Mikroiniekcja do transgenezy i edycji genomu u cierników trójgrzbietowych
13 maja 2016
Transgeniczne manipulacje i edycja genomu są kluczowe dla funkcjonalnego testowania ról genów i elementów cis-regulatorowych. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół mikroiniekcji w celu generowania modyfikacji genomowych (w tym fluorescencyjnych konstruktów transgenów reporterowych za pośrednictwem Tol2, TALEN-ów i CRISPR) dla wyłaniającej się ryby modelowej, ciernika trójkolcowego.
Ogólnym celem tej techniki mikroiniekcji jest wygenerowanie transgenicznych i edytowanych genomem ryb cierników w celu przetestowania funkcji genów i wzmacniaczy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w genetyce rozwojowej i ewolucyjnej, takie jak to, w jaki sposób geny i wzmacniacze działają w celu generowania wzorca ciała. Główną zaletą tej techniki jest to, że skutecznie generuje transgeniczne ryby do funkcjonalnej analizy genetycznej.
Po przygotowaniu dwóch plazmidów i mRNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy wyciągnąć co najmniej cztery igły do mikropipet ze szkła borokrzemianowego. Przechowywać pionowo w kapilarnym słoiku do przechowywania, którego ostre końce są skierowane w dół. Aby zapłodnić do stu jaj ciernika, dodaj 50 mikrolitrów roztworu nasienia i delikatnie wymieszaj końcówką pipety, aby upewnić się, że wszystkie jaja zostały zapłodnione.
Podczas pracy z lodem napełnij z powrotem co najmniej trzy igły, pipetując 0,5 mikrolitra roztworu do wstrzykiwań do końca igły i pozwól mu spłynąć. W międzyczasie włącz światło transiluminacyjne dla mikroskopu preparacyjnego i umieść szklaną płytkę o powierzchni 13 centymetrów kwadratowych na podstawie lampy mikroskopu z 15-centymetrowym brzeszczotem do gipsu na szklanej płycie. Ustawić piłę prostopadle do aparatu iniekcyjnego z wgłębieniami skierowanymi w stronę uchwytu igły, a następnie włączyć skrzynkę sterowniczą i upewnić się, że ciśnienie jest ustawione na około 175 kilopaskalów.
Ustaw czas wstrzyknięcia na 180 milisekund. Następnie poluzuj uchwyt igły, a następnie włóż wypełnioną igłę do uchwytu, aż będzie wyczuwalny opór gumowego uchwytu i dokręć uchwyt igły, aż zostanie dokręcony palcami. Następnie ustaw kąt igły na około 45 stopni.
Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby wyregulować igłę tak, aby koniec był wyśrodkowany w polu view. Powiększ do około 40-krotnego powiększenia i skup się na końcówce igły, która nie powinna dotykać szkła poniżej. Za pomocą kleszczyków zegarmistrzowskich chwyć końcówkę igły na szerokość od końca od dwóch do trzech kleszczyków i delikatnie złamij końcówkę pod kątem 60 stopni.
Następnie kilkakrotnie nacisnąć pedał nożny do wstrzykiwań, aby sprawdzić, czy igła nie jest złamana. Po kilku dotknięciach z końca powinny zacząć wypływać maleńkie czerwone kropelki. Użyj jednorazowej pipety transferowej, aby umieścić kilka kropel wody ciernika na szklanej płytce.
Delikatnie zanurz igłę w wodzie, a następnie zwiększ ciśnienie wsteczne, aż z igły wynurzy się słaby strumień różowego płynu. Cofnąć igłę tak daleko, jak to możliwe, aby nie uległa uszkodzeniu podczas przygotowywania zarodków. Około 25 minut po zapłodnieniu użyj dwóch końcówek do pipet o pojemności 10 mikrolitrów, aby usunąć od pięciu do 10 zarodków z lęgu i przenieść je na szklaną płytkę.
Za pomocą końcówek pipet delikatnie rozdziel zarodki na poszczególne wgłębienia brzeszczotu, uważając, aby nie nakłuwać zarodków. Następnie za pomocą pipety transferowej dodaj tyle wody, aby przykryć zarodki. Następnie po trzech do pięciu sekundach usuń większość wody, pozostawiając tylko niewielką objętość pokrywającą każdy zarodek.
Zaczynając od zarodka znajdującego się najdalej, przesuń szklaną płytkę i powiększ zarodek tak, aby wypełnił około 25 procent pola widzenia. Opuść igłę w pole widzenia, a następnie użyj końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby delikatnie obrócić zarodek, aby zidentyfikować blastomer, ziarnisty, lekko żółty, wypukły guzek cytoplazmy na wierzchu żółtka. Obróć zarodek tak, aby blastomer był bezpośrednio prostopadły do końca igły.
Obniż igłę, wywierając nacisk powoli i równomiernie, aby przebić korion i włóż igłę do cytoplazmy, nie przepychając jej przez leżące poniżej żółtko. Wciśnij pedał nożny trzy do czterech razy, aby wstrzyknąć tak, aby czerwony bolus z lekko rozproszonymi krawędziami wypełnił około 1/8 średnicy cytoplazmy. Posiadanie ostrej igły prostopadłej do koriona ułatwi ten krok.
Ograniczenie ilości dodawanej wody pomoże utrzymać miękkość coriona. I wreszcie, celowanie w cytoplazmę zwiększy prawdopodobieństwo uzyskania transgenicznego zwierzęcia. Użyj elementów sterujących mikromanipulatora, aby schować igłę, a za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów przytrzymaj zarodek, jeśli przyklei się do igły.
Po wyjęciu igły należy przesunąć szklaną płytkę, aby wyrównać następny zarodek z igłą i powtórzyć wstrzyknięcie. Po wstrzyknięciu wszystkich zarodków należy użyć pipety transferowej z odciętym końcem, aby dodać wodę do płytki. Następnie użyj pipety transferowej, aby zebrać zarodki i umieść je na 150-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej wodą ciernika.
Inkubuj zarodki w temperaturze 18 stopni Celsjusza. Jednego dnia po wstrzyknięciu delikatnie odlej wodę z ciernika i zastąp ją świeżą wodą. Sprawdź, czy nie ma martwych lub zniekształconych zarodków i usuń, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
Jak pokazano tutaj, w przypadku transgenów, które mają aktywność wzmacniającą, udane wstrzyknięcie powoduje specyficzną ekspresję komórkową transgenu. Na przykład w płetwach piersiowych i środkowych oraz strunie grzbietowej. Ryby, którym wstrzyknięto zastrzyki, mogą być następnie krzyżowane w celu wytworzenia stabilnych linii, takich jak ta stabilna linia grzbietowa, która napędza ekspresję GFP w sercu zarodkowym po czterech dniach od zapłodnienia.
W przypadku aktywnego wzmacniacza od 40 do 50 procent zarodków będzie wykazywać specyficzną dla tkanek ekspresję transgenu, na przykład w płetwach środkowych i piersiowych. Do 100 procent ryb z dodatnim wynikiem GFP F0 wykazujących ekspresję transgenów plazmidowych generujących transgeny plazmidowe wytwarza transgeniczne potomstwo. Jednak odsetek potomstwa noszącego transgen waha się znacznie od mniej niż jednego procenta do 72 procent.
Zapisywanie tylko zarodków z dodatnim wynikiem GFP na ogół zwiększa skuteczność transmisji. Tylko do 10 procent zarodków ciernika wstrzykniętych metodą F0 wykazuje fluorescencję w oczekiwanych tkankach. Ponadto szybkość transmisji pleców jest niższa niż w przypadku konstruktów plazmidowych.
Tylko do 14 procent przesiewanych cierników przenosi plecy. W przeciwieństwie do niskiej skuteczności transgenezy wstecznej, od 70 do 100 procent ryb, którym wstrzyknięto szpony, ma zmiany mozaikowe. W tym przypadku nieoszlifowany amplikon PCR w każdym z wstrzykniętych zarodków wskazuje, że niektóre komórki w każdym zarodku przenoszą zmiany chorobowe w locus docelowym.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w nieco ponad godzinę na lęg 100 zarodków, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że praktyka i cierpliwość są wymagane, aby poprawić technikę i przeżycie zarodka. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby odpowiedzieć na dalsze pytania dotyczące szczegółowych wzorców ekspresji wzmacniacza.
Ponadto ryby z edytowanym genomem mogą być hodowane krzyżowo w celu badania fenotypów wynikających z indukowanych mutacji. Po jego opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się genetyką ewolucyjną i rozwojową do badania regulacji i funkcji genów u cierników. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wstrzykiwać zarodki ciernika w celu transgenezy i edycji genomu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół mikroiniekcji służący do wprowadzania modyfikacji genomowych u łososia trójcierniowego. Metoda koncentruje się na manipulacjach transgenicznych i technikach edycji genomu, w tym na konstruktach opartych na systemie Tol2, TALEN oraz CRISPR.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia rozwoju
- Biologia ewolucyjna
Wstęp
- Techniki transgeniczne i edycji genomu są niezbędne do funkcjonalnej analizy genów.
- Kolec trójcierniowy służy jako rozwijający się organizm modelowy.
- Zrozumienie funkcji genów i enhancerów jest kluczowe dla genetyki rozwoju i ewolucji.
- Ta technika mikroiniekcji pozwala na efektywne otrzymywanie ryb transgenicznych.
Cel badania
- W celu wytworzenia transgenicznych ryb cierniowych do funkcjonalnych analiz genetycznych.
- W celu zbadania roli genów i enhancerów w generowaniu wzorca budowy ciała.
- W celu opracowania wiarygodnej metody testowania funkcji genów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie plazmidów Tol2 oraz mRNA zgodnie z protokołem.
- Mikroiniekcja do zapłodnionych jaj pielęgnicy.
- Użycie igieł mikropipet do precyzyjnej iniekcji.
- Zapłodnienie jaj roztworem nasienia w celu zapewnienia prawidłowego rozwoju.
Główne wyniki
- Technika mikroiniekcji pozwala na skuteczne generowanie transgenicznych ryb z rodzaju poziomka.
- Efektywna produkcja organizmów zmodyfikowanych genetycznie do celów analitycznych.
- Ułatwia badanie funkcji genów i enhancerów.
- Przyczynia się do zrozumienia procesów rozwojowych i ewolucyjnych.
Wnioski
- Ta metoda stanowi cenne narzędzie dla badaczy w dziedzinie genetyki.
- Usprawnia ona możliwość badania złożonych interakcji genetycznych.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć inne organizmy modelowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Transgeneza i edycja genomu oparta na mikroiniekcji u trzernigowca umożliwiają bezpośrednią analizę funkcjonalną genów kandydackich i elementów regulacyjnych w modelu kręgowca o wysokiej różnorodności fenotypowej. Możliwość ta wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego i walidację celów na najwcześniejszych etapach odkryć, zapewniając pewność prognostyczną w zakresie funkcji genów i architektury regulacyjnej. Podejście to jest strategicznie ukierunkowane na selekcję portfela i priorytetyzację celów genetycznych w kontekstach rozwojowych i ewolucyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia testowanie funkcjonalne genów kandydackich i enhancerów zidentyfikowanych w badaniach mapowania.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez umożliwienie ukierunkowanej edycji genomu za pomocą TALENs i CRISPR/Cas9.
- Ułatwia walidację elementów regulacyjnych genów z wykorzystaniem transgenicznych testów reporterowych.
- Zapewnia pewność prognostyczną w odniesieniu do relacji gen-fenotyp w systemie kręgowców.
Przesiewy i rozwój testów
- Przygotowuje zwalidowane linie transgeniczne i edytowane genomowo do późniejszego screeningu fenotypowego.
- Standaryzuje protokoły mikroiniekcji i selekcji w celu zapewnienia powtarzalności oraz ilościowej oceny wydajności transgenezy.
- Umożliwia skalowalną produkcję genetycznie zmodyfikowanych embrionów do rozwoju testów analitycznych.
- Wspiera wiarygodną ocenę funkcji genów i aktywności regulacyjnej in vivo.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie manipulacji genetycznych z fenotypami istotnymi dla przebiegu choroby oraz adaptacjami ewolucyjnymi.
- Zapewnia ciągłość procesu od odkrycia genu do opracowania modelu przedklinicznego w kontekście kręgowców.
- Umożliwia dostosowanie postępów w badaniach nad celami genetycznymi do poziomu ryzyka w oparciu o wyniki funkcjonalne.
- Wspiera tworzenie stabilnych linii do badań podłużnych i międzypokoleniowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół mikroiniekcji wpisuje się w ciąg procesu badawczego, począwszy od identyfikacji genów kandydackich, aż po walidację funkcjonalną i tworzenie modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez bezpośrednią manipulację genami i enhancerami.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla transgenezy i wydajności edycji genomu.
- Analityka: Umożliwia pomiar ekspresji transgenu i częstości mutacji w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną w systemie kręgowców o zróżnicowanych fenotypach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę do manipulacji genetycznych, którą można zastosować w wielu programach badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad funkcją genów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy w zakresie manipulacji genetycznych.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka biologicznego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój celów genetycznych w ramach różnych programów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie mikroiniekcji oraz obchodzenia się z zarodkami.
- Niezbędny jest dostęp do specjalistycznej aparatury, takiej jak mikromanipulatory i mikroskopy stereoskopowe.
- W celu zapewnienia powtarzalności wymagana jest standaryzacja protokołów iniekcji i selekcji pomiędzy zespołami.
- Może być wymagana adaptacja metody dla różnych konstruktów genetycznych lub systemów modelowych.
- Wydajność oraz wskaźniki transmisji mogą różnić się w zależności od typu konstruktu i muszą zostać określone empirycznie.
