Szybka weryfikacja terminatorów za pomocą plazmidu pGR-Blue i zespołu Golden Gate

Ogólnym celem protokołu biologii syntetycznej jest szybkie określenie funkcjonalności terminatora i ilościowe określenie siły terminatora w systemie in vitro, który wykorzystuje montaż złotej bramy. Protokół ten służy do testowania terminatorów, które znaleźliśmy in silico przy użyciu bioinformatyki i testowania ich w warunkach biologicznych. Pozwala to na szybkie i proste potwierdzenie biologicznie zidentyfikowanych terminatorów w warunkach laboratoryjnych.

Główną zaletą tego protokołu jest jego szybkość. Od identyfikacji bioinformatycznej do potwierdzenia biologicznego możemy przejść w czasie krótszym niż tydzień. W ten sposób możemy również zweryfikować, czy terminator jest w rzeczywistości terminatorem i możemy określić ilościowo jego siłę zakończenia.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby będą początkowo zmagać się z tą techniką, ponieważ wydaje się to sprzeczne z intuicją, aby dodać enzym restrykcyjny z ligazą w tej samej probówce. Używamy jednak endonukleaz restrykcyjnych typu 2S, a miejsce rozpoznania enzymu jest oddzielone od rzeczywistego miejsca cięcia. Gdy terminator zostanie podwiązany do niebieskiego plazmidu pGR, jest to trwałe podwiązanie.

Jednak dzięki temu, że enzym restrykcjonowy i ligaza znajdują się w tej samej probówce, przechodząc przez wiele cykli, możemy osiągnąć wysoką wydajność zamykania. Rozpocznij tę procedurę od ponownego zawieszenia poszczególnych oligonukleotydów w wodzie wolnej od nukleaz o stężeniu 100 mikromolowym, a następnie przygotuj 10-krotny bufor do wyżarzania. Następnie oznacz 1,5 mililitra probówkę mikrowirówki dla każdego testowanego terminatora.

Do każdej probówki dodaj 16 mikrolitrów ultraczystej wody, 2 mikrolitry 10x buforu do wyżarzania i po 1 mikrolitrze każdego z górnych i dolnych pasm oligonukleotydów z żądanych terminatorów. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że zamówione oligonukleotydy mają prawidłowe lepkie końce. Ponieważ po ich wyżarzeniu ważne jest, aby upewnić się, że terminator jest we właściwej orientacji.

Jeśli terminator jest w złej orientacji, niebieski pGR nie będzie w stanie zweryfikować, czy jest to działający terminator. Następnie umieść probówki do mikrowirówek w pływaku i gotuj je przez cztery minuty w łaźni wodnej. Po czterech minutach wyłącz płytę grzewczą, ale pozostaw rurkę w wodzie na noc, aby powoli ostygła.

Wyżarzone terminatory należy przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby uzyskać 40-nanomolowe rozcieńczenie wyżarzonych terminatorów, najpierw rozmrozić je na lodzie, a następnie w nowej 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej dodać 124 mikrolitry wody wolnej od nukleaz do 1 mikrolitra wyżarzonych terminatorów. Odwirowywać próbki przez 30 sekund przy 10 000 g.

Po odwirowaniu należy przechowywać próbki na lodzie. W nowej probówce termocyklera dodaj 6 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Następnie dodaj jeden mikrolitr komercyjnego buforu ligazy DNA.

Wykonaj wszystkie kolejne kroki na lodzie. Następnie dodaj 1 mikrolitr zawierający od 35 do 50 nanogramów na mikrolitr niebieskiego plazmidu docelowego pGR, 1 mikrolitr 40 terminatorów wyżarzonych nanomolowo, 0,5 mikrolitra komercyjnej endonukleazy restrykcyjnej BSA1 o wysokiej wierności i 0,5 mikrolitra komercyjnej ligazy DNA. Odwirować mieszaninę reakcyjną o stężeniu 10 000 g przez 120 sekund.

Następnie umieść probówkę bezpośrednio w termocyklerze i uruchom następujący program: 20 cykli po 1 minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, następnie 1 minutę w temperaturze 16 stopni Celsjusza, a następnie jeden cykl po 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu cyklu należy zamrozić i przechowywać próbki w temperaturze 20 stopni Celsjusza lub natychmiast przejść do transformacji.

Przekształć reakcje ligacji w chemicznie kompetentne komórki E. coli przy użyciu dowolnego odpowiedniego protokołu transformacji. Tutaj komórki JM109 są przekształcane za pomocą transformacji zippy.

Za pomocą szklanego kija hokejowego w kształcie litery L rozprowadź 25 mikrolitrów przekształconych komórek na wstępnie podgrzanych płytkach agarowych LB zawierających 1 milimolową ampicylinę i 10 milimolową arabinozę. Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Nie inkubuj ich dłużej niż 24 godziny.

Ampicylina ulega szybkiemu rozkładowi. Następnego dnia sprawdź kolor kolonii. Udana ligacja powinna być biała lub żółta w świetle widzialnym i fluoryzować na zielono w świetle niebieskim lub UV.

Nieudana ligacja wytworzy kolonię, która w świetle widzialnym ma niebieski kolor. Dla każdego z terminatorów i kontroli przygotuj probówkę zawierającą 5 mililitrów sterylnego bulionu LB z 1 milimolową ampicyliną i 10 milimolową arabinozą. Podczas wykonywania tego protokołu, w przypadku pGR bardzo ważne jest, aby upewnić się, że stosowane są odpowiednie kontrole.

Pierwszą kontrolą powinien być po prostu bulion LB. Następną kontrolą powinny być komórki, które mają oporność na ampicylinę, ale nie fluoryzują w świetle niebieskim. Będą one służyć jako puste miejsce.

Następna kontrola to plazmid pGR, który nie jest cięty, więc nie ma terminatora na miejscu, co posłuży jako punkt odniesienia dla siły terminatora, a ostatnia z twoich probówek będzie przeznaczona dla twojej próbki. W świetle widzialnym użyj sterylnej pętli, aby wybrać od 2 do 3 białych lub żółtych kolonii i przenieść je do bulionu LB. Pozostawić próbki do inkubacji na wytrząsarce w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy 160 obr./min przez 16 do 18 godzin.

Następnego dnia użyj spektrofotometru, aby określić gęstość komórek optycznych każdej próbki o długości 600 nanometrów. Ogólnie rzecz biorąc, po tym czasie oczekuje się, że OD 600 wyniesie od 0,8 do 1,0. Umieść sterylną 96-dołkową płytkę w kapturze.

Dla każdej próbki lub kontroli przygotuj 3 studzienki ze 199 mikrolitrami sterylnego bulionu LB z ampicyliną i arabinozą. Następnie odpipetować 1 mikrolitr roztworu komórkowego z bulionów na noc do indywidualnych dołków płytki 96-dołkowej. Napełnij talerze oddychającym pokrowcem, a następnie potrząsaj nimi przez 18 do 20 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 160 obr./min.

Następnego dnia użyj czytnika płytek, aby określić OD 600, który powinien wynosić około 0,5. Zmierz również fluorescencję G of P przy długości fali wzbudzenia 395 nanometrów i przy emisji 509 nanometrów. Zmierz fluorescencję RFP przy długości fali wzbudzenia 575 nanometrów i emisji 605 nanometrów.

Korzystając z programu Excel, znormalizuj zmienność wzrostu, dzieląc kwiatostan przez OD 600. Po normalizacji określ względną siłę terminatora, biorąc fluorescencję terminatora GFP nad fluorescencją kontrolną GFP i dzieląc ją przez fluorescencję terminatora RFP przez fluorescencję kontrolną RFP. Napraw domniemane terminatory od T1 do 6 bioinformatyczne zidentyfikowane w mikrobakteriach faga bernal 13 zostały przeanalizowane zgodnie z opisem w tym filmie.

Wyniki te wskazują na fluorescencję względną. Wszystkie wyniki znormalizowano przy użyciu komórek zawierających nieoszlifowany, niezmodyfikowany PGR jako kontrolę. Okazało się, że T3 jest silnym terminatorem.

Wszystkie wyniki reprezentują poszczególne kolonie wyhodowane w trzech egzemplarzach i uśrednione w celu reprezentacji wizualnej. Słupki błędów reprezentują odchylenia między uśrednionymi punktami danych. Aby określić najlepszą kontrolę referencyjną do ilościowego określania siły terminatora, porównano surowe dane przy użyciu oryginalnego plazmidu pGR nie zawierającego terminatora oraz niebieskiego pGR sklonowanego z sekwencją, o której wiadomo, że nie jest terminatorem.

Jak widać tutaj, obie kontrole wykazały podobne poziomy wyrażenia GFP i RFP, a co ważniejsze, wytworzyły podobne proporcje GFP do RFP. Wszystkie te wyniki reprezentują pojedyncze kolonie, które były hodowane w trzech egzemplarzach i uśrednione w celu reprezentacji wizualnej. Po opanowaniu ta technika może zająć zaledwie 72 godziny, wliczając w to czas wysyłki i zamówienia.

Ważne jest, aby pamiętać, że niebieski pGR działa tylko w E.coli. Dodatkowo, ponieważ patrzymy tylko na mały fragment terminatora, naprawdę nie mamy pojęcia o innych elementach regulacyjnych, które mogą kontrolować transkrypcję. Aby zweryfikować wyniki osiągnięte za pomocą tego protokołu przy użyciu pGR blue, można zastosować dodatkowe metody, takie jak ilościowy PCR.

Dodatkowo wkładkę pGR można wyciąć i podligować do wybranego plazmidu.