami kondycjonowanymi szpikiem kostnym i mózgiem. Ponadto analiza RT-qPCR wykazuje, że ekspozycja macierzystych komórek raka piersi MDA-MB-231 na pożywkę kondycjonowaną kością lub płucami indukuje nadekspresję genów związanych z przerzutami komórek raka piersi specyficznymi dla kości lub płuc in vivo.Po opanowaniu techniki, pobieranie tkanek oraz przygotowanie pożywki warunkującej mogą zostać ukończone w ciągu dwóch do trzech godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia prac. Kroki dotyczące pasażowania w kolejne dni zajmują od 15 do 30 minut dziennie. Podczas wykonywania tych procedur należy pamiętać o zachowaniu pełnej sterylności.Po przygotowaniu pożywki warunkującej można przeprowadzić inne metody, takie jak analizy macierzy białkowych, testy wzrostu i migracji komórek, badanie tworzenia sfer nowotworowych (tumorspheres) oraz RT-PCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu czynników specyficznych dla organów na zachowanie komórek nowotworowych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się rakiem piersi do analizy specyficznego dla organów zachowania przerzutowego w systemie modelowym ex vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować pożywki warunkujące z wykorzystaniem kości, płuc i mózgów myszy.Należy pamiętać, że praca z ostrymi narzędziami do sekcji może być niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie precyzyjnej i uważnej techniki sekcyjnej.

generation-organ-conditioned-media-applications-for-studying-organ

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje metodę generowania pożywki kondycjonowanej przez narządy pochodzącej z wątroby myszy. Ten system modelowy może być wykorzystany do identyfikacji i badania rozpuszczalnych czynników pochodzących z narządów oraz ich wpływu na tropizm narządów i przerzutowe zachowanie komórek nowotworowych.

Pożywka kondycjonowana narządowo: Generowanie pożywki z pobranych komórek narządów do badań nad rakiem z przerzutami

Pierwotna hodowla komórkowa przy użyciu nienaruszonych organoidów tkankowych dostarcza systemu modelowego, który naśladuje wielokomórkowe mikrośrodowisko in vivo. Opracowaliśmy model hodowli pierwotnej tkanki nabłonka piersi bez surowicy, który utrwala mieszane linie hodowli komórkowych i wykazuje zróżnicowaną morfologię, bez enzymatycznego rozerwania tkanki. Organoidy piersi zachowują żywotność przez &gt;6 miesięcy.

Nieenzymatyczna, pozbawiona surowicy hodowla tkankowa przedinwazyjnych zmian piersi do spontanicznego wytwarzania mammosfery

Opisano protokoły do badania migracji, proliferacji i kolonizacji komórek raka piersi w systemie modelowym eksplantacji ludzkiej tkanki kostnej.

Metody hodowli eksplantatów ludzkiej tkanki udowej w celu zbadania kolonizacji komórek raka piersi w niszy przerzutowej

Organoidy powstałe z mysich gruczołów sutkowych zostały napromieniowane i scharakteryzowane w celu oceny cech nabłonka i interakcji z komórkami odpornościowymi. Napromieniowane organoidy można wykorzystać do lepszej oceny interakcji komórka-komórka, które mogą prowadzić do rekrutacji komórek nowotworowych w napromieniowanej normalnej tkance.

Wzrost i charakterystyka napromieniowanych organoidów z gruczołów sutkowych

Pokazujemy metodę sekcji zwłok i sekcji mysich modeli raka prostaty, skupiając się na sekcji guza prostaty. Przedstawiono również protokół krok po kroku generowania organoidów guza gruczołu krokowego u myszy.

Generowanie organoidów nowotworowych z genetycznie modyfikowanych mysich modeli raka prostaty

Przedstawiono protokół generowania ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych, które składają się z komórek nabłonkowych i zrębowych oraz zachowują cechy natywnej tkanki endometrium. Protokół ten opisuje metody od pozyskania tkanki macicy do histologicznego przetwarzania organoidów endometrialnych.

Wytwarzanie wielokomórkowych ludzkich pierwotnych organoidów endometrialnych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Szczegółowy protokół jest tutaj podany do ustalania ludzkich organoidów piersi na podstawie resekcji guza piersi pochodzących od pacjenta lub normalnej tkanki piersi. Protokół zawiera kompleksowe instrukcje krok po kroku dotyczące hodowli, zamrażania i rozmrażania organoidów piersi pochodzących od ludzkich pacjentów.

Tworzenie i hodowla organoidów piersi pochodzących od pacjentów

Poznaj metodę generowania pożywek narządowych z węzłów chłonnych, kości, płuc i mózgu myszy do badania czynników rozpuszczalnych wpływających na zachowanie przerzutowe komórek raka piersi.

Generowanie pożywek narządowych i aplikacje do badania specyficznych dla narządów wpływów na zachowanie przerzutowe raka piersi

Przeglądaj więcej filmów