Name: Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę obrazowania torowania neutrofili in vivo przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β. Technika łączy fluorescencyjne reportery, in vivo etykietowanie i obrazowanie przyżyciowe w immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są przeprowadzane zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu w Toledo.
1. Fenotypowanie myszy pIL1-DsRed
UWAGA: Potomstwo jest generowane przez hodowlę heterozygotycznych myszy pIL1-DsRed z myszami typu dzikiego (WT) C57BL6. Trzy- lub czterotygodniowe szczenięta uważa się za gotowe do fenotypowania. Krwawienie podżuchwowe myszy przebiega zgodnie z ustalonym protokołem z niewielkimi modyfikacjami23.
<ol>
	<li>Izolacja białych krwinek z pełnej krwi szczeniąt myszy
	<ol>
		<li>Dodać 20 μl heparyny do każdej 1,5 ml probówki wirówkowej.</li>
		<li>Zdobądź jednego szczeniaka z klatki. Zapisz identyfikator szczeniaka. Nie jest wymagane znieczulanie szczeniąt przed pobraniem krwi z żyły podżuchwowej.</li>
		<li>Trzymaj szczeniaka za kark na szyi i przebij żyłę podżuchwową w woreczku policzkowym za pomocą lancetu 5 mm. Zastosuj odpowiednią siłę, aby stworzyć małe nakłucie, tak aby krople krwi wypływały z miejsca penetracji. Użyj nowej igły dla każdego szczeniaka.</li>
		<li>Zbierz 3 - 5 kropli krwi na szczenię w probówce mikrowirówkowej zawierającej heparynę. Oczyść miejsce nakłucia i zastosuj nacisk, aby ułatwić hemostazę.</li>
		<li>Umieść szczenię w nowej klatce i obserwuj przez 30 minut przed powrotem klatki do obiektu dla zwierząt.</li>
		<li>Zbierz krew od dorosłych myszy o znanym fenotypie jako kontrole pozytywne i negatywne.</li>
		<li>Dodaj 500 μl buforu lizującego czerwone krwinki do każdej probówki, rurki wirowe i inkubuj przez 5 - 10 minut na lodzie.</li>
		<li>Powoli dodawać 400 - 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS) pod zawiesiny komórkowe w każdej probówce. Można zaobserwować wyraźny interfejs między zawiesiną komórek górnej warstwy a dolną warstwą FBS.</li>
		<li>Probówki i próbki odwirować o masie 1 500 × g przez 5 minut.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.7 - 1.1.9, aby dalej usunąć czerwone krwinki. Nie powtarzaj, jeśli liza jest wystarczająca za pierwszym razem. Osad powinien być trudny do rozpoznania po odwirowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stymulacja i hodowla lipopolisacharydów (LPS)
	<ol>
		<li>Zawieś komórki w 200 μl kompletnej pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.</li>
		<li>Przenieś zawiesinę komórek do probówki do cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Przygotować roztwór roboczy LPS, mieszając 10 μl roztworu podstawowego LPS (1 mg/ml) z 990 μl kompletnej pożywki RPMI 1640.</li>
		<li>Dodać 20 μl 10 μg/ml roztworu roboczego LPS do 200 μl zawiesiny komórek.</li>
		<li>Luźno zakręcić probówki i inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Otwórz program do akwizycji danych dla cytometrii przepływowej. Skonfiguruj szablon pobierania przed pobraniem próbki.</li>
		<li>Kliknij narzędzie Wykres punktowy na palecie narzędzi. Narysuj wykres punktowy do przodu (FSC) i punktowy z boku (SSC). Ustaw parametry napięcia FSC i SSC na skalę liniową.</li>
		<li>Wybierz najniższe progi FSC i SSC dozwolone przez cytometr. Stosowanie progów 200 i 50 odpowiednio dla FSC i SSC.</li>
		<li>Na wykresie FSC vs SSC narysuj bramkę G1, która obejmuje monocyty, granulocyty i komórki dendrytyczne oraz wyklucza szczątki, czerwone krwinki i limfocyty.</li>
		<li>Kliknij narzędzie Histogram na palecie narzędzi. Narysuj histogram FL2 (czerwony kanał fluorescencji). Użyj próbki kontroli ujemnej, aby ustawić linię bazową sygnałów FL2 i próbki kontroli dodatniej, aby narysować bramkę obejmującą wszystkie zdarzenia dodatnie DsRed.</li>
		<li>Na panelu sterowania fluidyzacją cytometru ustaw tryb płynu na "RUN", a natężenie przepływu na "HI" (około 60 μl/min). Uzyskaj 10 000 zdarzeń dla każdej próbki.</li>
		<li>Określ fenotyp młodych, mierząc procent komórek DsRed dodatnich z bramki G1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Indukcja stanu zapalnego skóry u myszy pIL1-DsRed
<ol>
	<li>Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie koktajlu znieczulającego zawierającego 100 mg/kg ketaminy, 10 mg/kg ksylazyny i 1 mg/kg acepromazyny. Odpowiednio znieczulone myszy nie wykazują wycofania tylnej łapy do uszczypnięcia palca.</li>
	<li>Nałóż krem do depilacji na grzbietową powierzchnię obu uszu myszy. Odczekaj od 30 sekund do 1 minuty. Wytrzyj powierzchnię ucha bawełną nasączoną wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Zmierz grubość ucha za pomocą mikrometru i umieść mysz w osobnej klatce. Obserwuj aż do wyzdrowienia ze znieczulenia (~ 15 - 30 min). Aby rozwiązać stan zapalny skóry wywołany przez produkt do usuwania włosów, pozwól myszy odpocząć przez 3 dni przed przeprowadzeniem dalszych eksperymentów.</li>
	<li>Przygotować 1,25% (w/v) OX, rozpuszczając 16,7 mg OX w 1 ml acetonu i mieszając 750 μl roztworu OX/aceton z 250 μl oliwy z oliwek. Przygotować roztwór do podłoża, mieszając 750 μl acetonu z 250 μl oliwy z oliwek.</li>
	<li>Ponownie znieczulić mysz poprzez wstrzyknięcie koktajlu znieczulającego (2.1). Zmierz grubość ucha jak poprzednio.</li>
	<li>Nałóż 12,5 μl 1,25% OX na każdą stronę prawego ucha. Nałóż 12,5 μl roztworu acetonu/oliwy z oliwek na każdą stronę lewego ucha.</li>
	<li>Trzymaj mysz oddzielnie od kolegów z klatki, dopóki w pełni nie wyzdrowieje, aby zapobiec obrażeniu jej uszu przez inne myszy, a następnie umieść mysz w oryginalnej klatce i wróć do pomieszczenia dla zwierząt. 
	UWAGA: Depilacja może spowodować niewielkie zapalenie skóry, a następnie zmianę grubości ucha. Ten niewielki stan zapalny zostanie rozwiązany 3 dni później, potwierdzony normalną grubością ucha. Po miejscowym stosowaniu przez 24 godziny, uszy leczone OX wykazują znaczny (p < 0,01) obrzęk w porównaniu z uszami leczonymi samym roztworem nośnika.</li>
</ol>
3. Znakowanie neutrofili u myszy pIL1-DsRed
UWAGA: Znakowanie in vivo neutrofili za pomocą mAb specyficznego dla neutrofili w niskiej dawce fluorescencji odbywa się zgodnie z niedawno opracowanym protokołem19. Iniekcje zaoczodołowe są wykonywane zgodnie z ustalonym protokołem z kilkoma modyfikacjami24.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór roboczy anty-Ly6G mAb, rozcieńczając 10 μl 0,5 mg/ml mAb anty-Ly6G Alexa Fluor 647 (klon 1A8) w 90 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).</li>
	<li>Przenieść 100 μl roztworu roboczego mAb anty-Ly6G (50 μg/ml) do strzykawki insulinowej U-100 z igłą o rozmiarze 28.</li>
	<li>Znieczulić dorosłą mysz pIL1-DsRed poprzez wstrzyknięcie i.p. wcześniej opisanego koktajlu znieczulającego (2.1). Połóż znieczulony brzuch myszy na czystej desce roboczej.</li>
	<li>Delikatnie uciskaj skórę w dół, grzbietową i brzuszną do jednego oka myszy, aby częściowo wystawać gałkę oczną z oczodołu.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić igłę, skosem w dół, pod kątem około 30° w kancie przyśrodkowym do zatoki zaoczodołowej. 
	UWAGA: Operator może wyczuć ucisk, penetrację i złagodzony opór po wkłuciu igły do zatoki.</li>
	<li>Powoli i płynnie wstrzyknij 100 μl roztworu roboczego anty-Ly6G mAb (5 μg mAb/mysz/wstrzyknięcie) do myszy. Szybko wyjąć igłę. Niewielka ilość krwawienia sugeruje udane wstrzyknięcie.</li>
	<li>Natychmiast nałóż 1,25% OX i roztwór pojazdu na prawe i lewe ucho myszy.</li>
	<li>Po 8 godzinach podać 100 μl świeżo przygotowanego roztworu roboczego mAb anty-Ly6G (5 μg mAb/mysz/wstrzyknięcie) we wstrzyknięciu zaoczodołowym do tej samej myszy.</li>
	<li>Aby uwidocznić naczynia krwionośne, bezpośrednio przed obrazowaniem należy podać 100 μl 30 mg/ml dekstranu sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (150 kDa) przez wstrzyknięcie zaoczodołowe.</li>
</ol>
4. Obrazowanie przyżyciowe pobudzania neutrofili u myszy pIL-1-DsRed
<ol>
	<li>Znieczulić mysz za pomocą i.p. wstrzyknięcia koktajlu znieczulającego (2.1). Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia do obrazowania.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 ml koktajlu znieczulającego o połowie dawki, rozcieńczając 500 μl oryginalnego koktajlu znieczulającego o równej objętości PBS.</li>
		<li>Przenieść połowę dawki koktajlu znieczulającego do strzykawki o pojemności 1 ml z igłą motylkową o rozmiarze 27.</li>
		<li>Włóż igłę motyla do brzucha myszy dootrzewnowo i przymocuj skrzydło motyla do brzucha za pomocą taśmy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe na środku stolika do obrazowania. Przyklej krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby utrzymać je na miejscu.</li>
	<li>Umieść kroplę PBS na brzusznej powierzchni ucha myszy, a także na szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz z uchem nad szkiełkiem nakrywkowym. Zamontuj czubek ucha grzbietową stroną do dołu, umieszczając ucho między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem szklanym, również przytrzymywanym na miejscu za pomocą taśmy.</li>
	<li>Włącz multilaserowy fluorescencyjny mikroskop konfokalny i cały powiązany sprzęt. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby zminimalizować ekspozycję na światło otoczenia.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów. Wybierz kanały laserowe do wykrywania barwników fluorescencyjnych w menu Lista barwników.</li>
	<li>Dostosuj ostrość na skórze ucha objętej stanem zapalnym, obserwując zielone sygnały z naczyń krwionośnych i czerwone sygnały z komórek DsRed+ przez okular.</li>
	<li>Wykonaj szybkie skanowanie z prędkością skanowania 2 μs/piksel i rozdzielczością 512 × 512 pikseli. Wybierz pseudokolor dla każdego kanału w menu Podgląd aktywny. Wyreguluj pokrętło ostrości, aby ustawić lokalizację zakończenia i rozpoczęcia skanowania.</li>
	<li>Wykonuj powolne skanowanie z prędkością skanowania 4 - 8 μs/piksel i rozdzielczością 800 × 800 lub 1 024 × 1 024 pikseli. Dostosuj wysokie napięcie, wzmocnienie i przesunięcie na każdym pojedynczym kanale, aby zmaksymalizować intensywność sygnałów, unikając nasycenia (czerwone piksele). W każdym kanale powinno być tylko kilka czerwonych pikseli.</li>
	<li>Twórz trójwymiarowe zestawy obrazów, skanując skórę ucha, zaczynając powierzchownie w warstwie rogowej naskórka i postępując w dół z objętościami x, y, z 317 μm × 317 μm × 30 μm (obiektyw 40X), 635 μm × 635 μm × 30 μm (obiektyw 20X) lub 1 270 μm × 1 270 μm × 50 μm (obiektyw 10X) w krokach co 2 μm. 
UWAGA: Warstwa rogowa naskórka jest najbardziej zewnętrzną warstwą naskórka i może być łatwo zlokalizowana na podstawie silnego sygnału autofluorescencji.</li>
	<li>W eksperymentach z obrazowaniem poklatkowym rejestruj trójwymiarowe obrazy co 2 lub 4 minuty przez maksymalnie 8 godzin.</li>
	<li>Sporadycznie, gdy mysz zaczyna dochodzić do siebie po znieczuleniu, co zauważono na podstawie obserwacji drgających wąsów, podawaj 5 - 10 μl połowy dawki koktajlu znieczulającego przez igłę motylkową. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność co do dawki znieczulenia - przedawkowanie może spowodować śmierć myszy. Alternatywnie, znieczulenie wziewne w słoiku może być zastosowane u myszy w celu krótkotrwałego znieczulenia, a stożek nosowy może być użyty do długotrwałego obrazowania. </li>
	<li>Usuń znieczuloną mysz ze stolika po zakończeniu obrazowania. Odklej taśmę i usuń igłę motylkową z brzucha myszy. Umieść mysz z powrotem w osobnej klatce w pomieszczeniu dla zwierząt. 
	UWAGA: W przypadku obrazowania krótkotrwałego (<1 godz.) myszy w pełni wracają do zdrowia po znieczuleniu szybko w ciągu 1-3 godzin. W przypadku długotrwałego obrazowania (~ 8 godzin) myszy wracają do zdrowia powoli, z typowym okresem rekonwalescencji wynoszącym 12 - 16 godzin. Dlatego zaleca się doustne podawanie wody co najmniej kilka razy w okresie rekonwalescencji, aby zapobiec ciężkiemu odwodnieniu.</li>
	<li>Przetwarzaj zestawy danych obrazowania, śledź poszczególne komórki, generuj ścieżki migracji oraz obliczaj kierunkowość i prędkość migracji komórek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu25.</li>
</ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp.+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li>
<li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming%3A+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li>
<li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation%3A+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li>
<li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li>
<li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li>
<li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immunoimaging--deeper%2C+bigger%2C+more+precise%2C+and+definitively+more+colorful%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li>
<li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li>
<li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li>
<li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li>
<li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production%2C+survival%2C+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems%3A+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li>
<li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+the+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics.+Int%22%5BJournal%5D)">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li>
<li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li>
<li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

Celem niniejszej pracy jest opracowanie technologii monitorowania procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt, który nie został dotychczas spełniony przez obecnie dostępne techniki. Aby osiągnąć ten cel, przeprowadza się trzy ustalone metodologie: 1) indukcję stanu zapalnego skóry u myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β jako miarę torowania, 2) znakowanie in vivo neutrofili niskimi dawkami mAb anty-Ly6G sprzężonego z fluorescencją oraz 3) obrazowanie w mikroskopii konfokalnej przyżyciowej. P...

Neutrofile to najliczniejsze i najkrócej żyjące leukocyty w obiegu. Są one szybko rekrutowane do miejsc infekcji lub urazu, gdzie służą jako profesjonalne fagocyty poprzez uwalnianie reaktywnych produktów pośrednich tlenu i azotu wraz z granulkami zawierającymi peptydy przeciwdrobnoustrojowe i proteazy1. Podczas rekrutacji neutrofile są "przygotowywane" przez różne czynniki, w tym produkty mikrobiologiczne, chemoatraktanty i cytokiny zapalne, co skutkuje znacznie zwiększoną funkcjonalnością fagocytów po przybyciu do miejsca zapalenia2. Mechanizmy pobudzania neutrofili były szeroko badane in vitro3,4; Jednak do tej pory nie było możliwe dynamiczne monitorowanie procesu in vivo.
Ostatnio obrazowanie przyżyciowe stało się ważną techniką wizualizacji i ilościowego określania dynamiki komórkowej procesów biologicznych w organizmach żywych. Obrazowanie przyżyciowe można przeprowadzić za pomocą konwencjonalnej mikroskopii wzbudzenia jednofotonowego (np. konfokalnej) lub mikroskopii wielofotonowej5. Z biegiem czasu osiągnięto znaczne ulepszenia w tej technice, umożliwiając zwiększenie rozdzielczości obrazu, poprawę głębi obrazowania, zmniejszenie fotouszkodzeń tkanek i lepszą stabilizację obrazu6,7. Ze względu na swoją unikalną zdolność do dynamicznej wizualizacji migracji komórek i interakcji w czasie, mikroskopia przyżyteczna jest szeroko stosowana w różnych obszarach badań w immunologii8. Obrazowanie przyżyciowe umożliwia immunologom lepsze zrozumienie i kontekstualizację odpowiedzi immunologicznych zarówno na poziomie komórkowym, jak i molekularnym w żywych modelach zwierzęcych.
Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie myszy reporterowych transgenicznych i knock-in dostarczyły użytecznych narzędzi do monitorowania dynamicznych zachowań neutrofili u żywych zwierząt. Myszy knock-in z ulepszonym białkiem zielonej fluorescencji napędzane promotorem lizozymu M były szeroko stosowane do charakteryzowania ruchliwości neutrofili, monocytów i makrofagów podczas różnych procesów zapalnych, w tym wynaczynienia, infekcji bakteryjnej i sterylnego zapalenia9-15. Co więcej, transgeniczne myszy wyrażające bioczujnik transferu energii rezonansu fluorescencji cytoplazmatycznej zostały wykorzystane do badania aktywności kinazy mitonowej regulowanej zewnątrzkomórkowo i kinazy białkowej A w jelicie objętym stanem zapalnym16. Mysim modelem o wysokiej swoistości dla ekspresji fluorescencji w neutrofilach jest mysz knock-in Catchup, która wytwarza rekombinazę Cre, a także białko fluorescencyjne tdTomato, które samo w sobie jest sprzężone z ekspresją antygenu limfocytów 6G (Ly6G)17. Wizualizacja neutrofili z niedoborem Ly6G za pomocą tego modelu wykazała, że komórki te wywierają normalną funkcjonalność w różnych sterylnych lub zakaźnych kontekstach zapalnych in vivo. Transgeniczne myszy eksprymujące gen białka fluorescencyjnego DsRed pod kontrolą mysiego promotora interleuikiny-1β (IL-1β) (pIL1-DsRed) zostały wykorzystane do wizualizacji ruchliwych zachowań komórek wytwarzających IL-1β – uważa się, że obejmują neutrofile, monocyty zapalne i aktywowane makrofagi – pojawiające się w stanie zapalnym skóry18.
Znakowanie in vivo może służyć jako alternatywne podejście do śledzenia komórkowych i molekularnych zachowań neutrofili w tkankach objętych stanem zapalnym. Po dożylnym wstrzyknięciu małych dawek znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalnego anty-Gr-1 (mAb), kaskada rekrutacji neutrofili Gr-1 + została uwidoczniona w zmianach skórnych myszy zakażonych Staphylococcus aureus19. Podawanie in vivo koniugatów zawierających kropki kwantowe 705 nm sprzężone ze streptawidyną i biotynylowane mAb anty-Ly6G specyficznie znakowane krążące neutrofile20. Co więcej, endocytoza takich koniugatów w pęcherzyki neutrofilowe umożliwia śledzenie szybkiego transportu pęcherzyków w neutrofilach migrujących do śródmiąższu. Znakowanie in vivo przeciwciałami sprzężonymi z fluorescencją przeciwko ligandowi-1 glikoproteiny selektyny P-selektyny (PSGL-1), L-selektynie (CD62L), integrynie αM (CD11b) i receptorowi chemokiny (motyw C-X-C) 2 (CXCR2) w modelu zapalnym indukowanym przez TNFα wyjaśniło mechanizmy regulacyjne działające podczas wczesnego zapalenia21. Spolaryzowane neutrofile wystają z uropodów wzbogaconych w PSGL-1, aby wchodzić w interakcje z CD62L obecnym na aktywowanych płytkach krwi, co powoduje redystrybucję CD11b i CXCR2, receptorów, które napędzają migrację neutrofili i inicjują stan zapalny.
IL-1β jest jednym z charakterystycznych genów, który jest podwyższony u neutrofili22. U myszy reporterowych pIL1-DsRed sygnały fluorescencyjne DsRed (tj. aktywacja promotora IL-1β) dodatnio korelują z ekspresją mRNA IL-1β i produkcją białka IL-1β. 18 Aby monitorować proces pobudzania neutrofili, opracowano metodę mikroskopii przyżyciowej polegającą na indukcji stanu zapalnego skóry za pomocą oksazolonu (OX) w mysim modelu pIL1-DsRed po znakowaniu in vivo neutrofili za pomocą sprzężonego fluorescencyjnie przeciwciała anty-Ly6G. Za pomocą tego modelu możliwe jest badanie zachowania i funkcji neutrofili w modelach zwierzęcych różnych chorób i zaburzeń.

<table><tbody><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK bufor lizujący</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazyna</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Church & Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>Scientific A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 przeciwciało przeciw mysim przeciwciałom Ly6G</td> Strzykawka insulinowa <td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 z igłą 28 G</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do infuzji motylkowej (igła 27 G)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytometr</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro oprogramowanie</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Uniwersalne obrazowanie</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych dsred napędzanych promotorem il-1β

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrofile są najliczniejszymi leukocytami w ludzkim krążeniu krwi i są szybko rekrutowane do miejsc zapalnych. Pobudzanie jest krytycznym zdarzeniem, które zwiększa funkcjonalność fagocytarną neutrofili. Chociaż szeroko zakrojone badania ujawniły istnienie i znaczenie pobudzania neutrofili podczas infekcji i urazu, sposoby wizualizacji tego procesu in vivo były niedostępne. Dostarczony protokół umożliwia monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt poprzez połączenie trzech metodologii: 1) sygnału reporterowego DsRed - stosowanego jako miara torowania 2) znakowania neutrofili in vivo - osiągniętego przez wstrzyknięcie antygenu antylimfocytów 6G (Ly6G) z fluorescencją (mAb) i 3) przyżyciowego obrazowania konfokalnego. W tym protokole zaangażowanych jest kilka krytycznych etapów: zapalenie skóry ucha myszy wywołane oksazolonem, odpowiednia sedacja zwierząt, wielokrotne wstrzykiwanie przeciwciał anty-Ly6G i zapobieganie dryfowaniu ostrości podczas obrazowania. Chociaż zaobserwowano kilka ograniczeń, takich jak limit czasu ciągłego obrazowania (~ 8 godzin) u jednej myszy i wyciek izotiocyjanianu fluoresceiny-dekstranu z naczyń krwionośnych w stanie zapalnym, protokół ten zapewnia podstawowe ramy dla przyżyciowego obrazowania zachowania i funkcji neutrofili, które można łatwo rozszerzyć do badania innych komórek odpornościowych w mysich modelach zapalenia.

Przesiewowe badanie myszy pIL1-DsRed przeprowadza się na podstawie fenotypowego sygnału fluorescencji DsRed wytwarzanego przez leukocyty krwi obwodowej przy użyciu cytometrii przepływowej. Znane jest, że stymulacja LPS indukuje produkcję IL-1β w komórkach mieloidalnych, w tym w neutrofilach, monocytach i komórkach dendrytycznych26-28. W związku z tym izolowane leukocyty inkubuje się z LPS przez 4 hr przed analizą cytometryczną. Następnie, na podstawie wielkości komórek (FSC) i ...

Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie technologii monitorowania procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak wizualizacja zachowania i funkcji pobudzania neutrofili w modelach zwierzęcych najrzadszych chorób i zaburzeń. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy w sobie trzy uznane metodologie, w tym reportery fluorescencyjne w znakowaniu wirusów i obrazowanie przyżyciowe.Hoduj heterozygotyczne myszy pIL1-DsRed z sześcioma myszami C57Black typu dzikiego. W wieku trzech do czterech tygodni fenotypują swoje młode. Dla każdego szczeniaka przygotuj 1,5 mililitrową tubkę z 20 mikrolitrami heparyny.Aby pobrać krew, chwyć szczeniaka za kark na szyi i przebij żyłę podżuchwową w woreczku policzkowym za pomocą 5-milimetrowego lancetu. Potrzebne jest tylko niewielkie nakłucie. Zbierz od trzech do pięciu kropli krwi na probówkę.Po pobraniu należy zatrzymać krwawienie i obserwować zwierzęta przez 30 minut przed zwróceniem ich do obiektu dla zwierząt. Do każdej probówki z próbką dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek. Następnie zwiruj rurki i inkubuj je przez pięć do 10 minut na lodzie.Po inkubacji powoli dodawać od 400 do 500 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej pod zawiesiny komórkowe w każdej probówce. Między warstwami powinien powstać przejrzysty interfejs. Następnie odwirować próbki w temperaturze 1 500 g przez pięć minut, aby zebrać granulki komórek.Wyrzuć supernatent i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża RPMI-1640. Następnie przenieś każdą zawiesinę do probówki do cytometrii przepływowej i dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu roboczego LPS do każdej probówki. Inkubować próbki przez cztery godziny przed wykonaniem cytometrii przepływowej.Na początek znieczulij mysz domienetonicznym wstrzyknięciem koktajlu znieczulającego i potwierdź odpowiednią sedację za pomocą testu szczypania palca u nogi. Następnie nałóż krem do depilacji na grzbietową powierzchnię obu uszu, zetrzyj go w ciągu minuty i umyj skórę wodą. Zmierz grubość ucha, w którym zostały wykonane aplikacje, za pomocą mikrometru.Później umieść mysz w jej własnej klatce po wyzdrowieniu ze znieczulenia i pozwól myszy odpocząć przez co najmniej trzy dni przed dalszymi badaniami. Po trzech dniach ponownie znieczul mysz i ponownie zmierz grubość ucha, aby upewnić się, że nie jest podrażniona. Następnie nałóż 12,5 mikrolitra 1,25% oksazolonu na każdą stronę prawego ucha i nałóż 12,5 mikrolitra roztworu acetonu z oliwą z oliwek na każdą stronę lewego ucha.Jak zawsze, obserwuj, jak mysz wraca do zdrowia po znieczuleniu. 24 godziny później ponownie zmierz grubość ucha w znieczuleniu, aby upewnić się, że wystąpiło zapalenie skóry wywołane oksazolonem. Aby rozpocząć, przenieś 100 mikrolitrów przeciwciała mono-colonal XG przeciwko lizie do strzykawki insulinowej U100 za pomocą igły o rozmiarze 28.Następnie znieczul leczoną mysz zgodnie z wcześniejszym opisem. Trzymając brzuch myszy w dół, delikatnie uciskaj skórę w dół, grzbietową i brzuszną do oka, aby częściowo wysunąć gałkę oczną. Następnie ostrożnie umieść igłę, skos w dół, około 30 stopni do kantu przyśrodkowego i ostrożnie włóż igłę do zatoki tylnej oczodołu.Ciśnienie penetracji zostanie zmniejszone, gdy igła wejdzie do zatoki. Następnie należy wysunąć zawartość i szybko wyjąć igłę. Niewielka ilość krwawienia sugeruje udane wstrzyknięcie.Teraz natychmiast nałóż 1,25% oksazolone i roztwór nośnika na prawe i lewe ucho myszy, tak jak poprzednio. Osiem godzin później podaj drugą dawkę tego samego przeciwciała każdej myszy. Ponadto, aby uwidocznić naczynia krwionośne, retro orbitalnie podaj 100 mikrolitrów dekstranu fitc.W przypadku tej procedury najpierw znieczul mysz jak poprzednio. Następnie nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas obrazowania. Następnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na środku stolika do obrazowania i zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywkowego taśmą.Dodaj również kroplę PVS do szkiełka nakrywkowego. Teraz umieść ucho myszy nad szkiełkiem nakrywkowym, grzbietową stroną do dołu. Następnie zwilż brzuszną powierzchnię ucha myszy kroplą PVS.Następnie zamontuj końcówkę ucha za pomocą szklanego szkiełka na górze i zabezpiecz szkiełko taśmą. Teraz włącz multilaserowy fluorescencyjny mikroskop konfokalny i powiązany sprzęt. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby zminimalizować ekspozycję na światło otoczenia.Następnie rejestruj trójwymiarowe obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym rejestruj trójwymiarowe obrazy co dwie do czterech minut przez maksymalnie osiem godzin. Przez cały czas uważaj na drgające wąsy, co wskazuje, że mysz zaczyna dochodzić do siebie po znieczuleniu.W takich sytuacjach należy podać od pięciu do 10 mikrolitrów połowy dawki koktajlu znieczulającego za pomocą igły motylkowej. Myszy pIL-1-DsRed badano pod kątem fenotypowej fluorescencji DsRed wytwarzanej w leukocytach krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej. Krążące komórki szpikowe myszy typu dzikiego minimalnie wyrażają DsRed, podczas gdy te same komórki myszy pIL1-DsRed wyrażają wyraźne sygnały DsRed.Aktywacja promotora IL-1 beta jest markerem pobudzania neutrofili i można ją najlepiej zobrazować u żywych myszy pIL-1DsRed. Następnie środek uczulający na skórę, oksazolon, został miejscowo nałożony na prawe ucho. Później neutrofile zostały oznaczone przed i po drugim zastosowaniu uczulacza oksazolonu poprzez wstrzyknięcie wstecz orbitalne.Podobnie, fitc dekstran został wstrzyknięty w celu zlokalizowania naczyń krwionośnych. W przestrzeni pozanaczyniowej znaleziono wiele podwójnie znakowanych komórek, które reprezentują zaszczepione neutrofile. Niewielka liczba komórek została znakowana tylko przez przeciwciało lizy XG, które prawdopodobnie były neutrofilami w stanie spoczynku.Ponadto zaobserwowano niewielką populację komórek DsRed dodatnich, które mogą składać się z monocytów zapalnych i aktywowanych makrofagów. Śledzono ścieżki migracji komórek, aby porównać dwie populacje neutrofili. Obie populacje neutrofili wykazywały losową migrację po wejściu w przestrzeń zewnątrzkomórkową.Co ciekawe, przypuszczalnie zapoczątkowane neutrofile wykazywały znacznie większą prędkość w porównaniu z ich przypuszczalnie spoczynkowymi odpowiednikami. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii. Dwa z nich badają zachowanie i funkcję wielu komórek odpornościowych w różnych stanach zapalnych z udziałem różnych limfocytów T.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować dynamiczny proces pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy nieinwazyjną metodę mikroskopii dwufotonowej (2P) służącą do badania homingu leukocytów w poduszce stopy myszy. Omówiamy aspekty techniczne przygotowania tkanki do obrazowania i przeprowadzamy czytelnika przez typowy eksperyment – od początkowej konfiguracji, przez wykonanie, aż po gromadzenie danych.

Nieinwazyjne obrazowanie homingu i migracji leukocytów in vivo

Opisujemy protokół mikroskopii intravitalnej w świetle jasnym do pomiaru dynamicznych oddziaływań między neutrofilami a komórkami śródbłonka podczas rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na źródło chemoatraktanta dla neutrofili in vivo. Pełzanie neutrofili wewnątrz naczyniowych, migracja transendotelialna oraz chemotaksja w tkance mięśnia kroczo ścięgnistego myszy są wizualizowane za pomocą fotografii wideo z odstępami czasu i śledzone przy użyciu programu ImageJ.

Śledzenie pełzania wewnątrznaczyniowego, migracji transendotelialnej i chemotaksji neutrofili w tkankach za pomocą intravitalnej wideomikroskopii

Ten film demonstruje obrazowanie in vivo w celu zbadania dynamiki rekrutacji neutrofili w miejscu infekcji u transgenicznej myszy z obniżoną odpornością, z neutrofilami wykazującymi ekspresję GFP. Polega na wstrzyknięciu bakterii luminescencyjnych w celu wywołania infekcji. Prowadzi to do rekrutacji neutrofili do miejsca infekcji, których śledzenie odbywa się za pomocą obrazowania.

Monitorowanie dynamiki rekrutacji neutrofili i obciążenia bakteryjnego w miejscu zakażenia w modelu mysim

Ten film demonstruje technikę in vivo oceny testowego antygenu poprzez wywoływanie stanu zapalnego skóry w modelu mysim. Antygen testowy - hapten w roztworze oleju / acetonu - jest miejscowo nakładany na skórę ucha myszy, a stan zapalny skóry ocenia się po odpowiednim czasie.

Technika oceny odpowiedzi immunologicznej na antygen poprzez wywoływanie stanu zapalnego skóry

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Opisana tutaj metoda pozwala na wizualizację zależnej od promotora IL-8 aktywacji stanu zapalnego w płucach myszy za pomocą nieinwazyjnego obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). To samo zwierzę może być poddawane BLI wielokrotnie przez okres do dwóch miesięcy od momentu dostarczenia konstruktu reporterowego lucyferazy.

Przejściowo transgenizowany model myszy IL-8 do długoterminowego monitorowania in vivo reakcji zapalnych

Tutaj pokazujemy, jak wykonać mikroskopię przyżyciową na żyłkach powłosilarnych mięśnia cremaster myszy. Powszechnie stosowany do różnych modeli zapalenia i sepsy, szczególnie tych indukowanych przez chemokiny i cytokiny, podkreślamy jego znaczenie w badaniu muskolopatii obejmujących przesadny naciek leukocytów mięśniowych.

Naciek leukocytów mięśnia Cremaster u myszy oceniany za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Migracja neutrofili polega na szybkiej i ciągłej przebudowie błony plazmatycznej w odpowiedzi na chemoatraktant i jego interakcje z mikrośrodowiskiem zewnątrzkomórkowym. Opisana w niniejszym dokumencie jest procedura oparta na przyżyciowej mikroskopii subkomórkowej w celu zbadania dynamiki przebudowy błony w neutrofilach wstrzykniętych do ucha znieczulonych myszy.

Obrazowanie migracji neutrofili w skórze myszy w celu zbadania przebudowy błony subkomórkowej w warunkach fizjologicznych

Poznaj metodę obrazowania torowania neutrofili in vivo przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β. Technika łączy fluorescencyjne reportery, in vivo etykietowanie i obrazowanie przyżyciowe w immunologii.

Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β

Przeglądaj więcej filmów