Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Ogólnym celem tego protokołu jest poprawa wyrównania aksonów i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego przy użyciu statycznego, wstępnie rozciągniętego systemu hodowli komórek. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanki nerwowej, takie jak wyrównanie aksonów i wzrost grubości. Główną zaletą tej techniki jest to, że ta wstępnie rozciągnięta metoda nie tylko poprawia wyrównanie aksonów, ale także wspomaga mielinizację.

Aby rozpocząć tę procedurę, wlej mieszaninę bazy i utwardzacza do naczynia do hodowli tkankowej. Trzymaj mieszaninę żelu w próżni przez 20 minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Następnie umieść mieszaninę żelu w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza do utwardzenia przez noc.

Po utwardzeniu membrany PDMS powierzchnię należy poddać działaniu plazmy tlenowej w systemie czyszczenia i trawienia plazmowego przez trzy minuty. Następnie wytnij kawałek prostokątnej membrany z naczynia. Przymocuj go do ramy rozciągającej stroną nasączoną tlenem skierowaną do góry.

Następnie umieść ramę na stoliku do rozciągania i równomiernie ją rozciągnij, obracając pokrętło na stoliku, aż osiągnie 10% wydłużenia w dłuższej osi. Następnie napraw rozciągnięcie, dokręcając na ramie. Następnie usuń ramkę ze sceny.

Upewnij się, że powierzchnia membrany jest sucha i wolna od kurzu przed umieszczeniem silikonowej komory na membranie. Pozwól, aby lepka strona komory mocno przylegała do membrany. Następnie sterylizuj powierzchnię promieniami UV przez 10 minut.

Następnie dodaj jeden mililitr PLL do powierzchni PDMS w komorze w ciągu sześciu godzin od obróbki plazmowej. Następnie inkubuj go przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wysiewem neuronów DRG, aby zwiększyć przyczepienie komórek. Na tym etapie przygotuj standardowe podłoże do uprawy neuronów DRG.

Przed izolacją należy przelać w autoklawie sprzęt do izolacji i odczynniki do filtrowania. Dodać pięć mililitrów buforu izolacyjnego do jednego dołka na płytce sześciodołkowej i umieścić płytkę na lodzie. Następnie przygotuj 10 mililitrów pożywki dysocjującej, dodając jeden mililitr kolagenazy A do dziewięciu mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA.

Przefiltruj roztwór filtrem 0,22 mikrometra i umieść go na lodzie. Następnie poświęć 10 do 12 pięcio- do siedmiodniowych szczurów SD i odetnij skórę pokrywającą rdzeń kręgowy z tyłu każdego z nich. Usuń nadmiar tkanki wokół kręgosłupa.

Pod lupą chirurgiczną wykonaj pierwsze nacięcie od szyi, a następnie wykonaj nożyczkami jedno nacięcie wzdłuż kręgosłupa po obu stronach. Odłącz kręgosłup od ciała szczeniaka i usuń nadmiar mięśni. Następnie przetnij wzdłuż długiej osi kręgosłupa i użyj pęsety, aby całkowicie otworzyć kręgosłup, aby usunąć rdzeń kręgowy.

Następnie usuń ganglion z kieszonki kostnej. Przyciąć korzenie nerwowe i przenieść zwoje nerwowe do lodowatego bufora izolacyjnego. Zbierz około 10 do 16 DRG z obu stron.

Powtórz procedurę preparowania dla pozostałych szczeniąt. Teraz przenieś DRG z buforem izolacyjnym do sterylnej 15-mililitrowej probówki. Pozwól chusteczce osiąść na dnie probówki i delikatnie usuń bufor izolacyjny z góry.

Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki dysocjacyjnej do probówki. Inkubować wypreparowane tkanki w pożywce dysocjacyjnej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, potrząsając probówką co pięć do 10 minut. Po dysocjacji chemicznej odwirować zwoje nerwowe w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po pięciu minutach usuń supernatant, ponownie zawieś osad w 10 mililitrach standardowego podłoża wzrostowego i zwiruj go. Następnie ponownie odwiruj zdysocjowane komórki. Następnie usuń supernatant, ponownie zawieś osad w 12 mililitrach standardowego podłoża wzrostowego i zwiruj go.

Przed wysiewem komórek należy usunąć roztwór PLL z komory. Spłucz powierzchnię PDMS sterylną wodą i wysusz ją na powietrzu. Po ponownym wywieszeniu ogniw pozostaw zawiesinę na jedną do dwóch minut, aby zanieczyszczenia osiadły na dnie rurki.

Następnie dodaj 1,5 mililitra zawiesiny komórkowej do każdej rozciągniętej komory i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% CO2. Aby wyeliminować komórki glejowe w ciągu jednego dnia in vitro, dodaj 10 mikrolitrów lub 15 mikrolitrów roztworu podstawowego mieszaniny FDU-U do każdej studzienki. Po siedmiu godzinach zastąp tę pożywkę świeżą standardową pożywką wzrostową i umieść wstępnie rozciągnięte urządzenie do hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2.

W okresie hodowli komórkowej zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytej pożywki świeżą pożywką. W tej procedurze należy usunąć pożywkę hodowlaną z komórek Schwanna i dodać pięć mililitrów 0,05% trypsyny-EDTA do kolby. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2 przez dwie do trzech minut.

Sprawdź komórki pod mikroskopem optycznym za pomocą obiektywu 10X, aby zobaczyć, czy unoszą się z kolby. Następnie dodaj pięć mililitrów pożywki hodowlanej do komórek w kolbie i wymieszaj. Następnie dodaj zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki wirówkowej i wiruj w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś osad w siedmiu mililitrach standardowej pożywki wzrostowej DRG. Następnie przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do 0,5-mililitrowej probówki wirówkowej. Wymieszaj go z 10 mikrolitrami błękitu trypanowego, a następnie policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru za pomocą obiektywu 10X.

Dodaj pożywkę wzrostową DRG, aby rozcieńczyć zawiesinę komórek do 5 000 komórek na mililitr. Następnie należy usunąć 0,5 mililitra pożywki z kultury DRG w rozciągniętej komorze i dodać 0,5 mililitra zawiesiny komórek Schwanna do hodowli DRG. Hoduj komórki przez tydzień w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2.

Zmieniaj pożywkę co dwa dni, zastępując połowę zużytego podłoża świeżą standardową pożywką. Po wyhodowaniu na rozciągniętych i nierozciągniętych powierzchniach przez dwa tygodnie, oczyszczone komórki Schwanna dodano do komory i hodowano przez kolejny tydzień. Pokazano tutaj barwienie tubuliną beta-III dla aksonów na rozciągniętej powierzchni.

Jest to nakładka tubuliny beta-III i barwienia P0 na rozciągniętą powierzchnię, co sugeruje, że komórki Schwanna są przyłączone do aksonów i prawdopodobnie mielinizują je. Ten obraz przedstawia barwienie tubuliną beta-III dla aksonów na nierozciągniętej powierzchni. A nałożenie tubuliny beta-III i barwienia P0 na nierozciągniętą powierzchnię sugeruje, że komórki Schwanna nie są przyłączone do aksonów.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o tym, aby membrana PDMS była płaska i miała jednorodną grubość. Po tej procedurze można wykonać atomizery, takie jak wstępnie rozciągnięte mikrokanały, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak soczewka aksonowa i migracja komórek Schwanna.

Po opracowaniu technika ta utoruje drogę naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową do zbadania roli anizotropii powierzchni w regeneracji nerwów w rdzeniu kręgowym i nerwie kulszowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać wyrównanie aksonów i mielinizację za pomocą wstępnie rozciągniętego urządzenia.