Tworzenie gigantycznych rozmiarów polimeromów za pomocą ponownego uwodnienia wspomaganego żelem

Ogólnym celem tej metody nawadniania wspomaganego żelem jest solidne formowanie nienaruszonych jednowarstwowych gigantycznych pęcherzyków polimerowych, w których można łatwo kontrolować rozkład wielkości pęcherzyków. Metoda ta stanowi solidną alternatywę dla tworzenia pęcherzyków polimerowych, które można wykorzystać do zbadania właściwości fizycznych membrany, a następnie zintegrowania tych pęcherzyków z zastosowaniami bioinżynieryjnymi. Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego wytworzenia setek nienaruszonych gigantycznych pęcherzyków polimerowych znacznie szybciej i w mniej pracochłonny sposób niż tradycyjne techniki.

Pomysł na to zrodził się, gdy dowiedzieliśmy się o technice nawadniania wspomaganej żelem do tworzenia gigantycznych pęcherzyków lipidowych. Nasze obecne metody tworzenia gigantycznych polimeromów są jednak trudne i często mało wydajne, dlatego zdecydowaliśmy się zastosować tę metodologię jako alternatywne podejście. Przygotowanie roztworu polimeru należy rozpocząć od zawirowania pięciu miligramów kopolimeru diblokowego PEO-PBD w jednym mililitrze chloroformu w szklanej fiolce, aż do całkowitego rozpuszczenia.

Dodać pięć miligramów na mililitr roztworu polimeru i chloroformu oraz jeden miligram na mililitr roztworu fluorescencyjnie znakowanego lipidu i chloroformu do nowej fiolki, aż do uzyskania końcowego stężenia 99,5 procent molowego polimeru i 0,5 procent lipidu. Aby zminimalizować parowanie, przenieś roztwór polimeru do hermetycznej fiolki z pokrywką odporną na chloroform i przechowuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Aby rozpocząć przygotowanie filmu agarozowego, dodaj 50 mililitrów wody i 0,5 grama standardowej agarozy do 250-mililitrowej kolby Erlenmeyera.

Gotować przez minutę w kuchence mikrofalowej. Przed kontynuowaniem schłodź roztwór agarozy do temperatury od 65 do 75 stopni Celsjusza, aby zapobiec słabemu przyleganiu lub zbrylaniu. Następnie odetnij koniec końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów i użyj jej do pipetowania 300 mikrolitrów roztworu agarozy na 25-mililitrowe kwadratowe szklane szkiełko nakrywkowe.

Nosząc rękawiczki, przytrzymaj krawędź szkiełka nakrywkowego i równomiernie rozprowadź agarozę na całej powierzchni, używając dłuższej krawędzi kolejnej końcówki pipety o pojemności 1000 mikrolitrów. Umieścić szkiełko nakrywkowe z agarozą do góry na parafilmie i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Kontynuuj, pipetując 30 mikrolitrów wcześniej przygotowanego roztworu polimeru na szkiełko nakrywkowe pokryte folią agarozową.

Przytrzymaj krawędź szkiełka nakrywkowego palcami w rękawiczkach i rozprowadź roztwór polimeru na folii agarozowej okrężnymi ruchami, używając dłuższej krawędzi igły o rozmiarze 18. Na koniec umieść szkiełko nakrywkowe polimerową stroną do góry na plastikowej szalce Petriego wewnątrz eksykatora próżniowego. Opróżnić eksykator na co najmniej jedną godzinę w celu usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.

Aby utworzyć polimerosomy, najpierw dobrze przyklej pokrywę do polimerowej strony powlekanego szkiełka nakrywkowego, delikatnie dociskając, aż powstanie szczelne uszczelnienie. Następnie dodaj do komory od 200 do 500 mikrolitrów roztworu nawadniającego. Następnie umieść mokrą zwiniętą chusteczkę laboratoryjną wzdłuż wewnętrznej krawędzi szklanej szalki Petriego, aby utworzyć komorę wilgotności.

Umieść szkiełko nakrywkowe z przyklejoną pokrywką w naczyniu i przykryj je pokrywką. Przykryj szalkę Petriego folią, aby zminimalizować wybielanie zdjęć, a następnie umieść ją na gorącej płycie w temperaturze 40 stopni Celsjusza na co najmniej 30 minut, aby zakończyć tworzenie polimeromu. Aby rozpocząć proces obrazowania FRAP, należy umieścić szkiełko nakrywkowe z przyklejoną pokrywą na stoliku odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w regulowany kondensor.

Następnie wybierz zestaw filtrów w oparciu o zastosowany fluorescencyjny lipid i zobrazuj polimeromy na górnej powierzchni szkiełka nakrywkowego za pomocą obiektywu olejowego 100X. Aby scharakteryzować płynność membrany za pomocą FRAP, najpierw skoncentruj się na polimeromie, a następnie zamknij kondensor mikroskopu na małą aperturę i upewnij się, że krawędzie polimerosomu leżą w polu obrazu. Następnie zwiększ ekspozycję aparatu, usuń wszystkie filtry o neutralnej gęstości i pozwól obszarowi zainteresowania na wybielenie zdjęcia przez 30 do 60 sekund.

Na koniec wyłącz lampę i całkowicie otwórz skraplacz. Zmniejsz ekspozycję do ustawień początkowych i rób zdjęcia co 30 sekund przez trzy minuty. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu na komputerze mikroskopu i załaduj uzyskane obrazy polimeromów.

Ustaw skalę pomiaru, otwierając menu rozwijane Analizuj i wybierając opcję Ustaw skalę. Wprowadź odpowiednie jednostki kalibracji dla odległości w pikselach, znanej odległości i jednostki długości, a następnie wybierz pozycję OK. Następnie skorzystaj z przybornika linii i narysuj linię rozciągającą się na średnicę wybranego polimersomemu.

Zmierz średnicę polimeromu, otwierając menu rozwijane Analizuj i wybierając opcję Zmierz. Aby wspomóc analizę, użyj control plus D, aby wydrukować linię pomiarową na obrazie przed przejściem do następnego polimersomemu. Kontynuuj pomiar polimeromów zgodnie z powyższą procedurą i dodawanie każdego pomiaru do okna danych, aż do zakończenia.

Na koniec zapisz dane, klikając Plik i Zapisz jako.Kliknij Zapisz w oknie, które zostanie otwarte, a następnie otwórz plik wyników jako arkusz kalkulacyjny, aby przeanalizować dane. Polimeromy utworzone z warstw polimerowych PEO-PBD uwodnionych różnymi zobrazowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Obrazy pokazują, że polimeromy są niejednorodne pod względem wielkości w różnych warunkach hydratacji o średnicy zwykle poniżej 10 mikrometrów.

Obrazy epifluorescencyjne polimeromów powstających w wodzie w różnych temperaturach pokazują, że wraz ze wzrostem temperatury hydratacji powstają większe polimersomy. Obliczono średnie średnice dla ponad 100 polimerosomów powstałych w wodzie w różnych temperaturach hydratacji. Przy 24 stopniach Celsjusza średnia średnica wynosiła 2,93 mikrometra, wzrastając aż do 14,04 mikrometra przy 70 stopniach Celsjusza.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby polimeromy przez cały czas utrzymywać je w roztworze. Upewnij się, że wnęka pokrywy jest dobrze przymocowana do szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć wycieku roztworu do rehydratacji i wysuszenia polimeromów.

Zgodnie z tą procedurą, metody takie jak mikroskopia elektronowa mogą być wykorzystane do zrozumienia dodatkowych właściwości strukturalnych polimeromów. Technika ta toruje drogę dla badań w dziedzinie biologii syntetycznej i bioinżynierii w celu zbadania polimerosomów jako solidnej, chemicznie dostosowanej alternatywy dla błon lipidowych do badań i granicy abiotyczno-biotycznej, badań nad dostarczaniem leków i systemów protokomórkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak solidnie formować gigantyczne polimeromy za pomocą ponownego nawodnienia wspomaganego żelem, dostroić ogólny rozmiar pęcherzyków i scharakteryzować ich integralność błony.

Nie zapominaj, że praca z chloroformem lub agarozą i igłami może być niebezpieczna. Zachowaj szczególną ostrożność podczas wykonywania tych procedur. Podejmij środki ostrożności, takie jak praca w dygestoriach i zawsze używaj okularów i rękawic.