Name: Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę generowania komórek iPSC z fibroblastopodobnych synowiocytów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów przy użyciu systemu lentiwirusowego bez komórek karmicielskich. Protokół umożliwia badanie patologii choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Badawczy finansowany przez Koreańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (HI13D2188).

Oświadczenie etyczne: Niniejszy protokół badania został zatwierdzony przez instytucjonalną komisję rewizyjną Katolickiego Uniwersytetu Korei (KC12TISI0861).
1. Izolacja i ekspansja synocytów
<ol>
	<li>Izolacja synocytów
	<ol>
		<li>Wysterylizuj dwie pary nożyczek chirurgicznych i jedną parę kleszczy.</li>
		<li>Przenieść tkankę maziową do naczynia o średnicy 100 mm i przemyć 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
		<li>Odetnij żółtawą tkankę tłuszczową i resztki kości. Przenieść przyciętą tkankę do dołka na płytce 6-dołkowej i dodać 5 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
		<li>Posiekaj chusteczki nożyczkami, aż kawałki będą wystarczająco małe, aby przebić jednorazową pipetę.</li>
		<li>Przenieść pożywkę zawierającą tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zebrać pozostały materiał, dodając 5 ml DMEM z 20% FBS do płytki 6-dołkowej, a następnie przenieść do probówki.</li>
		<li>Rozmrozić kolagenazę na lodzie. Dodaj kolagenazę do końcowego stężenia 0,01% i uszczelnij probówkę parafilmem. Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 4 godziny.</li>
		<li>Po inkubacji napełnić probówkę DMEM 20% FBS, aż całkowita objętość wyniesie 50 ml i odwirować przy 300 x g, RT przez 10 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu i dodać 40 ml pożywki w celu ponownego zawieszenia osadu.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.10-1.1.11.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad w 25 ml DMEM z 20% FBS i poczekać, aż duże grudki tkanki opadną na dno.</li>
		<li>Przenieść supernatant na szalkę o średnicy 100 mm i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 14 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymanie i ekspansja synocytów
	<ol>
		<li>Wyrzucić zużyte podłoże z płytki i przemyć komórki 5 ml PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml PBS/1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 2 minuty.</li>
		<li>Delikatnie postukaj w naczynie i przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 250 x g, RT przez 2 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant bez naruszania osadu i ponownie zawiesić osad w 30 ml DMEM z 20% FBS.</li>
		<li>Przenieś komórki do szalek 3 x 100 mm, nie pozostawiając widocznych resztek materiału.</li>
		<li>Wymieniaj pożywkę na świeżą pożywkę co 3 dni. Podziel komórki przy 80% zbieżności, używając 1 ml PBS/1 mM EDTA. Utrzymać do przejścia 3 przed użyciem. Podziel każde naczynie z komórkami na 3 szalki w każdym podziale. 
		UWAGA: Po osiągnięciu przejścia 3 komórki, które nie zostaną natychmiast użyte, mogą zostać zamrożone.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przeprogramowanie FLS-ów za pomocą czynników Yamanaka kodujących Lentiwirusy
<ol>
	<li>Transdukcja (D0)
	<ol>
		<li>Nasiona 3 × 104 komórki na basenie 6-dołkowej płytki w pożywce wzrostowej (500 ml DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny). Inkubować komórki O/N w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
		<li>Następnego dnia wyjąć z zamrażarki jedną fiolkę lentiwirusa zawierającą 4 czynniki Yamanaka: Oct4, Klf4, Sox2 i c-Myc i rozmrozić w temperaturze 4 °C. Uwaga: Lentiwirus został wyprodukowany w procedurze opisanej w naszym poprzednim badaniu11.</li>
		<li>Podczas rozmrażania wirusa należy zmienić pożywkę na pożywkę wzrostową FLS (20% FBS plus antybiotyki w DMEM) zawierającą 10 μg/ml bromku heksadimetryny i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.</li>
		<li>Po zmianie pożywki dodać do komórek 30 μl lentiwirusa i delikatnie wymieszać. W celu poprawy infekcji należy odwirować płytkę w temperaturze 680 x g, 35 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Po odwirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konserwacja do momentu widocznego przeprogramowania
	<ol>
		<li>Przez 3 dni codziennie zastępuj pożywkę pożywką FLS zawierającą 0,1 mM maślanu sodu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego.</li>
		<li>Następnego dnia zastąp pożywkę mieszaniną pożywki FLS i pożywki iPSC (stosunek 1:1) zawierającej 0,1 mM maślanu sodu i 50 μg/ml kwasu askorbinowego. 
		Uwaga: Składniki nośników iPSC są podane w wykazie materiałów/sprzętu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzielenie komórek w celu tworzenia kolonii
	<ol>
		<li>Przygotować 6-dołkową płytkę pokrytą witronektyną.
		<ol>
			<li>Dodać 60 μl witronektyny do 6 ml PBS bez Ca2+ i Mg2+. Umieścić 2 ml mieszaniny w każdym dołku i inkubować w suchej temperaturze przez co najmniej 1 godzinę. Uwaga: Stężenie robocze witronektyny wynosi 5 μg/ml.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Na D5 umyj komórki PBS.</li>
		<li>Dodać 1 ml PBS/1 mM EDTA w celu odłączenia komórek i inkubacji w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 minuty.</li>
		<li>Zebrać komórki i odwirować przy 250 x g, RT przez 2 min.</li>
		<li>Podziel komórki w 3 różnych proporcjach (1:3, 1:6 i 1:9), aby uzyskać różne zbiegi. Dodać 900 μl pożywki do osadu komórkowego i ponownie zawiesić. Dodać 300, 150 i 100 μl mieszaniny komórek na dołek płytki 6-dołkowej, aby uzyskać stosunek odpowiednio 1:3, 1:6 i 1:9.</li>
		<li>Codziennie wymieniaj pożywkę na pożywkę iPSC, aż pojawią się kolonie. Kolonie pojawią się po około D18. Uwaga: Na tym etapie kolonie iPSC współistnieją z nieprzeprogramowanymi FLS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie kolonii
	<ol>
		<li>Przygotować 48-dołkową płytkę pokrytą witronektyną, dodając do studzienek 500 μl witronektyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Umieść mikroskop na czystej ławie i wyjmij 6-dołkową płytkę z inkubatora.</li>
		<li>Usunąć roztwór witronektyny z płytki 48-dołkowej i dodać 500 μl pożywki iPSC uzupełnionej 10mM związanym z Rho, inhibitorem kinazy białkowej (ROCK) związanym z Rho.</li>
		<li>Za pomocą końcówki do pipety 10 pensów przeciąć wokół kolonii. Przenieś pobraną kolonię do jednego dołka na 48-dołkowej płytce.</li>
		<li>Po wybraniu kilku kolonii inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Utrzymuj komórki, aż kolonie będą wystarczająco duże do przeniesienia. Uwaga: Zwykle rozlewamy komórki, gdy kolonia znajdzie się poza widzialnym polem mikroskopu, gdy ogląda się ją w 100-krotnym powiększeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Umieścić sterylne szkło nakrywkowe o średnicy 18 mm w płytce 12-dołkowej.</li>
		<li>Dodać 1 ml PBS do ostygnięcia i wypłukać szkło nakrywkowe.</li>
		<li>Zastąp 1 ml roztworu witronektyny o stężeniu 10 μg/ml.</li>
		<li>Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Roztwór witronektyny i płytki iPSC należy wyrzucić na 12-dołkową płytkę pokrytą witronektyną i hodować przez 7 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , zmieniając pożywkę codziennie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie komórek
	<ol>
		<li>Wyrzucić pożywkę hodowlaną i raz przemyć komórki PBS.</li>
		<li>Utrwal komórki w 0,4% paraformaldehydzie (PFA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 0,1% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć roztwór permeabilizacyjny i zablokować PBS zawierającym 2% albuminę surowicy bydlęcej (BSA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała w PBS zawierającym 2% BSA zgodnie z tabelą 1. Inkubować komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczone w stosunku 1:200) i inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, unikając światła.</li>
		<li>Traktuj komórki 1 μl/ml DAPI przez 10 minut.</li>
		<li>Umieścić szkło nakrywkowe na szkiełku szkiełkowym z odczynnikiem zapobiegającym blaknięciu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 24 godziny, unikając światła.</li>
		<li>Sprawdź ekspresję za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-PCR)
<ol>
	<li>Ekstrahować mRNA z osadu komórkowego przy użyciu metody ekstrakcji tiocyjanianianem fenolu i chloroformu guanidyny11.</li>
	<li>Amplifikuj cDNA z 2 μg całkowitego mRNA za pomocą odwrotnej transkrypcji11.</li>
	<li>Wymieszaj składniki wymagane do PCR, używając 2 μl matrycycDNA 11.</li>
	<li>Wykonaj RT-PCR i zweryfikuj wyniki za pomocą elektroforezy żelowej11.</li>
</ol>
5. Barwienie fosfatazą alkaliczną (AP)
<ol>
	<li>Hodowla iPSC przez 5-7 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed barwieniem.</li>
	<li>Odessać pożywkę i utrwalić komórki 4% PFA przez 1 minutę.</li>
	<li>Wyrzuć utrwalacz i przepłucz komórki 1X buforem do płukania.</li>
	<li>Przygotować odczynniki do barwienia AP. Wymieszać odczynniki w następującym stosunku: Szybki czerwony fiolet: roztwór fosforanu naftolu AS-BI: woda = 2:1:1.</li>
	<li>Inkubować komórki z roztworem barwiącym w temperaturze pokojowej przez 15 minut, unikając światła.</li>
	<li>Wyrzuć roztwór barwiący i przepłucz komórki buforem do płukania.</li>
	<li>Przykryj komórki PBS, aby zapobiec wysuszeniu i sprawdź ekspresję za pomocą mikroskopu jasnego pola.</li>
</ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przed odkryciem iPSC naukowcy wykorzystywali je głównie do badania biologii komórek macierzystych i innych linii komórkowych poprzez różnicowanie. Jednak ESC pochodzą z wewnętrznej masy blastocysty, która jest zarodkiem we wczesnym stadium rozwoju. Aby wyizolować ESC, zniszczenie blastocysty jest nieuniknione, co rodzi problemy etyczne, których nie można przezwyciężyć. Co więcej, chociaż EKM mają cechy macierzyste i pluripotencję, nie można ich uzyskać od osób fizycznych i czasami nie są idealnym narzędziem do spersonali...

Pluripotencjalne komórki macierzyste to platforma nowej generacji w różnych dziedzinach klinicznych i biologicznych. Są obiecującym narzędziem, które można wykorzystać w modelowaniu chorób, badaniach przesiewowych leków i medycynie regeneracyjnej. Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) wykorzystano głównie do badania i zrozumienia komórek pluripotencjalnych. Jednak wyizolowane przez zniszczenie ludzkiej blastocysty hESC wiążą się z kilkoma problemami etycznymi. W 2007 roku dr Shinya Yamanaka i jego zespół odwrócili proces programowania komórek i opracowali komórki macierzyste z ludzkich dorosłych komórek somatycznych1,2. W związku z tym, w przeciwieństwie do hESC, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą być generowane z dojrzałych komórek somatycznych, unikając przeszkód etycznych.
Zazwyczaj, iPSC są generowane przez dostarczenie czterech egzogennych genów: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Te czynniki Yamanaka są pierwotnie dostarczane za pomocą systemów lentiwirusowych i retrowirusowych. Pierwsze iPSC pochodziły z mysich komórek somatycznych3. Następnie technikę tę zastosowano do ludzkich fibroblastów skóry1,2. Kolejne badania z powodzeniem wygenerowały iPSC z różnych źródeł, takich jak mocz4,krew 5,6, keratynocyty7 i kilka innych typów komórek. Istnieją jednak pewne komórki somatyczne, które nie zostały wykorzystane w przeprogramowaniu, a badania przesiewowe zdolności przeprogramowywania różnych typów komórek z określonych tkanek w stanie chorobowym są nadal wymagane.
Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest chorobą, która może zaatakować wszystkie stawy i prowadzić do chorób autoimmunologicznych w innych narządach. RZS dotyka około 1% dorosłych w krajach rozwiniętych. Jest to dość powszechna choroba, a jej częstość występowania wzrasta z każdym rokiem8. Jednak RZS jest trudny do zidentyfikowania we wczesnych stadiach, a gdy dojdzie do zniszczenia kości, nie ma leczenia, które mogłoby naprawić uszkodzenie. Co więcej, skuteczność leku różni się w zależności od pacjenta i trudno jest przewidzieć, jaki lek jest wymagany. W związku z tym konieczne jest opracowanie metody badań przesiewowych leków i wymagany jest materiał komórkowy, który może odzwierciedlać warunki RZS.
Synocyty podobne do fibroblastów (FLS) są aktywnym uczestnikiem komórkowym w patogenezie RA9,10. FLS występują w błonie maziowej błony wewnętrznej między torebką stawową a jamą, która jest również określana jako błona maziowa. Wspierając strukturę stawu i dostarczając składniki odżywcze do otaczającej chrząstki, FLS zwykle odgrywają kluczową rolę w funkcjonowaniu i utrzymaniu stawów. Jednak FLS w RZS mają fenotyp inwazyjny. RZS FLS mają fenotyp podobny do raka, ostatecznie niszcząc otaczającą kość przez nieskończoną proliferację10. Dzięki tej unikalnej charakterystyce, FLS mogą być stosowane jako obiecujący materiał, który może odzwierciedlać patobiologię RZS. Jednak komórki te są rzadko produkowane, a fenotypy komórek zmieniają się, gdy komórki przechodzą przez kilka przejść w warunkach in vitro. W związku z tym użycie RA FLS jako narzędzia, które może reprezentować stan pacjenta, może być skomplikowane.
Teoretycznie, iPSC pochodzące od pacjentów z RZS (RA-iPSC) mogą stać się idealnym narzędziem do badań przesiewowych leków i dalszych badań. Wygenerowane komórki iPS mają zdolność do samoodnawiania się i mogą być utrzymywane i namnażane in vitro. Dzięki pluripotencji komórki te mogą być różnicowane w dojrzałe linie chondrocytów i osteocytów, które mogą stanowić materiał komórkowy do konkretnych badań nad RZS i innymi chorobami związanymi z kośćmi11.
W tym badaniu pokazujemy, jak izolować i rozszerzać FLS z chirurgicznie usuniętej błony maziowej oraz jak generować RA-iPSC z FLS za pomocą lentiwirusów zawierających czynniki Yamanaka.

<table><tbody><tr><td>Naczynie 100 mm</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówka rogowa</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówka rogowa</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipeta jednorazowa</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr> 5 <tr><td>ml Pipeta jednorazowa</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>FLS Materiały izolacyjne</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczne</tr><tr><td>Kleszcz</td><td></td><td></td><td></td>chirurgiczny</tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td> <td>PenicilinSigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>iPSC Generation Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>Składnik podłoża iPSC (500 ml)</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>Składnik podłoża iPSC (Konk.: 543 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>iPSC składnik podłoża&nbsp; (Stężenie: 14 ng/ml)</td></tr><tr><td>Ludzki składnik pożywki Transfferin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC (stężenie: 10,7 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Podstawowy składnik FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC&nbsp; (Stężenie: 100 ng/ml)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>Składnik pożywki iPSC (stężenie: 20 &mu; g/ml)</td></tr><tr><td>Ludzki TGF&beta; 1</td><td>Składnik pożywki Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC (stężenie: 2 ng/ml)</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>składnik iPSC&nbsp; (Konk.: 64 i mu; g / ml)</td></tr> <tr><td>Polybrene</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Guality Control Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm Szkło osłonowe</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyd (PFA)</td><td>Tech & Innowacja</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-60</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Sox2</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TRA-1-81 Przeciwciało</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Klf4</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L)</td><td>Sonda molekularna</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Sonda molekularna</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Sonda molekularna</td> <td>DAPI</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong złoty odczynnik przeciwblaknący</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Szkło szkiełkowe, powlekane</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isoprypylalcohol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA</td><td>RevertAid Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>gwiazda ładowania</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) marker drabinkowy DNA</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>Milipory</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

Dojrzałe komórki somatyczne mogą zostać odwrócone do stanu podobnego do pluripotencjalnej komórki macierzystej za pomocą zdefiniowanego zestawu czynników przeprogramowujących. Liczne badania wygenerowały indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z różnych typów komórek somatycznych poprzez transdukcję czterech czynników transkrypcyjnych Yamanaka: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc. Badania nad iPSC pozostają w czołówce badań biologicznych i klinicznych. W szczególności specyficzne dla pacjenta iPSC mogą być wykorzystywane jako pionierskie narzędzie do badania patobiologii choroby, ponieważ iPSC mogą być indukowane z tkanki dowolnej osoby. Reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) jest przewlekłą chorobą zapalną, klasyfikowaną przez zniszczenie struktury chrząstki i kości w stawie. Przerost błony maziowej jest jedną z głównych przyczyn lub objawów, które prowadzą do tych wyników w RZS. Synocyty podobne do fibroblastów (FLS) są głównymi komórkami składowymi błony maziowej hiperplastycznej. FLS w stawie rozmnażają się nieograniczenie, ostatecznie atakując sąsiednią chrząstkę i kość. Obecnie błonę maziową przerost można usunąć tylko za pomocą zabiegu chirurgicznego. Usunięta błona maziowa jest wykorzystywana do badań nad RZS jako materiał odzwierciedlający stan zapalny stawu. Jako główny gracz w patogenezie RZS, FLS mogą być wykorzystywane jako materiał do generowania i badania iPSC pacjentów z RZS. W tym badaniu wykorzystaliśmy FLS pacjenta z RZS do wygenerowania iPSC. Korzystając z systemu lentiwirusowego, odkryliśmy, że FLS mogą generować iPSC specyficzne dla pacjenta w kierunku RZS. Komórki iPS wygenerowane z FLS mogą być w przyszłości wykorzystywane jako narzędzie do badania patofizjologii RZS.

W niniejszym badaniu opisujemy protokół generowania iPSC z FLS z wykorzystaniem systemu lentiwirusowego. Rycina 1A przedstawia uproszczony schemat protokołu izolacji FLS. Po chirurgicznym usunięciu błony maziowej tkankę pocięto na małe fragmenty za pomocą nożyczek chirurgicznych. W celu wyizolowania komórek z grudek tkanki dodano kolagenazę. Komórki inkubowano przez 14 dni przed dalszą obróbą. Rycina1B przedstawia morfologię wyizolowanych...

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z synowicytów podobnych do fibroblastów pochodzących od pacjenta, przy użyciu systemu lentiwirusowego bez komórek zasilających.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Mature somatic cells can be reversed into a pluripotent stem cell-like state using a defined set of reprogramming factors. Numerous studies have generated ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, czyli iPSC, z synowiocytów fibroblastopodobnych wyizolowanych z tkanki błony maziowej zapalnego stawu w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Obecnie iPSC można generować z różnych ludzkich komórek pierwotnych. Z powodzeniem wygenerowaliśmy iPSC z ludzkich synowiocytów fibroblastopodobnych, które są kluczowymi komórkami patologicznymi w stawach dotkniętych reumatoidalnym zapaleniem stawów.Może to pomóc w badaniu patologii reumatoidalnego zapalenia stawów. Niniejsza publikacja może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące degeneracji iPSCs z wykorzystaniem RA-FLSs. Rozpocznij od umieszczenia tkanki błony maziowej w szalce o średnicy 100 mm i przemycia tkanki 5 ml PBS z dodatkiem antybiotyków.Usuń żółtawą tkankę tłuszczową oraz pozostałości kostne. Następnie przenieś przyciętą tkankę do jednego dołka płytki sześciodołkowej zawierającej 5 ml DMEM uzupełnionego o FBS i za pomocą nożyczek rozdrobnij tkankę, aż kawałki będą wystarczająco małe, aby przejść przez końcówkę jednorazowej pipety. Przenieś medium do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, następnie dodaj do dołka 5 ml świeżego DMEM z FBS, aby zebrać pozostałą tkankę, i przenieś całą zawartość dołka do probówki.Następnie do probówki dodać rozmrożoną w lodzie kolagenazę do stężenia końcowego 0,01% i zabezpieczyć probówkę parafilmem przed inkubacją w łaźni wodnej o temperaturze 37°C z wytrząsaniem. Po czterech godzinach dopełnić objętość w probówce do 50 ml świeżym medium DMEM z dodatkiem FBS i zebrać fragmenty tkanki poprzez wirowanie. Odpi Pipetować nadosad, uważając, aby nie naruszyć osadu, a następnie ponownie zawiesić komórki w 40 ml świeżego medium przed kolejnym wirowaniem.Resuspender drugi osad w 25 miilliters świeżej pożywki DMEM z dodatkiem FBS i pozwolić dużym grudkom tkanki opaść na dno. Następnie przenieść nadsącz do nowej szalki o średnicy 100 millimeter i inkubować synowiocyty w temperaturze 37 degrees Celsius i 5%CO2 przez 14 dni. Aby powiększyć hodowlę synowiocytów, usunąć zużytą pożywkę i przemyć komórki w 5 milliliters PBS.Usunąć PBS i dysocjować komórki w 1 mililitrze EDTA w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2 minuty. Po zakończeniu inkubacji delikatnie opukać płytkę, aby odspoić pozostałe przylegające komórki, a następnie przenieść powstałą zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów w celu odwirowania. Resuspender osad w 30 mililitrach DMEM i FBS, a następnie rozdzielić komórki do 3 nowych płytek o średnicy 100 milimetrów.Dokarmiaj synowiocyty świeżym medium co 3 dni, dzieląc komórki na 3 nowe hodowle przy 80% konfluencji, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. W dniu zero transdukcji, wysiej 3 x 10⁴ FLS na studzienkę płytki 6-dołkowej w świeżym medium wzrostowym i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2. Następnego dnia rozmroź 1 ampułkę Lenti-virus zawierającą 4 czynniki Yamanaki w temperaturze 4 °C i zastąp medium hodowlane FLS medium wzrostowym FLS uzupełnionym o bromek heksadymetryny i kwas askorbinowy.Po rozmrożeniu zawartości fiolki, dodaj 30 µL lentiwirusa do komórek i delikatnie wymieszaj, aby jednorodnie rozprowadzić wirusa. Aby usprawnić infekcję, odwiruj płytkę i przenieś komórki z powrotem do inkubatora, wymieniając medium każdego dnia na świeże medium wzrostowe FLS zawierające maślan sodu i kwas askorbinowy przez 3 dni. Czwartego dnia zastąp medium mieszaniną medium wzrostowego FLS i medium iPSC zawierającą maślan sodu i kwas askorbinowy.W 5. dniu dodaj 60 µL witronektyny do 6 ml PBS bez wapnia i magnezu, a następnie pokryj 3 dołki płytki 6-dołkowej 2 ml roztworu w każdym dołku, pozostawiając go na co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas gdy witronektyna się wiąże, przemyj przetransdukowane komórki PBS i odczep je za pomocą EDTA, zgodnie z instrukcją. Po zebraniu zdysocjowanych komórek poprzez wirowanie, resuspenduj osad w 900 µL świeżej pożywki.Usunąć nadmiar witronektyny z dołków i dodać po 300, 150 i 100 mikrolitrów komórek do poszczególnych dołków. Następnie umieścić komórki z powrotem w inkubatorze, codziennie wymieniając pożywkę na świeżą pożywkę do iPSC, aż do pojawienia się kolonii. Aby wybiórczo wyizolować kolonie, najpierw dodać 500 mikrolitrów pożywki do iPCS, uzupełnionej o inhibitor ROCK, do każdego dołka płytki 48-dołkowej powlekanej witronektyniną.Następnie umieść kultury FLS pod mikroskopem stereoskopowym w komorze z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 µl wyciąć obszar wokół interesującej kolonii. Używając końcówki pipety o pojemności 200 µl, przenieś wybraną kolonię do jednej studzienki płytki 48-dołkowej. Po pobraniu wszystkich kolonii umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych do czasu, aż kolonie osiągną odpowiednią wielkość do przeniesienia.Przesiewanie komórek, gdy kolonie wykraczają poza pole widzenia mikroskopu przy powiększeniu 100X. Na tym obrazie można zaobserwować morfologię izolowanych FLS po wstępnej 14-dniowej hodowli. Komórki wykazują ogólne cechy fibroblastów z podobną ekspresją markerów włóknistych, takich jak vimentin i fibronectin, a także niską ekspresję markera synowiocytów o charakterze makrofagowym CD-68. Od 8 do 11 dni po transdukcji lentiwirusowej czynnikami Yamanaki zaczynają pojawiać się małe kolonie, które można wyselekcjonować i namnażać przez 5 do 10 pasaży.Te iPSC z zapalenia stawów reumatoidalnych wykazują ekspresję fosfatazy zasadowej, co wskazuje na to, że pozostają one niezróżnicowane. Komórki wykazują również ekspresję markerów pluripotencji, co potwierdzono analizą RT-PCR i immunofluorescencyjną. iPSC z zapalenia stawów reumatoidalnych wykazują prawidłowy kariotyp 44+XY, co ustalono w drodze analizy chromosomowej.Ponadto, 12 tygodni po wstrzyknięciu myszom SCID, iPSC z zapalenia stawów reumatoidalnych utworzyły potworniaki wykazujące różnorodne fenotypy tkankowe. Potwierdzono ich różnicowanie w kierunku poszczególnych warstw zarodkowych za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Po opanowaniu tej metody iPSC mogą być generowane z FLS z błony maziowej.Po obejrzeniu filmu powinni Państwo mieć lepsze zrozumienie procesu izolacji z tkanki maziowej oraz sposobu indukowania reprogramowania z wykorzystaniem tych komórek. iPSC pochodne z RAF-FLS mogą być użyteczne w badaniach nad regeneracją lub w przesiewaniu leków w reumatologii. Po opracowaniu tych iPSC można wygenerować różne rodzaje komórek docelowych lub organów.Co może okazać się przydatne w badaniu choroby lub w innych przyszłych zastosowaniach, takich jak edycja genów i tym podobne.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-using-fibroblast-like

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Przedstawiamy protokół generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych przy użyciu dostarczania czynników ludzkich Oct4, Sox2, Nanog i Lin28 za pomocą lentiwirusów. Pluripotencjalność potwierdzono na podstawie morfologii oraz obecności markerów specyficznych dla embrionalnych komórek macierzystych (ES).

Generowanie indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych poprzez przeprogramowanie ludzkich fibroblastów za pomocą zestawu ludzkich lentiwirusów TF firmy Stemgent

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Ten film prezentuje terapię komórkową autoimmunologicznego zapalenia stawów u myszy. Komórkom regulatorowym T pochodzącym z iPSC, wyrażającym receptory specyficzne dla albuminy jaja kurzego, wstrzykuje się metylowaną albuminę surowicy bydlęcej (mBSA) emulgowaną w adiuwancie. Mysie komórki prezentujące antygen (APC) przetwarzają i prezentują mBSA limfocytom T, wywołując aktywację limfocytów T i migrację do błony maziowej stawu kolanowego. Kolejne wstrzyknięcia obejmują samo mBSA w lewym kolanie...

Terapia komórkowa autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Prezentujemy tutaj protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na każdą pochodną somitu (miotom, sklerotom, dermatom i syndetom) w chemicznie zdefiniowanych warunkach, który ma zastosowanie w przyszłym modelowaniu chorób i terapiach komórkowych w chirurgii ortopedycznej.

Wytwarzanie in vitro pochodnych somitów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Niniejsze badanie dostarcza zmodyfikowany protokół izolacji makrofagów i fibroblastów maziowych z mysiej tkanki zapalnego zapalenia stawów.

Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Opracowaliśmy ludzki system ex vivo transwell zdolny do oceny ostrych zmian zapalnych, zakaźnych i strukturalnych w błonie maziowej.

Model przedkliniczny synowitisu z wykorzystaniem ex vivo ludzkiego tkanki maziowej o zachowanej funkcji i architekturze

Poznaj metodę generowania komórek iPSC z fibroblastopodobnych synowiocytów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów przy użyciu systemu lentiwirusowego bez komórek karmicielskich. Protokół umożliwia badanie patologii choroby.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Przeglądaj więcej filmów