Test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa

Ogólnym celem testu paskowego (stripe assay) jest ocena zdolności konkretnych białek, takich jak cząsteczki kierujące, do przyciągania lub odpychania neuronów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kierowania aksonami, takie jak sposób, w jaki neurony mogą migrować lub wydłużać swoje aksony w odpowiedzi na zewnętrzne środowisko komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji dużej liczby neuronów w ramach jednego eksperymentu oraz jednoczesna analiza wielu stożków wzrostu.

W ramach przygotowania zagotuj od czterech do ośmiu matryc silikonowych w wodzie przez pięć minut. Pozostaw je do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stroną prążkowaną do góry. Proces ten trwa około godziny.

Kontynuuj pracę pod komorą sterylną. Użyj sprężonego powietrza lub taśmy klejącej, aby usunąć kurz z prążkowanej strony matryc. Następnie ostrożnie umieść każdą matrycę w osobnej sześciocentymetrowej plastikowej płytce, stroną prążkowaną do dołu.

Dociskając jednym palcem, mocno przyciśnij każdą matrycę. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza między matrycą a naczyniem. Jeśli matryca nie przylgnie, powtórz proces.

Po przytwierdzeniu zaznacz położenie pasków na spodzie szalki hodowlanej. Przygotuj rekombinowane białka znakowane fluorescencyjnie w PBS. Przygotuj 25 µL dla każdej szalki z paskami.

Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie, dla każdego naczynia, do strzykawki o rozmiarze 22 G nabrano 25 µL rozcieńczonego białka i wstrzyknięto je przez mały otwór z boku matrycy. Należy unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza do matryc, ponieważ zaburzą one wiązanie białek z naczyniami.

Następnie inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po inkubacji nanieś 300 µL PBS do górnej szczeliny każdej macierzy. Następnie odessij PBS przez mały otwór znajdujący się z boku każdej macierzy, aby usunąć wszystkie nieprzytwierdzone białka rekombinowane.

Nie odsysaj całkowicie PBS, aby zapobiec wysychaniu białek. Powtórz to płukanie PBS łącznie trzy razy. Następnie ostrożnie usuń matrycę z każdej płytki.

Następnie niezwłocznie dodaj około 100 µL białka kontrolnego na cały obszar paski, tworząc naprzemienne powłoki na każdej płytce. Następnie inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W międzyczasie, w temperaturze lodu, rozmroź lamininę oraz PBS o stężeniu 20 µg/mL.

Po 30 minutach wypłucz naczynia trzykrotnie buforem PBS. Następnie pokryj każde naczynie około 100 µL zimnej lamininy i umieść naczynia z powrotem w inkubatorze na kolejną godzinę. Po godzinie ponownie wypłucz naczynia trzykrotnie za pomocą PBS.

Po trzecim przemyciu dodaj około 150 µL medium hodowlanego do każdej płytki. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C do momentu ich kolejnego użycia. Po uśmierceniu myszy dawcy w stadium E15.5, przetnij skórę i czaszkę strzałkowo wzdłuż linii środkowej głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i pobierz mózg, używając mikroszpatułki.

Ostrożnie przenieś mózg do szalki Petriego o pojemności 60 mililitrów zawierającej trzy mililitry HBSS. W szalce, używając skalpela, wytnij półkule, obejmując korę, hipokamp i prążkowie. Następnie wypreparuj obszary hipokampa, ostrożnie usuwając opony mózgowe.

Przenieś wypreparowane tkanki hipokampa do probówki wirówkowej o objętości 15 ml zawierającej 2 ml roztworu HBSS w lodzie. Sześć hipokampów z trzech zarodków jest wystarczające do hodowli neuronów na ośmiu szalkach. Po zebraniu wszystkich tkanek hipokampa odessij HBSS i zastąp go 2 ml trypsyny z EDTA.

Następnie inkubuj probówkę przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Kolejnym krokiem jest neutralizacja aktywności trypsyny poprzez dodanie 500 µL płodowej surowicy bydlęcej. Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 100 ×g przez pięć minut.

Usunąć nadosad i przemyć osad dwoma mililitrami pożywki hodowlanej. Następnie ponownie odwirować mieszaninę i wymienić pożywkę na nową. Teraz rozdzielić tkankę poprzez delikatne triturację za pomocą końcówki do pipety o pojemności jednego mililitra z odciętym czubkiem.

Przesuwaj tkanki w górę i w dół za pomocą końcówki pipety około 10 razy. Następnie użyj nieociętej końcówki o pojemności jednego mililitra i powtórz proces trituracji, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Teraz wyizoluj pojedyncze komórki, przeciskając zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach od 80 do 100 mikronów.

Następnie odwiruj przefiltrowaną zawiesinę z prędkością 150 G przez pięć minut, odessaj supernatant i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiaj 10 000 neuronów w 150 µL pożywki hodowlanej na każdą przygotowaną płytkę z prążkami. Ostrożnie nanieś zawiesinę tak, aby pokryła cały obszar z prążkami.

Dysocjowane neurony hipokampa myszy w stadium E15.5 wysiano i hodowano przez 24 godziny na pasach fluorescencyjnie znakowanego białka kontrolnego FC lub wysiano neurony na pasach FLRT2 FC naprzemiennie z nieznakowanym białkiem kontrolnym FC. W obu przypadkach neurony uległy agregacji i wydłużały swoje aksony w formie pęczków. Na kontroli FC neurony były rozłożone równomiernie i wydłużały aksony w losowych kierunkach. W przeciwieństwie do tego, podczas hodowli na pasach FLRT2 FC, aksony unikały wzrostu w obszarach z FLRT2 FC.

W związku z tym wydłużające się aksony rosły głównie na pasach FC. Większe powiększenie pokazuje, że aksony rosły wzdłuż granicy z pasami FC FLRT2, ale nie wnikały na obszar FLRT2. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować pasowy dywan z zalecanych białek oraz jak ocenić aktywność przyciągającą lub odpychającą z wykorzystaniem dysocjowanych neuronów hipokampa.

Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w pięć godzin, pod warunkiem że zostanie ona wykonana prawidłowo.