Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja DNA i RNA o wysokiej wydajności i jakości z przybrzeżnych osadów morskich, a następnie ilościowe określenie genów i transkryptów rybosomalnego RNA 16S. Ta metoda opisująca ekstrakcję DNA i RNA z osadów morskich, a następnie ilościową reakcję PCR, jest kluczowym krokiem w analizie molekularnej obfitości i różnorodności drobnoustrojów w środowisku. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do koekstrakcji DNA i RNA z tej samej próbki, która może być następnie wykorzystana do dalszej analizy, takiej jak ilościowy PCR.

Procedurę zademonstrują dr Enrico Tatti z NUI Galway oraz Duncan Sweeney, doktorant z University of Essex. Aby koekstrahować DNA i RNA z osadów przybrzeżnych po przygotowaniu materiałów wolnych od RNA i pobraniu próbek osadów przybrzeżnych zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś 0,5 grama osadu do dwumililitrowej probówki do lizowania kulek. Dodaj 500 mikrolitrów buforu fosforanowego CTAB i 500 mikrolitrów alkoholu fenolowo-chloroformowego: izoamylowego do probówki i odwróć pięć do 10 razy w celu homogenizacji próbki.

Wiruj z pełną prędkością przez 2,5 minuty, a następnie wiruj z prędkością 16 000 razy g i czterema stopniami Celsjusza przez 10 minut. Następnie w dygestorium odsuń górną warstwę wody i przenieś ją do nowej sterylnej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie umieść próbki na lodzie i dodaj 500 mikrolitrów lodowatego chloroformu: alkoholu izoamylowego.

Następnie odwróć probówkę kilka razy, aż pojawi się emulsja i odwiruj jak poprzednio. W dygestoriach wyciągnij górną warstwę wodną i umieść w nowej sterylnej rurce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie, aby wytrącić kwasy nukleinowe, dodaj dwie objętości 30% roztworu chlorku sodu PEG i dobrze wymieszaj.

Inkubować na lodzie przez dwie godziny lub pozostawić próbki na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji odwirować próbki w temperaturze 16 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Za pomocą mikropipety delikatnie usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu.

Pozostaw około 10 mikrolitrów roztworu PEG w probówce i dodaj jeden mililitr lodowatego 70% etanolu. Po odwirowaniu próbki należy użyć mikropipety, aby powoli usunąć etanol, uważając, aby nie dotknąć osadu. Następnie odwirować przez pięć sekund i usunąć pozostały etanol.

Pozostaw granulkę do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut przed użyciem 50 mikrolitrów uzdatnionej wody DEPC do jej ponownego zawieszenia. Podwielokrotnić próbkę o objętości 15 mikrolitrów dla DNA i 30 mikrolitrów dla RNA. Najważniejszym krokiem jest upewnienie się, że osad DNA/RNA nie zostanie usunięty podczas usuwania supernatantu i nie pozostanie żaden pozostał etanol przed ponownym zawieszeniem osadu w wodzie, ponieważ hamuje to dalszą reakcję molekularną.

Aby strawić DNA w próbce RNA, dodaj trzy mikrolitry buforu DNazy I i 1,5 mikrolitra DNazy I do 30-mikrolitrowej podwielokrotności kwasu nukleinowego. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wymieszać odczynnik inaktywacji DNazy przez wirowanie przez 30 sekund.

Następnie dodaj 4,8 mikrolitra roztworu do próbki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut, od czasu do czasu stukając w dno probówek, aby wymieszać roztwór. Po odwirowaniu próbki przenieść supernatant zawierający RNA do nowej probówki, uważając, aby nie przenieść osadu. Aby sprawdzić jakość RNA, rozcieńczyć dwa mikrolitry RNA, jeden na 10, dodając 18 mikrolitrów sterylnej wody dejonizowanej bez RNaz.

W oddzielnych reakcjach PCR dodaj jeden mikrolitr czystego lub jeden na 10 rozcieńczenia RNA do sterylnej probówki PCR o pojemności 0,5 mililitra. Postępując zgodnie z tabelą w protokole tekstowym, dodaj składniki reakcji PCR, aby amplifikować gen rybosomalnego RNA 16S. Obejmują kontrolę pozytywną, kontrolę inhibitora PCR i kontrolę ujemną.

Następnie uruchom reakcje PCR, stosując następujące parametry amplifikacji. Aby wygenerować pierwszą nić cDNA z RNA, dodaj odczynniki reakcyjne do 0,2 mililitrowej probówki PCR zgodnie z protokołem tekstowym. Inkubować próbki w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie umieść próbki na lodzie na co najmniej jedną minutę, a następnie inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po inkubacji dodać odczynniki z podanej tutaj tabeli z protokołu tekstowego i inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez 50 minut. Następnie dezaktywuj reakcję w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po wygenerowaniu wzorców DNA i RNA do qPCR zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić środowiskowe próbki DNA i cDNA, wzorce i odczynniki qPCR na lodzie. Rozcieńczyć wzorce kwasów nukleinowych i przygotować jedno na 10 rozcieńczenia środowiskowego DNA i cDNA od czystego do 10 do minus trzy. Zrób mieszankę wzorcową dla całkowitej liczby reakcji plus 10% i dobrze wymieszaj.

Dodać 19 mikrolitrów mieszanki wzorcowej i jeden mikrolitr matrycy w trzech egzemplarzach do każdego dołka na 96-dołkowej płytce optycznej qPCR. Użyj osłony optycznej qPCR, aby zakryć płytkę. Następnie na krótko odwirować płytkę i załadować ją do bloku grzewczego maszyny qPCR.

Następnie otwórz oprogramowanie menedżera qPCR, a następnie kliknij kartę Protokół, kliknij Utwórz nowy i dodaj następujące warunki amplifikacji. Ustaw objętość próbki na 20 mikrolitrów, kliknij przycisk OK i zapisz protokół. Teraz wybierz zakładkę Blacha.

Następnie w obszarze Edytuj wybrane kliknij opcję Wybierz fluorofor. Dodaj barwnik reporterowy dla odpowiedniej sondy i kliknij przycisk OK. Podświetl studzienki zawierające wzorce, a następnie z menu Typ próbki wybierz Standardowy. Wybierz opcję Replikuj serię, aby zmienić wartość Rozmiar replikacji na trzy, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Wybierz Seria rozcieńczeń, aby dodać obliczone stężenie początkowe dla wzorca. Wskaż współczynnik rozcieńczenia równy 10, wybierz opcję Malejący lub Zwiększający w zależności od kolejności, w jakiej krzywa standardowa została dodana do płytki, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. Zaznacz pozycje odwiertów zawierających nieznane próbki i wybierz opcję Nieznany z menu rozwijanego Typ próbki.

Wybierz opcję Replikuj serie i zmień opcję Rozmiar replikacji na trzy, a następnie kliknij przycisk Zastosuj. W obszarze Nazwa próbki edytuj nazwy próbek i powtórz procedurę dla braku studzienek kontrolnych szablonu. Następnie w polu edytora blach kliknij przycisk OK i zapisz plik.

Następnie kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie. Po zakończeniu przebiegu wybierz kartę Kwantyfikacja, aby wyświetlić krzywą standardową, deskryptory krzywej standardowej i wykresy wzmocnienia. Na koniec wybierz zakładkę Dane kwantyfikacyjne dla wartości Cp i odpowiadającej im ilości początkowej dla genów z nieznanych próbek.

Określ liczbę kopii genów na gram osadu o mokrej masie zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tym zdjęciu żelu, udana ekstrakcja kwasu nukleinowego daje wyraźne prążki DNA i RNA, w których widoczne są ostre prążki rybosomalnego RNA 23S i 16S, oprócz obecności pasma genomowego DNA o dużej masie cząsteczkowej. Rysunek ten pokazuje, że gdy dziesięciokrotny zakres rozcieńczeń jest prawidłowo przygotowany i wzmocniony w celu wygenerowania krzywej wzorcowej, która ma być użyta w reakcji qPCR, widoczna jest różnica 3,3 cyklu między każdym wzorcowym rozcieńczeniem.

Ważne jest, aby zgłaszać punkt przecięcia lub wartości Cp z kontrolki braku szablonu lub NTC, jeśli jest dostępna. W takim przypadku narzuca się punkt odcięcia Cp dla próbek standardowych i nieznanych wynoszący 3,3 cykli lub logarytm zagięcia wyższy niż wartość Cp NTC, jak opisano wcześniej. Tutaj przeprowadzono amplifikację próbki środowiskowej od czystych, 10 do minus jeden, 10 do minus dwa i 10 do minus trzech.

Czysta próbka nie uległa amplifikacji, a wartości Cp od 10 do minus 10 do minus trzech rozcieńczeń wynosiły odpowiednio 24,12, 26,02 i 28,40. Jak widać na tym wykresie, pożądane są standardowe deskryptory krzywych, w tym wartości R kwadrat wynoszące 0,99 i sprawność PCR w zakresie od 90 do 110%. W tym eksperymencie NTC Cp wynosił 30,5, a ujemna wartość odcięcia Cp wynosiła 27,2.

Przeliczenie obfitości genów na gram mokrej masy osadu spowodowało odpowiednio 2,5 razy 10 do siódmego i 7,1 razy 10 do siódmego dla 10 do minus jeden i 10 do minus dwa rozcieńczenia. Rozcieńczenie Cp od 10 do minus 3 było większe niż wartość odcięcia NTC. W tym przypadku wybrano proporcje 10 do dwóch ujemnych jako optymalne rozcieńczenie matrycy.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że RNA może ulec szybkiej degradacji, dlatego ważne jest, aby trzymać próbkę na lodzie i używać rękawiczek, aby uniknąć zanieczyszczenia RNazą przez cały czas. Nie zapominaj, że pracujemy z fenolem: chloroformem i alkoholem izamylowym, a to może być bardzo niebezpieczne. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, rękawic i okularów ochronnych oraz praca pod kapturem chemicznym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ekstrahować DNA i RNA oraz określać ilościowo obfitość genów i transkryptów w morskich osadach przybrzeżnych. Pamiętaj, że ta procedura może być łatwo wykorzystana do ekstrakcji DNA i RNA oraz do ilościowego określenia szeregu docelowych genów z większości próbek środowiskowych, w tym gleby.