Name: Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia komórek czerniaka B16-BL6 do żyły ogonowej myszy w celu modelowania przerzutów do płuc. Technika ta umożliwia badanie immunoterapii i ocenę leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Częściowo wspierane przez grant National Cancer Institute 1R03CA172923.

Oświadczenie etyczne: Wykorzystanie myszy w badaniach naukowych jest dopuszczalne tylko w przypadkach, gdy może to przyczynić się do lepszego zrozumienia podstaw biologii lub w kierunku ostatecznego leczenia choroby.
1. Zamawianie
<ol>
	<li>Kup samice myszy C57BL/6 (w wieku 6 - 8 tygodni), 5 myszy na grupę. Odczekaj kilka dni, aż myszy się przystosują.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek B16-BL6
<ol>
	<li>Wyjmij płytki do hodowli komórkowych z inkubatora pod kątem 37 stopni i umieść w sterylnym kapturze. Płytki powinny być w około 70% zlewane z komórkami czerniaka myszy B16-BL6. Większa konfluencja może zmienić potencjał przerzutowy komórek.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA na płytkę, odstaw na 1 minutę, a następnie odessaj roztwór pożywki trypsynowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny na płytkę i włożyć płytki z powrotem do inkubatora na 10 minut.</li>
	<li>Po przeniesieniu płytek z inkubatora do sterylnego kaptura, dodaj 4 ml pożywki Rosewell Park Memorial Institute Medium (RPMI) bez surowicy do każdej płytki.</li>
	<li>Zbierz komórki za pomocą sterylnej, zmotoryzowanej pipety. Wysuń komórki na spód płytki, z końcówką dociśniętą pod bardzo niewielkim kątem, aby rozbić komórki. Powtórz kilka razy, aby zapewnić odpowiednie oddzielenie grudek komórek, które w przeciwnym razie mogłyby zatkać igłę wyrzutową. Zebrać i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Użyj hemocytometru, aby określić gęstość komórek. Utrzymując stałą całkowitą liczbę komórek B16-BL6, określ objętość RPMI bez surowicy potrzebną do osiągnięcia końcowych stężeń 0, 0,065, 0,015, 0,25 i 0,5 miliona komórek/ml.</li>
	<li>Równomiernie podzielić pożywkę w probówce o pojemności 50 ml na probówki stożkowe o pojemności 15 ml. Odwirować stożkowe probówki o masie 2 250 x g przez 5 minut. Zdekantować media. Dodaj odpowiednią objętość RPMI bez surowicy i potwierdź pożądaną gęstość komórek za pomocą hemacytometru. Dostosuj gęstości - dodając dodatkowe RPMI lub obracając i ponownie zawieszając w mniejszej objętości - odpowiednio.</li>
	<li>Porcję 500 μl każdej zawiesiny komórkowej rozlać do oznakowanych probówek o pojemności 1,8 ml na lodzie.</li>
</ol>
3. Iniekcja żyły ogonowej
<ol>
	<li>Weź mysz trzymaną za ogon i poprowadź ją tyłem do przodu do ogranicznika myszy. Trzymając tułów w głównej komorze respektu, z ogonem na zewnątrz, pociągnij mysz w kierunku końca ogranicznika. Włóż tłok ograniczający, kontynuując naciskanie, aż mysz zostanie zabezpieczona.</li>
	<li>Obróć mysz o 90 stopni tak, aby jedna z bocznych żył ogonowych była skierowana do góry. Za pomocą wacika nasączonego alkoholem energicznie wyczyść bok ogona myszy, szczególnie w miejscu, gdzie żyła ogonowa jest najbardziej widoczna. 
	Uwaga: Dobre oświetlenie jest niezbędne do efektywnej wizualizacji żył ogonowych na myszach B57BL/6J. Lampy grzewcze lub podgrzewane podkładki chirurgiczne, choć nie są konieczne, pomogą również zwiększyć objętość żyły ogonowej.</li>
	<li>W sterylnym kapturze hodowlanym zebrać 300 μl pożywki do hodowli komórkowych z probówki o pojemności 2 milionów komórek/ml. Odwrócić igłę, przesuwając bok i naciskając tłok, aby usunąć pęcherzyki ze strzykawki. Wysunąć kulturę-RPMI, aby uzyskać końcową objętość 250 μl.</li>
	<li>Wyprostuj ogon myszy ręką niedominującą. Trzymaj ogon z bliższym końcem ogona uniesionym palcem wskazującym ręki niedominującej, a dystalną częścią ogona wciśniętą kciukiem. 
	Uwaga: W ten sposób żyła ogonowa jest utrzymywana w pozycji bocznej, równolegle do powierzchni ograniczającej, z możliwością przystającego wejścia w bardziej dystalną część ogona.</li>
	<li>Wprowadzić igłę do żyły ogonowej, w kierunku dystalnego końca, pod minimalnym kątem w dół, a następnie wyregulować igłę tak, aby dopasować ją do kąta żyły ogonowej po dalszym wprowadzaniu (obniżając koniec tłoka strzykawki względem igły).</li>
	<li>Wbić igłę na około 1 cm do żyły ogonowej. Po włożeniu należy rozpocząć wciskanie tłoka, trzymając igłę stabilnie. 
	Uwaga: Jeśli igła znajduje się w żyle ogonowej, a koniec igły nie jest zatkany, pożywka powinna bez przeszkód przepływać do żyły. Skuteczne wstrzyknięcie charakteryzuje się usuwaniem krwi z żyły. Jeśli występuje opór lub w miejscu wstrzyknięcia zaczyna tworzyć się pęcherzyk, należy usunąć igłę i spróbować ponownie w miejscu bliższym wzdłuż żyły ogonowej. </li>
	<li>Wyjąć igłę z żyły i wyrzucić ją. Przyłóż gazę do miejsca wprowadzenia, aby zatamować krwawienie.</li>
	<li>Wyjąć tłok z ogranicznika i umieścić mysz w klatce odbiorcy.</li>
	<li>Powtórz dla wszystkich pozostałych stężeń. 
	Uwaga: Tworzenie ognisk płucnych trwa około 2 - 3 tygodni, przy czym zmienność zależy od linii komórkowej i pożądanej wielkości ognisk. 9 W międzyczasie myszy powinny być monitorowane pod kątem objawów, które mogłyby uzasadniać wczesną eutanazję, takich jak nadmierne dyszenie. </li>
</ol>
4. Liczenie ognisk płucnych
<ol>
	<li>Poddaj mysz eutanazji, umieszczając ją w komorze CO2 i wystawiając na działanie 100% CO2 wprowadzanego w tempie 10-30% objętości komory na minutę przez 5 minut. Następnie nastąpi zwichnięcie szyjki macicy. </li>
	<li>Rozłóż mysz na styropianie. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj chirurgiczne nacięcie wzdłuż mostka.</li>
	<li>Wykonaj dwa dodatkowe nacięcia, zarówno od góry nacięcia mostka, jak i rozgałęziając się w kierunku ramion myszy, odsłaniając klatkę piersiową.</li>
	<li>Wykonaj dwa cięcia, każde wzdłuż bocznych boków mostka, aby usunąć klatkę piersiową z tułowia, odsłaniając płuca i serce.</li>
	<li>Trzymając serce pęsetą chirurgiczną, przetnij przełyk i tchawicę, uwalniając serce i płuca od myszy. Umieść pod mikroskopem preparacyjnym przy 10-krotnym powiększeniu, aby uzyskać lepszą wizualizację.</li>
	<li>Wypreparuj serce z płuc i usuń grasicę, pozostawiając tylko dwa płuca.</li>
	<li>Mając płuca pod lunetą sekcyjną, zacznij liczyć ogniska płuc. Każde ognisko powinno pojawić się jako okrągły, brązowy wytrutek na powierzchni płuc.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać spójność między myszami, policz liczbę ognisk na powierzchni płata, a następnie odwróć ten płat. Wykonanie każdego z czterech płatów osobno pozwala na łatwiejsze liczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zachowaj i napraw płuca podczas wykonywania IHC, w przeciwnym razie wyrzuć resztki.</li>
</ol>

<ol><li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+interactions+with+the+extracellular+matrix+during+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis.</a> Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).</li>
<li>Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease.</a> Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
<li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+iimmunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape.</a> Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).</li>
<li>Hugo, H., Ackland, M. L., Blick, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+and+mesenchymal-epithelial+transition+in+carcinoma+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal and mesenchymal-epithelial transition in carcinoma progression.</a> J Cell Physiol. 213, 374-383 (2007).</li>
<li>Kang, Y., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions%3A+Twist+in+development+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions: Twist in development and metastasis.</a> Cell. 118, 277-279 (2004).</li>
<li>Hodi, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+Ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22NEJM%22%5BJournal%5D)">Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).</li>
<li>Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+health+burden+and+economic+costs+of+cutaneous+melanoma+motality+by+race%2Fethnicity-United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).</li>
<li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+review%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor.+Bio.Volume%22%5BJournal%5D)">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).</li>
<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+metastasis+predetermined%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Is metastasis predetermined.</a> Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).</li>
<li>Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+differentially+expressed+in+B16+murine+melanoma+sublines+with+different+metastatic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials.</a> Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).</li>
<li>Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406, 532-535 (2000).</li>
<li>Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metastasis.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).</li>
<li>Elkin, M., Vlodavsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail+vein+assay+of+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tail vein assay of cancer metastasis.</a> Curr Protoc in Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.2 (2001).</li>
<li>Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+degradation+of+basement+membranes+and+extracellular+matrix+and+their+regulation+by+TGF-beta+in+invasive+carcinomas+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review).</a> Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).</li>
<li>Hart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selection+and+characterization+of+an+invasive+variant+of+the+B16+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma.</a> Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).</li>
<li>Overwijk, W. W., Restifo, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N.P.+B16+as+a+Mouse+Model+for+Human+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma.</a> Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Krążące komórki nowotworowe z wstrzyknięcia żyły ogonowej reprezentują przerzuty, które unikają miejsc pierwotnego wzrostu i migrują drogami, takimi jak krwiobieg lub układ limfatyczny, czasami osiedlając się w łożyskach naczyń włosowatych w odległych miejscach. 14 Opisany powyżej protokół służy jako model dla przerzutów wtórnych. Przy optymalnej liczbie wstrzykniętych komórek B16-BL6 eksperymentatorzy mogą określić względny wpływ podanego leku lub populacji komórek odpornościowych, po neutralizacji, na przerzuty komórek rakowych.
Ten protokół ma ograniczenia. Krążące komórki nowotworowe zostały wyselekcjonowane ze względu na ich zdolność do przerzutów i dlatego są nieimmunogenne, mają niższy poziom cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy 1. 12 Co więcej, nagłe i skupione w sobie wprowadzenie dużej liczby przerzutów różni się od typowego scenariusza u pacjentów, u których niewielka liczba przerzutowych komórek nowotworowych rozprasza się w dłuższym okresie czasu z pierwotnego miejsca guza. Dodatkowo, wprowadzone dożylnie komórki nowotworowe pochodzą z hodowli tkankowej, a nie z pierwotnego nowotworu. Dlatego komórki te różnią się od przerzutów wtórnych, które wynikają ze zmian w adhezji komórek, migracji, rozpoznawaniu immunologicznym i tworzeniu narządu biorcy. 15,16
Alternatywnym protokołem byłoby podskórne wstrzyknięcie witaminy B16/BL6 w celu wytworzenia guzów pierwotnych i analiza powstałych "spontanicznych" przerzutów do płuc. Stwierdzono, że te "spontaniczne" przerzuty zawierają więcej heterogeniczności niż ich "eksperymentalne" odpowiedniki, bardziej odpowiadając przerzutom u ludzi. Protokół jest ograniczony pod względem możliwości określenia wpływu eksperymentalnego związku na przerzuty. W przypadku wstrzyknięcia bocznej żyły ogonowej liczbę komórek czerniaka wstrzykniętych do krwiobiegu można przybliżyć za pomocą hemocytometru. Jednak w przypadku "spontanicznych" przerzutów występuje większa niejednorodność między nowotworami, co dodaje dodatkową zmienną do liczby powstałych ognisk płucnych. 16
Podsumowując, model mysiego czerniaka żyły ogonowej B16-BL6 stanowi prosty model do określania wpływu leczenia lub immunoterapii na przerzuty. Poprzez dożylne wstrzykiwanie krążących komórek nowotworowych naukowcy mogą do pewnego stopnia replikować pacjentów po przerzutach. Biorąc pod uwagę destrukcyjne działanie przerzutowych komórek nowotworowych u pacjentów z rakiem, model ten jest potężnym narzędziem do zrozumienia wieloetapowego procesu przerzutów.

Przerzuty są główną przyczyną zgonów wśród pacjentów z nowotworami złośliwymi. Proces przerzutowego rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych jest słabo poznany, ale wydaje się, że obejmuje kilka etapów, w tym inwazję sąsiednich tkanek, wewnątrznaczynienie do układu limfatycznego i naczyniowego, przeżycie i translokację w układzie krążenia, wynaczynienie z układu naczyniowego w miejscu przerzutów, adaptację do nowego mikrośrodowiska w nowym miejscu i kolonizację w nowym miejscu przez proliferację i tworzenie guzów wtórnych. 1 Każde z tych zdarzeń biologicznych wiąże się z transformacją, rozprzestrzenianiem się i przeżywalnością przerzutowych komórek nowotworowych. Na przykład przekształcenie fenotypu nabłonkowego komórki nowotworowej w fenotyp mezenchymalny w połączeniu z udaną interakcją z macierzą zewnątrzkomórkową umożliwia im inwazję sąsiednich tkanek i przerzuty do innych części ciała. 2,3 Ponadto te komórki przerzutowe muszą przetrwać w krążącym krwiobiegu i uniknąć nadzoru immunologicznego ze strony gospodarza. 4,5 Wreszcie, po wszczepieniu w odległe miejsce w ciele, komórki nowotworowe muszą przystosować się do swojego mikrośrodowiska, aby się namnażać i tworzyć guzy wtórne. 6,7 Dlatego, chociaż przerzuty są powszechnym zjawiskiem wśród pacjentów z rakiem, przerzutowe komórki nowotworowe mają wiele obszarów podatnych na interwencję terapeutyczną.
Biorąc pod uwagę immunogenny charakter czerniaka i niedawne zainteresowanie immunoterapiami, modele czerniaka są coraz bardziej użyteczne. 8 Szacuje się, że w samych Stanach Zjednoczonych czerniak jest przyczyną 9 000 zgonów rocznie. 9 Częstymi lokalizacjami przerzutów czerniaka są kości, mózg, wątroba i płuca. Większość przerzutów do odległych miejsc występuje przez krwioobieg. Krążące we krwi komórki nowotworowe muszą uniknąć klirensu immunologicznego, dotrzeć do łożyska naczyń włosowatych dystalnego narządu i zaatakować przez komórki śródbłonka naczynia krwionośnego, aby skutecznie się zadomowić. 4-7,10, 11
Aby naśladować powszechne i zjadliwe zjawiska przerzutów, stworzono mysią linię komórkową B16-BL6. B16-BL6, spadkobierca rodzicielskiej linii komórkowej czerniaka C57BL/6 B16-F0, jest produktem końcowym 10 kolejnych selekcji przerzutów do płuc z wstrzyknięcia dożylnego (w wyniku B16-F10), po których następuje 6 kolejnych selekcji do penetracji błony pęcherza moczowego. 12 W związku z tym jest to niezawodna linia komórkowa czerniaka do tworzenia ognisk przerzutów u myszy, zwłaszcza po wstrzyknięciu dożylnym. 13
Po wstrzyknięciu wystarczającej ilości komórek B16-BL6 do żyły ogonowej myszy B57BL/6, a następnie dwóch lub więcej tygodni, aby umożliwić implantację i wzrost komórek B16/BL6, w płucach utworzą się ogniska przerzutowe. Po eutanazji i oględzinach za pomocą mikroskopii preparacyjnej można określić ilościowo liczbę obecnych ognisk. To z kolei można wykorzystać do ustalenia efektu dawka-przerzuty, ponieważ liczba wstrzykniętych komórek B16-BL6 koreluje z liczbą ognisk powstałych na powierzchni płuc. Model ten jest znany jako "przerzuty eksperymentalne", w których znane komórki przerzutowe są wprowadzane bezpośrednio do krwiobiegu, ułatwiając szybkie i przewidywalne rozprzestrzenianie się i osadzanie w płucach, wątrobie lub innym badanym narządzie. Jest to przeciwieństwo "spontanicznych przerzutów", w których komórki nowotworowe są wszczepiane, często podskórnie, a przerzuty pochodzą z organicznie zrzuconych komórek rakowych. 14,15
Ważne jest, aby wstrzyknąć odpowiednią ilość komórek B16/BL6 do żył ogonowych myszy. Zbyt wiele, a płuca zostaną pokryte przerzutami, a sąsiednie ogniska będą nie do odróżnienia od siebie. Zbyt mało, a wpływ środka terapeutycznego będzie niezauważalny ze względu na nieodłączne różnice między wstrzyknięciami. W celu uzyskania optymalnej liczby ognisk w płucach myszy C57BL/6 konieczne jest skorelowanie liczby wstrzykniętych komórek z ilością ustalonych ognisk przerzutowych na powierzchni płuc, biorąc pod uwagę rozróżnialność poszczególnych ognisk. Protokół ten zademonstruje model przerzutowego mysiego czerniaka dla myszy C57BL / 6.

<table><tbody><tr><td>Trypsin</td><td>Corning</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Corning</td><td>MT15040CM</td><td></td></tr><tr><td>Phase Contraast Hemacytometer</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe Micro-Fine IV</td><td>BD</td><td>14-829-1D</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne podkładki do przygotowywania alkoholu</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik</td> <td>myszyBraintree Scientific</td><td>NC9999969</td><td>Wybór ogranicznika zależy od wieku/wielkości myszy</td></tr><tr><td>Podkładka grzewcza</td><td>Harry Schein</td><td>NC0012697</td><td>Opcjonalnie</td></tr></tbody></table>

wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Około 90% zgonów z powodu raka u ludzi jest związanych z przerzutami. Pomimo rozpowszechnienia i względnej szkodliwości przerzutów brakuje środków terapeutycznych do leczenia lub profilaktyki. Przedstawiamy metodę tworzenia przerzutów do płuc u myszy, przydatną do badania tego zjawiska. Iniekcja do żyły ogonowej myszy B57BL/6J z B16-BL6 jest jednym z najczęściej stosowanych modeli przerzutów czerniaka. Niektóre z krążących komórek nowotworowych osadzają się w płucach myszy, tworząc "eksperymentalne" ogniska przerzutowe. Dzięki temu modelowi możliwe jest zmierzenie względnego wpływu środków terapeutycznych na rozwój przerzutów nowotworowych. Różnica w liczbie ognisk płucnych między leczonymi i nieleczonymi myszami wskazuje na skuteczność neutralizacji przerzutów. Jednak przed badaniem środka terapeutycznego konieczne jest określenie optymalnej liczby wstrzykniętych komórek B16-BL6 do analizy ilościowej ognisk przerzutowych. Wstrzyknięcie zbyt wielu komórek może spowodować nadmiar ognisk przerzutowych, upośledzając prawidłową kwantyfikację i przytłaczając efekty terapii przeciwnowotworowych, podczas gdy wstrzyknięcie zbyt małej liczby komórek utrudni porównanie między leczonymi a kontrolnymi.

Podczas inspekcji wizualnej widoczna jest zmienność ognisk powierzchniowych. Przeliczenie liczby guzów pod mikroskopem stereoskopowym powinno wykazać liniową zależność między liczbą wstrzykniętych komórek nowotworowych a liczbą powstałych, możliwych do policzenia ognisk. Celem jest zastosowanie optymalnej liczby wstrzykiwanych komórek, tak aby płuca nie były całkowicie pokryte, jak ma to miejsce przy 500,000 cells/ml na Rysunku 1A, ani zbyt słabo pokryte, jak w przypadku 62,500 cells/ml i 125,000 cells/ml. Można to również określić ilościowo za pomocą korelacji liniowej (Rysunek 1B).
<img alt="Schemat wyznaczania czerniaka płuc z efektami wstrzykiwania komórek; porównanie wzrostu guza eksperymentalnego." src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogniska w płucach powstałe w wyniku wstrzyknięcia komórek B16/BL6 do żyły ogonowej. (A) Ogniska w płucach można zaobserwować na powierzchni płuc myszy C57BL/6 jako brązowe, okrągłe masy (reprezentatywne ogniska wskazane strzałkami). Wraz ze wzrostem gęstości wstrzykniętej hodowli komórkowej (nad każdym obrazem) wzrasta odpowiadająca jej liczba powstałych ognisk w płucach (pod każdym obrazem). Płuca myszy, której wstrzyknięto najwyższą gęstość komórek, wykazują największy wizualny stopień zajęcia przez ogniska. Paski skali oznaczają 20 mm. (B) Wyliczenie liczby ognisk w płucach w zależności od gęstości hodowli komórkowej. Powyżej 125,000 cells/ml występuje relacja w przybliżeniu liniowa, określona za pomocą hemacytometru. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Przerzuty odgrywają ogromną rolę w zjadliwości raka, odpowiadając za około 90% zgonów. Przedstawiamy protokół dla modelu czerniaka z przerzutami u myszy, który jest przydatny do określenia skuteczności środków terapeutycznych przeciwko temu zjawisku klinicznemu.

Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie metody indukcji przerzutów nowotworowych u myszy C57BL/6. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunoterapii, takie jak wpływ badanych substancji na odpowiedź immunologiczną w płucach. Główną zaletą tej techniki jest możliwość eksperymentalnego modelowania przerzutów.Dzięki temu wyniki są wiarygodne i stosunkowo spójne. Na początek należy umieścić kultury komórek czerniaka B16-BL6, które powinny osiągnąć około 70% konfluencji, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie do każdej szalki należy dodać 1 mL 0,25% trypsyny EDTA i pozostawić komórki na jedną minutę.Po odessaniu tego roztworu należy dodać jeden mililitr trypsyny do każdej płytki, a następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora. Po 10 minutach przenieść komórki do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i dodać cztery mililitry pożywki RPMI bez surowicy do każdej płytki. Następnie zebrać komórki za pomocą sterylnej pipety z napędem elektrycznym.Aby rozbić grudki, które mogłyby potencjalnie zapchać igłę wtryskową, dociśnij końcówkę pipety do dna płytki i wydmuchaj komórki. Po kilkukrotnym powtórzeniu tego procesu ponownie zbierz komórki i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie pobierz próbkę zawiesiny komórkowej, wprowadź ją do hemocytometru i określ gęstość komórek.Równomiernie rozdziel zawiesinę komórkową do czterech probówek o pojemności 15 ml. Następnie wiruj probówki, a po zakończeniu procesu odlej nadsącz. Przejdź do oznakowania każdej z probówek różną gęstością komórek – 0, 0,063, 0,125, 0,25 lub 0,5 miliona komórek na ml.Następnie do każdej probówki stożkowej dodaj odpowiednią objętość pożywki RPMI bez surowicy, aby uzyskać te stężenia końcowe. Potwierdź pożądaną gęstość komórek za pomocą hemocytometru. Następnie przenieś 500 µL każdej zawiesiny do oznakowanych probótek o pojemności 1,8 ml umieszczonych w lodzie.Po przygotowaniu wszystkich zawiesin komórek B16-BL6, należy wybrać mysz. Trzymając zwierzę za ogon, należy wprowadzić je tylną częścią ciała do restrainera. Gdy tułów myszy znajdzie się w głównej komorze, a ogon pozostanie poza urządzeniem, należy pociągnąć zwierzę w stronę końca restrainera.Następnie wsuń tłok stabilizatora i naciskaj go dalej, aż mysz zostanie unieruchomiona. Gdy zwierzę znajdzie się na miejscu, obróć mysz o 90 stopni tak, aby jedna z bocznych żył ogonowych była skierowana do góry. Następnie za pomocą gazika nasączonego alkoholem energicznie oczyść bok ogona myszy w miejscu, gdzie żyła jest najbardziej widoczna.Aby przygotować próbkę do iniekcji, należy najpierw pobrać do strzykawki 300 µL zawiesiny zawierającej 0,5 miliona komórek na mililitr. Następnie należy usunąć pęcherzyki powietrza ze strzykawki poprzez jej odwrócenie, opukanie boku i pchnięcie tłoka. Po usunięciu pęcherzyków powietrza należy odrzucić nadmiar hodowli komórkowej, aby w strzykawce pozostała końcowa objętość 250 µL.Następnie należy wyprostować ogon myszy niedominującą ręką. Należy go trzymać tak, aby palec wskazujący unosił proksymalny koniec ogona, a kciuk dociskał jego część dystalną. Dominującą ręką należy wprowadzić igłę do żyły w kierunku dystalnego końca ogona, pod niewielkim kątem w dół.Następnie wprowadź igłę głębiej, dopasowując ją do kąta przebiegu żyły ogonowej. Po wprowadzeniu igły na odległość około jednego centymetra do żyły ogonowej, zacznij powoli naciskać tłok, trzymając strzykawkę nieruchomo. Tamponuj miejsce wkłucia gazą, aby zatrzymać krwawienie.Po wstrzyknięciu zawiesiny komórek należy wyjąć igłę z żyły i ją zutylizować. Następnie należy wyjąć tłok z ogranicznika i umieścić mysz w klatce docelowej. Celem niniejszego protokołu było określenie optymalnej liczby komórek B16-BL6 do wstrzyknięcia w celu stworzenia użytecznego modelu przerzutowego czerniaka.Przedstawiono tutaj eksperymentalne ogniska, wskazane strzałkami, które utworzyły się w płucach od dwóch do trzech tygodni po wstrzyknięciu pięciu różnych gęstości komórek. Przy wstrzyknięciu 500 000 komórek na mililitr ogniska całkowicie pokryły płuca. W pokazanym tutaj przykładzie policzono 102 ogniska.W przeciwieństwie do tego, płuca były pokryte jedynie nielicznymi ogniskami, gdy wstrzyknięto 62 500 komórek na mililitr lub 125 000 komórek na mililitr. Odpowiednio, zagęszczenia te skutkowały liczbą jednego i 17 ognisk w płucach. Przy zastosowaniu tej metody ustalono, że optymalne stężenie wstrzykiwanych komórek wynosiło 250 000 komórek na mililitr.Taka gęstość doprowadziła do powstania w płucach około 65 ognisk, co stanowiło liczbę, przy której organy nie były ani całkowicie pokryte, ani zbyt rzadko zasiedlone przez ogniska. Dalsza analiza tych danych na wykresie wykazuje w przybliżeniu liniową zależność między liczbą ognisk w płucach a gęstością hodowli komórkowej powyżej 125 000 komórek na mililitr, co przedstawiono tutaj. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w czasie krótszym niż godzina, w zależności od liczby myszy, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Podczas przeprowadzania procedury ważne jest, aby dążyć do wstrzyknięcia równolicznej liczby komórek u każdej myszy. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak podawanie leków, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, jak potencjalne terapie wpływają na liczbę powstałych ognisk. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom nowotworów do zbadania składników przerzutowego czerniaka u myszy szczepu C57BL/6.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak pobierać i przygotowywać komórki B16-BL6, unieruchamiać myszy, przygotowywać igły oraz wstrzykiwać równą liczbę komórek do każdej żyły ogonowej. Należy pamiętać, że praca z kulturami ssaków i igłami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak unikanie zakłuć igłą i noszenie odzieży ochronnej.

injection-syngeneic-murine-melanoma-cells-to-determine-their

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

W tym filmie komórki czerniaka są wstrzykiwane dożylnie przez żyłę ogonową w modelu mysim. Komórki czerniaka przemieszczają się dalej przez układ krążenia, przystosowując się do odległego mikrośrodowiska i powodując przerzuty w narządach, takich jak płuca.

Eksperymentalny mysi model czerniaka z przerzutami: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek czerniaka w płucach

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Tutaj prezentujemy protokół wszczepiania komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej w prosty, mniej inwazyjny i łatwy w obsłudze sposób, a ten mysi ortotopowy model raka piersi z odpowiednim środowiskiem poduszeczki tłuszczowej może być wykorzystany do badania różnych aspektów raka.

Ortotopowe wstrzyknięcie komórek raka piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka myszy

Dożylne wstrzykiwanie komórek rakowych jest często stosowane w badaniach nad przerzutami, ale obciążenie guzem przerzutowym może być trudne do analizy. W tym artykule demonstrujemy model przerzutów do iniekcji żyły ogonowej i uwzględniamy nowatorskie podejście do analizy wynikającego z przerzutowego obciążenia guzem płuc.

Analiza patologiczna przerzutów do płuc po bocznym wstrzyknięciu komórek nowotworowych do żyły ogonowej

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Protokół przedstawia model immunoterapii nowotworów za pomocą komórkowego szczepienia guza z ekspresją Flt3L czerniaka B16-F10. Protokół ten demonstruje procedury, w tym przygotowanie hodowanych komórek nowotworowych, implantację guza, napromienianie komórek, pomiar wzrostu guza, izolację wewnątrznowotworowych komórek odpornościowych i analizę cytometrii przepływowej.

Eksperymentalny model immunoterapii czerniaka z wykorzystaniem szczepienia przeciwnowotworowego cytokiną krwiotwórczą

Tutaj prezentujemy protokół dosercowego wstrzykiwania ludzkich komórek raka prostaty w celu wygenerowania mysiego modelu ze zmianami przerzutowymi do kości.

Wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek raka prostaty w celu stworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu z przerzutami do kości

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Głównym wyzwaniem przy opracowywaniu nowych terapii raka płuc jest modelowanie mikrośrodowiska guza w miarę postępu choroby regionalnej w kierunku choroby przerzutowej. Tutaj opisujemy prostą metodę ustanowienia ortotopowego modelu syngeneicznego raka płuc, który pozwala na śledzenie chorób in vivo w czasie.

Minimalnie inwazyjna metoda tworzenia syngeneicznego ortotopowego modelu myszy raka płuc

Poznaj metodę wstrzyknięcia komórek czerniaka B16-BL6 do żyły ogonowej myszy w celu modelowania przerzutów do płuc. Technika ta umożliwia badanie immunoterapii i ocenę leków przeciwnowotworowych.

Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Przeglądaj więcej filmów