Name: Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę ukierunkowanego sekwencjonowania RNA do badania ekspresji genów, mutacji i fuzji genowych. Technika obejmuje hybrydyzację sond, wzbogacanie transkryptów i analizę danych w genomice.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania kierujemy do Ezry Lyona, Eliota Zhu, Michele Wing, Esko Kautto i Erica Samorodnitsky'ego za wsparcie techniczne. Chcielibyśmy również podziękować Jenny Badillo za jej wsparcie administracyjne dla naszego zespołu. Dziękujemy Centrum Superkomputerowemu Ohio (OSC) za udostępnienie przestrzeni dyskowej, mocy obliczeniowej i wsparcia w przeprowadzaniu naszych analiz. Dziękujemy Comprehensive Cancer Center (CCC) przy The Ohio State University Wexner Medical Center za wsparcie administracyjne tej pracy. S.R. i jego zespół są wspierani przez American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), Prostate Cancer Foundation Young Investigator Award, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cancer Research Foundation, American Lung Association i Pelotonia.

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+for+gene+discovery+and+quantification+using+RNA+CaptureSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq.</a> Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).</li>
<li>Maher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+transcript+discovery+by+paired-end+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).</li>
<li>Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+identification+of+genomic+variants+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data.</a> Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).</li>
<li>Quinn, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+strategies+for+SNP+detection+in+RNA-seq+data%3A+application+to+lymphoblastoid+cell+lines+and+evaluation+using+1000+Genomes+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data.</a> PLoS One. 8, e58815(2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eSNV-detect%3A+a+computational+system+to+identify+expressed+single+nucleotide+variants+from+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).</li>
<li>Invitrogen. Qubit dsDNA HS Assay Kit Manual. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf">http://www.science.smith.edu/cmbs/documents/QubitdsDNAHSAssay.pdf</a> (2010).</li>
<li>Agilent. Agilent D1000 ScreenTape System Quick Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf">http://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2964-90032_ScreenTape_D1000_QG.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. Preparing Libraries for Sequencing on the MiSeq®. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/miseq/preparing-libraries-for-sequencing-on-miseq-15039740-d.pdf</a> (2013).</li>
<li>Illumina. MiSeq® Reagent Kit v2 Reagen Preparation Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html">https://support.illumina.com/downloads/miseq_reagent_kit_reagent_preparation_guide.html</a> (2012).</li>
<li>Andrews, S. FastQC. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2015).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14, R36(2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>Broad Institute. Picard. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://picard.sourceforge.net/">http://picard.sourceforge.net/</a> (2014).</li>
<li>DeLuca, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-SeQC%3A+RNA-seq+metrics+for+quality+control+and+process+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization.</a> Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Van der Auwera, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+FastQ+data+to+high+confidence+variant+calls%3A+the+Genome+Analysis+Toolkit+best+practices+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChimeraScan%3A+a+tool+for+identifying+chimeric+transcription+in+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data.</a> Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).</li>
<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
<li>Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncofuse%3A+a+computational+framework+for+the+prediction+of+the+oncogenic+potential+of+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions.</a> Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
<li>Cabanski, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+hybrid+capture+improves+transcriptome+analysis+on+low-input+and+archived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples.</a> J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).</li>
<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R. otrzymuje dofinansowanie od firm Novartis i Ariad Pharmaceuticals na prowadzenie badań klinicznych. Członkowie najbliższej rodziny S.R. są właścicielami akcji Johnson and Johnson.

Wychwytywanie RNAseq jest strategią pośrednią między podejściem RNAseq a mikromacierzowym do oceny wybranej części transkryptomu. Zalety Capture obejmują obniżone koszty, szybki czas realizacji sekwencera biurkowego, wysoką przepustowość i wykrywanie zmian w genomie. Metodę można dostosować do charakteryzowania niekodujących RNA23, wykrywania wariantów pojedynczych nukleotydów4-6, badania splicingu RNA oraz identyfikacji fuzji genów lub rearanżacji strukturalnych24. Ponadto podejście to m...

Sekwencjonowanie całego transkryptomu lub RNA (RNAseq) to bezstronna metoda sekwencjonowania do oceny wszystkich produktów RNA. Celem celowanego RNAseq (Capture) jest ukierunkowana ocena wybranych transkryptów o zwiększonej czułości, zakresie dynamiki, zmniejszonym koszcie lub skali oraz zwiększonej przepustowości w porównaniu ze standardowym RNAseq. Podobnie jak w przypadku standardowego RNAseq, ukierunkowane podejścia wzbogacające mogą być stosowane do oceny ekspresji genów, wielu gatunków RNA, takich jak mRNA, mikroRNA (miRNA), lncRNA1, inne niekodujące RNA2, fuzje genów3 i mutacje4-6.
Capture obejmuje hybrydyzację komplementarnych oligonukleotydów w celu wzbogacenia bibliotek cDNA do sekwencjonowania. Uzasadnienie wychwytywania RNAseq jest podobne do podejść mikromacierzowych, w których komplementarne oligonukleotydy lub sondy są hybrydyzowane z próbkami, a następnie mierzone pod kątem względnej obfitości. W przypadku technologii mikromacierzy ekspresja opiera się na względnym sygnale mierzonym dla transkryptów wiążących się z tymi sondami. Mikromacierze są zatem ograniczone zasięgiem, potencjalnym szumem tła wynikającym z niespecyficznego wiązania i hybrydyzacją krzyżową sond. Co więcej, macierze mają ograniczony zakres dynamiki dla transkryptów o niskiej i wysokiej ekspresji w porównaniu z RNAseq1. Mikromacierze są szeroko stosowane ze względu na ich obniżony koszt i wysoką przepustowość w porównaniu z RNAseq. 
Tutaj demonstrujemy metodę przechwytywania RNAseq, która oferuje pośrednie rozwiązanie między RNAseq a podejściem mikromacierzowym do oceny transkryptomu. RNAseq Capture ma średnią przepustowość, większy zakres dynamiki i czułość oraz jest skalowany w celu szybkiego zwrotu na sekwencerach stacjonarnych. RNAseq Capture wymaga również ograniczonych zasobów obliczeniowych w zakresie przestrzeni dyskowej i przetwarzania danych.

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Termoblok 24 x 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników MiSeq v2 (300- cykle)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Desktop Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Kit with RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Uniwersalny Oligo Blokujący - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Uniwersalny Oligo Blokujący - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&reg; Uniwersalny Oligo Blokujący - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg; AMPure&reg; XP - Koraliki oczyszczające PCR&nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&reg; M-270 Streptawidyna</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT Ludzkie DNA, klasa fluorometryczna, 1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&reg; Probówki testowe&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kubitów&reg; dsDNA HS Life</td><td>Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&reg; Zestawy do hybrydyzacji i mycia EZ&nbsp; (24 lub 96 reakcji)</td><td>Roche NimbleGen&nbsp;</td><td>05634261001 lub 05634253001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fluorometr kubitowy&reg; 2.0&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x roztwór TE)</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Dotyk&handel; Termocykler z 96&ndash; Well Fast Rection Module</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Zestawy do hybrydyzacji i mycia</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Odwrotna transkrypcja 200 U/&#956; l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Taśma ekranowa</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>Taśma ekranowa RNA</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka taśmowa RNA</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>Bufor próbki RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne Streptawidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 STRONA KAŻDA</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini Dry Bath</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 Odczynniki</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Odkurzacz Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ukierunkowany test sekwencjonowania rna w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

Sekwencjonowanie RNA (RNAseq) to wszechstronna metoda, która może być wykorzystana do wykrywania i charakteryzowania ekspresji genów, mutacji, fuzji genów i niekodujących RNA. Standardowy RNAseq wymaga od 30 do 100 milionów odczytów sekwencjonowania i może zawierać wiele produktów RNA, takich jak mRNA i niekodujące RNA. Pokazujemy, w jaki sposób ukierunkowane sekwencjonowanie (wychwytywanie) RNAseq (wychwytywanie) pozwala na ukierunkowane badanie wybranych produktów RNA przy użyciu sekwencera stacjonarnego. Przechwytywanie RNAseq może charakteryzować transkrypty bez adnotacji, o niskiej lub przejściowej ekspresji, które w przeciwnym razie mogłyby zostać pominięte przy użyciu tradycyjnych metod RNAseq. Tutaj opisujemy ekstrakcję RNA z linii komórkowych, zubożenie rybosomalnego RNA, syntezę cDNA, przygotowanie bibliotek kodów kreskowych, hybrydyzację i wychwytywanie docelowych transkryptów oraz sekwencjonowanie multipleksowe na sekwencerze stacjonarnym. Przedstawiamy również proces analizy obliczeniowej, który obejmuje ocenę kontroli jakości, dopasowanie, wykrywanie fuzji, kwantyfikację ekspresji genów i identyfikację wariantów pojedynczych nukleotydów. Test ten pozwala na ukierunkowane sekwencjonowanie transkryptów w celu scharakteryzowania ekspresji genów, fuzji genów i mutacji.

Schemat przedstawiający kluczowe etapy metody RNAseq Capture pokazano na Rysunku 1. W celu zademonstrowania skuteczności techniki RNAseq Capture wykorzystano cztery linie komórek nowotworowych o znanych mutacjach (K562 z fuzją ABL1, LC2 z fuzją RET, EOL1 z fuzją PDGFRalpha oraz RT-4 z fuzją FGFR3). Cztery próbki połączono w pulę i poddano sekwencjonowaniu z odczytami 2x 100 bp na sekwenatorze desktopowym, co pozwoliło na wygenerowanie p...

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...

Ogólnym celem niniejszego testu jest wzbogacenie docelowych transkryptów do sekwencjonowania nowej generacji. Ten celowany test sekwencjonowania RNA jest procedurą wieloetapową, która rozpoczyna się od usuwania rybosomalnego RNA z całkowitego RNA, a następnie obejmuje fragmentację chemiczną i syntezę komplementarnego DNA, przygotowanie bibliotek z kodami kreskowymi, hybrydyzację i wychwyt docelowych transkryptów, sekwencjonowanie multipleksowe i kończy się analizą danych. W niniejszym filmie zostaną zaprezentowane procedury hybrydyzacji, wychwytu celu oraz amplifikacji PCR po wychwycie dla czterech próbek.W związku z tym metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii molekularnej, takie jak identyfikacja fuzji genów, wariantów pojedynczych nukleotydów, względna ekspresja genów oraz alternatywny splicing obejmujący docelowe transkrypty. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej dostosowania do dowolnych genów będących przedmiotem zainteresowania. Aby rozpocząć procedurę hybrydyzacji, należy wyjąć z zamrażarki w temperaturze 20 °C i rozmrozić na lodzie następujące odczynniki: spersonalizowane sondy uwodnione, Cot-1 DNA, uniwersalne oligonukleotydy blokujące oraz specyficzne dla adapterów oligonukleotydy blokujące.W probówce 1,5 mililitra o niskim wiązaniu należy połączyć 500 nanogramów próbek DNA, 5 mikrolitrów Cot-1 DNA, jeden mikrolitr uniwersalnych oligosów blokujących, 0,5 mikrolitra specyficznych oligosów blokujących adapter sześcionukleotydowy oraz 0,5 mikrolitra specyficznych oligosów blokujących adapter ośmionukleotydowy. Probówkę z próbką należy umieścić w koncentratorze próżniowym z otwartą zakrętką skierowaną w kierunku przeciwnym do obrotu. Zawartość należy suszyć w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez 20 minut lub do całkowitego odparowania cieczy.Następnie resuspenduj wysuszoną zawartość w 8.5 µL 2x buforu do hybrydyzacji, 3.4 µL komponentu hybrydyzacyjnego A oraz 1.1 µL wody wolnej od nukleaz. Pozostaw na 10 minut w celu resuspensji, mieszając w wirówce vortex co 2.5 minuty. Przenieś resuspendowany materiał do probówki PCR o pojemności 0.2 mL i inkubuj w termocyklerze w temperaturze 95 °C przez 10 minut.Wyjmij probówkę z próbką do hybrydyzacji z termocyklera i dodaj dwa mikrolitry specjalistycznych sond rozpuszczonych w stężeniu 1,5 picomoles per microliter. Inkubuj reakcję hybrydyzacji przez noc w temperaturze 65 °C. Kolejnym krokiem po hybrydyzacji multipleksowej jest wychwyt docelowego RNA przy użyciu namagnesowanych kulek sprzężonych ze streptawidyną.Wyjąć butelkę z kuleczkami z temperatury 4 °C i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przygotować 1x roztwory robocze wszystkich wymaganych buforów. Odmierzyć 140 µL 1x buforu do mycia 1 do nowej probówki o pojemności 1,5 ml.Podgrzej ten bufor aliquotowy oraz całą objętość buforu stringentnego 1x w temperaturze 65 °C w bloku grzejnym przez co najmniej dwie godziny. Przenieś odpowiednią ilość kulek do probówki o pojemności 1,5 ml. Umieść ją w statywie do separacji magnetycznej i odlej nadsącz.Dodać bufor do płukania kulek i mieszać w wirówce typu vortex przez 10 sekund. Umieścić probówkę w statywie do separacji magnetycznej na od dwóch do pięciu minut lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny. Odpiąć nadsącz.Powtórzyć czynność, aby łącznie przeprowadzić dwa przemycia. Po usunięciu buforu do przemywania kulek dodać objętość buforu do przemywania kulek równą objętości początkowej. Resuspender i przenieść do probówki PCR o pojemności 0.2 milliliter.Umieść probówkę w statywie magnetycznym na od dwóch do pięciu minut lub do momentu, aż nadsącz stanie się klarowny. Odlej nadsącz. Umieść probówkę z kuleczkami w mini blokowym termostacie w temperaturze 65 °C.Przenieś próbkę do hybrydyzacji do probówki z kuleczkami, pipetuj w górę i w dół 10 razy w celu wymieszania, a następnie inkubuj w temperaturze 65 °C przez 45 minut. Co 15 minut wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex i odwiruj przez cztery sekundy, używając laboratoryjnej miniwirówki nakładkowej o stałej prędkości. Po zakończeniu 45-minutowej inkubacji wyjmij probówkę z blokiem grzewczym.Do probówki należy dodać 100 µL podgrzanego 1x buforu piorącego 1, a następnie wymieszać przez 10 sekund za pomocą wortexa. Mieszaninę należy przenieść do nowej probówki o niskim wiązaniu o pojemności 1,5 mL. Probówkę należy umieścić w statywie magnetycznym i odstawić na od dwóch do pięciu minut do czasu rozdzielenia faz, aż nadosad zniesie przejrzystość.Odlej nadsącz. Dodaj 200 µL podgrzanego buforu do rygorystycznego płukania 1x i pipetuj w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać. Inkubuj w temperaturze 65 °C przez pięć minut.Umieść probówkę w statywie magnetycznym i odczekaj od dwóch do trzech minut do czasu rozdzielenia faz. Odlej nadsącz. Powtórz rygorystyczne przemywanie raz, tak aby łącznie wykonać dwa przemywania.Dodać 200 µL buforu do płukania jeden 1x w temperaturze pokojowej i mieszać w wstrząsarze wierzchołkowym przez dwie minuty. Umieścić probówkę w statywie magnetycznym, odczekać od dwóch do pięciu minut do czasu oddzielenia się faz, a następnie odrzucić nadsącz. Dodać 200 µL buforu do płukania dwa 1x w temperaturze pokojowej i mieszać w wstrząsarzu wierzchołkowym przez jedną minutę.Umieść probówkę w statywie do separacji magnetycznej na dwie do pięciu minut, a następnie odlej nadsącz. Dodaj 200 µL buforu płuczącego 3 (1x) o temperaturze pokojowej i mieszaj na wortexie przez 30 sekund. Umieść probówkę w statywie do separacji magnetycznej na dwie do pięciu minut, a następnie odlej nadsącz.Na koniec wyjmij probówkę ze stojaka do separacji magnetycznej i dodaj 20 µL wody wolnej od nukleaz, aby resuspender kuleczki. Wymieszaj dokładnie, pipetując w górę i w dół 10 razy. Przed przystąpieniem do amplifikacji PCR po wychwycie (post capture PCR), wyjmij kuleczki paramagnetyczne z temperatury 4 °C i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w celu wyrównania temperatury.Wyjąć 2x hot start PCR ready mix oraz mieszaninę starterów PCR z zamrażarki ustawionej na 20 stopni Celsius, rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić na lodzie. Przygotować master mix do amplifikacji biblioteki, łącząc 27,5 microliters 2x hot start PCR ready mix, 2,75 microliters startera PCR jeden oraz 2,75 microliters startera PCR dwa. Przygotować reakcję w probówce do PCR, dodając 20 microliters kulek z wychwyconym DNA do 30 microliters master mixu do amplifikacji biblioteki.Odpowiednio zakręć probówkę i wymieszaj ją za pomocą wortexa. Wiruj probówkę przez cztery sekundy w miniwirówce nakładkowej o stałej prędkości przy 6×g. Umieść probówkę w termocyklerze i rozpocznij amplifikację PCR zgodnie z poniższym programem PCR: wstępna denaturacja w 98 °C przez 45 s, a następnie od 10 do 12 cykli obejmujących denaturację w 98 °C przez 15 s, przyłączanie w 65 °C przez 30 s oraz elongację w 72 °C przez 60 s.Ostatni cykl elongacji w 75 °C przez 60 s, a następnie utrzymanie temperatury 4 °C. Po zakończeniu reakcji PCR należy wyjąć próbkę z termocyklera. Dodać 75 µL kulek paramagnetycznych, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.Umieść probówkę w statywie magnetycznym w temperaturze pokojowej na dwie do trzech minut, a następnie usuń nadsącz. Przemyj kuleczki na magnesie, dodając 200 µL 80% etanolu, inkubując przez 30 sekund, a następnie usuwając nadsącz. Powtórz czynność, aby w sumie wykonać dwa przemycia.Po usunięciu supernatantu z drugiego przemywania etanolem inkubować w temperaturze pokojowej od pięciu do dziesięciu minut, aby kuleczki wyschły, unikając jednak nadmiernego wysuszenia prowadzącego do ich pękania. Resuspendować kuleczki w 22 µL Tris-EDTA pH 8.0 i odczekać trzy minuty w celu elucji. Umieścić próbkę na magnesie na trzy do pięciu minut.Na koniec przenieś 20 µL eluat produktu do nowej probówki 1,5 ml o niskim wiązaniu, upewniając się, że nie przeniesiono żadnych kuleczek. Porównanie ekspresji genów między metodą wychwytu a nieswoistym sekwencjonowaniem RNA w czterech liniach komórek nowotworowych wykazało, że metoda wychwytu wzbogaciła geny docelowe, zaznaczone na niebiesko, od 10 do 1000 razy w stosunku do genów niedocelowych, zaznaczonych na szaro. Ponadto odsetek odczytów mapujących do regionów docelowych był wyższy w bibliotekach RNA sekwencjonowanych metodą wychwytu w porównaniu do bibliotek nieswoistych.Ocena środków kontroli jakości wykazała, że sekwencjonowanie RNA z wykorzystaniem metody wychwytu (capture) oraz sekwencjonowanie RNA bez ukierunkowania (non-targeted) wykazują zbliżoną skuteczność pod względem dopasowania do transkryptomu oraz głównej wielkości wkładki. Zastosowanie metody wychwytu pozwoliło na zsekwencjonowanie większego odsetka regionów eksonowych i mniejszego odsetka regionów intronowych. Zgodnie z oczekiwaniami, sekwencjonowanie RNA bez ukierunkowania wygenerowało ponad 50-krotnie więcej całkowitych odczytów sekwencjonowania na próbkę niż metoda wychwytu.Przy zastosowaniu metody wychwytu procent sekwencji rybosomalnego RNA obecnych w każdej próbce był niższy. Wreszcie porównania wariantów pojedynczych nukleotydów zidentyfikowanych w nakładających się regionach wychwytu i sekwencjonowania RNA dla każdej z czterech linii komórkowych wykazują wysoką zgodność wariancji między wychwytem a sekwencjonowaniem RNA w obrębie regionu docelowego. Po opanowaniu techniki, w przypadku jej prawidłowego przeprowadzenia, można ją wykonać w ciągu trzech do czterech dni.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o szybkim działaniu w trakcie wychwytywania zhybrydyzowanych celów oraz o zapewnieniu utrzymania temperatury reakcji na poziomie 65 °C. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii molekularnej do badania interesujących transkryptów w sposób wysokoprzepustowy i kosztowo efektywny.

targeted-rna-sequencing-assay-to-characterize-gene-expression-genomic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne zostały wykorzystane do identyfikacji znacząco i różnicowo wyrażonych czynników transkrypcyjnych w subpopulacjach Lin-CD34+ i Lin-CD34- mysich komórek EML. Te czynniki transkrypcyjne mogą odgrywać ważną rolę w określaniu przełączania między samoodnawiającymi się komórkami Lin-CD34 + a częściowo zróżnicowanymi komórkami Lin-CD34.

Identyfikacja kluczowych czynników regulujących samoodnawianie i różnicowanie w hematopoetycznych komórkach prekursorowych EML za pomocą analizy sekwencjonowania RNA

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Tutaj opisujemy protokół mający na celu zbadanie wpływu nieprawidłowego splicingu na lekooporność w guzach litych i nowotworach hematologicznych. W tym celu przeanalizowaliśmy profile transkryptomiczne rodzicielskich i opornych modeli in vitro za pomocą sekwencjonowania RNA i ustaliliśmy metodę opartą na qRT-PCR w celu walidacji genów kandydujących.

Wykorzystanie sekwencjonowania RNA do wykrywania nowych wariantów splicingu związanych z opornością na leki w modelach nowotworów in vitro

Tutaj opisujemy test hybrydyzacji in situ, który umożliwia czułe i specyficzne wykrywanie sekwencji tak krótkich jak 50 nukleotydów z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu na poziomie pojedynczej komórki. Test, który może być wykonywany ręcznie lub automatycznie, może umożliwić wizualizację wariantów splicingu, krótkich sekwencji i mutacji w kontekście tkanki.

Wizualizacja wariantów genetycznych, krótkich celów i mutacji punktowych w kontekście morfologicznym tkanki za pomocą testu hybrydyzacji RNA in situ

terapia miRNA ma znaczący potencjał w regulowaniu progresji raka. Zademonstrowano tu podejścia analityczne stosowane do identyfikacji aktywności kombinatorycznego leczenia miRNA w zatrzymywaniu cyklu komórkowego i angiogenezie.

Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy

Tutaj autorzy prezentują użyteczność MULTI-seq do fenotypowania i kolejnych sparowanych scRNA-seq i scATAC-seq w charakterystyce transkryptomicznej i dostępności chromatyny w siatkówce.

Multipleksowana analiza ekspresji genów siatkówki i dostępności chromatyny przy użyciu scRNA-Seq i scATAC-Seq

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania nokautów genów, które są embrionalne śmiertelne in vivo w genetycznie modyfikowanych mysich modelach nowotworów, a następnie oceniamy wpływ nokautu na wzrost, proliferację, przeżycie, migrację, inwazję i transkryptom in vitro i in vivo.

Definiowanie funkcji genów w nowotworzeniu poprzez ablację ex vivo floksowanych alleli w złośliwych komórkach nowotworowych osłonki nerwów obwodowych

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Poznaj metodę ukierunkowanego sekwencjonowania RNA do badania ekspresji genów, mutacji i fuzji genowych. Technika obejmuje hybrydyzację sond, wzbogacanie transkryptów i analizę danych w genomice.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Przeglądaj więcej filmów