Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych
May 13th, 2016
Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.
Ogólnym celem tej techniki mikroiniekcji jest wygenerowanie transgenicznych i edytowanych genomem ryb cierników w celu przetestowania funkcji genów i wzmacniaczy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w genetyce rozwojowej i ewolucyjnej, takie jak to, w jaki sposób geny i wzmacniacze działają w celu generowania wzorca ciała. Główną zaletą tej techniki jest to, że skutecznie generuje transgeniczne ryby do funkcjonalnej analizy genetycznej.
Po przygotowaniu dwóch plazmidów i mRNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy wyciągnąć co najmniej cztery igły do mikropipet ze szkła borokrzemianowego. Przechowywać pionowo w kapilarnym słoiku do przechowywania, którego ostre końce są skierowane w dół. Aby zapłodnić do stu jaj ciernika, dodaj 50 mikrolitrów roztworu nasienia i delikatnie wymieszaj końcówką pipety, aby upewnić się, że wszystkie jaja zostały zapłodnione.
Podczas pracy z lodem napełnij z powrotem co najmniej trzy igły, pipetując 0,5 mikrolitra roztworu do wstrzykiwań do końca igły i pozwól mu spłynąć. W międzyczasie włącz światło transiluminacyjne dla mikroskopu preparacyjnego i umieść szklaną płytkę o powierzchni 13 centymetrów kwadratowych na podstawie lampy mikroskopu z 15-centymetrowym brzeszczotem do gipsu na szklanej płycie. Ustawić piłę prostopadle do aparatu iniekcyjnego z wgłębieniami skierowanymi w stronę uchwytu igły, a następnie włączyć skrzynkę sterowniczą i upewnić się, że ciśnienie jest ustawione na około 175 kilopaskalów.
Ustaw czas wstrzyknięcia na 180 milisekund. Następnie poluzuj uchwyt igły, a następnie włóż wypełnioną igłę do uchwytu, aż będzie wyczuwalny opór gumowego uchwytu i dokręć uchwyt igły, aż zostanie dokręcony palcami. Następnie ustaw kąt igły na około 45 stopni.
Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby wyregulować igłę tak, aby koniec był wyśrodkowany w polu view. Powiększ do około 40-krotnego powiększenia i skup się na końcówce igły, która nie powinna dotykać szkła poniżej. Za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich chwyć końcówkę igły na szerokość od końca od dwóch do trzech kleszczyków i delikatnie złamij końcówkę pod kątem 60 stopni.
Następnie kilkakrotnie nacisnąć pedał nożny do wstrzykiwań, aby sprawdzić, czy igła nie jest złamana. Po kilku dotknięciach z końca powinny zacząć wypływać maleńkie czerwone kropelki. Użyj jednorazowej pipety transferowej, aby umieścić kilka kropel wody ciernika na szklanej płytce.
Delikatnie zanurz igłę w wodzie, a następnie zwiększ ciśnienie wsteczne, aż z igły wynurzy się słaby strumień różowego płynu. Cofnąć igłę tak daleko, jak to możliwe, aby nie uległa uszkodzeniu podczas przygotowywania zarodków. Około 25 minut po zapłodnieniu użyj dwóch końcówek do pipet o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć od pięciu do 10 zarodków z lęgu i przenieść je na szklaną płytkę.
Za pomocą końcówek pipet delikatnie rozdziel zarodki na poszczególne wgłębienia brzeszczotu, uważając, aby nie nakłuwać zarodków. Następnie za pomocą pipety transferowej dodaj tyle wody, aby przykryć zarodki. Następnie po trzech do pięciu sekundach usuń większość wody, pozostawiając tylko niewielką objętość pokrywającą każdy zarodek.
Zaczynając od zarodka znajdującego się najdalej, przesuń szklaną płytkę i powiększ zarodek tak, aby wypełnił około 25 procent pola widzenia. Opuść igłę w pole widzenia, a następnie użyj końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby delikatnie obrócić zarodek, aby zidentyfikować blastomer, ziarnisty, lekko żółty, wypukły guzek cytoplazmy na wierzchu żółtka. Obróć zarodek tak, aby blastomer był bezpośrednio prostopadły do końca igły.
Obniż igłę, wywierając nacisk powoli i równomiernie, aby przebić korion i włóż igłę do cytoplazmy, nie przepychając jej przez leżące poniżej żółtko. Wciśnij pedał nożny trzy do czterech razy, aby wstrzyknąć tak, aby czerwony bolus z lekko rozproszonymi krawędziami wypełnił około 1/8 średnicy cytoplazmy. Posiadanie ostrej igły prostopadłej do koriona ułatwi ten krok.
Ograniczenie ilości dodawanej wody pomoże utrzymać miękkość coriona. I wreszcie, celowanie w cytoplazmę zwiększy prawdopodobieństwo uzyskania transgenicznego zwierzęcia. Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby schować igłę, a za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów przytrzymaj zarodek, jeśli przyklei się do igły.
Po wyjęciu igły należy przesunąć szklaną płytkę, aby wyrównać następny zarodek z igłą i powtórzyć wstrzyknięcie. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy użyć pipety transferowej z odciętym końcem, aby dodać wodę do płytki. Następnie użyj pipety transferowej, aby zebrać zarodki i umieść je na 150-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej wodą ciernika.
Inkubuj zarodki w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Jednego dnia po wstrzyknięciu delikatnie odlej wodę z ciernika i zastąp ją świeżą wodą. Sprawdź, czy nie ma martwych lub zniekształconych zarodków i usuń, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
Jak pokazano tutaj, w przypadku transgenów, które mają aktywność wzmacniającą, udane wstrzyknięcie powoduje specyficzną ekspresję komórkową transgenu. Na przykład w płetwach piersiowych i środkowych oraz strunie grzbietowej. Ryby, którym wstrzyknięto zastrzyki, mogą być następnie krzyżowane w celu wytworzenia stabilnych linii, takich jak ta stabilna linia grzbietowa, która napędza ekspresję GFP w sercu zarodkowym po czterech dniach od zapłodnienia.
W przypadku aktywnego wzmacniacza od 40 do 50 procent zarodków będzie wykazywać specyficzną dla tkanek ekspresję transgenu, na przykład w płetwach środkowych i piersiowych. Do 100 procent ryb z dodatnim wynikiem GFP F0 wykazujących ekspresję transgenów plazmidowych generujących transgeny plazmidowe wytwarza transgeniczne potomstwo. Jednak odsetek potomstwa noszącego transgen waha się znacznie od mniej niż jednego procenta do 72 procent.
Zapisywanie tylko zarodków z dodatnim wynikiem GFP na ogół zwiększa skuteczność transmisji. Tylko do 10 procent zarodków ciernika wstrzykniętych metodą F0 wykazuje fluorescencję w oczekiwanych tkankach. Ponadto szybkość transmisji pleców jest niższa niż w przypadku konstruktów plazmidowych.
Tylko do 14 procent przesiewanych cierników przenosi plecy. W przeciwieństwie do niskiej skuteczności transgenezy wstecznej, od 70 do 100 procent ryb, którym wstrzyknięto szpony, ma zmiany mozaikowe. W tym przypadku nieoszlifowany amplikon PCR w każdym z wstrzykniętych zarodków wskazuje, że niektóre komórki w każdym zarodku przenoszą zmiany chorobowe w locus docelowym.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w nieco ponad godzinę na lęg 100 zarodków, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że praktyka i cierpliwość są wymagane, aby poprawić technikę i przeżycie zarodka. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby odpowiedzieć na dalsze pytania dotyczące szczegółowych wzorców ekspresji wzmacniacza.
Ponadto ryby z edytowanym genomem mogą być hodowane krzyżowo w celu badania fenotypów wynikających z indukowanych mutacji. Po jego opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się genetyką ewolucyjną i rozwojową do badania regulacji i funkcji genów u cierników. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzykiwać zarodki ciernika w celu transgenezy i edycji genomu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół mikroiniekcji do generowania modyfikacji genomu u ryby ciernika trójcierniowego. Metoda koncentruje się na manipulacjach transgenicznych i technikach edycji genomu, w tym na konstruktach z otoczką Tol2, TALENach i CRISPRach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia rozwoju
- Biologia ewolucyjna
Tło
- Techniki transgeniczne i edycji genomu są niezbędne do funkcjonalnego testowania genów.
- Ciernik trójcierniowy służy jako organizm modelowy.
- Rozumienie funkcji genów i enhancerów jest kluczowe dla genetyki rozwojowej i ewolucyjnej.
- Ta technika mikroiniekcji może efektywnie produkować ryby transgeniczne.
Cel badania
- Wygenerowanie ryb ciernika transgenicznych do funkcjonalnej analizy genetycznej.
- Zbadanie ról genów i enhancerów w generowaniu wzorców ciała.
- Dostarczenie niezawodnej metody do testowania funkcji genów.
Stosowane metody
- Przygotowanie plazmidów Tol2 i mRNA zgodnie z protokołem.
- Mikroiniekcja do zapłodnionych jajeczek ciernika.
- Użycie igieł mikropipetowych do precyzyjnej iniekcji.
- Nasienne zapłodnienie jajeczek dla pomyślnego rozwoju.
Główne wyniki
- Technika mikroiniekcji skutecznie generuje ryby ciernika transgeniczne.
- Efektywna produkcja organizmów genetycznie zmodyfikowanych do analizy.
- Fascynuje badanie funkcji genów i enhancerów.
- Przyczynia się do zrozumienia procesów rozwojowych i ewolucyjnych.
Wnioski
- Ta metoda jest cennym narzędziem dla badaczy z dziedziny genetyki.
- Zwiększa zdolność do badania złożonych interakcji genetycznych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne organizmy modelowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Microinjection-based transgenesis and genome editing in threespine sticklebacks enables direct functional interrogation of candidate genes and regulatory elements in a vertebrate model with high phenotypic diversity. This capability supports mechanistic de-risking and target validation at the earliest stages of discovery, providing predictive confidence for gene function and regulatory architecture. The approach is strategically positioned for portfolio triage and prioritization of genetic targets in developmental and evolutionary contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional testing of candidate genes and enhancers identified from mapping studies.
- Supports mechanistic de-risking by allowing targeted genome editing with TALENs and CRISPR/Cas9.
- Facilitates validation of gene regulatory elements using transgenic reporter assays.
- Provides predictive confidence for gene-phenotype relationships in a vertebrate system.
Screening & Assay Development
- Prepares validated transgenic and genome-edited lines for downstream phenotypic screening.
- Standardizes microinjection and selection protocols to ensure reproducibility and quantitative assessment of transgenesis efficiency.
- Enables scalable production of genetically modified embryos for assay development.
- Supports reliable evaluation of gene function and regulatory activity in vivo.
Translational & Preclinical Research
- Aligns genetic manipulation with disease-relevant phenotypes and evolutionary adaptations.
- Provides continuity from gene discovery to preclinical model development in a vertebrate context.
- Enables risk-adjusted advancement of genetic targets based on functional outcomes.
- Supports the establishment of stable lines for longitudinal and cross-generational studies.
Pipeline & Workflow Integration
This microinjection protocol integrates into the discovery continuum from candidate gene identification to functional validation and preclinical model generation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through direct gene and enhancer manipulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for transgenesis and genome editing efficiency.
- Analytics: Enables measurement of transgene expression and mutation rates to compare experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in a vertebrate system with diverse phenotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic manipulation applicable to multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for genetic manipulation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early biological de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets across programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in microinjection and embryo handling.
- Needs access to specialized instrumentation such as micromanipulators and dissecting microscopes.
- Demands cross-team standardization of injection and selection protocols for reproducibility.
- May require adaptation for different genetic constructs or model systems.
- Efficiency and transmission rates can vary by construct type and must be empirically determined.
