Przyżyciowe obrazowanie torowania neutrofili przy użyciu myszy reporterowych DsRed napędzanych promotorem IL-1β
22 czerwca 2016
Ten obecny protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery, znakowanie in vivo i techniki obrazowania przyżyciowego, aby umożliwić monitorowanie dynamicznego procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.
Ogólnym celem tej procedury jest przedstawienie technologii monitorowania procesu pobudzania neutrofili u żywych zwierząt. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak wizualizacja zachowania i funkcji pobudzania neutrofili w modelach zwierzęcych najrzadszych chorób i zaburzeń. Główną zaletą tej techniki jest to, że łączy w sobie trzy uznane metodologie, w tym reportery fluorescencyjne w znakowaniu wirusów i obrazowanie przyżyciowe.
Hoduj heterozygotyczne myszy pIL1-DsRed z sześcioma myszami C57Black typu dzikiego. W wieku trzech do czterech tygodni fenotypują swoje młode. Dla każdego szczeniaka przygotuj 1,5 mililitrową tubkę z 20 mikrolitrami heparyny.
Aby pobrać krew, chwyć szczeniaka za kark na szyi i przebij żyłę podżuchwową w woreczku policzkowym za pomocą 5-milimetrowego lancetu. Potrzebne jest tylko niewielkie nakłucie. Zbierz od trzech do pięciu kropli krwi na probówkę.
Po pobraniu należy zatrzymać krwawienie i obserwować zwierzęta przez 30 minut przed zwróceniem ich do obiektu dla zwierząt. Do każdej probówki z próbką dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy czerwonych krwinek. Następnie zwiruj rurki i inkubuj je przez pięć do 10 minut na lodzie.
Po inkubacji powoli dodawać od 400 do 500 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej pod zawiesiny komórkowe w każdej probówce. Między warstwami powinien powstać przejrzysty interfejs. Następnie odwirować próbki w temperaturze 1 500 g przez pięć minut, aby zebrać granulki komórek.
Wyrzuć supernatent i ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach kompletnego podłoża RPMI-1640. Następnie przenieś każdą zawiesinę do probówki do cytometrii przepływowej i dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu roboczego LPS do każdej probówki. Inkubować próbki przez cztery godziny przed wykonaniem cytometrii przepływowej.
Na początek znieczulij mysz domienetonicznym wstrzyknięciem koktajlu znieczulającego i potwierdź odpowiednią sedację za pomocą testu szczypania palca u nogi. Następnie nałóż krem do depilacji na grzbietową powierzchnię obu uszu, zetrzyj go w ciągu minuty i umyj skórę wodą. Zmierz grubość ucha, w którym zostały wykonane aplikacje, za pomocą mikrometru.
Później umieść mysz w jej własnej klatce po wyzdrowieniu ze znieczulenia i pozwól myszy odpocząć przez co najmniej trzy dni przed dalszymi badaniami. Po trzech dniach ponownie znieczul mysz i ponownie zmierz grubość ucha, aby upewnić się, że nie jest podrażniona. Następnie nałóż 12,5 mikrolitra 1,25% oksazolonu na każdą stronę prawego ucha i nałóż 12,5 mikrolitra roztworu acetonu z oliwą z oliwek na każdą stronę lewego ucha.
Jak zawsze, obserwuj, jak mysz wraca do zdrowia po znieczuleniu. 24 godziny później ponownie zmierz grubość ucha w znieczuleniu, aby upewnić się, że wystąpiło zapalenie skóry wywołane oksazolonem. Aby rozpocząć, przenieś 100 mikrolitrów przeciwciała mono-colonal XG przeciwko lizie do strzykawki insulinowej U100 za pomocą igły o rozmiarze 28.
Następnie znieczul leczoną mysz zgodnie z wcześniejszym opisem. Trzymając brzuch myszy w dół, delikatnie uciskaj skórę w dół, grzbietową i brzuszną do oka, aby częściowo wysunąć gałkę oczną. Następnie ostrożnie umieść igłę, skos w dół, około 30 stopni do kantu przyśrodkowego i ostrożnie włóż igłę do zatoki tylnej oczodołu.
Ciśnienie penetracji zostanie zmniejszone, gdy igła wejdzie do zatoki. Następnie należy wysunąć zawartość i szybko wyjąć igłę. Niewielka ilość krwawienia sugeruje udane wstrzyknięcie.
Teraz natychmiast nałóż 1,25% oksazolone i roztwór nośnika na prawe i lewe ucho myszy, tak jak poprzednio. Osiem godzin później podaj drugą dawkę tego samego przeciwciała każdej myszy. Ponadto, aby uwidocznić naczynia krwionośne, retro orbitalnie podaj 100 mikrolitrów dekstranu fitc.
W przypadku tej procedury najpierw znieczul mysz jak poprzednio. Następnie nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas obrazowania. Następnie umieść szklane szkiełko nakrywkowe na środku stolika do obrazowania i zabezpiecz krawędzie szkiełka nakrywkowego taśmą.
Dodaj również kroplę PVS do szkiełka nakrywkowego. Teraz umieść ucho myszy nad szkiełkiem nakrywkowym, grzbietową stroną do dołu. Następnie zwilż brzuszną powierzchnię ucha myszy kroplą PVS.
Następnie zamontuj końcówkę ucha za pomocą szklanego szkiełka na górze i zabezpiecz szkiełko taśmą. Teraz włącz multilaserowy fluorescencyjny mikroskop konfokalny i powiązany sprzęt. Wyłącz światła w pomieszczeniu, aby zminimalizować ekspozycję na światło otoczenia.
Następnie rejestruj trójwymiarowe obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. W przypadku eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym rejestruj trójwymiarowe obrazy co dwie do czterech minut przez maksymalnie osiem godzin. Przez cały czas uważaj na drgające wąsy, co wskazuje, że mysz zaczyna dochodzić do siebie po znieczuleniu.
W takich sytuacjach należy podać od pięciu do 10 mikrolitrów połowy dawki koktajlu znieczulającego za pomocą igły motylkowej. Myszy pIL-1-DsRed badano pod kątem fenotypowej fluorescencji DsRed wytwarzanej w leukocytach krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej. Krążące komórki szpikowe myszy typu dzikiego minimalnie wyrażają DsRed, podczas gdy te same komórki myszy pIL1-DsRed wyrażają wyraźne sygnały DsRed.
Aktywacja promotora IL-1 beta jest markerem pobudzania neutrofili i można ją najlepiej zobrazować u żywych myszy pIL-1DsRed. Następnie środek uczulający na skórę, oksazolon, został miejscowo nałożony na prawe ucho. Później neutrofile zostały oznaczone przed i po drugim zastosowaniu uczulacza oksazolonu poprzez wstrzyknięcie wstecz orbitalne.
Podobnie, fitc dekstran został wstrzyknięty w celu zlokalizowania naczyń krwionośnych. W przestrzeni pozanaczyniowej znaleziono wiele podwójnie znakowanych komórek, które reprezentują zaszczepione neutrofile. Niewielka liczba komórek została znakowana tylko przez przeciwciało lizy XG, które prawdopodobnie były neutrofilami w stanie spoczynku.
Ponadto zaobserwowano niewielką populację komórek DsRed dodatnich, które mogą składać się z monocytów zapalnych i aktywowanych makrofagów. Śledzono ścieżki migracji komórek, aby porównać dwie populacje neutrofili. Obie populacje neutrofili wykazywały losową migrację po wejściu w przestrzeń zewnątrzkomórkową.
Co ciekawe, przypuszczalnie zapoczątkowane neutrofile wykazywały znacznie większą prędkość w porównaniu z ich przypuszczalnie spoczynkowymi odpowiednikami. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii. Dwa z nich badają zachowanie i funkcję wielu komórek odpornościowych w różnych stanach zapalnych z udziałem różnych limfocytów T.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak monitorować dynamiczny proces pobudzania neutrofili u żywych zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia technologię monitorowania primingu neutrofili u żywych zwierząt z wykorzystaniem reporterów fluorescencyjnych, znakowania in vivo oraz technik obrazowania intravitalnego. Metoda ta ma na celu wizualizację zachowania i funkcji neutrofili w modelach zwierzęcych rzadkich chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Obrazowanie in vivo
Wprowadzenie
- Neutrofile odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- Zrozumienie primingu neutrofili może dostarczyć wiedzy na temat różnych jednostek chorobowych.
- Istniejące metody badania neutrofili posiadają pewne ograniczenia.
- Niniejsze badanie łączy wiele technik w celu usprawnienia obserwacji.
Cel badania
- Monitorowanie dynamicznego procesu primingu neutrofilów.
- Wizualizacja zachowania neutrofilów w czasie rzeczywistym.
- Poprawa zrozumienia odpowiedzi immunologicznych w rzadkich chorobach.
Zastosowane metody
- Reportery fluorescencyjne do znakowania neutrofili.
- Techniki znakowania in vivo.
- Obrazowanie intravitalne do obserwacji w czasie rzeczywistym.
- Hodowla specyficznych modeli mysich do celów eksperymentalnych.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja primingu neutrofili u żywych zwierząt.
- Wykazanie użyteczności połączonych metodologii.
- Przedstawienie informacji na temat zachowania neutrofili w modelach chorobowych.
- Stworzenie podstaw dla przyszłych badań immunologicznych.
Wnioski
- Metoda ta pogłębia zrozumienie dynamiki neutrofili.
- Stanowi ona potężne narzędzie do badania odpowiedzi immunologicznych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu analizy rzadkich chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie intravitalne w czasie rzeczywistym primingu neutrofili z wykorzystaniem myszy reporterowych DsRed pod kontrolą promotora IL-1β umożliwia bezpośrednią wizualizację aktywacji komórek odpornościowych w żywych systemach. Możliwość ta pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu dynamicznych odpowiedzi immunologicznych i wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka na etapie odkryć. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w zakresie walidacji celów oraz dostarcza informacji pomocnych przy wczesnych decyzjach portfelowych w ramach programów badawczych nad stanami zapalnymi i immunologią.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację primingu i aktywacji neutrofili in vivo w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez rozróżnianie populacji neutrofili w stanie primingu od neutrofili spoczynkowych na podstawie ekspresji reportera.
- Ułatwia wyjaśnienie szlaków sygnałowych poprzez powiązanie aktywności promotora IL-1β z zachowaniem neutrofili w modelach zapalnych.
- Zapewnia ilościowe i rozdzielone przestrzennie dane, które pozwalają zwiększyć pewność prognostyczną w strategiach modulacji odporności.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowane modele in vivo do oceny aktywacji i migracji komórek odpornościowych w warunkach zapalnych.
- Umożliwia powtarzalną kwantyfikację primingu neutrofili z wykorzystaniem sygnałów fluorescencyjnych reporterów oraz cytometrii przepływowej.
- Wspiera standaryzację testów w zakresie śledzenia komórek odpornościowych i odczytów funkcjonalnych w badaniach przedklinicznych.
- Przygotowuje stabilne systemy biologiczne do dalszego screeningu związków ukierunkowanych na szlaki immunologiczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Usprawnia dopasowanie modeli przedklinicznych do stanów aktywacji immunologicznej istotnych dla danej choroby w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki możliwości obrazowania odpowiedzi immunologicznych w czasie.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem ryzyka poprzez ilościową ocenę dynamiki komórek odpornościowych in vivo.
- Ułatwia badania mechanistyczne funkcji komórek odpornościowych w modelach stanu zapalnego i uszkodzeń tkanek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta platforma obrazowania integruje się z continuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez, analizę szlaków sygnalizacyjnych oraz ilościową analizę komórek odpornościowych w żywych zwierzętach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania oparte na hipotezach dotyczące primingu neutrofili i aktywacji immunologicznej w modelach chorób.
- Przesiewowanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty primingu komórek odpornościowych do rozwoju testów i oceny związków.
- Analityka: Dostarcza przestrzennych i czasowych pomiarów ekspresji reportera oraz migracji komórek do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z badaniami przedklinicznymi poprzez modelowanie istotnych dla chorób odpowiedzi immunologicznych in vivo.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę wielokrotnego użytku do badania różnych typów komórek odpornościowych i mechanizmów zapalnych w ramach wielu programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych i redukuje niejednoznaczność w zakresie mechanizmów działania.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie in vivo oraz kwantyfikację aktywacji komórek odpornościowych w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczanie wczesnych informacji o funkcjonalności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów immunomodulujących z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o funkcjonalne dane in vivo.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami, obrazowania intravitalnego oraz cytometrii przepływowej.
- Konieczny jest dostęp do mikroskopii konfokalnej oraz zwalidowanych linii myszy reporterowych.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów obrazowania i schematów analizy danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych typów komórek odpornościowych lub modeli chorobowych może wymagać dodatkowych konstruktów reporterowych.
- Czas trwania obrazowania oraz przesięk naczyniowy stanowią praktyczne ograniczenia odnotowane w stanach zapalnych.
