Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych ze stawów pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (IPC) z synowiocytów podobnych do fibroblastów wyizolowanych z tkanki maziowej stawu objętego zapaleniem reumatoidalnym zapalenia stawów. Obecnie iPSC mogą być generowane z różnych ludzkich komórek pierwotnych. Udało nam się wygenerować iPSC z ludzkich synowiocytów podobnych do fibroblastów, które są kluczowymi patologicznymi komórkami stawów reumatoidalnych.

Może to pomóc w zbadaniu patologii reumatoidalnego zapalenia stawów. Czasopismo to może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące degeneracji IPSC przy użyciu RA-FLS. Zacznij od umieszczenia tkanki maziowej w 100-milimetrowym naczyniu i umycia tkanki 5 mililitrami PBS uzupełnionymi antybiotykami.

Usuń żółtawą tkankę tłuszczową i pozostałości kostne. Następnie przenieś przyciętą tkankę do jednego dołka sześciodołkowej płytki zawierającej 5 mililitrów DMEM uzupełnionego FBS i użyj nożyczek, aby zmielić tkankę, aż kawałki będą wystarczająco małe, aby przebić jednorazową końcówkę pipety. Przenieś pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów, a następnie dodaj 5 mililitrów świeżego DMEM plus FBS do studzienki, aby zebrać pozostałą tkankę i przenieść całą zawartość studzienki do probówki.

Następnie dodaj rozmrożoną lodem kolagenazę do końcowego stężenia 0,01% do probówki i uszczelnij probówkę parafilmem do inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Po czterech godzinach napełnij probówkę świeżym DMEM i FBS do końcowej objętości 50 mililitrów i zbierz fragmenty tkanek przez odwirowanie. Usunąć supernatant bez naruszania osadu, a następnie ponownie zawiesić komórki w 40 mililitrach świeżej pożywki do ponownego odwirowania.

Ponownie zawiesić drugą granulkę w 25 mililitrach świeżego DMEM plus FBS i pozwolić, aby duże grudki tkanki osiadły. Następnie przenieś supernatant do nowej 100-milimetrowej szalki i inkubuj synowiocyty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 14 dni. Aby rozszerzyć hodowlę synowiocytów, wyrzuć zużytą pożywkę i umyj komórki w 5 mililitrach PBS.

Usunąć PBS i oddzielić komórki od 1 mililitra EDTA w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2 minuty. Pod koniec inkubacji delikatnie postukaj w naczynie, aby odłączyć pozostałe przylegające komórki i przenieś powstałą zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawieś granulat w 30 mililitrach DMEM i FBS i podziel komórki na 3 nowe 100-milimetrowe naczynia

Karm synowiocyty świeżą pożywką co 3 dni, dzieląc komórki na 3 nowe kultury przy 80% zgrywaniu, jak właśnie pokazano. W dniu zerowym transdukcji zobacz 3 x 10 do 4 FLS na studzienkę na płytkę 6-dołkową w świeżej pożywce do inkubacji przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2. Następnego dnia rozmrozić 1 fiolkę wirusa lenti zawierającą 4 czynniki Yamanaka w temperaturze 4 stopni Celsjusza i zastąpić pożywkę hodowlaną FLS pożywką wzrostową FLS uzupełnioną bromkiem heksadimetryny i kwasem askorbinowym.

Gdy zawartość fiolki się rozmrozi, dodaj 30 mikrolitrów wirusa soczewicy do komórek i delikatnie wymieszaj, aby równomiernie rozprowadzić wirusa. Aby złagodzić infekcję, odwirować płytkę i umieścić komórki z powrotem w inkubatorze, codziennie zastępując pożywkę świeżą pożywką FLS zawierającą maślan sodu i kwas askorbinowy przez 3 dni. W 4 dniu zastąp pożywkę mieszaniną pożywki FLS i pożywki iPSC zawierającej maślan sodu i kwas askorbinowy.

W dniu 5 dodaj 60 mikrolitrów witronektyny do 6 mililitrów PBS bez wapnia i magnezu i pokryj 3 dołki 6-dołkowej płytki po 2 mililitry roztworu każdy przez co najmniej godzinę w temperaturze pokojowej. Podczas gdy witronektyna twardnieje, przemyj transdukowane komórki PBS i odłącz je za pomocą EDTA, jak pokazano. Po zebraniu zdysocjowanych komórek przez odwirowanie, ponownie zawiesić osad w 900 mikrolitrach świeżej pożywki.

Usuń nadmiar witronektyny ze studzienek i dodaj 300, 150 i 100 mikrolitrów komórek do poszczególnych studzienek. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora, codziennie zastępując pożywkę świeżą pożywką iPSC, aż pojawią się kolonie. Aby wybrać kolonie, najpierw dodaj 500 mikrolitrów pożywki iPCS, uzupełnionej inhibitorem ROCK, do każdej studzienki 48-dołkowej płytki pokrytej witronektyną.

Następnie umieść kultury FLS pod mikroskopem preparacyjnym na czystej ławce i użyj końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby przeciąć interesującą kolonię. Używając końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, przenieś pobraną kolonię do 1 dołka z 48-dołkowej płytki. Po zebraniu wszystkich kolonii umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż kolonie będą wystarczająco duże do przeniesienia.

Dzielenie komórek, gdy kolonie znajdują się poza widzialnym polem mikroskopu, patrząc w 100-krotnym powiększeniu. Na tym obrazie można zaobserwować morfologię wyizolowanego FLS po początkowej 14-dniowej hodowli. Komórki wykazują cechy fibroblastów w ogóle z podobną ekspresją markerów zwłóknienia wimentyny i fibronektyny, a także niską ekspresją makrofagopodobnego markera synowiocytów CD-68,8 do 11 dni po transdukcji lenti-wirusa czynnika Yamanaka zaczynają pojawiać się małe kolonie, które można pobrać i amplifikować przez 5 do 10 pasaży.

Te iPSC z reumatoidalnym zapaleniem stawów wyrażają fosfatazę alkaliczną, co wskazuje, że pozostają niezróżnicowane. Komórki wykazują również ekspresję markerów pluripotencjalnych, co potwierdza RT-PCR i analiza immunofluorescencyjna. Reumatoidalne zapalenie stawów iPCS wykazują normalny wzór chromosomalny 44 + XY, określony przez kariotypowanie.

Co więcej, 12 tygodni po wstrzyknięciu myszom SCID, reumatoidalne zapalenie stawów iPSC utworzyło potworniaka, który wykazuje różne fenotypy tkankowe. Różnicowanie listków zarodkowych potwierdzone barwieniem immunofluorescencyjnym. Po opanowaniu, iPSC można wygenerować z FLS z błoną maziową.

Po obejrzeniu filmu powinieneś lepiej zrozumieć, jak izolować od tkanki maziowej i jak wywołać przeprogramowanie za ich pomocą. Te iPSC pochodzące z RAF-FLS mogą być przydatne do badania regeneracji lub badań przesiewowych leków w reumatologii. Po ustaleniu tych iPSC można wygenerować różne rodzaje komórek lub narządów docelowych.

Co może być przydatne do badania choroby lub innych przyszłych zastosowań, takich jak edycja genów i tak dalej.