Inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie przestrzeni, w której tkanka może rosnąć i rozszerzać się jednocześnie z rozwojem solidnego dopływu krwi, co ostatecznie prowadzi do wytworzenia unaczynionego, dużego, trójwymiarowego bloku tkanki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w inżynierii unaczynionych tkanek do celów rekonstrukcyjnych, a także do wymiany i naprawy narządów. Główną zaletą tej techniki jest to, że nowo wytworzona tkanka jest wewnętrznie zaopatrywana przez własną sieć naczyniową bez konieczności polegania na dyfuzji z otoczenia w celu przeżycia.

Procedurę zademonstrują Sue McKay i Liliana Pepe. Znieczulij szczura ważącego co najmniej 250 gramów i oceń głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Jeśli szczur nie reaguje, należy utrzymać sedację za pomocą 2% izofluranu przez cały czas trwania zabiegu.

Następnie nałóż maść epsomiczną na oczy. Następnie, gdy szczur leży na wznak, użyj elektrycznych maszynek do golenia, aby ogolić pachwinę i usunąć włosy zwilżoną gazą. Następnie oczyść pola operacyjne roztworem chlorheksydyny zawierającym 70% etanolu.

Na koniec ułóż zwierzę sterylnymi ręcznikami i przystąp do operacji. Za pomocą ostrza numer 15 wykonaj czterocentymetrowe nacięcie skóry w lewej pachwinie równolegle do więzadła pachwinowego. Następnie przetnij nożyczkami odsłoniętą pachwinową poduszeczkę tłuszczową na obwodzie, pozostawiając ją przymocowaną do szypułki naczyniowej, w oparciu o naczynia nadbrzusza.

Teraz za pomocą mikronożyczek uwolnij zrosty tkanki łącznej między ścianą brzucha a leżącymi poniżej naczyniami udowymi. Następnie umieść retraktor na ścianie brzucha i pociągnij go przyśrodkowo, aby odsłonić więzadło pachwinowe i całą długość naczyń udowych. Następnie za pomocą mikrokleszczy i zakrzywionych nożyczek wypreparuj żyłę nadbrzusza i odizoluj ją od otaczającego tłuszczu.

Ta żyła będzie funkcjonować jako linka. Kontynuuj, otwierając osłonkę okołonaczyniową zawierającą naczynia udowe i nerw. Otwórz go aż do więzadła pachwinowego do jego rozwidlenia dystalnie do gałęzi nadbrzusza.

W tym momencie, jak i podczas całej procedury, delikatne obchodzenie się z naczyniami udowymi ma kluczowe znaczenie. Ich uszkodzenie może skutkować zakrzepicą i fiaskiem całego eksperymentu. Następnie za pomocą mikrokleszczyków należy podnieść żyłę udową za jej przydankę i delikatnie oddzielić ją od otaczających tkanek i towarzyszącej jej tętnicy.

Na tym etapie nie chwytaj całej grubości ściany żyły, co może spowodować uraz błony wewnętrznej, a tym samym podatność żyły na zakrzepicę. Również na tym etapie podwiąż boczne gałęzie nylonowym szwem 10-0 lub skoaguluj je koagulatorem bipolarnym. Gdy żyła udowa jest całkowicie wolna, podwiąż ją proksymalnie i dystalnie za pomocą jedwabnych szwów 4-0, aby uzyskać przeszczep żyły o długości co najmniej 10 milimetrów, w tym około pół centymetra długości gałęzi nadbrzusza.

Gałąź działa jak linka odciągowa, która utrzymuje pętlę otwartą w komorze. Następnie przydatek odetnij od końców przeszczepu. W razie potrzeby ten krok można odłożyć na czas przed założeniem zespoleń mikrochirurgicznych.

Zakończ przygotowanie przeszczepu żyły, przepłukując go heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej i pozostawiając do spoczynku wypełnionego heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej. Następnie zamknij ranę za pomocą ciągłego jedwabnego szwu 4-0 i dwóch lub trzech dodatkowych prostych przerywanych szwów. Na początek odsłoń więzadło pachwinowe i całą długość naczynia udowego kończyny przeciwległej, jak pokazano wcześniej.

Następnie za pomocą mikrokleszczy wypreparuj i odizoluj zarówno tętnicę nadbrzusza, jak i żyłę od otaczającej poduszeczki tłuszczowej. Zachowaj ostrożność podczas odciągania tkanki od naczyń. Kontynuuj, podnosząc tętnicę udową za jej przydankę i uwalniając ją od otaczających tkanek.

W tym procesie podwiązuje lub koaguluje boczne gałęzie tętnicy. Następnie umieść zacisk proksymalnie zarówno na tętnicy udowej, jak i żyle. Teraz, za pomocą jedwabnego szwu 4-0, podwiąż tętnicę udową i żyłę dystalnie do pojawienia się naczyń nadbrzusza.

Teraz umieść sterylne plastikowe kontrastowe tło pod naczyniami i użyj ostrych, prostych mikronożyczek, aby przeciąć każde naczynie w poprzek. Po przecięciu energicznie przepłucz naczynia dużą ilością heparynizowanej soli fizjologicznej, aż cała krew zostanie usunięta ze światła. Teraz wprowadź przeszczep żyły do pola operacyjnego.

Umieść przeszczep żyły tak, aby bliższy koniec przeszczepu żyły był gotowy do zespolenia z żyłą udową biorcy, a dystalny koniec z tętnicą udową biorcy. Umożliwi to przepływ krwi od strony tętniczej do żylnej bez oporu ze strony zastawek wewnątrz przeszczepu żylnego. Upewnij się, że naczynia udowe i przeszczep żyły spoczywają w swojej naturalnej pozycji bez żadnych skrętów.

Za pomocą nici nylonowego 10-0 należy wykonać zespolenie chirurgiczne po obu stronach. Dobre i atraumatyczne zespolenie mikrochirurgiczne to podstawa. Uszkodzenie błony wewnętrznej naczynia, przesuszenie naczyń lub nieprawidłowo założone szwy sprawiają, że miejsce zespolenia jest podatne na powstawanie skrzeplin.

Następnie sprawdź, czy nie ma przecieków w obu miejscach zespolenia. Rozwiąż małe wycieki, które wyglądają jak niepulsująca krew wypływająca z miejsca zespolenia, umieszczając mały kawałek tłuszczu lub gąbkę na wierzchu i delikatnie uciskając przez pięć do 10 minut. Większe pulsujące nieszczelności, które szybko zalewają całe pole, będą wymagały dodatkowych szwów.

Następnie sprawdź drożność pętli tętniczo-żylnej. Delikatne zamknięcie tętnicy udowej powinno spowodować jej obkurczenie. I odwrotnie, niedrożność żyły udowej powinna obrzęknąć pętlę.

Teraz umieść podstawę komory inżynierii tkankowej pod pętlą tętniczo-żylną. Upewnij się, że pętla spoczywa w swojej naturalnej pozycji, bez żadnych skrętów i załamań. Następnie, za pomocą nylonowych szwów 6-0, przymocuj podstawę komory do więzadła pachwinowego i leżącej pod nim powięzi mięśniowej.

Następnie umieść pokrywę na podstawie komory. Ściśnij gałęzie nadbrzusza pod pokrywką, aby utrzymać pętlę na miejscu. Następnie zamknij ranę za pomocą ciągłego jedwabnego szwu 4-0 oraz dwóch lub trzech dodatkowych prostych przerywanych szwów.

Na koniec pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w indywidualnej klatce i podaj pojedynczą dawkę karprofenu podskórnie jako środek przeciwbólowy. Przygotuj zwierzę do operacji jak poprzednio. Jednemu szczurowi można wszczepić dwie komory, po jednej w każdej pachwinie.

Następnie odizoluj naczynie udowe, jak opisano wcześniej. Gdy zarówno tętnica, jak i żyła są całkowicie wolne od otaczających tkanek, a ich gałęzie są podwiązane, wprowadź komorę do pola operacyjnego. Następnie umieść każde z nienaruszonych naczyń udowych w odpowiednich szczelinach podstawy komory.

Upewnij się, że żaden z nich nie jest skręcony ani załamany. Następnie zamknij komorę, przymocowując pokrywę do podstawy. Następnie zamknij ranę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie, jak opisano wcześniej.

Mikrochirurgiczne tworzenie komór inżynierii tkankowej przeprowadzono zgodnie z opisem. Za pomocą komory unaczynionej in vivo z powodzeniem zmodyfikowano różne typy tkanek, które obejmują tkankę serca z kardiomiocytami nowonarodzonych szczurów, tkankę mięśniową z mioblastami szkieletowymi szczurów oraz tkankę tłuszczową z hydrożelem pochodzącym z macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki tłuszczowej. System stereologiczny pozwala na bezstronną kwantyfikację określonej objętości tkanki.

Na przykład komórki śródbłonka barwione lektyną w przekrojach poprzecznych wykorzystano do oszacowania objętości naczyń krwionośnych. Po implantacji in vivo komórek znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi można śledzić ich losy. Na przykład kardiomiocyty nowonarodzonych szczurów znakowane barwnikiem i wykryto w konstruktach tkanek trzy dni po implantacji.

Alternatywnie, przeciwciała specyficzne dla gatunku mogą być wykorzystane do identyfikacji zagnieżdżonych komórek w badaniach ksenotransplanacji. Na przykład indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste wszczepione szczurom z obniżoną odpornością można zidentyfikować w tkance pobranej z komory. Po opanowaniu komory przepływowej i pętli tętniczo-żylnej można wszczepić odpowiednio w około 20 i 90 minut.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały czas zachować sterylność i podjąć niezbędne środki w przypadku wystąpienia zanieczyszczenia. Nie zapominaj, że delikatne obchodzenie się z naczyniami krwionośnymi i atraumatyczne zespolenie mikrochirurgiczne są kluczem do sukcesu. W związku z tym zalecamy podstawowe szkolenie mikrochirurgiczne przed przystąpieniem do tej procedury, szczególnie w zakresie budowy pętli tętniczo-żylnej.