Name: Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj metodę nieinwazyjnej izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych. Protokół obejmuje hodowlę i fenotypowanie komórek MSC z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Z wdzięcznością dziękujemy za wsparcie finansowe udzielone przez Program Next-Generation BioGreen 21 (No. PJ007969), Administracji Rozwoju Obszarów Wiejskich oraz Narodowej Fundacji Badawczej (grant nr NRF-2015R1D1A1A01056639) Republiki Korei.

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Centrum Eksperymentów Biomedycznych na Uniwersytecie Narodowym w Gyeongsang.
1. Przygotowania do zabiegu na zwierzętach
<ol>
	<li>Przygotować dorosłe samice świnek miniaturowych do nieinwazyjnego pobierania MSCs ze szpiku kostnego i płynu maziowego. Przeprowadzić badanie kliniczne świnek miniaturowych na dzień przed znieczuleniem i pobraniem próbki.
	<ol>
		<li>Zapewnić klinicznie normalne zwierzęta do badań fizykalnych, które obejmują temperaturę ciała, częstość oddechów i tętno, oraz do obserwacji zachowania świń i ich stanu hematologicznego, przy użyciu pełnych badań morfologii krwi. 
		Uwaga: Przedziały parametrów dla klinicznie zdrowych świnek miniaturowych wynoszą 11 - 29 / min dla częstości oddechów, 68 - 98 / min dla tętna i 37 - 38 °C dla temperatury ciała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń całą jadalną ściółkę z klatki podczas okresu postu przedoperacyjnego trwającego 6 - 12 godzin przed podaniem znieczulenia dla młodych i dorosłych świnek miniaturowych, należy przestrzegać 3 godzin postu u noworodków. Zapewnij wodę pitną do czasu znieczulenia.</li>
</ol>
2. Przygotowanie zwierząt do znieczulenia
<ol>
	<li>Przed podaniem znieczulenia świnki należy podać acepromazynę (0,1 mg/kg), medetomidynę (0,03 mg/kg) i atropinę (0,04 mg/kg).
	<ol>
		<li>Wszystkie leki należy wstrzykiwać domięśniowo za pomocą igły 21 G o długości co najmniej 30 mm w przypadku dorosłych świnek miniaturowych. Wykonać wstrzyknięcie domięśniowe 1-3 cm za uchem w boczny mięsień szyjny lub w mięsień uda. 
		Uwaga: Wykonuj wszystkie procedury bez wywoływania strachu lub stresu u zwierząt lub bez konieczności nieostrożnego obchodzenia się z premedykacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść miniświnki w pozycji grzbietowo-leżącej.</li>
	<li>Piętnaście minut po podaniu premedykacji należy rozpocząć znieczulenie za pomocą 1,5% izofluranu podawanego wziewnie.
	<ol>
		<li>Kontynuować inhalację izofluranu (1,5%) przez rurkę dotchawiczą, a następnie zwiększyć stężenie do 2,5%, podając tlen (1,5 l/min) jako gaz nośny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stale monitoruj tętno, temperaturę ciała i przezskórne nasycenie krwi tlenem (SpO2) miniświnek podczas znieczulenia. Używaj koca wodnego z cyrkulacją o temperaturze 38 - 39 °C, aby utrzymać temperaturę ciała. Zastosuj maść okulistyczną, aby chronić oczy przed wysuszeniem podczas znieczulenia.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z klasyfikacją Guedela, aby ocenić głębokość znieczulenia13.</li>
</ol>
3. Przygotowania do izolacji i hodowli komórek
<ol>
	<li>Aby wyhodować MSCs pochodzące ze szpiku kostnego i mazi stawowej, należy przygotować 500 ml zaawansowanej zmodyfikowanej pożywki orlikowej (ADMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% Glutamaxu, 10 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) i 1,0% penicyliny-streptomycyny (odpowiednio 10 000 IU i 10 000 μg/ml, Pen-Strep).
	<ol>
		<li>Inkubować ADMEM w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 w inkubatorze CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 500 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (DPBS) firmy Dulbecco zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi izolacji i przemywania komórek.</li>
</ol>
4. Zbieranie szpiku kostnego od Minipigs
<ol>
	<li>Wybierz obszar o wymiarach około 15 x 15 cm na grzebieniu biodrowym (ryc. 1) i usuń włosy z tego obszaru za pomocą wysterylizowanych maszynek do golenia lub elektrycznych maszynek do strzyżenia. Po umieszczeniu miniświnki należy na przemian trzykrotnie wyszorować miejsce zabiegu następującymi środkami sterylizującymi: jodopowidonem i 70% etanolem. Po dokładnym wyschnięciu obszaru nałóż sterylne zasłony.</li>
	<li>Wstępnie pokryć strzykawkę o pojemności 10 ml 100 j./ml heparyny, spłukując ją 3-4 ml heparyny przed wyrzuceniem środka przeciwzakrzepowego. 
	Uwaga: Wykonaj ten krok, aby uniknąć krzepnięcia w strzykawce podczas aspiracji szpiku kostnego.</li>
	<li>Pobrać co najmniej 5 ml szpiku kostnego z kości grzebienia biodrowego miniświni w znieczuleniu, używając ekstraktora szpiku kostnego (3,0 × 100 mm) ściśle przymocowanego do strzykawki o pojemności 10 ml pokrytej heparyną.</li>
</ol>
5. Izolacja komórek pobranych ze szpiku kostnego i hodowla in vitro
<ol>
	<li>Odizolować komórki od pobranego szpiku kostnego.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć wyekstrahowany szpik kostny równą objętością DPBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 3 ml pożywki wirówkowej o dużej gęstości (Ficoll-Paque) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć 4 ml warstwę szpiku kostnego za pomocą DPBS, który umieszcza się na pożywce wirowej o gęstości bez mieszania, i odwirować ją w temperaturze 400 × g przez 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Pobrać warstwę komórek jednojądrzastych (MNC) z kożucha między dwiema warstwami zawierającymi osocze (górna warstwa) i pożywkę wirującą o gęstości (dolna warstwa) i przenieść MNC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeniesione MNC 7-8 ml DPBS i odwirować je w temperaturze 500 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki DPBS.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 2 ml ADMEM i przenieść go do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm. Inkubować szalkę hodowlaną w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla in vitro komórek wyizolowanych ze szpiku kostnego.
	<ol>
		<li>Po 48 godzinach odessać pożywkę z komórkami, które nie są połączone z naczyniem, zastąpić 2 ml ADMEM i inkubować w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co trzy dni.</li>
		<li>Przy zbiegu 70 - 80% umyj komórki DPBS, dysocjuj je 1 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut, aż komórki się oderwą.</li>
		<li>Zebrać komórki za pomocą 10 ml ADMEM, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Pobrane komórki zawiesić w 1 ml świeżego ADMEM i policzyć je za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Umieścić komórki w kolbie o wymiarach 5 - 7,5 x 105/25T zawierającej 4 ml ADMEM i inkubować je w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 . Zmieniaj podłoże co trzeci dzień.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Pobieranie płynu maziowego od świnek
<ol>
	<li>Podobnie jak w przypadku aspiracji szpiku kostnego, wybierz odpowiedni obszar o wymiarach około 15 x 10 cm (długość/szerokość) nad stawem udowym i usuń włosy za pomocą wysterylizowanych maszynek do golenia lub elektrycznych maszynek do strzyżenia, a następnie wykonaj procedury odkażania (krok 4.1).</li>
	<li>Wprowadzić strzykawkę o pojemności 3 ml z igłą 23 G do stawu po punktach orientacyjnych badania palpacyjnego (grzebień rzepki i piszczeli).
	<ol>
		<li>Delikatnie przyssać strzykawki w celu aspiracji mazi stawowej w stawie. Przybliżona objętość mazi stawowej pobranej ze stawu wynosi 0,5 - 1 ml, ale różni się to w zależności od wielkości świnki lub stawu. Przepłukać przez DPBS w jamie maziowej, jeśli zebrana objętość płynu maziowego jest zbyt mała.</li>
		<li>Natychmiast wyjąć strzykawkę, aby uniknąć zanieczyszczenia krwią.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Izolacja komórek z pobranego płynu maziowego i hodowla in vitro
<ol>
	<li>Wyizoluj komórki z zasysanego płynu maziowego.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć odessany płyn maziowy równą objętością DPBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Aby usunąć zanieczyszczenia, przefiltruj rozcieńczony płyn maziowy za pomocą sitka do komórek nylonowych o średnicy 40 μm.</li>
		<li>Dodać 10 ml DPBS do probówki zawierającej przefiltrowany płyn maziowy i odwirować go przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć komórki DPBS.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 2 ml ADMEM, umieścić komórki na naczyniu do hodowli tkankowej 2 - 3 x 10 5 komórek/35 mm z 2 ml ADMEM i inkubować je w temperaturze 38,5 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórzyć krok 5.2 dla hodowli in vitro izolowanych MSC pochodzących z płynu maziowego.</li>
</ol>
8. Opieka pozabiegowa nad świnkami miniaturowymi
<ol>
	<li>W razie potrzeby zamknąć skórę w miejscu wstrzyknięcia śpiku kostnego pojedynczym szwem za pomocą zszywacza do skóry, po pobraniu szpiku kostnego.</li>
	<li>Po zakończeniu zabiegu należy podawać domięśniowe wstrzyknięcie enrofloksacyny (5 mg/kg) i meloksykamu (0,2 mg/kg) świnkom miniaturowym raz dziennie przez 3 dni.</li>
	<li>Po zakończeniu zabiegu należy raz dziennie przez 3 dni zdezynfekować miejsce pobrania szpiku kostnego i płynu maziowego 0,1% jodowidonu. Uważnie obserwuj codziennie, aby monitorować objawy powikłań (np. obrzęk, ropę lub zaczerwienienie).</li>
</ol>
9. Fenotypowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Gdy MSCs są w 70 - 80% zlewające się w pasażach 3 - 5, przemyj komórki DPBS i potraktuj je 1 ml 0,25% (v/v) Trypsyny/EDTA. Następnie inkubować je w temperaturze 37 °C przez 3-5 minut, aż komórki zostaną odłączone.</li>
	<li>Zebrać komórki za pomocą 10 ml DPBS, przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.</li>
	<li>Aby utrwalić komórki, zawiesić osad komórek w 10 ml 3,7% roztworu formaldehydu i utrzymywać go w temperaturze 4 °C przez jeden dzień przed analizą.
	<ol>
		<li>Jednego dnia po utrwaleniu przemyć komórki DPBS dwukrotnie, odwirowując w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 4 ml DPBS, który jest uzupełniony 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować osad przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C w celu zablokowania niespecyficznych oddziaływań, w których pośredniczy Fc.</li>
		<li>Rozprowadzić 500 μl podwielokrotności zawiesiny komórek do probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>W przypadku przeciwciał niesprzężonych (CD29 i wimentyna) przemywać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 3 minuty. Roztwór supernatantu należy wyrzucić.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl przeciwciała pierwszorzędowego w rozcieńczeniu 1:100 i inkubować go przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie 1% albuminą surowicy bydlęcej przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) w stosunku 1:100 i inkubować go przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku przeciwciał sprzężonych z FITC (izotyp, CD34, CD44 i CD45) przemywać komórki przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 3 minuty. Roztwór supernatantu należy wyrzucić.
	<ol>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 500 μl przeciwciała sprzężonego z FITC w stosunku 1:100 i inkubować go przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W przypadku obu warunków barwienia przemyć komórki dwukrotnie DPBS przez odwirowanie w stężeniu 300 × g przez 5 minut za każdym razem. Roztwór sklarowanego osadu należy odrzucić.</li>
		<li>Zawiesić komórki w 500 μl DPBS, przenieść je do 5 ml probówki okrągłodennej i przeanalizować wyniki za pomocą cytometru przepływowego8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Woodbury, D., Schwarz, E. J., Prockop, D. J., Black, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+rat+and+human+bone+marrow+stromal+cells+differentiate+into+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons.</a> J Neurosci Res. 61 (4), 364-370 (2000).</li>
<li>Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+stem+cells+derived+from+various+mesenchymal+tissues%3A+Superiority+of+synovium+as+a+cell+source%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: Superiority of synovium as a cell source.</a> Arthritis Rheum. 52 (8), 2521-2529 (2005).</li>
<li>De Coppi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amniotic+fluid+and+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+can+be+converted+to+smooth+muscle+cells+in+the+cryo-injured+rat+bladder+and+prevent+compensatory+hypertrophy+of+surviving+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Amniotic fluid and bone marrow derived mesenchymal stem cells can be converted to smooth muscle cells in the cryo-injured rat bladder and prevent compensatory hypertrophy of surviving smooth muscle cells.</a> J Urol. 177 (1), 369-376 (2007).</li>
<li>Arufe, M. C., De la Fuente, A., Fuentes, I., de Toro, F. J., Blanco, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+subpopulations+of+cells+expressing+mesenchymal+stem+cell+markers+derived+from+human+synovial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of subpopulations of cells expressing mesenchymal stem cell markers derived from human synovial membranes.</a> J Cell Biochem. 111 (4), 834-845 (2010).</li>
<li>Patil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+and+proteomic+profiling+of+human+dental+stem+cells+derived+from+a+single+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential and proteomic profiling of human dental stem cells derived from a single donor.</a> Exp Cell Res. 320 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Hatsushika, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra+articular+injection+of+synovial+stem+cells+promotes+meniscal+regeneration+in+a+rabbit+massive+meniscal+defect+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Intra articular injection of synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit massive meniscal defect model.</a> J Orthop Res. 31 (9), 1354-1359 (2013).</li>
<li>Hagmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+bone+marrow-+and+synovium-derived+mesenchymal+stromal+cells+from+osteoarthritis+patients+on+regulatory+T+cells+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22ClinExpImmunol%22%5BJournal%5D)">The influence of bone marrow- and synovium-derived mesenchymal stromal cells from osteoarthritis patients on regulatory T cells in co-culture.</a> ClinExpImmunol. 73 (3), 454-462 (2013).</li>
<li>Lee, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+source-dependent+in+vivo+immunosuppressive+properties+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+the+bone+marrow+and+synovial+fluid+of+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell source-dependent in vivo immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow and synovial fluid of minipigs.</a> Exp Cell Res. 333 (2), 273-288 (2015).</li>
<li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+distinction+of+iNOS+and+IDO+function+in+mesenchymal+stem+cell-mediated+immunosuppression+in+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic distinction of iNOS and IDO function in mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression in mammalian species.</a> Cell Death Differ. 21 (3), 388-396 (2014).</li>
<li>Jones, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+mesenchymal+stem+cells+in+health+and+early+osteoarthritis%3A+Detection+and+functional+evaluation+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid mesenchymal stem cells in health and early osteoarthritis: Detection and functional evaluation at the single-cell level.</a> Arthritis Rheum. 58 (6), 1731-1740 (2008).</li>
<li>Morito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+increase+after+intra-articular+ligament+injury+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology+%28Oxford%29%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid-derived mesenchymal stem cells increase after intra-articular ligament injury in humans.</a> Rheumatology (Oxford). 47 (8), 1137-1143 (2008).</li>
<li>Sekiya, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+synovial+fluid+increase+in+the+knee+with+degenerated+cartilage+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis.</a> J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2011).</li>
<li>John, T., Lerche, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohn%2C+T+%22Anesthesia+and+analgesia+for+veterinary+technicians%22">Anesthesia and analgesia for veterinary technicians</a>. , Mosby Elsevier press. St. Louis, Missouri. (2011).</li>
<li>Cooper, D. K., Gollackner, B., Sachs, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+the+pig+solve+the+transplantation+backlog%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Will the pig solve the transplantation backlog.</a> Annu Rev Med. 53, 133-147 (2002).</li>
<li>Millard, A. L., Mueller, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+issues+related+to+porcine+xenograft+exposure+to+human+viruses%3A+Lessons+from+allotransplantation%5BTitle%5D)+AND+%22CurrOpin+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Critical issues related to porcine xenograft exposure to human viruses: Lessons from allotransplantation.</a> CurrOpin Organ Transplant. 15 (2), 230-235 (2010).</li>
<li>Ringe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+mesenchymal+stem+cells.+Induction+of+distinct+mesenchymal+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Porcine mesenchymal stem cells. Induction of distinct mesenchymal cell lineages.</a> Cell Tissue Res. 307 (3), 321-327 (2002).</li>
<li>Petersen, B., Carnwath, J. W., Niemann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perspectives+for+porcine-to-human+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Micro+biol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The perspectives for porcine-to-human xenografts.</a> Comp Immunol Micro biol Infect Dis. 32 (2), 91-105 (2009).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+adult+progenitor+cells+from+swine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Multipotent adult progenitor cells from swine bone marrow.</a> Stem Cells. 24 (11), 2355-2366 (2006).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Sekiya, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+in+synovial+fluid+increase+in+the+knee+with+degenerated+cartilage+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells in synovial fluid increase in the knee with degenerated cartilage and osteoarthritis.</a> J Orthop Res. 30 (6), 943-949 (2012).</li>
<li>Mochizuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+chondrogenic+potential+of+fibrous+synovium-+and+adipose+synovium-derived+cells+compared+with+subcutaneous+fat-derived+cells%3A+Distinguishing+properties+of+mesenchymal+stem+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: Distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans.</a> Arthritis Rheum. 54 (3), 843-853 (2006).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Świnie miniaturowe wykorzystano do wyizolowania MSCs ze szpiku kostnego i płynu maziowego. Aby wyeliminować różne stany fizjologiczne, takie jak wiek, płeć i choroba, wybrano świnie miniaturowe od dawców tła izogenicznego, aby dokładnie ocenić charakterystykę zależną od źródła komórek. Wiadomo, że świnie są anatomicznie, fizjologicznie i genetycznie podobne do ludzi, a w szczególności świnki miniaturowe mogą wytwarzać narządy o dopasowanej wielkości; W związku z tym mogą być stosowane jako zastępcze gatunki dawców do kse...

Multipotencjalne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) można podzielić na linie komórek mezenchymalnych, a MSC zostały założone i wyizolowane z różnych źródeł tkankowych, takich jak szpik kostny, pępowina, łożyska, tkanka tłuszczowa, skóra skórna, mięśnie szkieletowe, mieszki włosowe, błony maziowe i zęby1-5. Obecnie zwraca się uwagę na MSCs pochodzące z błony maziowej, ponieważ komórki te mogą pomóc w leczeniu chorób stawów, takich jak frakcja kości, choroba zwyrodnieniowa stawów i reumatoidalne zapalenie stawów (RZS), a ze względu na potencjał regeneracyjny MSCs w uszkodzonej chrząstce lub kości, mogą one również pomóc w leczeniu modulacji immunologicznej lub chorób autoimmunologicznych6-8. W większości badań nad MSCs pochodzącymi ze źródeł maziowych wykorzystywano MSCs z błony maziowej, a nie z płynu maziowego2,9; w związku z tym biologiczna wiedza na temat MSC pochodzących z płynu maziowego jest ograniczona.
Płyn maziowy jest łatwo dostępnym źródłem MSC, które mogą być odsysane podczas diagnozowania lub leczenia pacjentów oraz podczas diagnostycznych potwierdzeń różnych stanów zapalenia stawów, które nie wymagają inwazyjnych procedur, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów lub RZS. Populacja MSCs pochodzących z mazi stawowej w jamie maziowej jest znacznie zwiększona u pacjentów z zapaleniem stawów w porównaniu z pacjentami bez zapalenia stawów10-12. Dlatego płyn maziowy jest doskonałym kandydatem na źródło MSCs, szczególnie w terapii autologicznymi komórkami macierzystymi u pacjentów ze stanem zapalnym lub uszkodzonymi stawami. Ponadto MSCs pochodzące z płynu maziowego mają zdolność chondrogenną, zdolności immunomodulacyjne i wysokie tempo proliferacji. W badaniu tym ustanowiono protokoły ekstrakcji szpiku kostnego i aspiracji płynu maziowego od świnek miniaturowych przy użyciu metod nieinwazyjnych oraz ekspansji in vitro izolowanych komórek i analizy fenotypów komórkowych.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowany Dulbecco' s zmodyfikowana pożywka Eagle (ADMEM)</td><td>Gibco</td><td>12491-023</td><td>Pożywka hodowlana MSC</td></tr><tr><td>Dulbecco' s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Pożywka do przemywania komórek, wolna od Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Składnik pożywki MSCs</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Składnik pożywki MSCs</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td>Składnik pożywki MSCs</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>Simga</td><td>F0291</td><td>Składnik pożywki MSCs</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td>Składnik pożywki MSCs</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Odczynnik do dysocjacji komórek&nbsp;</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>Składnik pożywki MSCs</td></tr><tr><td>Przeciwciało izotypowe</td><td>BD Pharmingen</td><td>Przeciwciało 550616</td><td>Kontrola izotypu</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD29</td><td>Pharmingen Pharmingen</td><td>552369</td><td>Integryna beta-1 Marker MSCs</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD44</td><td>BD Pharmingen</td><td>553133</td><td>Marker powierzchniowej komórki Marker MSCs</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD45</td><td>BD Pharmingen</td> Marker <td>hematopoetycznych komórek macierzystych</td> <td>ChAD 340664</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555821</td><td>Marker hematopoetycznych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD90 Przeciwciało</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD 555595</td><td>Marker Thy-1 glikoproteina błonowa Thy-1 Marker MHC</td></tr><tr><td>Przeciwciało klasy II</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-32247</td><td>Marker komórek prezentujących antygen</td></tr><tr><td>Przeciwciało Vimentin</td><td>Sigma</td><td>Sigma-S6389</td><td>Typ III pośredni filament MSCs marker</td></tr><tr><td>Fosfataza alkaliczna</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td>Mieszanina 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-fosforanu (BCIP) i błękitu nitro tetrazolowego (NBT)</td></tr> <tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Wirowanie w gradionym gradimencie gęstości</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>40 &micro; m Nylonowe sitko do komórek</td></tr><tr><td>15 ml polistyrenowa rurka stożkowa</td><td>BD Falcon</td><td>351095</td><td>Pobieranie próbek i izolacja komórek</td></tr><tr><td>Szalki 35 mm</td><td>Nunc</td><td>153066</td><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Ekstraktor szpiku kostnego</td><td>GmbH Medizintechnologie, Niemcy</td><td>1145-1W010</td><td>TrokaBone, 3,0 x 100 mm</td></tr><tr><td>Komora hematokrytowa</td><td>Marinfeld</td><td>640130</td><td>Komora</td></tr> <tr>zliczania komórek<td>Atropine</td><td>Jeil Pharmaceutical Co, Korea</td><td></td> Południowa <td>Hydrat siarczanu atropiny</td></tr><tr><td>Acepromazyna</td><td>Samu Median, Korea</td><td></td> Południowa <td>Przedznieczulający lek uspokajający i przeciwwymiotny</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Lek znieczulający i przeciwbólowy</td></tr><tr><td>Enrofloksacyna</td><td>Bayer Healthcare, Niemcy</td><td></td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Meloksykam</td><td>nad medycyną weterynaryjną, Argentyna</td><td>Lek przeciwzapalny i przeciwbólowy</td>Isoflurane Hana pharm, Korea Południowa Znieczulenie wziewne Jod powidonu&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Korea Pharma, Korea</td><td></td> Południowa <td>Środek sterylizujący</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Środek sterylizujący</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td>Środek przeciwzakrzepowy</td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td>Środek utrwalający komórki</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna&nbsp;</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Oxytetracyklina HCl z siarczanem polimyksyny B</td></tr><tr><td>Cyrkulacyjny koc wodny</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td>System ocieplający w trakcie i po znieczuleniu</td></tr><tr><td>Zszywacz do skóry</td><td>Covidien, USA</td><td></td><td>Zamknięcie skóry szwu</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Thermo Forma</td><td>3111</td><td>Sprzęt do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Analizator komórek</td></tr><tr><td>Minipig</td><td>PWG Genetics Korea, Ltd.</td><td>Miniaturowa świnia</td> <td>typu T</td></tr></tbody></table>

izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych

Isolation and Cellular Phenotyping of Mesenchymal Stem Cells Derived from Synovial Fluid and Bone Marrow of Minipigs

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały stworzone po izolacji z różnych źródeł tkanek, w tym szpiku kostnego i mazi stawowej. Ostatnio doniesiono, że MSCs pochodzące z płynu maziowego mają potencjał różnicowania wieloliniowego i cechy immunomodulacyjne, co wskazuje, że komórki te mogą być wykorzystywane w inżynierii tkankowej i leczeniu ogólnoustrojowym. W pracy przedstawiono protokół prostej i nieinwazyjnej izolacji MSCs pochodzących ze szpiku kostnego i płynu maziowego świnek miniaturowych w celu analizy markerów powierzchniowych komórek do fenotypowania komórek i hodowli in vitro. Wykorzystując dojrzałe płciowo sześciomiesięczne świnki miniaturowe, szpik kostny pobrano z kości grzebienia biodrowego za pomocą ekstraktora szpiku kostnego, a płyn maziowy odessano ze stawu udowo-piszczelowego. Procedury pobierania próbek z obu źródeł były nieinwazyjne. Podano protokoły skutecznej izolacji MSCs od pobranych komórek oraz tworzenia warunków do hodowli in vitro w celu namnażania stabilnych MSCs od świnek miniaturowych oraz stosowania ogólnoustrojowych zabiegów autologicznych. W celu fenotypowania komórek markery powierzchniowe obu komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. W uzyskanych wynikach MSCs wyizolowano z płynu maziowego świnek miniaturowych i wykazano, że MSCs pochodzące z płynu maziowego mają podobną morfologię i fenotyp komórek do MSCs pochodzących ze szpiku kostnego. Dlatego nieinwazyjnie pozyskiwany płyn maziowy jest cennym źródłem MSCs.

Ustanowienie MSC pochodnych z szpiku kostnego i płynu stawowego minipigów
Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostały pomyślnie wyizolowane ze szpiku kostnego oraz stawowych błon maziowych minipigów i namnożone in vitro (Rysunek 2). Aspiracja płynu stawowego za pomocą strzykawki jest prostym zabiegiem, który pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby komórek adherentnych podczas hod...

Przedstawiono protokół ustanawiający mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowane z mazi stawowej i szpiku kostnego świnek miniaturowych i pobrane nieinwazyjnie za pomocą aspiracji strzykawki. Fenotypowanie komórkowe przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej po izolacji komórek oraz hodowli in vitro szpiku kostnego i płynów maziowych pochodzących z MSCs.

Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych

Mesenchymal stem cells (MSCs) have been established after isolation from various tissue sources, including bone marrow and synovial fluid. Recently, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest nieinwazyjne pobieranie płynu stawowego oraz szpiku kostnego od miniprzesiewnych świń w celu pozyskania mezenchymalnych komórek macierzystych do wykorzystania w badaniach nad regeneracją i immunomodulacją. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie terapii MSC w otologii, takie jak sposób pozyskiwania MSC z płynu stawowego oraz ich charakterystyka w porównaniu do MSC pochodzących z szpiku kostnego. Główną zaletą tej techniki jest skuteczne określenie kluczowych właściwości MSC pochodzących z płynu stawowego i szpiku kostnego miniprzesiewnych świń, co będzie przydatne w zastosowaniach klinicznych u pacjentów.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię różnych chorób stawów, ponieważ populacja MSC pochodzących z płynu stawowego w jamie stawowej jest znacznie zwiększona u pacjentów uprawiających sport. Chociaż metoda ta może dostarczyć cennych informacji dla medycyny regeneracyjnej, może być ona również zastosowana w innych badaniach, takich jak badania nad chorobami autoimmunologicznymi. Ponieważ MSC minipig są autologiczne, immunosupresja może być interesująca dla ludzi.Oprócz pozostałych naukowców, procedurę zade

isolation-cellular-phenotyping-mesenchymal-stem-cells-derived-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten protokół opisuje izolację komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej świni (pADSC) z podskórnych tkanek tłuszczowych z badaniem multipotencji. Multipotencjalne pADSC są wykorzystywane do wyznaczania procesów różnicowania adipocytów i badania transdyferencjacji do wielu linii komórkowych mezenchymy mezodermalnej lub dalszych linii ektodermy i endodermy do badań regeneracyjnych.

Izolacja i różnicowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z podskórnych tkanek tłuszczowych świń

Ten artykuł przedstawia prosty i ekonomiczny protokół prostej izolacji i oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii.

Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Mezenchymalne komórki macierzyste poduszeczki tłuszczowej (IFP-MSC) można łatwo wyizolować z podrzepkowej poduszki tłuszczowej stawu kolanowego. Dobrze rozmnażają się in vitro, tworzą kolonie CFU-F i różnicują się w linie adipogenne, chondrogeniczne i osteogenne. W niniejszym artykule przedstawiono metodologię izolacji, rozszerzania i różnicowania IFP-MSC od stawu kolanowego kóz.

Izolacja, ekspansja i różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych z podrzepkowej poduszeczki tłuszczowej stawu kolanowego kozy

Niniejsze badanie dostarcza zmodyfikowany protokół izolacji makrofagów i fibroblastów maziowych z mysiej tkanki zapalnego zapalenia stawów.

Izolacja i hodowla pierwotnych makrofagów maziowych i fibroblastów z mysiej tkanki zapalenia stawów

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Opisana metoda obejmuje izolację i charakterystykę ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba (hDPSCs) z wykorzystaniem dysocjacji enzymatycznej miazgi (DPSC-ED) lub bezpośredniego wypływu komórek macierzystych z eksplantów tkanki miazgi (DPSC-OG). Następnie przeprowadzono porównawczą różnicowanie obu typów hDPSCs w odontoblasty in vitro.

Izolacja, charakterystyka i różnicowanie porównawcze ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zębowej pochodzących z zębów trwałych z wykorzystaniem dwóch różnych metod

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Receptorowe kinazy tyrozynowe są ektopowo wyrażane w wielu nowotworach i zostały zidentyfikowane jako cele terapeutyczne w ostrej białaczce. W artykule opisano skuteczną strategię oceny przedklinicznej inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki.

Przedkliniczna ocena inhibitorów kinazy tyrozynowej w leczeniu ostrej białaczki

Ten protokół opisuje znakowanie radioaktywne mezenchymalnych komórek macierzystych koni i ich implantację do urazów ścięgien u konia w celu określenia przeżycia komórek i dystrybucji tkanek za pomocą scyntygrafii gamma.

In vivo (in vivo) Obrazowanie i śledzenie mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego znakowanych technetem-99m w tendinopatii koni

Poznaj metodę nieinwazyjnej izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych. Protokół obejmuje hodowlę i fenotypowanie komórek MSC z wykorzystaniem cytometrii przepływowej.

Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych

Przeglądaj więcej filmów