Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podniesienie ciśnienia wewnątrzgałkowego
14 lipca 2016
Ten artykuł opisuje procedurę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki przez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe u myszy. Uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne siatkówki spowodowane podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym służy do modelowania ludzkich patologii charakteryzujących się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki, umożliwiając naukowcom zbadanie potencjalnych mechanizmów komórkowych i metod leczenia chorób układu nerwowo-naczyniowego siatkówki u ludzi.
Ogólnym celem tej techniki jest dostarczenie eksperymentalnego modelu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki i jego patologicznych konsekwencji. Metoda ta jest powszechnie stosowana do badania mechanizmów leżących u podstaw niedokrwienia-reperfuzji siatkówki, a także do oceny potencjalnych podejść terapeutycznych w leczeniu powiązanych patologii. Główną zaletą tej techniki jest to, że powoduje ona uraz silnie ukierunkowany na struktury oka, powodując jednocześnie minimalne uszkodzenia otaczających tkanek.
Przydatność tej techniki rozciąga się w kierunku zrozumienia i trzech miesięcy wielu objawów uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki, w tym: stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego i dysfunkcji spojrzenia w jednostce nerwowo-naczyniowej siatkówki. Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ techniki chirurgiczne zakładania kaniuli mogą być trudne do odtworzenia bez przewodnika wizualnego. Przed rozpoczęciem zabiegu ogrzej pustą klatkę na stole.
Następnie włóż ostry koniec wstępnie przebitej rurki w kształcie litery Y do butelki z 0,1% heparyną sodową i zawieś spód heparyny sodowej na przedłużeniu bieguna dożylnego. Otwórz zaślepkę filtra powietrza na węźle. Następnie podnieś butelkę z heparyną na 163 centymetry od blatu stołu do szczytu kroplówki z heparyną sodową, aby wytworzyć ciśnienie przepływu heparyny sodowej wynoszące 120 mililitrów rtęci.
Otwórz wstępnie przebity przewód w kształcie litery Y w zestawie głównym, aby umożliwić heparynie sodowej wypełnienie przewodu, a następnie podłącz wstępnie przebity przewód w kształcie litery Y do kolektora z pięcioma zaworami. Następnie, używając złączek rurkowych Luer męskich na męskich Luer, podłącz półcalowe igły o średnicy 30 mm do pięcioportowego kolektora. Włóż każdą z igieł do własnego dziesięciocalowego segmentu rurki o rozmiarze 30.
Następnie, używając hemostatów, złamij nowe półcalowe końcówki igieł o rozmiarze 30 i włóż ich końce do otwartych końców rurki o rozmiarze 30. Następnie użyj taśmy, aby ułożyć rurki igłowe w taki sposób, aby rurki połączone z portami wewnętrznymi były umieszczone na górze rurek połączonych z portami zewnętrznymi, aby zapobiec splątaniu rurki podczas kaniulacji komory przedniej. Teraz włącz przepływ 0,1% heparyny sodowej do kolektora pięciu zaworów i do każdego pojedynczego portu na dwie do trzech minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.
Następnie wyłącz wszystkie porty na wyspie z pięcioma zaworami. Aby wykonać kaniulację, po podaniu znieczulenia, umieść wszystkie myszy w ciepłej klatce na stole operacyjnym, potwierdzając osiągnięcie głębokiego znieczulenia przez brak reakcji na szczypanie palca u nogi po pięciu do dziesięciu minutach. Następnie podaj jedną kroplę tropicamidu do rozszerzenia źrenicy i jedną kroplę proparakainy do znieczulenia miejscowego do oczu każdego ze zwierząt i ułóż myszy w kolejności znieczulenia, tak aby pierwsza znieczulona mysz była pierwszą myszą, która zostanie poddana kaniulacji.
Czekając, aż krople do oczu zaczną działać, przygotuj czterocalowe proste kawałki taśmy, mocno pociągając za taśmę przed rozdarciem i odkładając na bok jeden kawałek taśmy na zwierzę. Należy pamiętać, że niemocne pociągnięcie za taśmę spowoduje zwijanie się taśmy. Kiedy pierwsza mysz będzie gotowa, umieść zwierzę pod mikroskopem chirurgicznym.
Następnie włącz pierwszy port sodowy 0,1% heparyny na kolektorze z pięcioma zaworami i użyj kleszczy, aby delikatnie przesunąć jedno oko. Następnie włóż igłę kaniuli o rozmiarze 30 do przedniej komory mniej więcej w połowie odległości między włóknami strefowymi a wierzchołkiem rogówki. Uważając, aby nie przeniknąć do konrei po raz drugi.
Należy pamiętać, że delikatny ruch skręcający służy do głębokiego wprowadzenia kaniuli do przedniej komory. Teraz dociśnij rurkę o rozmiarze 30 do blatu, aby zminimalizować ruch włożonej kaniuli, sięgając po kawałek taśmy, a następnie użyj taśmy, aby przymocować rurkę do stołu. Po zabezpieczeniu rurki zapisz czas rozpoczęcia zabiegu.
Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy nie ma wycieku i czy oko niedokrwienno-reperfuzyjne jest większe niż oko przeciwległe, aby ustalić obecność wzdęcia oka. Nakładaj hypromelozę na oba oczy co 30 minut, aż do końca eksperymentu, aby nasmarować rogówkę i uszczelnić wszelkie mikrowycieki. Jeśli zwierzę poruszy się podczas zabiegu, podnieś ogon i podaj dootrzewnowo wzmacniacz ketaminy.
90 minut po kaniulacji pierwszego zwierzęcia delikatnie wyciągnij kaniulę z przedniej komory i nasmaruj oba oczy galaretką nawilżającą. Gdy kolejne kaniule są usuwane, umieść każdą mysz z powrotem w klatce na stole operacyjnym, aż zwierzęta w pełni wyzdrowieją. Po usunięciu wszystkich kaniul zdezynfekuj je chusteczkami nasączonymi alkoholem.
Następnie użyj 60-mililitrowej strzykawki wypełnionej powietrzem, aby usunąć sód heparyny z pięciu zaworów, igieł 30 G, rurki 30 G i kaniuli. Następnie opłucz wszystkie narzędzia 60-mililitrową strzykawką wypełnioną wodą destylowaną. Na koniec usuń destylowaną wodę ze wszystkich materiałów za pomocą 60 mililitrów powietrza i przechowuj zdezynfekowany i wypłukany sprzęt do późniejszego użycia.
Znakowanie immunologiczne NeuN jąder neuronalnych ujawnia znaczną utratę komórek nuronalnych, w następstwie uszkodzenia niedokrwienia-reperfuzji, za pomocą konfokalnego obrazowania mikroskopowego, siedem dni po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym. Rzeczywiście, ręczna kwantyfikacja komórek NeuN dodatnich w kontroli i oczy z reperfuzją niedokrwienną wykazuje zmniejszenie liczby neuronów warstwy komórek gangelionu po urazie, wskazując na obecność śmierci komórki wywołanej niedokrwieniem-reperfuzją. Niższe amplitudy załamków a i b udokumentowane przez elektroretinografię oznaczają również występowanie zaburzeń funkcji neuronów siatkówki wywołanych niedokrwieniem-reperfuzją w porównaniu z kontrolnymi, nieuszkodzonymi oczami.
Po opanowaniu technikę tę można wykonać na dziesięciu zwierzętach w ciągu około pięciu godzin, w tym ostatnie dwie godziny spędzone na oczekiwaniu, aż myszy dojdą do siebie po znieczuleniu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać głębokie znieczulenie. Jako skuteczna sedacja zapobiegnie przemieszczaniu się kaniuli przez ruch zwierzęcia.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektroretinografia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcji siatkówki. Technika ta umożliwiła naukowcom zajmującym się okulistyką, neurobiologią i biologią naczyniową zbadanie patogenezy nerwowo-naczyniowej siatkówki i interwencji terapeutycznej u gryzoni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć ukierunkowany uraz siatkówki poprzez kaniulację przedniej komory oka.
Nie zapominaj, że praca z narzędziami chirurgicznymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie skutecznego usuwania ostrych narzędzi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę indukowania urazu niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podwyższenie ciśnienia wewnątrzgałkowego u myszy. Metoda ta modeluje patologie ludzkie charakteryzujące się upośledzonym dostarczaniem tlenu i składników odżywczych do siatkówki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Okulistyka
- Patofizjologia
Wstęp
- Uszkodzenie reperfuzyjne w wyniku niedokrwienia siatkówki jest kluczowym obszarem badań.
- Model ten pomaga w zrozumieniu mechanizmów komórkowych związanych z chorobami siatkówki.
- Umożliwia on ocenę potencjalnych podejść terapeutycznych.
- Technika ta minimalizuje uszkodzenia tkanek otaczających.
Cel badania
- Aby stworzyć model eksperymentalny uszkodzenia wynikającego z niedokrwienia i reperfuzji siatkówki.
- Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw niedokrwienia i reperfuzji siatkówki.
- Aby ocenić podejścia terapeutyczne w stosunku do związanych z tym patologii.
Zastosowane metody
- Indukcja urazu niedokrwienno-reperfuzyjnego siatkówki poprzez podwyższone ciśnienie wewnątrzgałkowe.
- Wykorzystanie kaniulacji w celu precyzyjnego ukierunkowania urazu.
- Demonstracja wideo wspomagająca reprodukcję techniki chirurgicznej.
- Ocena stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego oraz dysfunkcji w neuronaczyniowej jednostce siatkówki.
Główne wyniki
- Utworzenie ukierunkowanego uszkodzenia struktur oka.
- Zaobserwowano minimalne uszkodzenia tkanek otaczających.
- Wgląd w mechanizmy stanu zapalnego i stresu oksydacyjnego.
- Potencjalne implikacje dla strategii terapeutycznych w chorobach siatkówki.
Wnioski
- Technika ta jest cenna w badaniach nad uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym siatkówki.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie następstw patologicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu w celu eksploracji metod leczenia.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model ten zapewnia ukierunkowany, powtarzalny system do badania neurodegeneracji siatkówki w jaskrze oraz w niedrożnościach naczyniowych, co umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka kandydatów na leki neuroprotekcyjne. Poprzez izolację niedokrwienia wewnętrznych warstw siatkówki za pomocą kontrolowanego podniesienia IOP, model ten wspiera testowanie hipotez w obrębie neuronaczyniowej jednostki siatkówki z zachowaniem specyficzności anatomicznej. Podejście to zapewnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po przedkliniczną ewaluację terapii ukierunkowanych na stany zapalne, stres oksydacyjny oraz szlaki śmierci neuronalnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych w szlakach neurodegeneracji siatkówki.
- Wartość operacyjna: Zapewnia system istotny dla danej choroby do funkcjonalnej walidacji celu w modelach chorób oczu.
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez modelowanie mechanizmów niedokrwienia i reperfuzji istotnych dla patologii ludzkiej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanej tkanki siatkówki do ilościowej oceny wpływu związków na przeżywalność neuronów.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie powtarzalnego uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego do standaryzowanego przesiewu czynników neuroprotekcyjnych.
- Wartość naukowa: Umożliwienie pomiaru wyników funkcjonalnych za pomocą elektroretinografii oraz punktów końcowych histopatologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje mechanizmy uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego (I/R) siatkówki człowieka, w tym stan zapalny i degenerację naczyń włosowatych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia zachowanie ciągłości od etapu odkryć po przedkliniczną walidację strategii modyfikujących przebieg choroby.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka, łącząc oddziaływanie na cel terapeutyczny z odczytami neurodegeneracji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności, w szczególności w przypadku neurodegeneracyjnych chorób siatkówki. Umożliwia on przesiewy oparte na hipotezach, a następnie walidację mechanistyczną w fizjologicznie istotnym kontekście.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka biologicznego w odniesieniu do celów terapeutycznych w neurodegeneracji siatkówki.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testów z mierzalnymi wynikami, takimi jak utrata komórek NeuN+ oraz redukcja amplitudy ERG.
- Analityka: Generuje mierzalne zmienne zależne, w tym liczbę komórek neuronalnych i dysfunkcję elektrofizjologiczną.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie patofizjologii I/R istotnej dla człowieka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do oceny wielu modalności terapeutycznych w programach okulistycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celu poprzez mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad neurodegeneracją siatkówki.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki kontrolowanemu podwyższeniu IOP oraz technice kaniulacji.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji go/no-go poprzez ograniczenie biologicznego ryzyka na późnych etapach rozwoju terapeutyków okulistycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji skorygowanej o ryzyko w oparciu o neurodegenerację i wyniki funkcjonalne.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrochirurgii i technik kaniulacji wewnątrzgałkowej.
- Zależne od instrumentarium, w tym mikroskopów chirurgicznych, zbiorników ciśnieniowych i rozdzielaczy zaworowych.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia spójnego podwyższenia IOP oraz czasu trwania niedokrwienia.
- Konieczne jest uwzględnienie różnic między szczepami myszy a podstawową fizjologią oka.
- Ograniczone przez złożoność techniczną kaniulacji oraz potrzebę prowadzenia wizualnego w celu zapewnienia powtarzalności.
