Name: Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Poznaj metodę izolacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego szczura i ich hodowlę na statycznie rozciągniętym podłożu PDMS. Współkultura z komórkami Schwanna wspiera mielinizację i wyrównanie aksonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Vasco za pomoc w przygotowaniu substratów PDMS, dr Shiyong Wang z laboratorium dr Mariny Maty na Uniwersytecie Michigan za pomocne sugestie i szkolenie dotyczące izolacji DRG, oraz dr Markowi Tuszynskiemu i dr W. Marie Campana z UC San Diego za pomocne sugestie i protokół izolacji SC. Badanie to było częściowo wspierane przez National Science Foundation (CBET 0941055 i CBET 1510895), National Institute of Health (R21CA176854, R01GM089866 i R01EB014986).

Wszystkie procedury izolacji komórek zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Michigan.
1. Przygotowanie wstępnie rozciągniętej powierzchni anizotropowej 
<ol>
	<li>Wymieszaj roztwór bazy i utwardzacza w stosunku 10:1 i wlej mieszaninę do naczynia do hodowli tkankowej (średnica 12 cm). Użyj 4,900 mg zasady i 490 mg utwardzacza dla całkowitej mieszaniny sieciującej.</li>
	<li>Trzymaj mieszaninę żelu w próżni przez 20 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Umieść mieszaninę żelu w piekarniku do utwardzania przez noc w temperaturze 60 °C.</li>
	<li>Po utwardzeniu membrany PDMS należy pokryć powierzchnię plazmą tlenową za pomocą systemu czyszczenia/trawienia plazmowego przez 3 minuty przy przepływie 165 mTorr i 65 sccm przepływuO2.</li>
	<li>Wytnij kawałek prostokątnej membrany (5 × 3,5 cm) z naczynia, mając świadomość, która strona jest poddana działaniu tlenu, upewnij się, że strona poddana działaniu tlenu jest skierowana do góry i przymocuj do ramy rozciągającej. Umieść ramkę na stoliku rozciągającym i równomiernie rozciągnij, obracając pokrętło na stoliku, aż osiągnie 10% wydłużenia (lub inne z góry określone rozciągnięcie; wydłużenie można odczytać bezpośrednio z etapu rozciągania) na dłuższej osi 9. Napraw rozciągnięcie, dokręcając na ramie.</li>
	<li>Usuń ramkę ze stołu montażowego. Upewnij się, że powierzchnia membrany jest sucha i wolna od kurzu, a następnie umieść silikonową komorę na membranie, pozwalając lepkiej stronie komory mocno przylegać do membrany. 
	Uwaga: Silikonowa komora zapewnia dołek do zatrzymywania podłoża komórkowego na membranie PDMS. Konstrukcję urządzenia pokazano na rysunku 1.</li>
	<li>Sterylizuj powierzchnię promieniami UV przez 10 min.</li>
	<li>Dodać 1 ml poli-L-lizyny (PLL) (0,01% w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami) do powierzchni PDMS w komorze, w ciągu 6 godzin od obróbki osoczem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C przed wysiewem neuronów DRG. Zwiększa to przyczepianie komórek.</li>
</ol>
2. Izolacja DRG
<ol>
	<li>Przygotuj standardową pożywkę wzrostową dla neuronów DRG.</li>
	<li>Przed izolacją należy przelać w autoklawie sprzęt do izolacji i przefiltrować odczynniki. Dodać 5 ml buforu izolacyjnego do jednego dołka na płytce 6-dołkowej i umieścić płytkę na lodzie. Przygotować 10 ml pożywki dysocjacyjnej, dodając 1 ml kolagenazy A (500 U/ml) do 9 ml 0,05% trypsyny-EDTA (1 mg/ml), przefiltrować roztwory filtrem 0,22 μm i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Do izolacji użyj dziesięciu do dwunastu 5-7-dniowych szczurów Sprague-Dawley. Spryskaj szczenięta 75% izopropanolem i złóż w ofierze przez ścięcie.</li>
	<li>Odetnij skórę pokrywającą rdzeń kręgowy od tyłu i usuń nadmiar tkanki wokół kręgosłupa. Pod lupą chirurgiczną z włączonymi chirurgicznymi światłami punktowymi wykonaj pierwsze nacięcie od szyi, a następnie jedno nacięcie wzdłuż kręgosłupa po obu stronach nożyczkami. Odłącz kręgosłup od ciała szczeniąt i usuń nadmiar mięśni. Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż długiej osi kręgosłupa i użyj pęsety, aby całkowicie otworzyć kręgosłup i usunąć rdzeń kręgowy. Zdjąć końcówkę z pipety, aby utworzyć większy otwór do przenoszenia DRG z buforem izolacyjnym do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej pęsety usuń ganglion z kieszonki kostnej i zbierz około 10 – 16 DRG z obu stron. Przyciąć korzenie nerwowe i przenieść zwoje nerwowe do lodowatego bufora izolacyjnego.</li>
	<li>Zdjąć końcówkę z pipety, aby utworzyć większy otwór do przenoszenia DRG z buforem izolacyjnym do sterylnej probówki o pojemności 15 ml. Po dysocjacji chemicznej odwirować zwoje jaj w temperaturze 900 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Pozwól tkankom osiąść na dnie probówki i delikatnie usuń bufor izolacyjny z góry i dodaj 10 ml pożywki dysocjacyjnej do probówki.</li>
	<li>Wypreparowane tkanki inkubować w pożywce dysocjacyjnej w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wstrząsając probówką co 5 - 10 minut.</li>
	<li>Po dysocjacji chemicznej odwirować zwoje jaj w temperaturze 900 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml standardowej pożywki wzrostowej i odwirować.</li>
	<li>Ponownie odwirować zdysocjowane komórki, jak wskazano w sekcji 2.9.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 12 ml standardowej pożywki wzrostowej i odwirować.</li>
</ol>
3. Kultura DRG na wstępnie rozciągniętej powierzchni
<ol>
	<li>Przed wysiewem komórek należy usunąć roztwory PLL z komory i spłukać powierzchnię PDMS sterylną wodą i wysuszyć na powietrzu.</li>
	<li>Po ponownym zawieszeniu ogniw pozwól zawiesinie zastygnąć na 1 - 2 minuty, aby zanieczyszczenia opadły na dno rurki. Dodać 1,5 ml zawiesiny komórkowej do każdej komory rozciągania i inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
	<li>Aby wyeliminować komórki glejowe, po 1 dniu in vitro (DIV) dodać 10 μl (lub 15 μl) mieszaniny fluoro-2 deoksyurydyny i roztworu podstawowego urydyny (FDU-U) (patrz tabela materiałów) do każdego dołka. Po 7 godzinach zastąpić tę pożywkę świeżą standardową pożywką wzrostową i umieścić wstępnie rozciągnięte urządzenie do hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>W okresie hodowli komórkowej (2-3 tygodnie) zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką. Uwaga: Po hodowli na rozciągniętych i nierozciągniętych powierzchniach przez 2 tygodnie, oczyszczone SC dodaje się do komory i hoduje przez kolejny tydzień (krok 4.7).</li>
</ol>
4. Współhodowla komórek Schwanna (SC) z neuronami DRG na wstępnie rozciągniętej powierzchni
<ol>
	<li>Izoluj SC zgodnie z opisem grupy dr Campana wcześniej 15.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, odizoluj SC od 1-dniowego szczeniaka. Zbierz i oddziel nerwy kulszowe zarówno chemicznie (Trypsyna-EDTA i Kolagenaza A), jak i mechanicznie (igła 18 G / strzykawka 10 ml) 15.</li>
		<li>Zasiać zdysocjowane komórki w kolbie T25 pokrytej poli-D-lizyną (PDL) i wyhodować w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 . W dniu 5 oczyść komórki poprzez selekcję przeciwciał przy użyciu przeciwciała Anti-thy 1.1 i dopełniacza królika i subkulturuj oczyszczone komórki do pasażu 2 - 4. Należy użyć pożywki zawierającej zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco Eagle Medium (DMEM), 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny (Penn/Strep), 21 μg/ml ekstraktu z przysadki bydlęcej (BPE) i 4 μM forskoliny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z SC i dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA do kolby. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 przez 2-3 minuty.</li>
	<li>Sprawdzić komórki pod mikroskopem optycznym za pomocą obiektywu 10X, aby zobaczyć, czy podnoszą się z kolby, a następnie dodać 5 ml pożywki hodowlanej i wymieszać z komórkami w kolbie.</li>
	<li>Dodać zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować w temperaturze 200 x g i temperaturze 20 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 7 ml standardowej pożywki wzrostowej DRG.</li>
	<li>Pobrać 10 μl zawiesiny komórkowej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml, wymieszać z 10 μl błękitu trypanowego, a następnie policzyć liczbę komórek za pomocą hemocytometru pod mikroskopią optyczną przy użyciu obiektywu 10X. Rozcieńczyć zawiesinę komórkową do 5 000 komórek na ml, dodając pożywkę wzrostową DRG.</li>
	<li>Usunąć 0,5 ml pożywki z kultury DRG w rozciągniętej komorze i dodać 0,5 ml zawiesiny SC do kultury DRG.</li>
	<li>Hodować komórki przez 1 tydzień w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą standardową pożywką do DRG. Po 1 tygodniu kohodowli przetworzyć komórki za pomocą immunohistochemii 10.</li>
</ol>

<ol><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+C+%22Layer-by-Layer+Films+for+Biomedical+Applications%22">Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications</a>. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).</li>
<li>Faweett, J. W., Keynes, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+Nerve+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral Nerve Regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).</li>
<li>Li, Y., Field, P. M., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+adult+rat+corticospinal+tract+by+transplants+of+olfactory+ensheathing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Repair of adult rat corticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells.</a> Science. 277, 2000-2002 (1997).</li>
<li>Geller, H. M., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+bridge%3A+Engineering+spinal+cord+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Building a bridge: Engineering spinal cord repair.</a> Exp Neurol. 174, 125-136 (2002).</li>
<li>Totoiu, M. O., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+injury+is+accompanied+by+chronic+progressive+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination.</a> J Comp Neurol. 486, 373-383 (2005).</li>
<li>Chua, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+neurites+sense+the+depth+of+the+underlying+topography+during+neuronal+differentiation+and+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Extending neurites sense the depth of the underlying topography during neuronal differentiation and contact guidance.</a> Biomaterials. 35, 7750-7761 (2014).</li>
<li>Dowell-Mesfin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topographically+modified+surfaces+affect+orientation+and+growth+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Topographically modified surfaces affect orientation and growth of hippocampal neurons.</a> J Neural Eng. 1, 78-90 (2004).</li>
<li>Baek, S., Gleason, R. L., Rajagopal, K. R., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+of+small+on+large%3A+Potential+utility+in+computations+of+fluid-solid+interactions+in+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Method+Appl+M%22%5BJournal%5D)">Theory of small on large: Potential utility in computations of fluid-solid interactions in arteries.</a> Comput Method Appl M. 196, 3070-3078 (2007).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Static+Pre-stretch+Induced+Surface+Anisotropy+on+Orientation+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Effect of Static Pre-stretch Induced Surface Anisotropy on Orientation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Cell Mol Bioeng. 7, 106-121 (2014).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+pre-stretch+induced+surface+anisotropy+on+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">The impact of pre-stretch induced surface anisotropy on axon regeneration.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li>
<li>Berns, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligned+neurite+outgrowth+and+directed+cell+migration+in+self-assembled+monodomain+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Aligned neurite outgrowth and directed cell migration in self-assembled monodomain gels.</a> Biomaterials. 35, 185-195 (2014).</li>
<li>Kidambi, S., Lee, I., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neuron%2Fastrocyte+co-culture+on+polyelectrolyte+multilayer+films%3A+A+template+for+studying+astrocyte-mediated+oxidative+stress+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Primary neuron/astrocyte co-culture on polyelectrolyte multilayer films: A template for studying astrocyte-mediated oxidative stress in neurons.</a> Adv Funct Mater. 18, 294-301 (2008).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+neurite+growth+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+and+increased+colocalization+with+Schwann+cells+on+aligned+poly%28methyl+methacrylate%29+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Directed neurite growth of rat dorsal root ganglion neurons and increased colocalization with Schwann cells on aligned poly(methyl methacrylate) electrospun nanofibers.</a> Brain Research. 1565, 18-27 (2014).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+Extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: Extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Mantuano, E., Jo, M., Gonias, S. L., Campana, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+Density+Lipoprotein+Receptor-related+Protein+%28LRP1%29+Regulates+Rac1+and+RhoA+Reciprocally+to+Control+Schwann+Cell+Adhesion+and+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low Density Lipoprotein Receptor-related Protein (LRP1) Regulates Rac1 and RhoA Reciprocally to Control Schwann Cell Adhesion and Migration.</a> Journal of Biological Chemistry. 285, 14259-14266 (2010).</li>
<li>Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+of+plasma+oxidized+PDMS+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).</li>
<li>Lopera, S., Mansano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-Based+Surface+Modification+of+Polydimethylsiloxane+for+PDMS-PDMS+Molding%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding.</a> ISRN Polymer Science. 2012, (2012).</li>
<li>Chandra, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChandra%2C+G+%22Organosilicon+Materials%22">Organosilicon Materials</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).</li>
<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+poly%28dimethylsiloxane%29+surface+modification+to+control+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-channel+scaffolds+to+promote+spinal+cord+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration.</a> Biomaterials. 27, 419-429 (2006).</li>
<li>Clarke, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+methacrylate+polymers+direct+spiral+ganglion+neurite+and+Schwann+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth.</a> Hearing Res. 278, 96-105 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnego konfliktu interesów.

Aby wywołać wyrównanie aksonów na wstępnie rozciągniętej powierzchni, istnieją dwa krytyczne kroki: 1) membrana PDMS musi być płaska i mieć jednorodną grubość; oraz 2) komórki glejowe muszą zostać usunięte z DRG. Po wymieszaniu PDMS i środka sieciującego oraz utwardzeniu w piekarniku, usieciowany żel PDMS należy przechowywać na płaskim blacie i obchodzić się z nim ostrożnie, aby uniknąć przechylenia. Po obróbce plazmą tlenową membrany PDMS należy w ciągu 6 godzin nałożyć powłokę PLL, ponieważ hydrofilowość powierzchni (w...

W uszkodzeniach nerwów, proksymalne i dystalne kikuty nerwowe są często uniemożliwione przed bezpośrednim wyrównaniem pęczków nerwowych ze względu na miejsce uszkodzenia 1-2. Zwykle trakty aksonów składają się z wysoce uporządkowanych i wyrównanych wiązek aksonów, które tworzą złożone sieci połączeń. Jednak regeneracja nerwów jest procesem chaotycznym z powodu źle zorganizowanego ustawienia aksonów 3-4. Dlatego, aby wygenerować wystarczającą liczbę regenerujących się aksonów, które wypełniają miejsce uszkodzenia, konieczne jest wywołanie dobrze zorganizowanego wyrównania aksonów. Dodatkowo demienizacja towarzyszy urazom nerwów spowodowanym obumarciem komórek mielinizujących w miejscu urazu. Ponieważ demienizacja silnie upośledza zdolność przewodzenia aksonów, które przeżyły, leczenie ukierunkowane na demielinizację lub promowanie remielinizacji jest istotne dla powrotu do sprawności funkcjonalnej po uszkodzeniu nerwów 5. Tak więc celem tego protokołu jest zilustrowanie podejścia inżynieryjnego, które odnosi się do tych dwóch kwestii regeneracji nerwów.
Anizotropia powierzchniowa, która jest definiowana jako różnica, mierzona wzdłuż różnych osi, w fizycznych lub mechanicznych właściwościach materiału, została zastosowana do wpływania na wyrównanie, wzrost i migrację komórek, 6-7. Oprócz topografii istnieją inne metody wywoływania anizotropii. Wcześniej badaliśmy anizotropię powierzchni indukowaną mechanicznym statycznym wstępnym rozciąganiem membrany polidimetylosiloksanowej (PDMS). Teoria "małej deformacji nałożonej na dużą" przewidywała, że efektywna sztywność, którą komórki wyczuwają w kierunku rozciągnięcia, różni się od kierunku prostopadłego, a ta różnica w efektywnej sztywności wynika z anizotropii powierzchni 8. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) hodowane na wstępnie rozciągniętej błonie PDMS są w stanie wyczuć anizotropię poprzez aktywne ciągnięcie powierzchni i w rezultacie wyrównać się w kierunku wstępnie rozciągniętym 9. Podobnie powierzchnia anizotropowa powstająca z mechanicznej wstępnie rozciągniętej powierzchni wpływa na wyrównanie, a także wzrost i mielinizację aksonów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) 10. W tym miejscu przedstawiamy protokół indukowania anizotropii powierzchni na statycznym, wstępnie rozciągniętym podłożu PDMS w celu poprawy regeneracji aksonów 10.
Aby wywołać wyrównanie aksonów, wykazano, że cechy topologiczne z pożądanymi wzorcami, które zapewniają prowadzenie kontaktu przez wyrównane włókna i kanały 6,11-12, ułatwiają wyrównanie aksonów 11,13. Jednak zgłoszone techniki indukowania wyrównania aksonów za pomocą cech topologicznych, takich jak włókna, kanały i wzory, nie były w stanie wydłużyć i zwiększyć grubości aksonów. W przeciwieństwie do tego, stopniowe rozciąganie mechaniczne prowadziło do wyrównania aksonów w kierunku rozciągania z dłuższymi i grubszymi aksonami, które zwiększały się wraz z wielkością rozciągnięcia 14. Jednak włączenie zasilanego urządzenia silnikowego in vivo nie jest możliwe. W przeciwieństwie do tego, statyczna anizotropia indukowana jest mniej skomplikowana i może być łatwiej włączona do przyszłych projektów rusztowań do zastosowań in vivo.
W tym protokole, statyczny system hodowli komórek wstępnie rozciągniętych jest używany do wywoływania anizotropii powierzchni bez cech topologicznych. System hodowli wstępnie rozciągniętej składa się z membrany PDMS, rozciągliwej ramy i etapu rozciągania, po czym membrana jest mocowana do ramy, a na etapie rozciągania nakładana jest z góry określona wielkość rozciągania. Świeżo wyizolowane neurony DRG hodowane na wstępnie rozciągniętej powierzchni przez okres do 21 dni są monitorowane pod kątem wyrównania i grubości aksonów. Następnie komórki Schwanna (SC) hodowane wspólnie z wyrównanymi aksonami są monitorowane pod kątem mielinizacji. Włączając anizotropię powierzchniową indukowaną przed rozciągnięciem, byliśmy w stanie zwiększyć wyrównanie-różnicowanie komórek i wzrost wyrównania aksonów odpowiednio neuronów MSC i DRG 9-10.

<table><tbody><tr><td>Podłoże neuropodstawowe 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 Suplement 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizyna</td><td>Trevigen</td><td><a href="http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01</a></td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-2 deoksy-urydyna</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>Bufor izolacyjny</td></tr><tr><td>typu I Kolagenaza</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie hyklon płodowej surowicy bydlęcej</td><td></td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Clonetics</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Komora silikonowa</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM ConA</td> System do czyszczenia/trawienia plazmowego <td></td></tr><tr><td></td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Thy 1.1</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Complement</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe podłoże wzrostowe</td><td></td><td></td><td>Na 500 ml Neurobasal Medium 1x dodać 10 ml B-27 50x, 5 ml Glutamax-I 100x, 2,5 ml Penicyliny/Streptomycyny (Penn/Strep), 1 ml Albumax-I i 1 &mu; l z NGF-7S (50 &mu; g/ml).</td></tr><tr><td>FDU Roztwór</td><td></td><td></td> podstawowy urydyny <td>FDU 100 mg w 10 ml ddH2O (10 mg/ml), przefiltrować w kapturze i podzielić na 500 μ; l porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Urydyna 5 g w 166,7 ml ddH2O (33 mg/ml), przefiltrować w kapturze, podzielić na 200 μ; l porcje i przechowywać w temperaturze -20 &ordm;C.
Weź 61.5 &mu; l FDU (10 mg/ml) i 20,5 &mu; l urydyny (33 mg / ml) i dodać 4,918 &mu; l ddH2O do końcowego stężenia podstawowego, następnie podzielić na 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.</td></tr></tbody></table>

podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

Regeneracja aksonów to chaotyczny proces, spowodowany głównie niezorganizowanym dopasowaniem aksonów. Dlatego, aby wystarczająca liczba zregenerowanych aksonów wypełniła miejsce uszkodzenia, wymagane jest odpowiednio zorganizowane wyrównanie aksonów. Ponieważ demienizacja po uszkodzeniu nerwu silnie upośledza zdolność przewodzenia aksonów, które przeżyły, remielinizacja ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego funkcjonowania zregenerowanych nerwów. Wcześniej wykazaliśmy, że mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) ustawiają się na anizotropowej powierzchni indukowanej przed rozciągnięciem, ponieważ komórki mogą wyczuwać większą efektywną sztywność w kierunku rozciągniętym niż w kierunku prostopadłym. Wykazaliśmy również, że powierzchnia anizotropowa powstająca z mechanicznej powierzchni wstępnie rozciągniętej w podobny sposób wpływa na wyrównanie, a także wzrost i mielinizację aksonów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania wstępnie rozciągniętej powierzchni anizotropowej, izolacji i hodowli neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) na wstępnie rozciągniętej powierzchni oraz pokazujemy zachowanie mielinizacyjne kokultury neuronów DRG z komórkami Schwanna (SC) na wstępnie rozciągniętej powierzchni.

System hodowli komórek wstępnie rozciągniętych sprzyjał ułożeniu wąsko równoległym aksonów z gangliów korzeni grzbietowych 10. Neurony z gangliów korzeni grzbietowych hodowano na powierzchniach wstępnie rozciągniętych i nierozciągniętych przez 12 dni. Aksony wybarwiono za pomocą przeciwciała przeciwko β-III-tubulinie, aby zademonstrować ich uporządkowanie. Rycina 2 porównuje orientację aksonów na rozciągniętych i nierozciągniętych podłożach PDMS po 12 dniach ho...

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Axon regeneration is a chaotic process due largely to unorganized axon alignment. Therefore, in order for a sufficient number of regenerated axons to ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest poprawa wyrównania aksonów oraz mielinizacji neuronów z zwojów korzeni grzbietowych z wykorzystaniem statycznego, wstępnie rozciągniętego systemu hodowli komórkowej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanki nerwowej, takie jak wyrównanie aksonów i wzrost ich grubości. Główną zaletą tej techniki jest to, że metoda wstępnego rozciągania nie tylko poprawia wyrównanie aksonów, ale również promuje mielinizację.Aby rozpocząć tę procedurę, wlej mieszaninę bazy i utwardzacza do naczynia hodowlanego. Pozostaw mieszaninę żelu pod próżnią przez 20 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Następnie umieść mieszaninę żelu w piekarniku w temperaturze 60 °C w celu utwardzenia przez noc.Po utwardzeniu membrany PDMS należy poddać jej powierzchnię działaniu plazmy tlenowej w systemie do czyszczenia i trawienia plazmowego przez trzy minuty. Następnie należy wyciąć z naczynia prostokątny fragment membrany. Należy go zamocować w ramce rozciągającej stroną potraktowaną tlenem do góry.Następnie umieść ramkę na stole rozciąganym i rozciągnij ją równomiernie, obracając pokrętłem stołu, aż osiągnie 10% wydłużenia w dłu

an-approach-to-enhance-alignment-myelination-dorsal-root-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym opracowaniu opisujemy technikę przygotowywania i utrzymywania komór przedzielonych do hodowli neuronów sensorycznych z zwojów korzeni grzbietowych.

Przygotowanie i utrzymanie neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w hodowlach przedzielonych

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

Wideo pokazuje współtworzenie neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z komórkami Schwanna. Neurony DRG są najpierw hodowane na wstępnie rozciągniętej błonie w celu wyrównania wzrostu aksonów. Następnie wprowadzane są komórki Schwanna, które przyczepiają się do aksonów, izolując je i promując przeżycie i funkcję komórek nerwowych.

Wspólna hodowla komórek Schwanna z neuronami DRG na wstępnie rozciągniętej błonie

Ten film demonstruje protokół wzbogacania kultur neuronalnych z grzbietowych zwojów korzeniowych poprzez immunopanning, poprawiając w ten sposób ich czystość i użyteczność dla badań neurologicznych.

Wzbogacenie neuronalne zwojów korzenia grzbietowego przez immunopanning

Ten film demonstruje model kokulturacyjny eksplantacji zwoju korzenia grzbietowego i komórek Schwanna. W warunkach kokultury kwas askorbinowy sprzyja różnicowaniu komórek Schwanna w formy mielinizujące. Mielinizujące się komórki Schwanna wielokrotnie owijają aksony, aby utworzyć osłonkę mielinową, która jest niezbędna do funkcjonowania nerwów.

Wspólna hodowla eksplantatu zwoju korzenia grzbietowego z komórkami Schwanna do mielinizacji neuronów

Źródło: Li, Q. et al. Badanie regeneracji aksonów ssaków: elektroporacja in vivo zwoju korzenia grzbietowego dorosłej myszy. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje transfekcję neuronów DRG myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu zbadania regeneracji aksonów. Przedstawiono w nim etapy dostarczania konstruktów kwasu nukleinowego do neuronów DRG, indukowania uszkodzenia nerwu kulszowego i oceny regeneracji aksonów.

Transfekcja zwojów korzenia grzbietowego myszy za pośrednictwem elektroporacji w celu wspomagania regeneracji aksonów czuciowych

Zwoje korzenia grzbietowego (DRG) to struktury zawierające neurony czuciowe obwodowego układu nerwowego. Po dysocjacji mogą być hodowane wspólnie z komórkami macierzystymi pochodzącymi z tkanki tłuszczowej (ASC) podobnymi do SC, stanowiąc cenny model do badania regeneracji i mielinizacji nerwów in vitro, naśladując środowisko in vivo w miejscu urazu.

Neurony zwojów korzenia grzbietowego i zróżnicowane komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej: model wspólnej hodowli in vitro do badania regeneracji nerwów obwodowych

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Zapis jednowłóknisty to skuteczna technika elektrofizjologiczna, która ma zastosowanie do ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego. Wraz z przygotowaniem nienaruszonego DRG z przyczepionym nerwem kulszowym badany jest mechanizm niewydolności przewodzenia. Oba protokoły poprawiają zrozumienie związku obwodowego układu nerwowego z bólem.

Zastosowanie zapisu pojedynczego włókna in vivo i nienaruszonego zwoju korzenia grzbietowego z przyczepionym nerwem kulszowym w celu zbadania mechanizmu uszkodzenia przewodzenia

W systemie kokultury zwojów korzenia grzbietowego i komórek Schwanna, mielinizacja obwodowego układu nerwowego może być badana. Model ten zapewnia eksperymentalne możliwości obserwacji i ilościowego określenia mielinizacji obwodowej oraz zbadania wpływu związków będących przedmiotem zainteresowania na osłonkę mielinową.

Mielinizacja in vitro aksonów obwodowych w kokulturze eksplantatów zwojów korzenia grzbietowego szczura i komórek Schwanna

Protokół ten opisuje metody tworzenia całych i zdysocjowanych kultur zwojów korzenia grzbietowego myszy (DRG) i ich zastosowanie do oceny interakcji guz-nerw.

Tworzenie modeli in vitro hodowli zwojów korzenia grzbietowego: uzupełniające podejścia do badania przesłuchów rak-nerw

Poznaj metodę izolacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego szczura i ich hodowlę na statycznie rozciągniętym podłożu PDMS. Współkultura z komórkami Schwanna wspiera mielinizację i wyrównanie aksonów.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Przeglądaj więcej filmów