Izolacja i fenotypowanie komórkowe mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego świnek miniaturowych
2 lipca 2016
Przedstawiono protokół ustanawiający mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wyizolowane z mazi stawowej i szpiku kostnego świnek miniaturowych i pobrane nieinwazyjnie za pomocą aspiracji strzykawki. Fenotypowanie komórkowe przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej po izolacji komórek oraz hodowli in vitro szpiku kostnego i płynów maziowych pochodzących z MSCs.
Ogólnym celem tej procedury jest nieinwazyjne pobranie mazi stawowej i szpiku kostnego od świnek miniaturowych w celu pobrania mezenchymalnych komórek macierzystych do wykorzystania w badaniach nad regeneracją i immunomodulacją. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie otologii MSC, takie jak sposób ustalenia mazi stawowej w MSC i jak scharakteryzować ją w porównaniu z MSC szpiku kostnego. Główną zaletą tej techniki jest skuteczne ustalenie kluczowych właściwości płynu maziowego i MSCs pochodzących ze szpiku kostnego od świnek miniaturowych, które będą przydatne do stosowania u pacjentów.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię różnych chorób stawów, ponieważ populacja MSC pochodzącego z mazi stawowej w jamie maziowej jest znacznie zwiększona u pacjentów wysportowanych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w medycynę regeneracyjną, może być również stosowana w innych badaniach, takich jak badania nad chorobami autoimmunologicznymi. Ponieważ MSCs świnek miniaturowych są autologiczne, immunosupresja może zainteresować ludzi.
Oprócz innych naukowców, procedurę zademonstrują Hyeon-Jeong Lee i Won-Jae Lee z mojego poziomu trzeciego. Na początek ustaw znieczuloną miniświnkę, aby uzyskać dostęp do grzebienia biodrowego. Następnie wykonaj depilację obszaru o powierzchni 15 centymetrów kwadratowych na grzebieniu biodrowym za pomocą brzytwy lub maszynki do strzyżenia.
Następnie na przemian trzykrotnie szoruj odsłoniętą skórę powidonem-jodem i 70% etanolem. Po całkowitym wyschnięciu nałóż sterylne zasłony. Teraz wstępnie pokryj dziesięciomililitrową strzykawkę heparyną, używając trzy- do czteromililitrowego płukanki.
Zapobiegnie to krzepnięciu szpiku kostnego podczas jego ekstrakcji. Następnie, dokładnie w grzebieniu kości biodrowej, mocno przymocuj ekstraktor szpiku kostnego do strzykawki pokrytej heparyną i wyekstrahuj co najmniej pięć mililitrów szpiku kostnego. Aby wyizolować komórki z wyekstrahowanego szpiku kostnego, najpierw rozcieńcz go równą objętością DPBS w 15-mililitrowej stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
Następnie załaduj trzy mililitry pożywki wirowej o gęstości do drugiej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Następnie ostrożnie przenieś cztery mililitry rozcieńczonego szpiku kostnego na pożywkę wirówkową o dużej gęstości, aby utworzyć dwie warstwy roztworu. Teraz odwiruj probówkę o sile 400 g przez 40 minut w temperaturze pokojowej.
Pożądane korporacje wielonarodowe są zbierane w centralnej białej warstwie. Zassaj tylko tę warstwę. Wyrzuć warstwę MNC do 15-mililitrowej stożkowej rurki i rozcieńcz ją siedmioma do ośmiu mililitrami DPBS.
Następnie odwirować komórki w temperaturze 500 g przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Wyrzucić supernatant i dwukrotnie przemyć paletyzowane komórki dziesięcioma mililitrami DPBS, powtarzając poprzedni cykl wirowania. Po dwóch praniach zawieszamy MNC w dwóch mililitrach ADMEM.
Następnie załaduj komórki na 35-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej i inkubuj je w temperaturze 38,5 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Po 48 godzinach odessać pożywkę wraz z niepodłączonymi MNC. Następnie dodaj z powrotem dwa mililitry świeżego ADMEM i kontynuuj inkubację, zmieniając pożywkę co trzy dni.
Gdy komórki osiągną zbieżność od 70 do 80%, umyj kulturę świeżym DPBS. Następnie rozdziel komórki, używając jednego mililitra 0,25% trypsyny-EDTA przez trzy do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zbierz komórki w dziesięciu mililitrach ADMEM i przenieś je do 15-mililitrowej stożkowej probówki.
Następnie odwiruj komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i wyrzuć supernatant. Teraz zawieś zebrane MNC w jednym mililitrze świeżego ADMEM i zmierz ich gęstość. Zakończ posiewem od 1/2 do trzech czwartych miliona komórek w kolbach T25 z czterema mililitrami ADMEM.
Inkubować kolby tak samo jak płytki i zmieniać podłoże co trzeci dzień. Przygotuj wycinek skóry o wymiarach 15x10 centymetrów nad stawem udowym, tak jak to miało miejsce podczas przygotowań do pobrania szpiku kostnego. Następnie badanie palpacyjne w poszukiwaniu grzebieni rzepki i piszczeli pod skórą, aby zidentyfikować staw maziowy, i włóż trzymililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 23 dokładnie do stawu.
Używając delikatnego odsysania, wyekstrahuj od 1/2 do jednego mililitra płynu i natychmiast wyjmij igłę. Jeśli objętość płynu maziowego jest zbyt mała, przepłucz jamę DPBS, aby zebrać płyn maziowy za pomocą DPBS. Objętość DPBS do użycia różni się w zależności od wielkości jamy maziowej.
Optymalna objętość mazi stawowej jest ograniczona w zdrowym stawie. Objętość zmienia się w zależności od wielkości i stanu patologicznego stawu. Aby wyizolować komórki z płynu maziowego, rozcieńczyć płyn równą objętością DPBS w 15-mililitrowej stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
Następnie przesuwamy zanieczyszczenia, filtrując rozcieńczenie przez 40-mikronowe sitko do komórek nylonowych. Następnie dodaj jeszcze dziesięć mililitrów DPBS i odwiruj zawiesinę w temperaturze 400 g przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć supernatant i umyj komórki dwa razy za pomocą DPBS.
Umytą paletę komórek zawieszamy w dwóch mililitrach ADMEM. Następnie należy przystąpić do hodowli komórek, tak jak wykazano w przypadku MSC. MSCs zostały z powodzeniem wyizolowane ze szpiku kostnego i stawowych stawów maziowych świnek miniaturowych i namnażone in vitro.
Morfologia MSCs pochodzących z płynu maziowego jest podobna do morfologii MSCs pochodzących ze szpiku kostnego: oba mają kształt wrzeciona fibroblastycznego i są jednorodnie przylegające. MSCs wykazały dodatnią ekspresję barwienia fosfatazą alkaliczną po zakończeniu trzeciej subkultury. Następnie przeanalizowano markery powierzchniowe w obu kulturach.
Zgodnie z oczekiwaniami, oba typy MSC wykazywały znaczącą ekspresję CD29, CD44 i wimentyny. Natomiast ekspresja CD34 i CD45 była ujemna i niska. Wyniki te były identyczne z wynikami uzyskanymi za pomocą charakterystycznych MSC, w tym komórek wyizolowanych z mazi stawowej.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nieinwazyjnie odsysać płyn maziowy i szpik kostny w celu wyizolowania ich MSC od świnek miniaturowych oraz jak przeprowadzić porównanie i fenotypowanie tego MSC. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zlokalizowaniu obiektywnego punktu na grzebieniu biodrowym i błonie maziowej, wyznaczonego przez dokładne badanie palpacyjne. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak modele choroby zwyrodnieniowej stawów lub reumatoidalnego zapalenia stawów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy nie tylko ze szpiku MSC, ale także płynu maziowego, MSC mają taką samą zdolność do inicjacji chrząstki lub kości i immunosupresji.
Po opracowaniu technika ta przyczyniła się do rozwoju autologicznej terapii chorób stawów, pomagając scharakteryzować MSCs pochodzące z zaatakowanego lub zapalnego stawu u pacjentów z zapaleniem stawów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół nieinwazyjnego pobierania komórek macierzystych mezenchymalnych (MSCs) z płynu maziowego i szpiku kostnego miniświń. Badanie podkreśla znaczenie charakteryzacji tych komórek dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej i immunomodulacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna regeneracyjna
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Immunomodulacja
Tło
- Komórki macierzyste mezenchymalne (MSCs) mają potencjalne zastosowania terapeutyczne.
- Miniświnie są cennym modelem do badania chorób człowieka.
- MSCs pochodzące z płynu maziowego mogą różnić się od MSCs pochodzących z szpiku kostnego.
- Zrozumienie tych różnic może poprawić strategie leczenia chorób stawów.
Cel badania
- Ustanowienie nieinwazyjnej metody pobierania MSCs od miniświń.
- Porównanie właściwości MSCs pochodzących z płynu maziowego i szpiku kostnego.
- Zbadanie implikacji dla terapii chorób stawów i badań nad chorobami autoimmunologicznymi.
Zastosowane metody
- Nieinwazyjne pobieranie płynu maziowego i szpiku kostnego za pomocą aspiracji strzykawką.
- Izolacja i hodowla in vitro MSCs.
- Fenotypizacja komórek wykonywana za pomocą cytometrii przepływowej.
- Porównanie cech MSCs z różnych źródeł.
Główne wyniki
- Udana izolacja MSCs zarówno z płynu maziowego, jak i szpiku kostnego.
- Charakteryzacja MSCs ujawniła różne właściwości w zależności od ich źródła.
- Wyniki potwierdzają potencjał MSCs w leczeniu chorób stawów.
- Uzyskane wglądy mogą pomóc w przyszłych badaniach nad chorobami autoimmunologicznymi.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę pobierania MSCs od miniświń.
- Charakteryzacja MSCs z różnych źródeł jest kluczowa dla zastosowań terapeutycznych.
- To badanie przyczynia się do lepszego zrozumienia MSCs w medycynie regeneracyjnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Non-invasive isolation and phenotyping of mesenchymal stem cells (MSCs) from minipig synovial fluid and bone marrow enables robust comparative analysis of cell sources for regenerative and immunomodulatory research. This workflow supports early-stage target validation and de-risks translational studies by providing standardized, reproducible MSC populations for downstream applications. The approach enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio advancement for cell-based therapies targeting joint and autoimmune diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of MSCs from distinct tissue sources for functional target validation.
- Supports biological de-risking by confirming phenotypic equivalence of synovial and marrow-derived MSCs.
- Facilitates hypothesis testing on MSC immunomodulatory and regenerative properties.
- Provides a foundation for mechanistic studies in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Delivers validated MSC populations for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative flow cytometry-based phenotyping for robust screening outputs.
- Supports preparation of scalable, homogeneous cell systems for compound evaluation.
- Improves readiness for high-content screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns MSC sourcing with disease-relevant preclinical models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of autologous cell therapy candidates.
- Supports biomarker alignment through surface marker analysis and functional assays.
- De-risks preclinical studies by confirming cell identity and comparability across sources.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying standardized MSCs for target validation, assay development, and translational research in joint and autoimmune disease models.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification using well-characterized MSCs.
- Screening: Enables reproducible, quantitative phenotyping for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based surface marker data for comparative analysis of cell populations.
- Translational Research: Supports continuity from early discovery through preclinical validation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for MSC isolation and characterization across multiple studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in MSC-based research.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and phenotyping for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in cell therapy pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of MSC-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and flow cytometry analysis.
- Needs access to centrifugation, cell culture, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of isolation and phenotyping protocols.
- Adaptable to various preclinical models with attention to joint size and fluid volume.
- Limited by synovial fluid availability in healthy versus diseased joints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Collecting Bone Marrow from Minipigs
2:47
Isolation of Cells and In Vitro Cultivation
4:42
In Vitro Cultivation of Cells Isolated from Bone Marrow
6:18
Collecting Synovial Fluid and Cultivating Isolated Cells
8:19
Results: Bone Marrow- and Synovial Fluid-derived MSC Morphology and Cell Surface Marker Expression
9:23
Conclusion
