Ekspresja i oczyszczanie cząstek wirusopodobnych do szczepienia

Tutaj prezentujemy protokół syntezy cząsteczek wirusopodobnych za pomocą systemów ekspresji bakulowirusa lub ssaków oraz oczyszczania przez ultrawirowanie. To wysoce konfigurowalne podejście służy do identyfikacji antygenów wirusowych jako celów szczepionek w bezpieczny i elastyczny sposób.

Ogólnym celem tej procedury jest oczyszczenie cząsteczek wirusopodobnych (VLP), ulegających ekspresji i wydzielanych przez systemy ekspresji komórek ssaków lub owadów. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie szczepionek, takie jak sposób ekspresji i oczyszczania konformacyjnie istotnych antygenów wirusowych w bezpieczny i elastyczny sposób. Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga wytrącania białek za pomocą glikolu polietylenowego ani przygotowania warstw o wielu gęstościach w celu zagęszczenia VLP.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w identyfikację antygenów wirusowych jako celów szczepionek, VLP mogą być również wykorzystywane jako narzędzia do diagnozowania chorób i serologii. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ podkład glicerolowy w etapach ponownego zawieszania VLP jest trudny do nauczenia, ponieważ początkujący mogą nie ćwiczyć prawidłowej techniki. W dniu transwekcji należy przygotować roztwory liposomów i DNA zgodnie z zaleceniami producenta.

Transwekować komórki DNA o składzie DNA jeden do jednego do dwóch, HA do NA do Gag i całkowitej ilości DNA 40 mikrogramów na kolbę T150. Powtórz ten krok, aby utworzyć dziewięć kolb T150 o łącznej objętości 200 mililitrów. Następnie rozcieńczyć DNA i roztwory liposomów w pożywkach transwekcyjnych bez surowicy bez antybiotyków, tak aby każda kolba zawierała całkowitą objętość 24 mililitrów.

Kolby należy umieścić z powrotem w inkubatorze i utrzymywać komórki oraz pożywkę do hodowli transwekcyjnej do dnia, w którym dojdzie do zbioru cząstek wirusopodobnych (VLP). Przenieść supernatant do 50-mililitrowych stożkowych probówek, aby pobrać kulturę z komórek po 72 do 96 godzinach po transwekcji. Zakręć komórkami w dół, aby granulować resztki komórkowe.

Zebrać supernatanty i przefiltrować je przez membranę nalewającą o wielkości 0,22 mikrona. Hodowla uprzednio przygotowanych komórek spodoptera frugiperda lub Sf9 w zawiesinie w kolbach przędzarkowych, poprzez ciągłe mieszanie z prędkością 130 obr./min na wielopunktowym systemie płytek mieszających. Utrzymuj objętość kultur na poziomie nie większym niż połowa objętości kolby obrotowej w celu prawidłowego napowietrzenia.

Następnie poddaj ekspresję CHIK VLP poprzez zakażenie 250 mililitrów komórek Sf9 w kolbie obrotowej o gęstości dwa razy dziesięć do sześciu komórek na mililitr wcześniej przygotowanym rekombinowanym bakulowirusem i wróć komórki do inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Użyj wykluczenia błękitu trypanowego, aby określić, czy żywotność komórek zmniejszyła się do 70 do 80%Po potwierdzeniu przenieś kultury bezpośrednio z zawiesiny do 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj komórki w dół. Zebrać supernatanty i przefiltrować je przez membranę nalewającą o wielkości 0,22 mikrona przed sedymentacją.

Wysterylizuj sześć probówek ultrawirówek ultrawirówek o wymiarach 25 milimetrów na 89 milimetrów z otwartym dnem 70% etanolu. Następnie upewnij się, że etanol całkowicie wysechł. Załaduj 32 mililitry supernatantów do czystych probówek.

Następnie ostrożnie podłóż supernatanty trzema mililitrami sterylnego 20% glicerolu i PBS. Podkładaj glicerol powoli, aby uniknąć przerwania cienkiej warstwy gęstości między glicerolem a roztworem VLP. Zbyt szybkie dozowanie glicerolu spowoduje zmieszanie glicerolu i roztworów VLP, zmniejszając sedymentację VLP.

Upewnij się, że rurki są wyważone, a następnie rozpocznij wirowanie. Po czterech godzinach wyjmij probówki z wirówki. Odessać supernatant, uważając, aby nie wysunąć osadu z probówki.

Zawiesić osadzone VLP w co najmniej 100 mikrolitrach na dnie probówek sterylnym PBS, delikatnie i powoli pipetując w górę iw dół. Ponowne zawieszenie osadu VLP powinno być przeprowadzone z delikatnym, powolnym, powtarzającym się zasysaniem i usuwaniem PBS za pomocą pipety. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, aby ograniczyć utratę VLP.

Na koniec przechowuj zawieszone VLP. Objętości VLP i całkowity uzysk białka z konwencjonalnego testu BCA uzyskano z różnych konstruktów SVP i VLP. Wydajność CHIK SVP z komórek Sf9 waha się od 0,008 do 0,016 miligrama całkowitego białka na mililitr objętości supernatantu.

Podczas gdy produkcja przez 293 limfocyty T ssaków powoduje dziesięciokrotną redukcję białka. Ten obraz z mikrografu elektronowego pokazuje, że wirusy grypy rdzeniowej HA Gag są z powodzeniem wyrażane, składane i oczyszczane jako VLP. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby transfekować i infekować tylko zdrowe i żywotne hodowle komórkowe, ponieważ wpłynie to na ogólny poziom ekspresji białek.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak testy BCA, ELIZA i HA, w celu pomiaru całkowitej zawartości białka, specyficznej zawartości antygenu i ekspresji funkcjonalnego HA. Nie zapominaj, że praca z ultrawirówką może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak wyważanie probówek, używanie tylko zalecanych wirników i prędkości oraz odpowiedni nadzór nad nowym personelem laboratoryjnym.