Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie metody wytwarzania guzów przerzutowych u sześciu czarnych myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunoterapii, takie jak wpływ środków badawczych na odpowiedź immunologiczną w płucach. Główną zaletą tej techniki jest to, że daje ona przerzuty eksperymentalne.

Tak więc wyniki są wiarygodne i stosunkowo spójne. Na początek umieść hodowle komórek czerniaka B16-BL6, które powinny mieć około 70% zbieżności, w sterylnym kapturze. Następnie dodaj jeden mililitr 05% trypsyny EDTA do każdego naczynia i pozostaw komórki na jedną minutę.

Po zaessaniu tego roztworu należy dodać jeden mililitr trypsyny do każdej płytki, a następnie wrzucić komórki z powrotem do inkubatora. Po 10 minutach przenieś komórki do sterylnego kaptura i dodaj cztery mililitry pożywki RPMI bez surowicy do każdej płytki. Następnie zbierz komórki za pomocą sterylnej pipety z napędem elektrycznym.

Aby rozbić grudki, które mogłyby potencjalnie zatkać igłę wyrzutową, należy przycisnąć końcówkę pipety do dna płytki i usunąć komórki. Po kilkukrotnym powtórzeniu tego procesu zbierz komórki i przenieś je do stożkowej rurki o średnicy 15 militerów. Następnie usuń próbkę zawiesiny komórek, wprowadź ją do hemocytometru i określ gęstość komórek.

Równomiernie przydziel zawiesinę komórek do czterech 15-mililitrowych probówek. Następnie odwirować probówki, a następnie zdekantować supernatant. Kontynuuj oznaczanie każdej z probówek inną gęstością komórek - 0, 0,063, 0,125, 0,25 lub 0,5 miliona komórek na mililitr.

Następnie dodaj odpowiednią objętość RPMI wolnego od surowicy do każdego stożka, aby uzyskać te końcowe stężenia. Potwierdź żądaną gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Następnie przydziel 500 mikrolitrów każdej zawiesiny do oznaczonych 1,8 mililitrowych probówek umieszczonych na lodzie.

Po przygotowaniu wszystkich zawiesin komórek B16-BL6 wybierz mysz. Trzymając go za ogon, poprowadź zwierzę z tyłu do ogranicznika. Gdy tułów myszy znajdzie się w komorze głównej, a jej ogon na zewnątrz aparatu, przystąp do ciągnięcia zwierzęcia w kierunku końca krępowania.

Następnie włóż tłok ograniczający i kontynuuj naciskanie tłoka, aż mysz zostanie zabezpieczona. Gdy zwierzę znajdzie się na miejscu, obróć mysz o 90 stopni tak, aby jedna z bocznych żył ogonowych była skierowana do góry. Następnie użyj wacika nasączonego alkoholem, aby energicznie oczyścić stronę ogona myszy, w której żyła jest najbardziej widoczna.

Aby przygotować się do wstrzyknięcia, należy najpierw zebrać 300 mikrolitrów z 0,5 miliona komórek na mililitr zawiesiny do strzykawki. Następnie wysuń bąbelki ze strzykawki, odwracając ją, przesuwając na bok i naciskając tłok. Po usunięciu pęcherzyków należy wyrzucić hodowlę komórkową, aby uzyskać ostateczną objętość 250 mikrolitrów w strzykawce.

Kontynuuj rozciąganie ogona myszy ręką niedominującą. Przytrzymaj go tak, aby palec wskazujący uniósł bliższy koniec ogona, a kciuk wcisnął dystalną część. Ręką dominującą wbij igłę do żyły w kierunku dystalnego końca ogona pod niewielkim kątem w dół.

Następnie włóż igłę dalej, regulując ją tak, aby pasowała do kąta żyły ogonowej. Po wprowadzeniu igły na około jeden centymetr do żyły ogonowej, należy rozpocząć wciskanie tłoka, trzymając strzykawkę stabilnie. Zatamować krwawienie, przytrzymując gazę przy miejscu wejścia.

Po wyrzuceniu zawiesiny komórkowej należy wyjąć igłę z żyły i wyrzucić ją. Następnie wyjmij tłok z ogranicznika i umieść mysz w klatce odbiorczej. Protokół ten miał na celu zidentyfikowanie optymalnej liczby komórek B16-BL6 do wstrzyknięcia w celu stworzenia użytecznego modelu czerniaka z przerzutami.

Pokazane tutaj są ogniska eksperymentalne oznaczone strzałkami utworzonymi w płucach dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu pięciu różnych gęstości komórek. Po wstrzyknięciu 500 000 komórek na mililitr, ogniska całkowicie pokryły płuca. W pokazanym tutaj przykładzie policzono 102 ogniska.

W przeciwieństwie do tego, płuca były słabo pokryte ogniskami tylko wtedy, gdy wstrzyknięto 62 500 komórek na mililitr lub 125 000 komórek na mililitr. Odpowiednio gęstości te powodowały liczbę ognisk w płucach od 1 do 17. Za pomocą tej metody określono, że optymalne stężenie komórek do wstrzyknięcia wynosi 250 000 komórek na mililitr.

Gęstość ta spowodowała, że płuca miały około 65 ognisk, przy liczbie, przy której narządy nie były ani całkowicie pokryte, ani zbyt słabo pokryte ogniskami. Dalsze wyliczenie tych danych na wykresie pokazuje w przybliżeniu liniową zależność między ogniskami płuc a gęstością hodowli komórek powyżej 125 000 komórek na mililitr, jak pokazano tutaj. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w mniej niż godzinę, liczba myszy zależy od tego, czy zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas próby zabiegu ważne jest, aby pamiętać, aby spróbować wstrzyknąć równoważną liczbę komórek na mysz. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak dostarczanie leków, aby odpowiedzieć na pytania, jak potencjalne terapie wpływają na wiele powstałych ognisk. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom nowotworów do zbadania składników przerzutowego raka w czerniaku u czarnych sześciu myszy.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać i przygotowywać komórki B16-BL6, krępować myszy, przygotowywać igły i wstrzykiwać równoważną liczbę komórek do każdej żyły ogonowej. Nie zapominaj, że praca z hodowlą ssaków i igłami może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy podjąć środki ostrożności, takie jak unikanie ukłuć igłą i noszenie sprzętu ochronnego.