Name: Test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa. Ta metoda pozwala wizualizować dużą liczbę neuronów i stożków wzrostu jednocześnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Granty na Badania Naukowe od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (23700412, 25122707 i 26670090 do S.Y.).

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Szkole Medycznej Uniwersytetu Hamamatsu.
1. Przygotowanie matryc
<ol>
	<li>Gotuj 4-8 matryc silikonowych w kuchence mikrofalowej lub na płycie grzejnej przez 5 minut i pozostaw do całkowitego wyschnięcia na 1 godzinę pod przepływem laminarnym (paskami do góry). 
	Uwaga: Poniższe procedury należy wykonywać przy przepływie laminarnym.</li>
	<li>Przedmuchaj sprężonym powietrzem lub użyj przezroczystej taśmy klejącej, aby usunąć kurz z pasiastej strony matryc. Utrzymuj stronę w paski w czystości, aby mogła mocno przylegać do powierzchni płyty.</li>
	<li>Ostrożnie umieść matryce na plastikowych naczyniach o średnicy 6 cm, naciskając palcem (po jednej matrycy na naczynie; paskiem do dołu). Unikaj dostania się pęcherzyków powietrza między matrycę a naczynie. Zaznacz położenie pasków na dolnej stronie naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Jeśli nie uda się przyczepić matrycy, powtórz czynności od kroku 1.2.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie pasków i powlekanie laminy w hodowli neuronów
<ol>
	<li>Przygotować znakowane fluorescencyjnie rekombinowane białko (po 25 μl do wstrzykiwań [krok 2.2] lub po 100 μl do metody umieszczania [krok 2.2.1]) przez zmieszanie białka znakowanego Fc (10-50 μg/ml) i fluorescencyjnego przeciwciała anty-ludzkiego Fc sprzężonego z barwnikiem (stosunek 1 do 3: 30-150 μg / ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Następnie inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki 22 G wstrzyknąć 25 μl rekombinowanego białka przygotowanego w poprzednim kroku (2.1) przez mały otwór z boku matrycy (strzałki na rysunku 1A, 1C i 1E).
	<ol>
		<li>Alternatywnie, umieścić 100 μl rekombinowanego białka w górnej szczelinie matrycy i odessać około połowy roztworu z małego otworu (strzałki na rysunku 1A, 1C i 1E), tak aby rekombinowane białko pozostało w pasiastych obszarach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować szalkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Umieścić 300 μl PBS w górnej szczelinie (ryc. 1B) i odessać z małego otworu znajdującego się z boku matrycy (strzałki na rysunku 1A, C i E) w celu usunięcia nieprzyłączonych rekombinowanych białek. Nie zasysaj całkowicie PBS, ponieważ białka wyschną. Powtórz ten krok dwukrotnie. (Razem 3 razy)</li>
	<li>Ostrożnie usunąć matrycę i natychmiast umieścić ~100 μl białka kontrolnego (10-50 μg/ml; Fc), aby pokryć cały obszar w paski, tworząc alternatywną powłokę. Następnie inkubować naczynie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Po trzykrotnym umyciu powierzchni naczynia PBS, pokryj ją ~100 μl 20 μg/ml lamininy w PBS. 
	Uwaga: Lamininę należy rozmrażać na lodzie, aby zapobiec krzepnięciu.</li>
	<li>Inkubować naczynie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Umyj powierzchnię naczynia trzykrotnie PBS i dodaj pożywkę hodowlaną. Umieścić pokryte naczynie z pożywką hodowlaną w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Hodowla neuronów hipokampa z embrionów myszy E15.5
<ol>
	<li>Poddać matkę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i wyizolować trzy zarodki E15,5.</li>
	<li>Przetnij nożyczkami skórę i czaszkę strzałkowo w linii środkowej głowy i usuń mózg za pomocą małej łyżki. Ostrożnie przenieś mózg na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 3 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS).</li>
	<li>Za pomocą skalpela wytnij półkule, w tym korę, hipokamp i prążkowie (ryc. 2A). Następnie wypreparuj obszar hipokampa, ostrożnie usuwając opony mózgowe, i przenieś wypreparowane tkanki hipokampa do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 2 ml roztworu HBSS na lodzie (ryc. 2B-C). Zbierz 6 hipokampów z 3 zarodków w probówce, które wystarczą do hodowli neuronów w 8 szalkach.</li>
	<li>Zastąpić roztwór HBSS roztworem trypsyny/EDTA (2 ml) i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut w łaźni wodnej><.
	Uwaga: Odsysać HBSS bez wirowania i nie dekantować roztworu HBSS poprzez przechylanie probówki.</li>
	<li>Zneutralizuj aktywność trypsyny, dodając 500 μl płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Odwirować mieszaninę przy 100 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i przemyć osad 2 ml pożywki. Powtórz ten krok jeszcze raz.</li>
	<li>Pipetuj hipokampy w górę i w dół 10 razy w pożywce hodowlanej za pomocą końcówki o pojemności 1,000 μl z dużym otworem (odciętą końcówką), aby zdysocjować tkankę.</li>
	<li>Zmień końcówkę na zwykłą (nieoszlifowaną) o pojemności 1000 μl i pipetuj zdysocjowaną tkankę w górę iw dół, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Oddziel pojedyncze komórki, przepuszczając je przez sitko siatkowe o wielkości 80-100 μm.</li>
	<li>Odwirować przefiltrowaną zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 150 x g przez 5 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez zasysanie i ponownie zawiesić osad (neurony) w 2 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru z barwieniem błękitem trypanowym, aby określić gęstość i żywotność. Następnie umieść 10 000 neuronów w 150 μl pożywki hodowlanej dla każdego zestawu pasków. Zawieszenie należy ostrożnie umieścić, aby pokryć cały obszar paska.</li>
</ol>
4. Wizualizacja ciał komórkowych i aksonów za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciała anty-Tau1
<ol>
	<li>Po 24 godzinach hodowli odessać pożywkę bez naruszania przylegających komórek i utrwalić neurony wstępnie podgrzanym 4% paraformaldehydem (PFA)/4% sacharozą/PBS w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Umyj powierzchnię płytki 3 razy za pomocą PBS. W razie potrzeby użyj wodoodpornego pisaka, aby narysować okrąg wokół pasiastego obszaru, aby zmniejszyć potrzebną ilość przeciwciała.</li>
	<li>Uzdatniaj neurony za pomocą 0,3% Triton X-100/PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować neurony z roztworem blokującym zawierającym 3% surowicy osła i 0,1% Triton X-100 przez 30 minut, a następnie inkubować z przeciwciałem anty-Tau1 (1:200) w 1% surowicy osła/0,1% Triton X-100/PBS O/N w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyj powierzchnię płytki 3 razy za pomocą PBS. Inkubować neurony z fluoroforowym przeciwciałem anty-mysim IgG w 1% albuminie surowicy bydlęcej (BSA)/0,1% Triton X-100/PBS przez 30 minut.</li>
	<li>Umyj powierzchnię płytki 3 razy za pomocą PBS. Przykryj obszar w paski szkłem nakrywkowym o wymiarach 18 mm x 18 mm, używając 50 μl roztworu zapobiegającego blaknięciu. Unikaj pęcherzyków powietrza, które zakłócają obrazowanie.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu odpowiedniego systemu, np. soczewki obiektywu x10, zestawów filtrów dla GFP i RFP oraz czasu naświetlania 1000 ms (ryc. 3).</li>
</ol>

<ol><li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).</li>
<li>Bashaw, G. J., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+axon+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling from axon guidance receptors.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).</li>
<li>Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+the+guidance+of+nerve+growth+by+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1.</a> Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).</li>
<li>Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+Activity+Modulates+Growth+Cone+Guidance+by+Diffusible+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors.</a> Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).</li>
<li>Dudanova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+for+a+contribution+of+EphA%3AephrinA+reverse+signaling+to+motor+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance.</a> J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).</li>
<li>Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit2+regulates+attractive+eosinophil+and+repulsive+neutrophil+chemotaxis+through+differential+srGAP1+expression+during+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation.</a> J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).</li>
<li>Ly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSCAM+is+a+netrin+receptor+that+collaborates+with+DCC+in+mediating+turning+responses+to+netrin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1.</a> Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).</li>
<li>Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unc5B+associates+with+LARG+to+mediate+the+action+of+repulsive+guidance+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule.</a> J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).</li>
<li>Egea, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+EphA+4+kinase+activity+is+required+for+a+subset+of+axon+guidance+decisions+suggesting+a+key+role+for+receptor+clustering+in+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function.</a> Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).</li>
<li>von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-Bound+Protein+Gradients+for+Cell+Culture+Fabricated+by+Microfluidic+Networks+and+Microcontact+Printing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing.</a> Sci Signal. , (2007).</li>
<li>Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+submicrometer+features+on+curved+substrates+by+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing.</a> Science. 269 (5224), 664-666 (1995).</li>
<li>Mrksich, M., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+self-assembled+monolayers+to+understand+the+interactions+of+man-made+surfaces+with+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).</li>
<li>Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+position-specific+properties+of+tectai+cell+membranes+by+retinal+axons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro.</a> Development. 101, 685-696 (1987).</li>
<li>Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stripe+assay+to+examine+axonal+guidance+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).</li>
<li>Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stripe+assay%3A+studying+growth+preference+and+axon+guidance+on+binary+choice+substrates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro.</a> Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+functional+relevance+of+the+Slit2+homodimerization+domain%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain.</a> EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).</li>
<li>Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+of+ephrin%2FEph+forward+and+reverse+signaling+as+the+driving+force+of+adaptive+topographic+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping.</a> Development. 139 (2), 335-345 (2012).</li>
<li>Atapattu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+binding+the+ADAM10+substrate+recognition+domain+inhibit+Eph+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function.</a> J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).</li>
<li>Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrin+interactions+modulate+muscle+satellite+cell+motility+and+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning.</a> Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).</li>
<li>Seiradake, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT+Structure%3A+Balancing+Repulsion+and+Cell+Adhesion+in+Cortical+and+Vascular+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development.</a> Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).</li>
<li>Yamagishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FLRT2+and+FLRT3+act+as+repulsive+guidance+cues+for+Unc5-positive+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons.</a> EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje test paskowy, który wykorzystuje rekombinowane białko i zdysocjowane neurony z hipokampa myszy E15.5. Test ten pozwala na efektywną obserwację odpychających, atrakcyjnych lub neutralnych reakcji neuronów na interesujące nas rekombinowane białko umieszczone w pasiasty wzór. Główną zaletą tego protokołu jest prosta metoda generowania pasków, w której białko jest bezpośrednio drukowane na powierzchni plastikowego naczynia, w porównaniu z tradycyjną metodą, która wymaga specjalnych matryc, systemu próżni...

Prowadzenie aksonu to proces, w którym nowo powstałe neurony wysyłają aksony do swojego celu podczas rozwoju układu nerwowego1,2. Rozwijające się aksony mają na swoim końcu bardzo ruchliwą strukturę zwaną stożkiem wzrostu. Stożek wzrostu wyczuwa sygnały zewnątrzkomórkowe, aby poruszać się po ścieżce aksonu. Cząsteczki prowadzące, takie jak szczelina, semaforyna i efryny, mogą przyciągać lub odpychać aksony w zależności od ich interakcji z odpowiednimi receptorami i koreceptorami na aksonie1,3,4. Aktywowane receptory przekazują sygnały do stożka wzrostu, które wpływają na jego organizację cytoszkieletu dla ruchów aksonów i stożków wzrostu.
Opracowano różne metody oceny działania cząsteczek wabiących i odstraszających. Chemoatraktanty i repelenty mogą być podawane do pożywki wzrostowej/hodowlanej o stężeniu gradientowym (np. komora Dunna lub szkiełka μ)5,6, w miejscu o wysokim stężeniu za pomocą mikropipety (np. test obracania)7 lub w jednorodnym stężeniu przez kąpiel (np. test zapadania się stożka wzrostu)8,9.
Inne metody obejmują test paskowy lub druk mikrokontaktowy (μCP), w którym chemo-atraktant lub repelent jest powlekany na powierzchni płytki jako podłoże10-12. Test paskowy został pierwotnie opracowany przez Bonhoeffera i współpracowników w 1987 roku w celu analizy mapowania topograficznego w systemie siatkówkowo-tektalnym piskląt13. Pierwotna metoda wymagała systemu próżniowego do powlekania białek na poliwęglanowych błonach nukleoporowych za pomocą matryc w paski i siatki. W późniejszych wersjach rekombinowane białka wydrukowano bezpośrednio na powierzchni płytki hodowlanej w paski przy użyciu wąskich szczelinowych matryc krzemowych14,15. Ostatnio różne grupy badawcze z powodzeniem zastosowały ten test paskowy do analizy aktywności cząsteczek kierujących aksonami16-21.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół testu paskowego, który mierzy przyciąganie lub odpychanie cząsteczek kierujących aksonami dla zdysocjowanych neuronów hipokampa. Warto zauważyć, że metoda ta może być stosowana w minimalnie wyposażonych warunkach laboratoryjnych. W tym teście naprzemienne paski znakowanego fluorescencyjnie substratu i białka kontrolnego są generowane na plastikowym naczyniu przy użyciu matrycy krzemowej ze szczelinami 90 μm i pokryte lamininą. W naszej demonstracji zdysocjowane neurony hipokampa myszy E15.5 hodowano na naprzemiennych paskach rekombinowanej ektodomeny fibronektyny i bogatego w leucynę białka transbłonowego-2 (FLRT2) i kontrolnego białka Fc21. Po 24 godzinach hodowli zarówno aksony, jak i ciała komórkowe neuronów zostały silnie odpychane od pasków FLRT2. Barwienie przeciwciałem anty-Tau1 ujawniło, że ~90% neuronów było rozmieszczonych w regionach pokrytych Fc, w porównaniu do ~10% na FLRT2-Fc, co wskazuje, że FLRT2 ma silną funkcję odpychania neuronów hipokampa21.

<table><tbody><tr><td>Probówka wirówkowa 15 ml</td><td>Violamo&nbsp;</td><td>1-3500-01</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd (PFA)</td><td>Nacalai</td><td>01954-85</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Kozie przeciwciało anty-ludzkie IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Przeciwciało przeciw mysim osiołkom Thermo</td><td>Scientific</td><td>A-21203</td><td>Rozcieńczenie 1/500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Tau1</td><td>Chemicon</td><td>MAB3420</td><td>Rozcieńczenie 1/200</td></tr><tr><td>Antifade</td><td>Thermo Scientific</td><td>P7481</td><td>Można zastosować alternatywne media montażowe</td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Thermo Scientific</td><td>17504-044</td><td>Rozcieńczenie 1/50</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>01-2030-2</td><td></td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 100 um</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Kubota</td><td>2410</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe 18mmx18mm</td><td>Matsunami</td><td>18x18 mm No. 1</td><td></td></tr><tr><td>Długopis</td><td>DAKO DAKO</td><td>S2002</td><td>Można użyć alternatywnego długopisu hydrofobowego</td></tr><tr><td>Skalpel jednorazowy</td><td>Feather</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluoostatni</td><td>Nikon</td><td>E600</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze nr 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050-061</td><td>Rozcieńczenie 1/100</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td></td><td>805N</td><td>22 gauge, 50 uL</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka IgG, fragment Fc</td><td>Jackson</td><td>009-000-008</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermo Scientific</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Thermo Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Nacalai</td><td>14249-24</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>15070-063</td><td>Rozcieńczenie 1/100</td></tr><tr><td>Plastikowe naczynie hodowlane, 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Matryce silikonowe</td><td></td><td></td><td>Dostępne i do kupienia u Prof. Martina Bastmeyera (bastmeyer@kit.edu)</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka, 1000 uL</td><td>Watson</td><td>125-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta taśma klejąca</td><td>Tesa</td><td>57315</td><td>Można użyć alternatywnej taśmy klejącej</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski, 0,4%</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka</td><td></td><td></td><td>hodowlana Neurobaseal uzupełniona o B27, GlutaMAX i Penicylinę-Streptomycynę.</td></tr></tbody></table>

test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Rosnące aksony rozwijają na swoim końcu bardzo ruchliwą strukturę, zwaną stożkiem wzrostu. Stożek wzrostu kontaktuje się z zewnątrzkomórkowymi sygnałami środowiskowymi, aby nawigować po wzroście aksonów. Netrin, szczelina, semaforyna i efryny są znanymi cząsteczkami prowadzącymi, które mogą przyciągać lub odpychać aksony po związaniu się z receptorami i koreceptorami na aksonie. Aktywowane receptory inicjują różne cząsteczki sygnałowe w stożku wzrostu, które zmieniają strukturę i ruch neuronu. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół testu paskowego w celu oceny zdolności cząsteczki prowadzącej do przyciągania lub odpychania neuronów. W tej metodzie zdysocjowane neurony hipokampa myszy E15.5 są hodowane na naczyniach pokrytych lamininą przetworzonych z naprzemiennymi paskami ektodomeny fibronektyny i bogatego w leucynę białka transbłonowego-2 (FLRT2) i białka kontrolnego regionu krystalizacyjnego (Fc) immunoglobuliny G (IgG). Zarówno aksony, jak i ciała komórkowe zostały silnie odpychane od regionów paskowych pokrytych FLRT2 po 24 godzinach hodowli. Barwienie immunologiczne za pomocą tau1 wykazało, że ~90% neuronów było rozmieszczonych na paskach pokrytych Fc w porównaniu z paskami pokrytymi FLRT2-Fc (~10%). Wynik ten wskazuje, że FLRT2 ma silnie odpychający wpływ na te neurony. Ta potężna metoda ma zastosowanie nie tylko do pierwotnych neuronów hodowlanych, ale także do wielu innych komórek, takich jak neuroblasty.

Rozdzielone neurony hipokampa od myszy w stadium E15.5 wysiano i hodowano przez 24 h na pasmach fluorescencyjnie znakowanej kontrolnej białka Fc (Rycyna 3A-C) lub FLRT2-Fc (Rycyna 3D-F), naprzemiennie z nieznakowaną kontrolną białkiem Fc. W obu przypadkach neurony agregowały i wydłużały aksony w postaci pęczków. Na pasmach Fc/Fc kontrolnych neurony rozmieszczały się równomiernie na pasmach znakowanych fluorescencyjnie i nieznakowanych, a ich aksony wydłuż...

Cząsteczki naprowadzające aksonów regulują migrację neuronów i ukierunkowaną nawigację stożka wzrostu. Przedstawiamy potężną metodę, test paskowy, do oceny zdolności cząsteczek przewodnich do przyciągania lub odpychania neuronów. W tym protokole demonstrujemy test prążkowany, pokazując zdolność FLRT2 do odpychania hodowanych neuronów hipokampa.

Test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to ...

Ogólnym celem testu paskowego (stripe assay) jest ocena zdolności konkretnych białek, takich jak cząsteczki kierujące, do przyciągania lub odpychania neuronów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kierowania aksonami, takie jak sposób, w jaki neurony mogą migrować lub wydłużać swoje aksony w odpowiedzi na zewnętrzne środowisko komórkowe. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wizualizacji dużej liczby neuronów w ramach jednego eksperymentu oraz jednoczesna analiza wielu stożków wzrostu.W ramach przygotowania zagotuj od czterech do ośmiu matryc silikonowych w wodzie przez pięć minut. Pozostaw je do całkowitego wyschnięcia na powietrzu w komorze z laminarnym przepływem powietrza, stroną prążkowaną do góry. Proces ten trwa około godziny.Kontynuuj pracę pod komorą sterylną. Użyj sprężonego powietrza lub taśmy klejącej, aby usunąć kurz z prążkowanej strony matryc. Następnie ostrożnie umieść każdą matrycę w osobnej sześciocentymetrowej plastikowej płytce, stroną prążkowaną do dołu.Dociskając jednym palcem, mocno przyciśnij każdą matrycę. Unikaj uwięzienia pęcherzyków powietrza między matrycą a naczyniem. Jeśli matryca nie przylgnie, powtórz proces.Po przytwierdzeniu zaznacz położenie pasków na spodzie szalki hodowlanej. Przygotuj rekombinowane białka znakowane fluorescencyjnie w PBS. Przygotuj 25 µL dla każdej szalki z paskami.Mieszaninę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie, dla każdego naczynia, do strzykawki o rozmiarze 22 G nabrano 25 µL rozcieńczonego białka i wstrzyknięto je przez mały otwór z boku matrycy. Należy unikać wstrzykiwania pęcherzyków powietrza do matryc, ponieważ zaburzą one wiązanie białek z naczyniami.Następnie inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po inkubacji nanieś 300 µL PBS do górnej szczeliny każdej macierzy. Następnie odessij PBS przez mały otwór znajdujący się z boku każdej macierzy, aby usunąć wszystkie nieprzytwierdzone białka rekombinowane.Nie odsysaj całkowicie PBS, aby zapobiec wysychaniu białek. Powtórz to płukanie PBS łącznie trzy razy. Następnie ostrożnie usuń matrycę z każdej płytki.Następnie niezwłocznie dodaj około 100 µL białka kontrolnego na cały obszar paski, tworząc naprzemienne powłoki na każdej płytce. Następnie inkubuj płytki przez 30 minut w temperaturze 37 °C. W międzyczasie, w temperaturze lodu, rozmroź lamininę oraz PBS o stężeniu 20 µg/mL.Po 30 minutach wypłucz naczynia trzykrotnie buforem PBS. Następnie pokryj każde naczynie około 100 µL zimnej lamininy i umieść naczynia z powrotem w inkubatorze na kolejną godzinę. Po godzinie ponownie wypłucz naczynia trzykrotnie za pomocą PBS.Po trzecim przemyciu dodaj około 150 µL medium hodowlanego do każdej płytki. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C do momentu ich kolejnego użycia. Po uśmierceniu myszy dawcy w stadium E15.5, przetnij skórę i czaszkę strzałkowo wzdłuż linii środkowej głowy za pomocą nożyczek chirurgicznych i pobierz mózg, używając mikroszpatułki.Ostrożnie przenieś mózg do szalki Petriego o pojemności 60 mililitrów zawierającej trzy mililitry HBSS. W szalce, używając skalpela, wytnij półkule, obejmując korę, hipokamp i prążkowie. Następnie wypreparuj obszary hipokampa, ostrożnie usuwając opony mózgowe.Przenieś wypreparowane tkanki hipokampa do probówki wirówkowej o objętości 15 ml zawierającej 2 ml roztworu HBSS w lodzie. Sześć hipokampów z trzech zarodków jest wystarczające do hodowli neuronów na ośmiu szalkach. Po zebraniu wszystkich tkanek hipokampa odessij HBSS i zastąp go 2 ml trypsyny z EDTA.Następnie inkubuj probówkę przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Kolejnym krokiem jest neutralizacja aktywności trypsyny poprzez dodanie 500 µL płodowej surowicy bydlęcej. Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 100 ×g przez pięć minut.Usunąć nadosad i przemyć osad dwoma mililitrami pożywki hodowlanej. Następnie ponownie odwirować mieszaninę i wymienić pożywkę na nową. Teraz rozdzielić tkankę poprzez delikatne triturację za pomocą końcówki do pipety o pojemności jednego mililitra z odciętym czubkiem.Przesuwaj tkanki w górę i w dół za pomocą końcówki pipety około 10 razy. Następnie użyj nieociętej końcówki o pojemności jednego mililitra i powtórz proces trituracji, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Teraz wyizoluj pojedyncze komórki, przeciskając zawiesinę przez sitko komórkowe o oczkach od 80 do 100 mikronów.Następnie odwiruj przefiltrowaną zawiesinę z prędkością 150 G przez pięć minut, odessaj supernatant i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach pożywki hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemocytometru i zasiaj 10 000 neuronów w 150 µL pożywki hodowlanej na każdą przygotowaną płytkę z prążkami. Ostrożnie nanieś zawiesinę tak, aby pokryła cały obszar z prążkami.Dysocjowane neurony hipokampa myszy w stadium E15.5 wysiano i hodowano przez 24 godziny na pasach fluorescencyjnie znakowanego białka kontrolnego FC lub wysiano neurony na pasach FLRT2 FC naprzemiennie z nieznakowanym białkiem kontrolnym FC. W obu przypadkach neurony uległy agregacji i wydłużały swoje aksony w formie pęczków. Na kontroli FC neurony były rozłożone równomiernie i wydłużały aksony w losowych kierunkach. W przeciwieństwie do tego, podczas hodowli na pasach FLRT2 FC, aksony unikały wzrostu w obszarach z FLRT2 FC.W związku z tym wydłużające się aksony rosły głównie na pasach FC. Większe powiększenie pokazuje, że aksony rosły wzdłuż granicy z pasami FC FLRT2, ale nie wnikały na obszar FLRT2. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować pasowy dywan z zalecanych białek oraz jak ocenić aktywność przyciągającą lub odpychającą z wykorzystaniem dysocjowanych neuronów hipokampa.Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w pięć godzin, pod warunkiem że zostanie ona wykonana prawidłowo.

stripe-assay-to-study-attractive-or-repulsive-activity-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje podejście oparte na podawaniu przeciwciał do badania transportu receptorów glutaminianu w pierwotnych kulturach neuronów hipokampa. Takie podejście pozwala na obserwację populacji receptorów zarówno w plazmie, jak i błonach wewnętrznych. Dyskryminację między tymi podzbiorami uzyskuje się poprzez znakowanie receptorów przed i po przepuszczalności błony, przy użyciu tego samego przeciwciała pierwszorzędowego, ale przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z różnymi fluoroforami.

Technika in vitro do badania transportu receptorów glutaminianu w neuronach hipokampa

Ten film demonstruje metodę oceny aktywności białek za pomocą neuronów hipokampa nad wzorzystymi strefami białkowymi. Neurony wykazują odpychanie w strefach białek testowych i przyłączanie się w strefach białek kontrolnych, podkreślając efekty atrakcyjnej lub odpychającej aktywności białek.

Ocena atrakcyjnej lub odpychającej aktywności białek za pomocą neuronów hipokampa

Odwracalne dodawanie palmitynianu do białek jest ważnym regulatorem wewnątrzkomórkowego transportu białek. Jest to szczególnie interesujące w neuronach, w których wiele białek synaptycznych jest palmitoilowanych. Wykorzystujemy prostą metodę biochemiczną do wykrywania białek palmitoilowanych w hodowanych neuronach, które można dostosować do wielu typów komórek i tkanek.

Wykrywanie palmitoylacji białek w hodowanych neuronach hipokampa poprzez immunoprecypitację i wymianę acylo-biotyny (ABE)

Opisujemy metodę znakowania białka na powierzchni żywych neuronów za pomocą specyficznego poliklonalnego przeciwciała przeciwko epitopom zewnątrzkomórkowym. Białko związane przez przeciwciało na powierzchni komórki, a następnie internalizowane przez endocytozę, można odróżnić od białka pozostającego na powierzchni lub transportowanego na powierzchnię podczas inkubacji.

Znakowanie różnicowe białek powierzchniowych i zinternalizowanych po karmieniu przeciwciałami żywych hodowanych neuronów

Udostępniamy szczegółowy protokół indukcji długotrwałego wzmocnienia w regionie CA1 hipokampa i późniejszej izolacji frakcji wzbogaconych jądrowo z obszaru tetanizowanego wycinka. Podejście to można wykorzystać do określenia zależnego od aktywności importu białek jądrowych w komórkowych modelach uczenia się i pamięci.

Izolacja frakcji wzbogaconych jądrami CA1 z wycinków hipokampa w celu zbadania zależnego od aktywności importu jądrowego synaptojądrowych białek przekaźnikowych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Pobudliwość neuronów może być modulowana poprzez dynamiczny proces endo- i egzocytozy pobudzających jonotropowych receptorów glutaminianu. Opisany tutaj jest dostępny test o wysokiej zawartości do ilościowego określania puli populacji receptorów powierzchniowych i wewnętrznych.

Test o wysokiej zawartości do monitorowania transportu receptora AMPA

W tym protokole wprowadzamy metodę oczyszczania bogatej w filopodia frakcji dendrytycznej z fagocytarnej struktury wypukłości przypominającej miseczkę na hodowanych neuronach hipokampa, wykorzystując specyficzne i silne powinowactwo między cząsteczką adhezyjną filopodialną, TLCN, a cząsteczką macierzy zewnątrzkomórkowej, witronektyną.

Oczyszczanie frakcji bogatej w dendrytyczne filopodia

Ten artykuł przedstawia metodę badania transportu receptora glutaminianu (GluR) w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa. Wykorzystując podejście oparte na podawaniu przeciwciał do znakowania endogennych lub nadmiernie eksprymowanych receptorów w połączeniu z podejściami farmakologicznymi, metoda ta pozwala na identyfikację mechanizmów molekularnych regulujących ekspresję powierzchniową GluR poprzez modulację procesów internalizacji lub recyklingu.

Podejście do karmienia przeciwciałami w celu zbadania transportu receptora glutaminianu w zdysocjowanych pierwotnych kulturach hipokampa

Przedstawiamy protokół do oznaczania i analizowania neuronów piramidowych, który jest kluczowy dla oceny potencjalnych zmian morfologicznych w neuronach i kolcach dendrytycznych, które mogą leżeć u podstaw nieprawidłowości neurochemicznych i behawioralnych.

Znakowanie balistyczne neuronów piramidowych w wycinkach mózgu i w pierwotnej hodowli komórkowej

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa. Ta metoda pozwala wizualizować dużą liczbę neuronów i stożków wzrostu jednocześnie.

Test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa (Wideo) | JoVE Journal

Test paskowy do badania atrakcyjnej lub odpychającej aktywności substratu białkowego przy użyciu zdysocjowanych neuronów hipokampa

Przeglądaj więcej filmów