Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo
26 września 2016
Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.
Ogólnym celem obrazowania paramagnetycznego elektronów szybkiego skanowania (RSEPRI) jest dostarczenie ilościowych informacji na temat stężenia tlenu, pH, statusu redoks i stężenia cząsteczek sygnałowych, które są przydatne w badaniach biomedycznych. EPRI jest narzędziem, które można wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad rakiem dotyczące środowiska guza. Główną zaletą szybkiego skanowania obrazowania EPR jest to, że można uzyskać więcej informacji w znacznie szybszym czasie, przy użyciu szerszej gamy cząsteczek sondy w porównaniu z obrazowaniem EPR fali ciągłej lub CW.
Cząsteczki, które są wrażliwe na status redoks lub pH, są dobrym przykładem tego, gdzie EPRI z szybkim skanowaniem naprawdę błyszczy. Rozpocznij tę procedurę od obliczenia warunków eksperymentalnych szybkiego skanowania, jak określono w protokole tekstowym. Jednym z ważnych elementów szybkiego skanowania jest zrozumienie zależności sygnału od szerokości pasma rezonatora i warunków eksperymentalnych, takich jak szerokość przemiatania częstotliwości skanowania.
Aby naprawdę zoptymalizować eksperyment, musisz zrozumieć wszystkie trzy. Sterownik cewki szybkiego skanowania ma dwa wzmacniacze. Wybierając kondensator, skrzynka kondensatora musi być zrównoważona z równą pojemnością po każdej stronie obudowy.
Obie strony są połączone szeregowo. Odkręć górną pokrywę skrzynki kondensatorów i włóż kondensatory po obu stronach, które są równe określonej wartości. Załóż górną część obudowy kondensatora i przykręć ją, aby upewnić się, że pozostaje na swoim miejscu.
Korzystając z przedniego panelu przetwornika cewki rezonansowej, wyreguluj częstotliwość wyjściową, aż przebieg sinusoidalny osiągnie maksymalną amplitudę. Aby przygotować rodniki, wyjmij N-15 PDT z zamrażarki i pozwól, aby pojemnik osiągnął temperaturę pokojową. Odważ 1,4 miligrama N-15 PDT za pomocą wagi analitycznej.
Dodaj 1,4 miligrama N-15 PDT do 15 mililitrów wody dejonizowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 milimola. Następnie połącz 50 miligramów BMPO z pięcioma mililitrami wody w 16-milimetrowej rurce do napromieniania kwarcowego. Dodaj 100 mikrolitrów 300-milimolowego nadtlenku wodoru.
Napromieniuj mieszaninę w 16-milimetrowej kwarcowej rurce do napromieniania średniociśnieniową lampą ultrafioletową o mocy 450 W przez pięć minut. Za pomocą szklanej pipety transferowej przenieś dwa punkty pięciomililitrowe napromieniowanego roztworu BMPO-OH z kwarcowej probówki do napromieniania na jedną stronę kwarcowej probówki do pobierania próbek o grubości 16 milimetrów z trzymilimetrowym rozdzielaczem. Przenieś pozostałe dwa przecinki po pięć mililitrów napromieniowanego BMPO-OH na drugą stronę kwarcowej probówki z próbką za pomocą rozdzielacza.
Drugim krytycznym krokiem jest zrozumienie krzywej nasycenia mocy. Wraz ze wzrostem szybkości skanowania uzyskujesz dostęp do wyższych mocy i większych amplitud sygnału, zanim sygnał zostanie nasycony. Większe amplitudy sygnału to kolejny sposób na skrócenie czasu akwizycji.
Najpierw dostrój rezonator wodną próbką rodnika nitroksydowego, wkładając 15-mililitrową próbkę 0,5 milimolowego N-15 PDT do wody do 16-milimetrowej kwarcowej rurki rezonansu paramagnetycznego elektronów. Włóż rurkę kwarcową po stronie detekcji rezonatora rezonansu paramagnetycznego elektronowego z szybką pętlą krzyżową lub rezonatora RSEPR. Zmień częstotliwość źródła przyrządu, aż będzie zgodna z częstotliwością strony detekcji, która zawiera próbkę.
Teraz zmień częstotliwość strony wzbudzenia, aby dopasować ją do częstotliwości źródła eksperymentu i strony detekcji rezonatora. Zmień częstotliwość strony wzbudzenia, obracając kondensator zmienny we wnęce rezonatora. Aby ustawić konsolę instrumentu i magnes główny, włącz spektrometr i wybierz eksperyment, który rejestruje dane przejściowe wraz z czasem na odciętych.
Wykonaj krzywą nasycenia mocy na standardowej próbce rodnika nitroksydowego w tych samych warunkach eksperymentalnych, które zostaną wykorzystane do przyjrzenia się rodnikom wrażliwym na pH lub status redoks. Po skonfigurowaniu systemu gradienty są stosowane ręcznie lub za pomocą programu komputerowego do eksperymentu obrazowania. Natężenie sygnału EPR jest wprost proporcjonalne do pola mikrofalowego w rezonatorze, które powoduje przejście spinu z jednego poziomu energii na drugi.
To pole mikrofalowe nosi nazwę B1. B1 jest proporcjonalna do pierwiastka kwadratowego z mocy mikrofal. Gdy moc mikrofal wzrasta czterokrotnie, B1 jest podwajana. W tej liczbie moc jest czterokrotnie zwiększona z ośmiu do 32 miliwatów, a B1 jest podwojona z 18 do 36 miligaussów.
Krzywą nasycenia mocy można skonstruować, wykreślając amplitudę względną jako funkcję pierwiastka kwadratowego mocy mikrofal lub, jeśli znana jest sprawność rezonatora, B1. Obszar tej krzywej, który jest liniowy, pokazuje obszar mocy, w którym sygnał EPR nie jest nasycony ani zniekształcony. Jedną z zalet eksperymentu z szybkim skanowaniem jest to, że liniowy zakres mocy jest rozszerzony, reprezentowany przez kolorowe kropki, w porównaniu ze zwykłym eksperymentem CW reprezentowanym przez czarne kropki. Pokazano dwuwymiarowy spektralny przestrzenny obraz fantomów składający się z adduktu BMPO-OH oddalonego od siebie o trzy milimetry przy stężeniu pięciu mikromolowców.
Przekrój obrazu pokazuje kształt widmowy w zakresie 250 megaherców. Zdjęcie przedstawia rodnik nitranylowy N-14, który może być użyty do uwięzienia tlenku azotu in vivo w fantomie, gdzie ścianka o grubości jednego punktu i pięciu milimetrów oddziela dwie komory na próbki. Kształt widmowy w częstotliwości 250 megaherców jest pokazany tutaj.
Dwuwymiarowy obraz rodników triarylometylowych wrażliwych na pH odzwierciedla różnicę w cechach spektralnych, gdy pH buforu fosforanowego jest równe siedmiu przecinkom zerowym lub pH jest równe siedmiu przecinkom czterema. To zdjęcie przedstawia dinitrotlenek N-15 w dwukomorowym fantomie z 10-milimetrowym przekładką. Początkowo w obu komorach znajduje się sonda 0,5 milimolowa.
Dodanie glutationu do dinitroksydu rozbija zredukowany obszar łącznika i wytwarza dwa mononitroksydy, zmianę, która znajduje odzwierciedlenie w dwuwymiarowym obrazie. Opracowanie EPR do szybkiego skanowania to całkowita zmiana paradygmatu w naszej zdolności do badania cząsteczek z niesparowanymi elektronami. Widzieliście dzisiaj jego zastosowanie do EPR in vivo, ale ma również wspaniałe możliwości w badaniach niskotemperaturowych związków zawierających metale i wiele innych rodzajów układów.
Dla wszystkich próbek, które badaliśmy do tej pory, uzyskaliśmy poprawę w stosunku sygnału do szumu o co najmniej rząd wielkości, a czasem nawet więcej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono nową metodę elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) znaną jako RS-EPR (rapid scan EPR), służącą do dwuwymiarowego (2D) obrazowania przestrzennego widm. Metoda RS-EPR oferuje liczne zalety w porównaniu do tradycyjnych technik fali ciągłej (CW), szczególnie w kontekście zastosowań w obrazowaniu in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Obrazowanie biomedyczne
- Elektronowy rezonans paramagnetyczny
- Badania nad rakiem
Wprowadzenie
- Szybkie obrazowanie paramagnetyczne za pomocą skanowania elektronowego (RSEPRI) dostarcza ilościowych danych na temat różnych parametrów biologicznych.
- Jest ono szczególnie użyteczne w ocenie środowisk nowotworowych w badaniach nad rakiem.
- Technika ta pozwala na szybsze pozyskiwanie danych w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Może ona wykorzystywać szerszy zakres cząsteczek sondy wrażliwych na stan redoks i pH.
Cel badania
- Udoskonalić techniki obrazowania stosowane w badaniach biomedycznych.
- Dostarczyć szczegółowych informacji na temat stężenia tlenu, pH oraz cząsteczek sygnałowych.
- Poprawić zrozumienie mikrośrodowiska guza.
Zastosowane metody
- Obliczanie warunków eksperymentalnych dla szybkiego skanowania.
- Ocena zależności sygnału od szerokości pasma rezonatora.
- Ocena warunków eksperymentalnych, takich jak zakresy częstotliwości skanowania.
- Zastosowanie RS-EPR przy 250 MHz, z możliwością użycia innych częstotliwości.
Główne wyniki
- Wykazanie przewagi RS-EPR nad CW EPR w obrazowaniu.
- Zdolność do pozyskania większej ilości informacji w krótszym czasie.
- Skuteczne obrazowanie cząsteczek wrażliwych na pH i stan redoks.
- Potencjał do szerszych zastosowań w obrazowaniu in vivo.
Wnioski
- RS-EPR stanowi znaczący postęp w technikach obrazowania EPR.
- Otwiera on nowe możliwości badawcze w obszarze nowotworów oraz innych dziedzin biomedycznych.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jego zastosowań na różne częstotliwości.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Szybkie obrazowanie EPR (elektronowy rezonans paramagnetyczny) umożliwia ilościową, w czasie rzeczywistym ocenę krytycznych parametrów fizjologicznych, takich jak napięcie tlenowe, pH, stan redoks oraz reaktywne cząsteczki sygnałowe w żywych systemach. Zdolność ta wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad onkologią i chorobami zapalnymi, zapewniając bezpośredni odczyt warunków mikrośrodowiskowych, które wpływają na odpowiedź terapeutyczną i oporność. Zwiększona czułość, rozdzielczość przestrzenna oraz szybkość akwizycji tej metody poprawiają pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych, co ułatwia wcześniejsze podejmowanie decyzji go/no-go w procesach walidacji celów terapeutycznych i optymalizacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie dynamiki natlenienia, pH i procesów redox w modelach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowych, rozdzielczych przestrzennie odczytów biomarkerów mikrośrodowiskowych w celu wyjaśnienia aktywności szlaków oraz stopnia zaangażowania celu terapeutycznego.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez korelację zmian sygnału sondy z fenotypami funkcjonalnymi, co zwiększa pewność co do relacji między celem a chorobą.
Przesiew i opracowanie testu
- Gotowość analizy: Generuje standaryzowane, powtarzalne obrazy spektralno-przestrzenne cząsteczek reporterów rodnikowych wrażliwych na bodźce fizjologiczne.
- Wynik ilościowy: Dostarcza zależne od stężenia zmiany sygnału dla tlenu, pH i form redoks, umożliwiając profilowanie odpowiedzi na dawkę oraz inhibitorów.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Kompatybilna z różnorodnymi cząsteczkami sond (np. BMPO-OH dla •OH, nitranyl dla NO•, triarylometyl dla pH) w wielu układach eksperymentalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio obrazuje niedotlenienie guza, kwasicę i stres oksydacyjny – kluczowe cechy progresji nowotworu i oporności na terapię.
- Ciągłość translacyjna: Łączy mechanistyczne wnioski z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez monitorowanie tych samych biomarkerów w różnych modelach.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Umożliwia podłużne śledzenie zmian w mikrośrodowisku w celu optymalizacji schematów dawkowania i strategii łączonych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Szybkie skanowanie EPR (elektronowy rezonans paramagnetyczny) wpisuje się w kontinuum odkryć – od testowania hipotez dotyczących celu, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po przedkliniczną ocenę skuteczności, szczególnie w sytuacjach, gdy modulacja mikrośrodowiska jest mechanizmem działania lub czynnikiem oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez wizualizację wpływu perturbacji genetycznych lub farmakologicznych na parametry tlenowe, pH lub redoks w modelach komórkowych i tkankowych.
- Przesiewanie: Umożliwia opracowanie testów dla związków modulujących sygnalizację hipoksyczną, szlaki antyoksydacyjne lub enzymy regulujące pH poprzez mierzalne przesunięcia EPR.
- Analityka: Zapewnia ilościowe, ratiometryczne pomiary intensywności sygnału sondy i kształtu widma, co pozwala na porównania między różnymi warunkami i punktami czasowymi.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z istotnością in vivo poprzez obrazowanie tych samych reporterów rodnikowych w fantomach i systemach żywych.
- Zastosowania komercyjne: Funkcjonuje jako nieniszczący, gotowy do użycia moduł obrazowania, kompatybilny z istniejącymi zestawami do obrazowania przedklinicznego i możliwy do adaptacji do różnych chemii sond.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności wkładu mikrośrodowiska w fenotyp.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i wydajność dzięki szybszej akwizycji oraz wyższemu stosunkowi sygnału do szumu w porównaniu z CW-EPR.
- Wartość strategiczna: Usprawnia selekcję portfela poprzez wczesne identyfikowanie związków, które zawodzą z powodu niekorzystnych oddziaływań mikrośrodowiskowych na etapie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia alokację zasobów dostosowaną do ryzyka poprzez priorytetyzację czynników o korzystnym wpływie na natlenienie guza, normalizację pH lub równowagę redoks.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie spektroskopii EPR, chemii rodnikowej oraz postępowania z próbkami biologicznymi.
- Konieczny jest dostęp do spektrometru EPR z szybkim skanowaniem, wyposażonego w rezonator pętli krzyżowej i możliwości generowania gradientu do obrazowania 2D.
- Wymagana jest standaryzacja przygotowania sondy, kalibracji oraz kontroli parametrów środowiskowych (temperatury, wilgotności) pomiędzy ośrodkami.
- Należy uwzględnić kwestie adaptacji dla różnych reporterów rodnikowych (np. wrażliwych na pH w porównaniu do wrażliwych na utlenienie-redukcję) oraz różnych typów tkanek (fantomy, ex vivo, in vivo).
- Ograniczenia praktyczne obejmują stabilność sondy, biodostępność oraz potencjalne sygnały tła pochodzące od endogennych rodników w złożonych macierzach biologicznych.
