Name: Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów i enhancerów w genetyce rozwojowej i ewolucyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez NIH R01 #DE021475 (CTM), NIH Predoctoral Training Grant 5T32GM007127 (PAE) oraz NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Dziękujemy Kevinowi Schwalbachowi za przeprowadzenie rekombinacji i wstrzyknięć BAC, Nickowi Donde za wygenerowanie danych sekwencjonowania CRISPR Sanger oraz Katherine Lipari za pomocne informacje zwrotne na temat protokołu iniekcji.

<ol><li>Bell, M. A., Foster, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBell%2C+MA+%22The+Evolutionary+Biology+of+the+Threespine+Stickleback%22">The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback</a>. , Oxford University Press. (1994).</li>
<li>Jones, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+basis+of+adaptive+evolution+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks.</a> Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).</li>
<li>Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+assembly+improvement+and+mapping+convergently+evolved+skeletal+traits+in+sticklebacks+with+Genotyping-by-Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing.</a> G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).</li>
<li>Miller, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+skeletal+evolution+in+sticklebacks+is+controlled+by+additive+and+clustered+quantitative+trait+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci.</a> Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).</li>
<li>Shapiro, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+basis+of+evolutionary+pelvic+reduction+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks.</a> Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).</li>
<li>Colosimo, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+parallel+evolution+in+sticklebacks+by+repeated+fixation+of+Ectodysplasin+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles.</a> Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).</li>
<li>Chan, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+pelvic+reduction+in+sticklebacks+by+recurrent+deletion+of+a+Pitx1+enhancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer.</a> Science. 327 (5963), 302-305 (2010).</li>
<li>O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recurrent+regulatory+change+underlying+altered+expression+and+Wnt+response+of+the+stickleback+armor+plates+gene+EDA%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA.</a> eLife. , e05290(2015).</li>
<li>Cleves, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+tooth+gain+in+sticklebacks+is+associated+with+a+cis-regulatory+allele+of+Bmp6%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).</li>
<li>Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+developmentally+temporal+quantitative+trait+loci+underlie+convergent+evolution+of+increased+branchial+bone+length+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks.</a> Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).</li>
<li>Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+developmental+genetic+features+underlie+stickleback+gill+raker+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22EvoDevo%22%5BJournal%5D)">Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution.</a> EvoDevo. 5 (1), (2014).</li>
<li>Ellis, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+and+genetic+mechanisms+underlie+convergently+evolved+tooth+gain+in+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks.</a> Development. 142, 2442-2451 (2015).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+linkage+disequilibrium+and+parallel+adaptive+divergence+across+threespine+stickleback+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).</li>
<li>Hohenlohe, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+genomics+of+parallel+adaptation+in+threespine+stickleback+using+sequenced+RAD+tags%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags.</a> PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).</li>
<li>McKinnon, J. S., Rundle, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+in+nature%3A+the+threespine+stickleback+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Ecol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Speciation in nature: the threespine stickleback model systems.</a> Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).</li>
<li>Shao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+feedback+effects+on+LH+and+FSH%2C+and+photoperiodic+control+of+reproduction+in+male+three-spined+sticklebacks%2C+Gasterosteus+aculeatus%5BTitle%5D)+AND+%22Gen.+Comp.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus.</a> Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).</li>
<li>Katsiadaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-spined+stickleback%3A+an+emerging+model+in+environmental+endocrine+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Int.+J.+Environ.+Physiol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption.</a> Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).</li>
<li>Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+local+immunological+adaptation+of+two+stickleback+ecotypes+by+experimental+infection+and+transcriptome-wide+digital+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis.</a> Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).</li>
<li>Barber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sticklebacks+as+model+hosts+in+ecological+and+evolutionary+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology.</a> Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).</li>
<li>Erickson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+190+base+pair%2C+TGF-%CE%B2+responsive+tooth+and+fin+enhancer+is+required+for+stickleback+Bmp6+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression.</a> Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).</li>
<li>Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+microinjection+protocol+for+making+transgenic+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Carroll, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-Devo+and+an+expanding+evolutionary+synthesis%3A+a+genetic+theory+of+morphological+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution.</a> Cell. 134 (1), 25-36 (2008).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Hindorff, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+etiologic+and+functional+implications+of+genome-wide+association+loci+for+human+diseases+and+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).</li>
<li>Fisher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+biological+relevance+of+putative+enhancers+using+Tol2+transposon-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).</li>
<li>Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+transposase+of+the+Tol2+element%2C+an+Ac-like+element+from+the+Japanese+medaka+fish%2C+and+its+transposition+in+the+zebrafish+germ+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).</li>
<li>Kikuta, H., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+transgenesis+using+Tol2+transposon+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Moleculario+Biology%3A+Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors.</a> Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).</li>
<li>Halloran, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+gene+expression+in+specific+cells+of+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish.</a> Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).</li>
<li>Kingsley, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+genomic+tools+for+molecular+studies+of+evolutionary+change+in+threespine+sticklebacks%5BTitle%5D)+AND+%22Behaviour%22%5BJournal%5D)">New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks.</a> Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).</li>
<li>Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+approach+for+identifying+distant+regulatory+elements+applied+to+the+Gdf6+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene.</a> Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice.</a> BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).</li>
<li>Kim, H., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+genome+engineering+with+programmable+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">A guide to genome engineering with programmable nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).</li>
<li>Cermak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+design+and+assembly+of+custom+TALEN+and+other+TAL+effector-based+constructs+for+DNA+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting.</a> Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).</li>
<li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Talbot, J. C., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+CRISPR+pipeline+to+reliably+generate+zebrafish+frameshifting+alleles%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles.</a> Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transposon-Mediated+Gene+Trap+Approach+Identifies+Developmentally+Regulated+Genes+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish.</a> Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway+compatible+vectors+for+analysis+of+gene+function+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).</li>
<li>Doyle, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAL+Effector-Nucleotide+Targeter+%28TALE-NT%29+2.0%3A+tools+for+TAL+effector+design+and+target+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3-new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3-new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29+%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) </a>. , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).</li>
<li>Dale, R. M., Topczewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+evolutionarily+conserved+regulatory+element+of+the+zebrafish+col2a1a%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a.</a> Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li>
<li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+Gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wstrzykiwanie jednokomórkowych zarodków ciernika w celu transgenezy lub edycji genomu wiąże się z trzema głównymi wyzwaniami. Po pierwsze, w porównaniu z zarodkami danio pręgowanego, embrionalna kosmówka ciernika jest twarda i często łamie igły. Problem ten można częściowo rozwiązać, stosując grubsze i mocniejsze szklane mikropipety i wstrzykując je prostopadle do kosmówki (patrz protokół, ryc. 2). Upewnienie się, że do zarodków dodaje się jak najmniej wody (tylko tyle, aby kosmówka pęcznieje i odrywa si...

Jednym z podstawowych elementów zrozumienia, jak powstaje bioróżnorodność, jest określenie genetycznych i rozwojowych podstaw wyewoluowanych zmian fenotypowych w przyrodzie. Ciernik trójgrzbietowy, Gasterosteus aculeatus, stał się doskonałym modelem do badania genetycznych podstaw ewolucji. Cierniki przeszły wiele adaptacyjnych zmian ewolucyjnych, ponieważ ryby morskie skolonizowały niezliczone środowiska słodkowodne na półkuli północnej, co spowodowało dramatyczne zmiany morfologiczne, fizjologiczne i behawioralne1. Genomy osobników z dwudziestu jeden populacji ciernika zostały zsekwencjonowane i złożone, a następnie wygenerowano mapę połączeń o wysokiej gęstości w celu dalszego ulepszenia składania2,3. Eksperymenty z mapowaniem genetycznym zidentyfikowały regiony genomowe leżące u podstaw wyewoluowanych fenotypów 4-6, a w kilku przypadkach przetestowano funkcjonalne role określonych genów kandydujących7,8. Zidentyfikowano szereg regionów genomu leżących u podstaw zmian morfologicznych z obiecującymi genami kandydującymi, ale kandydaci ci nie zostali jeszcze przebadani funkcjonalnie 9-12. Ponadto cierniki są powszechnymi modelami w badaniach genetyki/genomiki populacyjnej13,14, specjacji15, zachowania16, ekotoksykologii17, immunologii18 i parazytologii19. Przyszłe badania w każdej z tych dziedzin skorzystają z możliwości wykonywania funkcjonalnych manipulacji genetycznych u cierników. Oprócz manipulowania ich sekwencjami kodującymi, role genów kandydujących można oceniać, badając ich sekwencje cis-regulatorowe oraz funkcjonalnie zwiększając, zmniejszając lub eliminując ekspresję genu kandydującego. Metody mikroiniekcji i transgenezy u cierników są dobrze znane7,8,20 i zostały początkowo opracowane przy użyciu metody za pośrednictwem meganukleazy21, po raz pierwszy opisanej w medaka22. Przedstawiona tutaj zmodyfikowana metoda mikroiniekcji została zoptymalizowana zarówno pod kątem transgenezy za pośrednictwem Tol2, jak i niedawno opracowanych odczynników do edycji genomu, w tym TALEN-ów i CRISPR-ów.
Uważa się, że zmiany w elementach cis-regulatorowych są kluczowe dla ewolucji morfologicznej, ponieważ zmiany cis-regulatorowe pozwalają uniknąć negatywnych plejotropowych konsekwencji mutacji kodujących23. Dlatego testowanie i porównywanie przypuszczalnych sekwencji cis-regulatorowych stało się głównym celem coraz większej liczby badań ewolucyjnych. Ponadto większość wariantów choroby u ludzi to warianty regulatorowe24,25, a modelowe systemy kręgowców są pilnie potrzebne do badania funkcji i logiki elementów cis-regulatorowych. Ryby, które w dużych ilościach zapładniają swoje zarodki zewnętrznie, oferują potężne systemy kręgowców do badania regulacji cis. System transpozonów Tol2, w którym obce DNA, które ma zostać zintegrowane z genomem, jest otoczone miejscami wiązania transpozazy Tol2 i wstrzykiwane jednocześnie z mRNA transpozazy Tol2, działa z wysoką wydajnością w celu pomyślnej integracji konstruktów plazmidowych z genomami ryb26-28. Zazwyczaj potencjalny wzmacniacz jest klonowany przed podstawowym promotorem (takim jak hsp70l29) i fluorescencyjnym genem reporterowym, takim jak EGFP (wzmocnione zielone białko fluorescencyjne) lub mCherry w szkielecie Tol2 i wstrzykiwany z transpozazą mRNA26. Obserwacja ekspresji fluorescencyjnego reportera, zarówno w wstrzykniętych zarodkach, jak i potomstwie ze stabilnie zintegrowanymi transgenami, dostarcza informacji na temat czasoprzestrzennej regulacji ekspresji genów napędzanej przez domniemany wzmacniacz. W dalszych eksperymentach zwalidowane wzmacniacze mogą być stosowane do napędzania specyficznej tkankowo nadekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania.
Do analizy większych regionów cis-regulatorowych, stworzono wysokiej jakości biblioteki genomiczne z dużymi wstawkami, wykorzystujące sztuczne chromosomy bakteryjne (BAC) zarówno dla morskich, jak i słodkowodnych cierników30. Te BAC mogą być rekombinowane w celu zastąpienia genu fluorescencyjnym genem reporterowym w kontekście dużego (150-200 kb) regionu genomowego31. Reporter fluorescencyjny jest następnie wyrażany we wzorcu czasoprzestrzennym, określonym przez sekwencje regulatorowe w BAC. W przypadku badań na rybach miejsca Tol2 można dodać do BAC, aby ułatwić integrację genomową32,33. W późniejszych stadiach rozwoju, gdy hybrydyzacja in situ jest technicznie trudna, fluorescencyjny odczyt BAC może być wykorzystany do badania wzorców ekspresji genów, jak wykazano w przypadku ciernika Bone morphogenetic protein 6 (Bmp6)20. Dodatkowo, wzorce ekspresji fluorescencyjnej u danej osoby mogą być śledzone w czasie, czego nie można osiągnąć za pomocą hybrydyzacji in situ. BAC mogą być również używane do dodawania dodatkowej kopii regionu genomowego w celu zwiększenia dawki genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Do badania funkcji genów, edycja genomu to gwałtownie rozwijająca się dziedzina, która może być wykorzystana do tworzenia ukierunkowanych zmian w sekwencjach genomowych w wielu różnych organizmach34. Nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) to modułowe, specyficzne dla sekwencji nukleazy pierwotnie wyizolowane z patogenów roślinnych, które można precyzyjnie zaprojektować, aby wiązały się bezpośrednio z wybraną sekwencją genomową i generowały podwójne pęknięcie nici35,36. Zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)/systemy CAS zostały pierwotnie znalezione w bakteriach i wykorzystują przewodnik RNA i białko Cas9 do wygenerowania przerwy w docelowej sekwencji DNA komplementarnej do przewodnika37. Późniejsza naprawa podwójnej przerwy nici utworzonej zarówno przez TALEN, jak i CRISPR często pozostawia niewielką insercję lub delecję, co może zakłócić funkcję sekwencji docelowej35-37. U cierników TALEN-y zostały użyte do zakłócenia ekspresji genów poprzez ukierunkowanie na wzmacniacz20, a zarówno TALEN-y, jak i CRISPR z powodzeniem wytworzyły mutacje w sekwencjach kodujących (dane niepublikowane). Szczegółowy protokół generowania CRISPR do stosowania u danio pręgowanego może posłużyć jako wytyczne do opracowania CRISPR dla cierników38.
Eksperymenty transgeniczne i edycja genomu wymagają wprowadzenia kwasów nukleinowych do nowo zapłodnionego zarodka jednokomórkowego. Wprowadzenie transgenu lub narzędzia do edycji genomu na wczesnym etapie rozwoju, maksymalizuje się liczbę genetycznie zmanipulowanych komórek potomnych w zarodku. Wstrzyknięte zarodki są następnie poddawane wizualnym badaniom przesiewowym pod kątem fluorescencji lub molekularnym badaniom przesiewowym pod kątem modyfikacji genomu. Jeśli komórki przyczyniające się do linii zarodkowej zostaną skutecznie namierzone, transgen lub mutacja może zostać przekazana podgrupie potomstwa, nawet jeśli śmiertelność po wstrzyknięciu jest wysoka. Ryby mozaikowe mogą być krzyżowane lub krzyżowane, a ich potomstwo poddawane badaniom przesiewowym w celu odzyskania zmutowanych alleli lub stabilnie zintegrowanego transgenu będącego przedmiotem zainteresowania. Protokół ten opisuje metody wprowadzania transgenów i odczynników do edycji genomu do jednokomórkowych zarodków ciernika oraz monitorowania udanych modyfikacji genomu.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy z transilluminacją</td><td>Leica</td><td>S6e/ KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny mikromanipulator</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MM33</td><td>Marzhauser M33 Mikromanipulator</td></tr><tr><td>System pomiaru ciśnienia</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka ciśnienia zwrotnego</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>BPU</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw uchwytów do mikropipet</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny uchwyt podstawy</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>Podstawa</td><td></td>magnetyczna</tr><tr><td>Przełącznik nożny</td><td>Stosowane oprzyrządowanie naukowe</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Żelazna płyta (podstawa magnetyczna)</td><td>Narishige</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>Płonący/brązowy ściągacz do mikropipet</td><td>Instrument</td> <td>SutterP-97</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety transferowe</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>0,5% czerwieni fenolowej w DPBS</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P0290</td><td>znacznik iniekcyjny</td></tr><tr><td>#5 kleszcze, biologia dumoxel&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>do łamania igieł</td></tr><tr><td>Słoik do przechowywania mikropipet</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>mieści igły</td></tr><tr><td>6", 6 zębów na cal piła do płyt kartonowo-gipsowych</td><td>Lenox</td><td>20571 (S636RP)</td><td>trzymaj jaja do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>13 cm x 13 cm szklana płyta</td><td>dowolny sklep z narzędziami-kapilary</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ze szkła borokrzemianowego, 1,0 mm OD/0,58 mm ID&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-F4</td><td>*twardsze szkło niż kapilary iniekcyjne danio pręgowanego</td></tr><tr><td>150 x 15mm szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>FB0875714</td><td>wychowywać zarodki ciernika</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm szalka Petriego</td><td>Fisher</td><td>08-757-100A</td><td>przechowywać jaja przed wstrzyknięciem</td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt</td><td>Instant Ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy/MS-222</td><td>Western Chemical Inc</td><td>MS222</td><td>znieczulenie/eutanazja</td></tr><tr><td>ryb Zestaw do transkrypcji Sp6</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>Do transkrypcji TALEN-ów i transpozazy mRNA</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>oczyszcza transpozazę lub TALEN RNA</td></tr><tr><td>Zestaw do czyszczenia QiaQuick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>oczyszcza plazmidy dla iniekcja</td></tr><tr><td>Proteinaza K 20 mg/ml</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>do preparacji DNA</td></tr><tr><td>Zestaw Nucleobond BAC 100</td><td>Clontech</td><td>740579</td><td>do preparatu DNA BAC</td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189L</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Phusion</td><td>Fisher</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Qiagen PlasmidPlus Midi</td><td>Qiagen</td><td>12943</td><td>zawiera bufor do płukania endotoksyn</td></tr><tr><td>QIAQuick Ekstrakcja żelu</td><td>Qiagen</td><td>28704&nbsp;</td><td>do sekwencjonowania mutacji wywołanych</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:Alkohol izoamylowy</td><td>Sigma</td><td>P2069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (klasa biologii molekularnej)</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>50x Bufor tris-octan EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>B49</td><td></td></tr><tr><td>0,5-10 Kb drabinka</td> <td>RNAThermoFisher</td><td>15623-200</td><td></td></tr><tr><td>Nanokropla&nbsp; Spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>1 kb Plus Drabinka DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris pH 8,3</td><td>Teknova</td><td>T1083</td><td></td></tr><tr><td>12-paskowa probówka do PCR</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1113</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

Ciernik trójgrzbietowy okazał się potężnym systemem do badania genetycznych podstaw szerokiej gamy morfologicznych, fizjologicznych i behawioralnych fenotypów. Niezwykle zróżnicowane fenotypy, które ewoluowały, gdy populacje morskie przystosowują się do niezliczonych środowisk słodkowodnych, w połączeniu ze zdolnością do krzyżowania form morskich i słodkowodnych, zapewniają rzadki system kręgowców, w którym genetyka może być wykorzystana do mapowania regionów genomu kontrolujących wyewoluowane cechy. Obecnie dostępne są doskonałe zasoby genomiczne, które ułatwiają molekularną analizę genetyczną wyewoluowanych zmian. Podczas gdy eksperymenty mapowania generują listy interesujących genów kandydujących, wymagane są funkcjonalne manipulacje genetyczne w celu przetestowania roli tych genów. Regulację genów można badać za pomocą transgenicznych plazmidów reporterowych i BAC zintegrowanych z genomem za pomocą systemu transpozazy Tol2. Funkcje określonych genów kandydujących i elementów cis-regulatorowych można ocenić poprzez indukcję ukierunkowanych mutacji za pomocą odczynników do edycji genomu TALEN i CRISPR/Cas9. Wszystkie metody wymagają wprowadzenia kwasów nukleinowych do zapłodnionych jednokomórkowych zarodków ciernika, co jest zadaniem utrudnionym ze względu na grubą kosmówkę zarodków ciernika oraz stosunkowo mały i cienki blastomer. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół mikroiniekcji kwasów nukleinowych do zarodków ciernika dla zastosowań transgenicznych i edycji genomu w celu badania ekspresji i funkcji genów, a także technik oceny sukcesu transgenezy i odzyskiwania stabilnych linii.

W przypadku transgenów genu reporterowego wykazujących aktywność enhansera, udana iniekcja doprowadzi do specyficznej, komórkowej ekspresji transgenu (Ryc. 4A, 4C). Iniektowane ryby mogą następnie zostać poddane krzyżówkom wstecznym w celu wytworzenia stabilnych linii (przykład stabilnej linii BAC przedstawiono na Ryc. 4B). Iniekcja DNA do embrionów kolca wschodniego zazwyczaj skutkuje znacznie wyższą śmiertelnością niż w przypadku samego...

Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Ogólnym celem tej techniki mikroiniekcji jest wytwarzanie transgenicznych i edytowanych genomicznie łupaczy, aby testować funkcję genów i enhancerów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu genetyki rozwojowej i ewolucyjnej, takie jak sposób, w jaki geny i enhancery funkcjonują w celu wytworzenia wzorca budowy ciała. Główną zaletą tej techniki jest wydajne generowanie transgenicznych ryb do funkcjonalnych analiz genetycznych.Po przygotowaniu obu plazmidów i mRNA zgodnie z protokołem tekstowym, wyciągnij co najmniej cztery igły do mikropipety ze szkła borokrzemianego. Przechowuj je pionowo w słoiku do przechowywania kapilar, z ostrymi końcami skierowanymi w dół. Aby zapłodnić do stu jaj kłucia, dodaj 50 µL roztworu nasienia i delikatnie zamieszaj końcówką pipety, aby upewnić się, że wszystkie jaja zostały zapłodnione.Podczas pracy na lodzie, napełnij wstecznie co najmniej trzy igły, pipetując 0,5 µL roztworu do wstrzykiwania do tępego końca igły i pozwalając mu spłynąć. W międzyczasie włącz oświetlenie prześwietlające mikroskopu dissectingowego i umieść szklaną płytkę o powierzchni 13 cm² na podstawie oświetleniowej mikroskopu, kładąc na niej ostrze piłki gipsowej o długości 15 cm. Ustaw piłkę prostopadle do aparatury do wstrzykiwania, tak aby wcięcia były skierowane w stronę uchwytu igły, następnie włącz sterownik i upewnij się, że ciśnienie jest ustawione na około 175 kPa.Ustaw czas wstrzyknięcia na 180 milisekund. Następnie poluzuj uchwyt igły, po czym włóż wypełnioną igłę do uchwytu, aż poczujesz opór gumowego mocowania, i dokręć uchwyt igły, aż zostanie mocno zaciśnięty palcami. Następnie ustaw kąt igły na około 45 stopni.Używając sterowników mikromanipulatora, ustaw igłę tak, aby jej koniec znajdował się w centrum pola widzenia. Powiększ obraz do około 40x i ustaw ostrość na czubku igły, który nie powinien dotykać znajdującego się poniżej szkła. Za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej chwyć czubek igły w odległości dwóch do trzech szerokości pęsety od końca i delikatnie odłam go pod kątem 60 stopni.Następnie kilkukrotnie naciśnij pedał wtryskowy, aby sprawdzić, czy igła nie jest zapchana. Po kilku naciśnięciach z końcówki powinny zacząć wypływać małe czerwone kropelki. Za pomocą jednorazowej pipety transferowej nanieś kilka kropli wody z hodowli ukleja na szklaną płytkę.Powoli zanurz igłę w wodzie, a następnie zwiększ ciśnienie wsteczne, aż z igły zacznie wypływać cienki strumień różowego płynu. Cofnij igłę tak daleko, jak to możliwe, aby nie uległa uszkodzeniu podczas przygotowywania embrionów. Około 25 minut po zapłodnieniu, używając dwóch końcówek pipety 10 µL, wyjmij od pięciu do 10 embrionów z grupy i przenieś je na szklaną płytkę.Za pomocą końcówek do pipety ostrożnie przenieś zarodki do poszczególnych wgłębień ostrza piły, uważając, aby ich nie przebić. Następnie, używając pipety transferowej, dodaj odpowiednią ilość wody z hodowlą ukleja trzonowego, aby pokryć zarodki. Po trzech do pięciu sekundach usuń większość wody, pozostawiając jedynie niewielką objętość pokrywającą każdy zarodek.Zaczynając od zarodka znajdującego się najdalej, przesuń płytkę szklaną i przybliż obraz, tak aby zarodek wypełniał około 25 procent pola widzenia. Obniż igłę do pola widzenia, a następnie za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 µL delikatnie obróć zarodek, aby zidentyfikować blastomer – ziarnisty, lekko żółty, wypukły grudek cytoplazmy na górnej części żółtka. Obróć zarodek tak, aby blastomer znajdował się prostopadle do końcówki igły.Powoli i równomiernie opuść igłę, wywierając nacisk, aby przebić korion i wprowadzić igłę do cytoplazmy, nie przebijając przy tym leżącego poniżej żółtka. Naciśnij pedał trzy lub cztery razy, aby wykonać wtrysk, tak aby czerwony bolus o lekko rozmytych krawędziach wypełnił około 1/8 średnicy cytoplazmy. Utrzymanie ostrej igły prostopadle do korionu ułatwi wykonanie tego kroku.Ograniczenie ilości dodawanej wody pomoże zachować miękkość chorionu. Na koniec, celowanie w cytoplazmę zwiększy prawdopodobieństwo uzyskania zwierzęcia transgenicznego. Użyj sterowania mikromanipulatorem, aby wycofać igłę, a za pomocą końcówki pipety 10 µl przytrzymaj embrion, jeśli przyklei się on do igły.Po wycofaniu igły przesuń szklaną płytkę, aby ustawić kolejny embrion w linii z igłą i powtórz wstrzyknięcie. Gdy wszystkie embriony zostaną wstrzyknięte, użyj pipety transferowej z odciętym końcem, aby dodać wodę na płytkę. Następnie za pomocą pipety transferowej zbierz embriony i umieść je w 150 milimetrowej szalce Petriego wypełnionej wodą dla ukławca.Inkubuj zarodki w temperaturze 18 °C. Jeden dzień po wstrzyknięciu ostrożnie zlej wodę z łucznikami i zastąp ją świeżą wodą. Sprawdź, czy nie ma martwych lub zdeformowanych zarodków i usuń je, aby zapobiec kontaminacji.Jak pokazano tutaj, w przypadku transgenów posiadających aktywność enhansera, pomyślna iniekcja prowadzi do specyficznej ekspresji transgenu w komórkach. Przykładowo, w płetwach piersiowych i medianowych oraz w notochordzie. Iniektowane ryby można następnie krzyżować w celu uzyskania stabilnych linii, takich jak ta przedstawiona stabilna linia, która wymusza ekspresję GFP w embrionalnym sercu w czwartej dobie po zapłodnieniu.W przypadku aktywnego wzmacniacza od 40 do 50 procent embrionów wykaże tkankowo specyficzną ekspresję transgenu, na przykład w płetwach piersiowych i brzusznych. Do 100 procent ryb F0 pozytywnych pod kątem GFP, wykazujących ekspresję dwóch transgenów z plazmidu toll, daje potomstwo transgeniczne. Jednak odsetek potomstwa niosącego transgen jest bardzo zróżnicowany i wynosi od mniej niż jeden procent do 72 procent.Wybieranie wyłącznie wstrzykniętych embrionów pozytywnych pod kątem GFP zazwyczaj zwiększa efektywność transmisji. Jedynie do 10 procent embrionów ryby kolcolistnej w pokoleniu F0 po ponownym wstrzyknięciu wykazuje fluorescencję w oczekiwanych tkankach. Ponadto wskaźnik transmisji dla materiału z ponownego wstrzyknięcia jest niższy niż w przypadku konstruktów plazmidowych.Jedynie do 14 procent przesiewowych osobników rodzaju stickleback przekazało modyfikację potomstwu. W przeciwieństwie do niskiej wydajności transgenezy zwrotnej, od 70 do 100 procent ryb po wstrzyknięciu talons wykazuje zmiany mozaikowe. W każdym z wstrzykniętych embrionów nieprzecięty amplikon PCR wskazuje, że niektóre komórki w każdym embrionie posiadają zmiany w locus docelowym.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura dla grupy 100 embrionów zajmuje nieco ponad godzinę. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że doskonalenie techniki i zwiększenie przeżywalności embrionów wymagają praktyki i cierpliwości. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby odpowiedzieć na dalsze pytania dotyczące szczegółowych wzorców ekspresji enhancerów.Ponadto ryby z edytowanym genomem mogą być hodowane w krzyżówkach w celu badania fenotypów wynikających z indukowanych mutacji. Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie genetyki ewolucyjnej i rozwojowej do badania regulacji i funkcji genów u ukleja. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobre zrozumienie sposobu wstrzykiwania embrionów ukleja w celu przeprowadzenia transgenezy i edycji genomu.

microinjection-for-transgenesis-genome-editing-threespine

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

Źródło: Chen, S., et al., Stereotaktyka chirurgiczna w komórkach prążkowia noworodków w mózgach myszy noworodków. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje stereotaktyczne wstrzyknięcie wektora wirusowego kodującego rekombinazę Cre i białko zielonej fluorescencji lub GFP do prążkowia genetycznie zmodyfikowanego szczeniaka myszy w celu uzyskania manipulacji genami poprzez wycięcie kasety STOP po bokach loxP, aktywując białko czerwonej fluorescencji lub RFP jako reportera.

Stereotaktyczne mikrowstrzyknięcie wektora wirusowego do manipulacji genami u prążkowia szczeniąt myszy

Mutageneza ukierunkowana na geny jest teraz możliwa w szerokim zakresie organizmów przy użyciu technik edycji genomu. W tym miejscu demonstrujemy protokół celowanej mutagenezy genów przy użyciu aktywatora transkrypcji, takiego jak nukleazy efektorowe (TALEN) u Astyanax mexicanus, gatunku ryb, który obejmuje ryby powierzchniowe i jaskiniowe.

Edycja genomu w Astyanax mexicanus przy użyciu nukleaz efektorowych podobnych do aktywatora transkrypcji (TALEN)

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak mikrowstrzykiwać mieszaninę DNA/DOTAP do pąków ocznych jednodniowych zarodków Xenopus laevis, oraz jak obrazować i rekonstruować indywidualne zielone białko fluorescencyjne (GFP) wyrażające aksonalne trzpienie wzrokowe w tektalnych śródmózgowiu nienaruszonych, żyjących kijanek Xenopus.

Mikroiniekcja DNA do zawiązków ocznych w zarodkach Xenopus laevis i obrazowanie GFP wyrażającego altanki aksonalne wzrokowe w nienaruszonych, żywych kijankach Xenopus

Tutaj przedstawiono protokół do produkcji i hodowli ryb elektrycznych z nokautem genomu CRISPR/Cas9. Szczegółowo przedstawiono wymagane wymagania z zakresu biologii molekularnej, hodowli i hodowli zarówno dla żywiciela, jak i mormyryda, a także techniki iniekcji w celu wytworzenia larw indelu F0 indukowanych przez Cas9.

Wyciszanie iskry: edycja genomu CRISPR/Cas9 u ryb o słabym natężeniu elektrycznym

Obecny protokół opisuje metodę wstrzykiwania zarodków kleszczy. Wstrzyknięcie zarodka jest preferowaną techniką manipulacji genetycznej w celu wytworzenia linii transgenicznych.

Technika iniekcji zarodka do edycji genów u kleszcza czarnonogiego, Ixodes scapularis

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Poznaj technikę mikroiniekcji do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów i enhancerów w genetyce rozwojowej i ewolucyjnej.

Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych

Przeglądaj więcej filmów