Jednoetapowe oczyszczanie metodą chromatografii ujemnej białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori z nadekspresją w Escherichia coli w trybie wsadowym

Ogólnym celem niniejszego oczyszczania jest uzyskanie funkcjonalnego białka aktywującego neutrofile Helicobacter pylori lub HP-NAP w jego formie natywnej, o wysokiej czystości i wysokiej wydajności, z wykorzystaniem chromatografii w trybie wsadowym w trybie negatywnym z użyciem żywicy jonowymiennej dietyloaminoetylowej. Główną zaletą tej techniki jest możliwość oczyszczenia HP-NAP w formie natywnej w jednym kroku, przy zachowaniu wysokiej czystości i wydajności. Negatywne oczyszczanie HP-NAP rozpoczyna się od procedury wiązania wsadowego, w której rozpuszczalna frakcja białek z lizatów bakteryjnych jest dodawana do żywicy DEAE.

Mieszaninę inkubuje się, aby umożliwić wiązanie białek całkowitych z żywicą. HP-NAP obecne w frakcji niepowiązanej jest następnie otrzymywane poprzez wirowanie lub przepływ grawitacyjny. Zastosowanie tej techniki obejmuje profilaktykę w stosunku 10:1 oraz diagnostykę prognostyczną chorób związanych z Helicobacter pylori, a także terapię nowotworową.

Ze względu na immunogenne i immunomodulujące właściwości HP-NAP. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące tę metodę napotykają trudności, ponieważ HP-NAP łatwo ulega agregacji podczas sterylizacji.

Procedurę zademonstruje Zhi-Wei Hong, doktorant z naszego laboratorium. Pracując w temperaturze 4°C, zawieszamy 50 ml osadu komórkowego, przygotowanego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, w 20 ml niskosolowego buforu Tris o pH 9,0 z dodatkiem mieszaniny inhibitorów proteaz. Kluczowe jest utrzymywanie próbki w temperaturze 4°C, aby zapobiec agregacji białek podczas procedury.

Rozbić komórki bakteryjne, przepuszczając zawiesinę bakteryjną przez homogenizator wysokociśnieniowy pracujący w zakresie od 15 000 do 20 000 PSI siedem razy w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po uzyskaniu lizatów należy je niezwłocznie odwirować. Przenieść homogenizowane próbki do probówki do wirowania.

Natychmiast odwiruj lizat komórkowy w ultrawirówce przy 30 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby oddzielić rozpuszczalne i nierozpuszczalne frakcje białek. Po wirowaniu przelej supernatant, stanowiący frakcję białek rozpuszczalnych, do zlewki. Pomiar stężenia białka w frakcji rozpuszczalnej przeprowadź metodą Bradforda, korzystając z gotowego zestawu z albuminą surowicy bydlęcej jako standardem, zgodnie z instrukcją producenta.

Następnie dodaj 177,6 µL 1N HCl do 20 mL frakcji białek rozpuszczalnych, aby skorygować wartość pH z 9,0 do 8,0. Do roztworu białek dodaj 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) oraz 50 mM chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie białka 0,5 mg/mL. W celu przygotowania 15 mL żywicy DEAE, zawieś 0,6 g suchego proszku żywicy DEAE w 30 mL buforu Tris-HCl w temperaturze pokojowej przez co najmniej jeden dzień.

Odwiruj żywicę przy 10 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę, a następnie usuń i odrzuć supernatant. Następnie dodaj 15 mililitrów buforu Tris-HCl. Po powtórzeniu etapów wirowania i resuspensji jeszcze cztery razy, przechowuj 15 mililitrów osadzonych żywic w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia.

Pracując w temperaturze 4°C, należy dodać 45 ml przygotowanych białek rozpuszczalnych do mililitrów żywicy i przenieść całość do zlewki o pojemności 100 ml z mieszadełkiem magnetycznym. Mieszaninę białek z żywicą należy mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4°C przez jedną godzinę. Następnie należy przelać zawiesinę białek z żywicą do plastikowej lub szklanej kolumny wyposażonej w kranik i pozwolić żywicy osiaść pod wpływem grawitacji.

Otwórz kranik, aby pozwolić roztworowi białka przepłynąć przez kolumnę pod wpływem grawitacji, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zbierz frakcję przepływową jako frakcję niezmiązaną, która zawiera oczyszczone białko aktywujące neutrofile. Dodaj do kolumny 15 mililitrów schłodzonego w lodzie buforu Tris-HCl.

Ponownie otwórz kurek, aby bufor płuczący mógł przepłynąć przez kolumnę siłami grawitacji, aż poziom cieczy w kolumnie znajdzie się tuż nad żywicą. Zbierz przesącz jako frakcję płukania. Powtórz płukanie lodowatym buforem jeszcze cztery razy, aby zebrać kolejne frakcje płukania.

Następnie do kolumny dodaj 15 mililitrów lodowatego 20 milimolowego Tris-HCl pH 8,0 i jednego molowego chlorku sodu. Zbierz przelew jako frakcje elucyjne w ten sam sposób co poprzednio. Powtórz kroki elucji jeszcze cztery razy, aby zebrać dodatkowe frakcje elucyjne.

Wpływ pH na rozpuszczalność HP-NAP w lizacie E.coli przedstawiono tutaj. Ilość HP-NAP wykryta w tej frakcji rozpuszczalnej znacznie wzrosła w zakresie pH od 7,5 do 9,5. Rekombinowane HP-NAP zostało odzyskanego niemal w całości we frakcji rozpuszczalnej po lizie komórek przy pH 9,0.

Przedstawiono tutaj wpływ pH na negatywne oczyszczanie rekombinowanego HP-NAP ekspresowanego w E.coli przy użyciu żywic DEAE w trybie okresowym. Przy pH 8,0 w frakcji elucyjnej obecna była jedynie niewielka ilość HP-NAP. Największa ilość HP-NAP w frakcjach niezatrzymanych wystąpiła przy pH 8,0.

Zoptymalizowana ilość białek naniesionych na żywicę DEAE wynosi 1,5 mg białka na mililitr żywicy, co pozwala na osiągnięcie maksymalnej pojemności żywicy w zakresie absorpcji zanieczyszczeń z E.coli. Przy pH 8,0, w frakcji nie związanej, przy zastosowaniu żywic DEAE w trybie wsadowym, odzyskuje się bardzo mało białek poza HP-NAP w jego formie natywnej. Czystość HP-NAP była wyższa niż 95%.

Oczyszczone HP-NAP tworzy multimer o strukturze drugorzędowej w postaci alfa-helisy, co wykazano w chromatogramie z filtracji żelowej oraz w widmie dichroizmu kołowego w dalekim UV. Analiza chemiluminescencyjna zależna od światła wewnątrzkomórkowego wykazała, że oczyszczone HP-NAP jest w stanie indukować produkcję reaktywnych form tlenu przez neutrofile. Po opanowaniu tych technik, ich przeprowadzenie zajmuje do pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowej realizacji procedur.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak oczyszczać funkcjonalne HP-NAP w jego formie natywnej z wysoką wydajnością i czystością, wykorzystując seryjną chromatografię w trybie negatywnym z zastosowaniem żywicy DEAE i żywicy wymiany. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu buforów o odpowiednim pH na etapie sterylizacji w chromatografii seryjnej. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy próbowaliśmy zastosować inne podejścia chromatograficzne zamiast filtracji w celu oczyszczenia HP-NAP w jego formie natywnej.

Chociaż metoda ta została opracowana z myślą o oczyszczaniu rekombinowanego HP-NAP ekspresowanego w E.coli, może ona zostać zastosowana również w innych bakteryjnych systemach ekspresyjnych, takich jak per-sida sep-tidas. Wizualna demonstracja tej procedury jest przedstawiona w szybkim tempie.

Ponadto etapy sterylizacji i chromatografii seryjnej są trudne do opanowania, ponieważ kroki te muszą być przeprowadzane w temperaturze 4 °C bez żadnych opóźnień czasowych. Jeśli białko przeznaczone do oczyszczania nadaje się do naszej chromatografii wymiany w trybie negatywnym, procedura ta może również zostać dostosowana jako punkt wyjścia dla opracowania procesu oczyszczania.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie badań klinicznych do eksploracji możliwości wykorzystania HP-NAP w terapii nowotworowej, a także do rozwoju szczepionek, leków i diagnostyki chorób związanych z Helicobacter pylori.