Name: Szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pGR-Blue i zespołu Golden Gate (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę szybkiej weryfikacji terminatorów za pomocą zespołu Golden Gate i plazmidu pGR-Blue. Protokół umożliwia ilościowe określenie siły terminatorów w ciągu mniej niż tygodnia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Malcomowi Campbellowi i Toddowi Eckdahlowi z programu Genome Consortium for Active Teaching (GCAT) oraz HHMI-Science Education Alliance - Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science (SEA-PHAGES).
Ten projekt był wspierany przez granty z National Center for Research Resources (P20RR016460) i National Institute of General Medical Sciences (P20GM103429) z National Institutes of Health. Badania te były częściowo wspierane przez National Science Foundation w ramach grantu# IIA-1457888. Dodatkowo fundusze instytucjonalne (Ouachita Baptist University) zostały zapewnione za pośrednictwem J.D. Patterson Summer Research Fellowship.

1. Projektowanie i zamawianie oligonukleotydów z odpowiednimi lepkimi końcami
<ol>
	<li>Zidentyfikuj potencjalne terminatory niezależne od rho poprzez analizę genomiczną z wykorzystaniem programów dostępnych bezpłatnie w sieci.7</li>
	<li>W przypadku pracy z dwuniciowym DNA określ orientację testowanego terminatora.7 Plazmid pGR-Blue weryfikuje jedynie terminatory ligowane w kierunku 5' do 3' na nici górnej (pasmo w przód).
	<ol>
		<li>Przekształć terminator z nici dolnej (odwrotnej) w jego komplementarny odwrócony odpowiednik, aby zmienić orientację sekwencji na potrzeby testowania w pGR-Blue, korzystając z bezpłatnego oprogramowania online, np. ApE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po potwierdzeniu prawidłowej orientacji dodaj lepki koniec „ 5'-CGAC-3' ” do końca 5' nici górnej. Dodaj lepki koniec „ 5'-CCGC-3' ” do końca 5' nici dolnej. 8 Zapewni to, że ligowany insert zostanie wstawiony w odpowiedniej orientacji przy użyciu GGA.</li>
	<li>Po ustaleniu sekwencji zamów komercyjnie jednoniciowe oligonukleotydy.</li>
</ol>
2. Wyżarzanie oligonukleotydów (dotyczy tylko liofilizowanego DNA)
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 100 µM.</li>
	<li>Przygotować 10-krotny bufor do wyżarzania: 1 M NaCl i 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Bufor do wyżarzania można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Po przygotowaniu bufora i ponownym zawieszeniu oligonukleotydów rozpocząć wyżarzanie8.</li>
	<li>Dla każdego terminatora poddanego badaniu dodać 16 µl wody ultra-czystej do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 2 µl 10-krotnego buforu do wyżarzania do każdej probówki do mikrocentryfugi.</li>
	<li>Dodać 1 µl oligonukleotydu nici górnej (10 µM) z wybranego terminatora.</li>
	<li>Dodać 1 µl oligonukleotydu nici dolnej (10 µM) z wybranego terminatora.</li>
	<li>Przygotować kąpiel w wrzącej wodzie, używając zlewki o pojemności 1 0 ml zawierającej około 40 ml wody z kranu, i ustawić ją na płycie grzewczej.</li>
	<li>Umieścić probówki do mikrocentryfugi z kroku 2.6 w pływaku i gotować przez 4 min. Po 4 min wyłączyć płytę grzewczą, ale pozostawić probówki i pływak w kąpieli wodnej do powolnego schłodzenia przez noc (18 h) 8. Wyżarzone terminatory przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
3. Montaż Golden Gate (mieszanka standardowa — kosztowo efektywna)
<ol>
	<li>Przygotować rozcieńczenie wyżarzonych terminatorów o stężeniu 40 nM. Dodać 124 µl wody wolnej od nukleaz do 1 µl mieszaniny wyżarzonych terminatorów (10 µM).
	<ol>
		<li>Odwirować próbki przez 30 s przy 10 0 x g i przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do nowej probówki odpowiedniej dla używanego termocyklera dodać 6 µl wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Dodać 1 µl komercyjnego buforu do ligazy DNA [30 mM Tris-HCl (pH 7,7-7,8), 10 mM MgCl2, 100 mM DTT oraz 10 mM ATP]. Wszystkie kolejne kroki wykonywać na lodzie.</li>
	<li>Do probówki do mikrowirowania dodać 1 µl plazmidu docelowego pGR-Blue (35-50 ng/µl).</li>
	<li>Do probówki do mikrowirowania dodać 1 µl wyżarzonych terminatorów o stężeniu 40 nM.</li>
	<li>Do probówki do mikrowirowania dodać 0,5 µl komercyjnej wysokowiernej endonukleazy restrykcyjnej BsaI.</li>
	<li>Do probówki do mikrowirowania dodać 0,5 µl komercyjnej ligazy DNA.</li>
	<li>Odwirować mieszaninę reakcyjną przy 10 0 x g przez 120 s. Następnie umieścić probówkę bezpośrednio w termocyklerze.</li>
	<li>Uruchomić program termocyklera: 20 cykli składających się z 1 min przy 37 °C, a następnie 1 min przy 16 °C, po których następuje 1 cykl 15 min przy 37 °C. Próbki należy zużyć niezwłocznie lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.8</li>
</ol>
4. Montaż Golden Gate (komercyjny Master Mix — oszczędność czasu)
<ol>
	<li>Do 1 µl wyżarzonych terminatorów o stężeniu 10 µM przygotowanych w kroku 2 dodać 124 µl wody wolnej od nukleaz. Pozwala to rozcieńczyć stężenie DNA terminatorów do 40 nM. Krok ten należy przeprowadzić w nowej, opisanej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Do nowej probówki odpowiedniej do termocyklera dodać 14 µl wody wolnej od nukleaz. Należy upewnić się, że nowa probówka jest odpowiednio opisana.</li>
	<li>Do probówki do mikrocentryfugi dodać 2 µl Commercial Master Mix Buffer.</li>
	<li>Do probówki do mikrocentryfugi dodać 1 µl plazmidu pGR-Blue (35-50 ng/µl).</li>
	<li>Do probówki do mikrocentryfugi dodać 2 µl wyżarzonych terminatorów o stężeniu 40 nM.</li>
	<li>Do probówki do mikrocentryfugi dodać 1 µl Commercial Master Mix.</li>
	<li>Probówkę z roztworem 40 nM wirować przy 10,0 x g przez 120 sec. Następnie umieścić probówkę bezpośrednio w termocyklerze.</li>
	<li>Uruchomić program termocyklera: 1 cykl trwający 60 min w 37 °C, a następnie 1 cykl trwający 15 min w 5 °C. Próbki należy wykorzystać niezwłocznie lub zamrozić i przechowywać w -20 °C.</li>
</ol>
5. Transformacja i selekcja kolonii
<ol>
	<li>Przygotować płytki Petri z agarem Luria Base (LB) zawierające ampicylinę (Amp) w stężeniu 1 mM oraz arabinozę (arb) w stężeniu 10 mM. Przygotować co najmniej 10 ml roztworu zapasowego L-arabinozy o stężeniu 1 M, ponieważ roztwór ten będzie wykorzystywany w kolejnych etapach.</li>
	<li>Do transformacji użyć dowolnych wysokowydajnych (108 - 109 transformantów/µg) chemicznie kompetentnych komórek E. coli (JM109).9 Aby uzyskać najlepsze wyniki, dodać 3-5 µl reakcji ligacji do 50 µl kompetentnych komórek. W przypadku użycia chemicznie kompetentnych komórek należy postępować zgodnie z protokołem transformacji specyficznym dla używanych komórek.</li>
	<li>Połowę (25 µl) przetransformowanych komórek rozprowadzić na uprzednio ogrzanych płytkach z agarem LB (Amp/arb) za pomocą sterylnego, L-kształtnego rozprowadzacza („hockey stick”) i inkubować przez noc (O/N) w temperaturze 37 °C. Ze względu na szybkie tempo rozkładu ampicyliny nie inkubować w 37 °C przez więcej niż 24 h.</li>
	<li>Przeprowadzić selekcję kolonii na podstawie koloru poprzez inspekcję wizualną. Prawidłowa ligacja powinna dawać kolonie w kolorze białym/żółtym w świetle widzialnym i fluorescencyjne zielone pod światłem niebieskim (450 nm) lub UV. Nieudana ligacja spowoduje powstanie kolonii o kolorze niebieskim w świetle widzialnym po 18 - 20 h.</li>
</ol>
6. Weryfikacja i kwantyfikacja terminatora
<ol>
	<li>Przygotować probówki z 5 ml sterylnego bulionu LB z dodatkiem 1 mM ampicyliny i 10 mM arabinozy. Liczba potrzebnych probówek zależy od liczby testowanych terminatorów oraz kontroli (komórki z opornością na ampicylinę, które nie fluorescują, oraz komórki zawierające niecięty plazmid pGR-Blue).</li>
	<li>W świetle widzialnym należy za pomocą sterylnej pętli pobrać 2–3 białe/żółte kolonie (krok 5.4). Próbki należy inkubować w bulionach na wytrząsarce w 37 °C oraz 160 obr./min przez 16–18 godz. Próbek tych nie należy inkubować dłużej niż przez 24 godz.
	<ol>
		<li>Opcjonalnie można użyć spektrofotometru do oznaczenia gęstości optycznej hodowli przy 60 nm (OD600) w celu zapewnienia odpowiedniego wzrostu komórek. Zazwyczaj wartość OD600 po 16–18 godzinach wzrostu obserwuje się wartość ~0,8–1,0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W pozostałych krokach należy użyć sterylnej płytki 96-dołkowej. Kroki te należy przeprowadzić w środowisku aseptycznym i w trzech powtórzeniach. Dodać 199 µl sterylnego bulionu LB z ampicyliną i arabinozą (1 mM ampicyliny/10 mM arabinozy) do każdego dołka. Pozostaw na płytce miejsce na trzy oddzielne kontrole.
	<ol>
		<li>Należy zastosować trzy poniższe kontrolki: dołek (1) zawierający wyłącznie pożywkę LB + Amp/arabinose oraz dołek (2) z nieprzekształconymi komórkami kompetentnymi (próba ślepa), służący jako tło. Do kwantyfikacji (3) siły terminatora należy włączyć komórki zawierające niecięty oryginalny pGR lub pGR-Blue zligowany z sekwencją nieterminującą (kontrolka referencyjna do kwantyfikacji). Patrz Rysunek 1 do układu płytki w czytniku płytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pipetka 1 µl zawiesiny komórkowej z pożywek inkubowanych przez noc do poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Uszczelnić płytki przepuszczalną osłoną i inkubować z wytrząsaniem przez 18–20 h w temperaturze 37 °C oraz 160 obr./min.</li>
	<li>Za pomocą czytnika płytek wyznaczyć OD600 poprzez odczyt absorbancji przy 60 nm. Fluorescencję GFP należy mierzyć przy następujących parametrach: wzbudzenie 395 i emisja 509. Fluorescencję RFP należy mierzyć przy następujących parametrach: wzbudzenie 575 i emisja 605. Po 18–20 godzinach wartość OD600 powinna wynosić około 0,5.</li>
	<li>Aby znormalizować wyniki pod kątem różnic w przyroście, należy zastosować następujące równanie: <img alt="Wzór na fluorescencję/gęstość optyczną (OD60); analiza danych mikrobiologicznych; równanie eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> zarówno dla GFP, jak i RFP.</li>
	<li>Po normalizacji należy wyznaczyć względną siłę terminatora, korzystając z równania  <img alt="Wzór na stosunek ekspresji genów; równowaga syntezy GFP i RFP; równanie w badaniach biologii molekularnej." src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 2"></li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
<li>Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+the+biology+community%3A+snapshots+of+change%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in the biology community: snapshots of change.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARNold%3A+a+web+tool+for+the+prediction+of+Rho-independent+transcription+terminators%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</a> RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).</li>
<li>Campbell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pClone%3A+Synthetic+Biology+Tool+Makes+Promoter+Research+Accessible+to+Beginning+Biology+Students%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).</li>
<li>Rhee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+medium+composition+and+plasmid+combination+on+the+growth+of+recombinant+Escherichia+coli+JM109+and+on+the+production+of+the+fusion+protein+EcoRI%3A%3ASPA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA.</a> J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).</li>
<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest odpowiednie zaprojektowanie oligonukleotydu przed złożeniem zamówienia. Oligonukleotydy muszą mieć odpowiednie lepkie końce dodane do końców 5' zarówno górnej, jak i dolnej nici, aby zapewnić możliwość włączenia GGA. Ponadto ważne jest, aby zmienić orientację terminatorów skierowanych w lewo (terminatorów, które zatrzymują transkrypcję na dolnej nici) na orientację terminatorów skierowanych w prawo (kończy transkrypcję na górnej nici), ponieważ wyrażenie GFP i RFP jest skierowa...

Duże projekty biologii syntetycznej wymagają użycia wysoce skutecznych terminatorów transkrypcji, aby pomóc regulować ekspresję genów. Identyfikacja nowych terminatorów wymaga bioinformatycznej analizy nowych genomów. Jednak wraz z rozwojem coraz większej ilości oprogramowania bioinformatycznego, z których każde ma unikalny algorytm wykorzystywany do przewidywania, pojawia się większa rozbieżność między przypuszczalnymi wynikami. Ponieważ proces ten jest nieco subiektywny i odbywa się in silico, przewidywania te wymagają biologicznego potwierdzenia. 1 Ponadto liczba domniemanych terminatorów zidentyfikowanych za pomocą analizy in silico wymaga zastosowania strategii klonowania, które można ukończyć w stosunkowo krótkim czasie. 
Plazmid PGR-Blue jest modyfikacją plazmidu PGR, która została przeprojektowana tak, aby używała Golden Gate Assembly (GGA) w celu uproszczenia procedury klonowania, umożliwiając jednoczesne przeprowadzenie wszystkich etapów reakcji w jednej probówce mikrowirówki. 2,3 Selekcja kolorów została włączona do plazmidu, aby zwiększyć łatwość identyfikacji dodatnich kolonii. Udana ligacja powinna być biało-żółta w świetle widzialnym i fluoryzować na zielono w świetle niebieskim (450 nm) lub ultrafioletowym (UV), gdy jest uprawiana na płytkach zawierających arabinozę. Ponieważ nieoszlifowany pGR-blue zawiera niebieskie białko chromo (amilCP), kolonie zawierające niezmodyfikowany plazmid są niebieskie w świetle widzialnym. To uproszczenie wraz z uproszczonym protokołem pozwala naukowcom przejść od identyfikacji bioinformatycznej do potwierdzenia biologicznego w ciągu trzech do czterech dni. Konstrukcja tego systemu może być korzystna zarówno w laboratorium badawczym, jak i w środowisku edukacyjnym.
Plazmid pGR-Blue pozwala na ilościowe określenie siły terminatora. 4 Pojedynczy promotor indukowany arabinozą jest używany do produkcji białka zielonej fluorescencji (GFP) i białka czerwonej fluorescencji (RFP). Terminator jest klonowany do plazmidu po sekwencji GFP, ale przed sekwencją RFP, zatrzymując w ten sposób transkrypcję białka RFP. Wytrzymałość terminatora zależy od stosunku wyprodukowanej GFP do wyprodukowanego zapytania ofertowego. 
Raport Vision and Change5 sugerował, że edukacja w zakresie nauk ścisłych, technologii, inżynierii i matematyki (STEM) wprowadza do klasy doświadczenia oparte na badaniach. 6 Wymaga to jednak opracowania protokołów, które mogą być wykonane przez uczniów o ograniczonych umiejętnościach w określonym czasie. Chociaż protokół można zrealizować w ciągu zaledwie trzech dni, został on również zaprojektowany tak, aby każdy główny krok można było wykonać w oddzielnym tygodniowym (2-3 godzinnym) okresie laboratoryjnym, aby stworzyć Course Research Experience (CRE). W przypadku zastosowania w ten sposób procedura trwa od trzech do sześciu tygodni i jest odpowiednia zarówno dla początkujących, jak i zaawansowanych kursów z genetyki, biologii komórki lub bioinformatyki.

<table><tbody><tr><td>pGR-Niebieski plazmid</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-Plasmid</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-(sterylne arkusze)</td> <td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>Tylko sterylne arkusze</td></tr><tr><td>10x bufor ligazy DNA T4</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>Enzym inny niż HF będzie działał, ale jest mniej stabilny termicznie.</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate Assembly Mix NEB</td><td></td><td>E1600S</td><td>Commerial Master Mix, o którym mowa w protokole.</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Okrągła mikrowirówka pływająca</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinoza</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A-3256</td><td>D-Arabinoza nie wywoła promotora pBAD</td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Broth, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>Luria Base (LB) - Agar, Miller</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix & Go Competent Cells - Szczep JM109</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>Użyj zalecanego przez firmę protokołu transformacji</td></tr><tr><td>ApE: Oprogramowanie do edytora plazmidów</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Tris-HCl, klasa molekularna</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (krystaliczny / biologiczny, certyfikowany)</td> <td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>Komercjalna synteza oligonukleotydów</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Mikrotestowe płytki do hodowli tkanek - 96 dołków (sterylne)</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacteriophage "Bernal13"</td><td>"Bank genów</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr>Zintegrowane technologie DNA<td>bez nukleazy</td> (<td>IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny, w kształcie litery L Hockey-Stick Cell Life</td><td>Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold: narzędzie internetowe do przewidywania terminatorów transkrypcji niezależnych od Rho.</td><td></td><td></td><td></td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</tr></tbody></table>

szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pgr-blue i zespołu golden gate

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

Celem tego protokołu jest umożliwienie szybkiej weryfikacji biologicznie zidentyfikowanych terminatorów. Co więcej, plazmid (pGR-Blue) został zaprojektowany specjalnie dla tego protokołu i pozwala na ilościowe określenie wydajności terminatora. Jako dowód słuszności koncepcji, w mykobakteriofagu Bernal13 zidentyfikowano bioinformatyczny sześć terminatorów. Po zidentyfikowaniu terminatory zostały następnie wykonane jako oligonukleotydy z odpowiednimi lepkimi końcami i wyżarzane razem. Korzystając z Golden Gate Assembly (GGA), terminatory zostały następnie sklonowane do pGR-Blue. W świetle widzialnym fałszywie dodatnie kolonie wydają się niebieskie, a dodatnio przekształcone kolonie są białe/żółte. Po indukcji promotora indukowanego arabinozą (pBad) arabinozą, siłę kolonii można określić, mierząc stosunek wytwarzanego białka zielonej fluorescencji (GFP) do wytwarzanego białka czerwonej fluorescencji (RFP). Dzięki pGR-Blue protokół można ukończyć w ciągu zaledwie trzech dni i jest idealny w środowisku edukacyjnym. Ponadto wyniki pokazują, że protokół ten jest przydatny jako środek do zrozumienia przewidywań in silico dotyczących wydajności terminatora związanej z regulacją transkrypcji.

Niniejszy protokół pozwoli na otrzymanie komórek zawierających pGR-Blue z terminatorem ligowanym pomiędzy GFP i RFP przy użyciu metody Golden Gate Assembly (Rysunek 2). Pozytywne kolonie zawierające zligowany insert można wyselekcjonować na podstawie koloru. W świetle widzialnym kolonie pozytywne będą białe/żółte, natomiast wyniki fałszywie dodatnie objawią się powstaniem kolonii niebieskich po 18-20 h inkubacji w 37 °C (Rysunek 3).
<p class="jove_con...

Ten protokół wykorzystuje Golden Gate Assembly i plazmid pGR-blue do szybkiego ilościowego określenia siły terminatorów znalezionych w silico.

Szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pGR-Blue i zespołu Golden Gate

The goal of this protocol is to allow for the rapid verification of bioinformatically identified terminators. Further, the plasmid (pGR-Blue) is designed ...

Ogólnym celem protokołu biologii syntetycznej jest szybkie określenie funkcjonalności terminatorów oraz ilościowe określenie ich siły w systemie in vitro wykorzystującym montaż Golden Gate. Protokół ten służy do testowania terminatorów zidentyfikowanych in silico za pomocą bioinformatyki i weryfikowania ich w środowisku biologicznym. Pozwala to na szybkie i proste potwierdzenie w warunkach laboratoryjnych terminatorów wytypowanych metodami bioinformatycznymi.Główną zaletą tego protokołu jest jego szybkość. Możemy przejść od identyfikacji bioinformatycznej do potwierdzenia biologicznego w mniej niż jeden tydzień. Robiąc to, możemy również zweryfikować, czy terminator rzeczywiście jest terminatorem, oraz określić siłę jego terminacji.Zazwyczaj osoby początkująco mają trudności z opanowaniem tej techniki, ponieważ dodanie enzymu restrykcyjnego i ligazy do tej samej probówki wydaje się nieintuicyjne. Jednak stosujemy endonukleazy restrykcyjne typu 2S, w których miejsce rozpoznawania enzymu jest oddzielone od właściwego miejsca cięcia. Gdy terminator zostanie ligowany do plazmidu pGR blue, ligacja ta staje się trwała.Jednak dzięki umieszczeniu enzymu restrykcyjnego i ligazy w jednej probówce oraz przeprowadzeniu wielu cykli, możemy uzyskać wysoką wydajność klonowania. Należy rozpocząć tę procedurę od resuspensji poszczególnych oligonukleotydów w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia 100 µM, a następnie przygotować 10x bufor do wyżarzania. Następnie należy opisać probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dla każdego testowanego terminatora.Do każdej probówki dodaj 16 µL ultra-czystej wody, 2 µL 10x buforu do hybrydyzacji oraz po 1 µL oligonukleotydów nici górnej i dolnej dla wybranych terminatorów. Bardzo ważne jest upewnienie się, że zamówione oligonukleotydy posiadają prawidłowe lepkie końce. Po ich wzajemnej hybrydyzacji kluczowe jest, aby terminator znajdował się w odpowiedniej orientacji.Jeśli terminator znajduje się w niewłaściwej orientacji, pGR blue nie pozwoli zweryfikować, czy jest on funkcjonalny. Następnie umieść probówki do mikrocentryfugi w wyporności i gotuj je przez cztery minuty w łaźni wodnej. Po czterech minutach wyłącz płytkę grzejną, ale pozostaw probówki w wodzie na noc, aby powoli ostygły.Przechowywać wyżarzane terminatory w temperaturze 20°C. Aby przygotować rozcieńczenie wyżarzonych terminatorów do stężenia 40 nM, najpierw rozmrozić je na lodzie, a następnie w nowej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml dodać 124 µL wody wolnej od nukleaz do 1 µL wyżarzonych terminatorów. Wirować próbki przez 30 sekund przy 10 000×g.Po wirowaniu próbki należy przechowywać w lodzie. Do nowej probówki odpowiedniej dla termocyklera należy dodać 6 µL wody wolnej od nukleaz. Następnie należy dodać 1 µL komercyjnego buforu do ligazy DNA.Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w lodzie. Następnie dodać 1 µL zawierającego od 35 do 50 ng/µL plazmidu docelowego pGR blue, 1 µL 40 nM wyżarzonych terminatorów, 0,5 µL komercyjnej wysokowiernej nukleazy restrykcyjnej BSA1 oraz 0,5 µL komercyjnej ligazy DNA. Mieszaninę reakcyjną wirować z prędkością 10 000x g przez 120 sekund.Następnie umieść probówkę bezpośrednio w termocyklerze i uruchom następujący program: 20 cykli obejmujących 1 minutę w temperaturze 37 °C, a następnie 1 minutę w temperaturze 16 °C, a na koniec jeden cykl trwający 15 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu programu zamroź i przechowuj próbki w temperaturze -20 °C lub natychmiast przystąp do transformacji.Przenieś produkty reakcji ligacji do chemicznie kompetentnych komórek e. coli, stosując dowolny odpowiedni protokół transformacji. W tym przypadku komórki JM109 są transformowane metodą zippy transformation.Używając szklanego rozpylacza w kształcie litery L, rozprzestrzenić 25 µL transformowanych komórek na uprzednio ogrzanych płytkach z agarem LB zawierającym 1 mM ampicyliny oraz 10 mM arabinozy. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C. Nie inkubować ich dłużej niż przez 24 godziny.Ampicylina ulega szybkiej degradacji. Następnego dnia należy sprawdzić kolor kolonii. Prawidłowa ligacja powinna być biała lub żółta w świetle widzialnym i wykazywać zieloną fluorescencję pod wpływem światła niebieskiego lub UV.Nieudana ligacja spowoduje powstanie kolonii o niebieskim kolorze w świetle widzialnym. Dla każdego z terminatorów i kontroli należy przygotować probówkę zawierającą 5 milliliters sterylnego bulionu LB z 1 millimolar ampicillin i 10 millimolar arabinose. Podczas wykonywania tego protokołu z pGR niezwykle ważne jest upewnienie się, że zastosowano odpowiednie kontrole.Pierwszą kontrolą powinna być sama pożywka LB. Kolejną kontrolą powinny być komórki wykazujące oporność na ampicylinę, ale niefluorescencyjne w świetle niebieskim. Będą one służyć jako tło.Kolejną kontrolą jest nieprzecięty plazmid pGR, który nie posiada wstawionego terminatora, co będzie służyć jako punkt odniesienia dla siły terminacji; ostatnia z probówek jest przeznaczona dla próbki. W świetle widzialnym, za pomocą sterylnej pętli, pobierz 2 do 3 białych lub żółtych kolonii i przenieś je do bulionu LB. Próbki inkubuj w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przy 160 rpm przez 16 do 18 godzin.Następnego dnia, przy użyciu spektrofotometru, należy oznaczyć gęstość optyczną każdej próbki przy 600 nanometrach. Zazwyczaj po tym czasie oczekiwana wartość OD 600 wynosi od 0,8 do 1,0. Umieść sterylną płytkę 96-dołkową w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Dla każdej próbki lub kontroli przygotuj 3 dołki zawierające 199 µL sterylnego bulionu LB z ampicyliną i arabinozą. Następnie pipetuj 1 µL roztworu komórek z bulionów hodowlanych z inkubacji nocnej do poszczególnych dołków płytki 96-dołkowej. Przykryj płytki przepuszczalną osłoną, a następnie inkubuj je przez 18 do 20 godzin w temperaturze 37 °C przy 160 rpm.Następnego dnia za pomocą czytnika płytek należy wyznaczyć wartość OD 600, która powinna wynosić około 0,5. Należy również zmierzyć fluorescencję G of P przy długości fali wzbudzenia 395 nanometrów i długości fali emisji 509 nanometrów. Fluorescencję RFP należy zmierzyć przy długości fali wzbudzenia 575 nanometrów i długości fali emisji 605 nanometrów.Przy użyciu programu Excel znormalizuj różnice w tempie wzrostu, dzieląc fluorescencję przez OD 600. Po normalizacji określ względną siłę terminatora, dzieląc stosunek fluorescencji terminatora GFP do fluorescencji kontroli GFP przez stosunek fluorescencji terminatora RFP do fluorescencji kontroli RFP. Zgodnie z opisem w tym filmie przeanalizowano domniemane terminatory od T1 do T6, zidentyfikowane bioinformatycznie w fagu bernal 13 mikrobakterii.Wyniki te przedstawiają względną fluorescencję. Wszystkie wyniki zostały znormalizowane z wykorzystaniem komórek zawierających niepocięty, niemodyfikowany PGR jako kontrolę. Stwierdzono, że T3 jest silnym terminatorem.Wszystkie wyniki reprezentują poszczególne kolonie hodowane w trzech powtórzeniach, a ich średnie wartości zostały przedstawione w celu wizualizacji. Słupki błędów reprezentują odchylenia między uśrednionymi punktami danych. Aby wyznaczyć najlepszą kontrolę referencyjną do kwantyfikacji siły terminatora, porównano surowe dane z wykorzystaniem oryginalnego plazmidu pGR niezawierającego terminatora oraz pGR blue z wklonowaną sekwencją, o której wiadomo, że nie jest terminatorem.Jak widać tutaj, obie kontrolne wykazały podobne poziomy ekspresji GFP i RFP, a co ważniejsze, wygenerowały podobne stosunki GFP do RFP. Wszystkie te wyniki reprezentują pojedyncze kolonie, które były hodowane w trzech powtórzeniach, a ich średnie wartości zostały przedstawione w celu wizualizacji. Po opanowaniu tej techniki cały proces może zająć zaledwie 72 godziny, wliczając w to czas zamawiania i wysyłki.Należy zauważyć, że pGR blue działa wyłącznie w e.coli. Ponadto, ponieważ analizujemy tylko niewielki fragment terminatora, nie mamy pewności co do innych elementów regulacyjnych, które mogą kontrolować transkrypcję. Aby zweryfikować wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu z wykorzystaniem pGR blue, można zastosować dodatkowe metody, takie jak ilościowy PCR.Dodatkowo wstawkę pGR można wyciąć i ligować do wybranego plazmidu.

rapid-verification-terminators-using-pgr-blue-plasmid-golden-gate

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Designerskie nukleazy, takie jak nukleazy palców cynkowych (ZFN) i aktywatory transkrypcji podobne do efektorów (TALENs) mogą być używane do modyfikacji genomu mysich zarodków preimplantacyjnych poprzez aktywowanie zarówno szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ), jak i homologicznej rekombinacji (HR). Postępy te umożliwiają szybkie generowanie myszy z precyzyjnymi modyfikacjami genetycznymi.

Inżynieria genomu myszy przy użyciu nukleaz projektanta

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Ten protokół opisuje metodę wyprowadzania bramek przemieszczenia nici DNA z plazmidów i testowania ich za pomocą pomiarów kinetyki fluorescencji. Bramki można modułowo komponować w systemy wieloskładnikowe w celu przybliżenia zachowania formalnych sieci reakcji chemicznych (CRN), demonstrując nowe zastosowanie CRN jako molekularnego języka programowania.

Bramki przemieszczenia nici DNA pochodzące z plazmidu do realizacji sieci reakcji chemicznych

Przedstawiamy protokół do oceny funkcjonalnej kompleksowych bibliotek mutagenezy saturacji pojedynczym miejscem białek wykorzystujących sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Co ważne, podejście to wykorzystuje ortogonalne pary starterów do budowy i sekwencjonowania bibliotek multipleksowych. Przedstawiono reprezentatywne wyniki przy użyciu TEM-1 β-laktamazy dobranej w klinicznie istotnej dawce ampicyliny.

Protokół oceny funkcjonalnej bibliotek mutagenezy nasycenia całych białek wykorzystujących sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

Tutaj prezentujemy protokół opisujący, jak i) złożyć samoreplikujący się wektor za pomocą modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate, ii) wprowadzić wektor do sinicowego gospodarza przez koniugację, oraz iii) scharakteryzować transgeniczne szczepy sinic za pomocą czytnika płytek lub cytometrii przepływowej.

Modyfikacja genetyczna cyjanobakterii przez koniugację przy użyciu modułowego zestawu narzędzi do klonowania CyanoGate

Opisujemy metodę generowania nasyconych bibliotek mutantów transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych i późniejszego przygotowania bibliotek amplikonów DNA do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Jako przykład skupiamy się na patogenie ESKAPE, Acinetobacter baumannii, ale ten protokół jest podatny na szeroką gamę organizmów Gram-ujemnych.

Generowanie bibliotek insercji transpozonów w bakteriach Gram-ujemnych w celu sekwencjonowania o wysokiej przepustowości

Celem tego protokołu jest dostarczenie szczegółowego, krok po kroku przewodnika do tworzenia konstruktów wielogenowych za pomocą modułowego systemu klonowania opartego na klonowaniu Golden Gate. Zawiera również zalecenia dotyczące krytycznych kroków, aby zapewnić optymalny montaż w oparciu o nasze doświadczenia.

Szybkie składanie konstruktów wielogenowych przy użyciu modułowego klonowania Golden Gate

Systemy CRISPR-Cas i białka anty-CRISPR zostały zintegrowane ze schematem bramek Boole'a u Saccharomyces cerevisiae. Nowe małe obwody logiczne wykazały się dobrą wydajnością i pogłębiły wiedzę zarówno na temat czynników transkrypcyjnych opartych na dCas9/dCas12a, jak i właściwości białek anty-CRISPR.

Genowe obwody cyfrowe oparte na systemach CRISPR-Cas i białkach anty-CRISPR

Poznaj metodę szybkiej weryfikacji terminatorów za pomocą zespołu Golden Gate i plazmidu pGR-Blue. Protokół umożliwia ilościowe określenie siły terminatorów w ciągu mniej niż tygodnia.

Szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pGR-Blue i zespołu Golden Gate

Przeglądaj więcej filmów