Name: Inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj metodę inżynierii tkankowej z wewnętrznym unaczynieniem w komorze in vivo. Technika ta umożliwia generowanie dużych, trójwymiarowych bloków tkanki z własną siecią naczyniową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z NHMRC i Stafford Fox Medical Foundation. Autorzy dziękują za chirurgiczną pomoc Sue McKay, Liliany Pepe, Anny Deftereos i Amandy Rixon z Eksperymentalnego Oddziału Medycznego i Chirurgicznego Szpitala św. Wincentego w Melbourne. Wsparcie udziela również Departament Innowacji, Przemysłu i Rozwoju Regionalnego Departamentu Innowacji, Przemysłu i Rozwoju Regionalnego Rządu Stanu Wiktoria.

Opisane tutaj protokoły zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Szpitala St. Vincent's Hospital Melbourne w Australii i zostały przeprowadzone przy ścisłym przestrzeganiu wytycznych Australijskiej Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych.
UWAGA: Poniżej opisano dwa protokoły komory. Dwa różne modele i ich specyficzne konstrukcje studzienek przedstawiono na rysunku 1. Komora (1) wykonana jest z poliwęglanu (do modelu komory pętli tętniczo-żylnej szczura). Jest cylindryczny o średnicy wewnętrznej 13 mm i wysokości 4 mm. Okno w jednym miejscu w ścianie umożliwia swobodny dostęp do szypułki. W drugim modelu (dla modelu z przepływową komorą pedikularną dla szczurów) komora wykonana jest z poliakrylu i jest prostokątna (10 x 8 x 4 mm3 wymiary wewnętrzne). Posiada dwa otwory o średnicy 1,5 mm po przeciwnych stronach, aby pomieścić tętnicę udową i żyłę, gdy przekraczają komorę.
1. Model komory pętli tętniczo-żylnej szczura (jedna komora na zwierzę)
UWAGA: Przed rozpoczęciem operacji upewnij się, że wszystkie narzędzia zostały odpowiednio wysterylizowane. Podobnie, upewnij się, że narzędzia spoczywają na sterylnych ręcznikach i znajdują się w rozsądnej odległości od pola operacyjnego, aby uniknąć zanieczyszczenia podczas zabiegu.
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierzęcia do operacji
	<ol>
		<li>Do stworzenia pętli tętniczo-żylnej należy używać szczurów o wadze co najmniej 250 g ze względu na ich duże rozmiary naczyń.</li>
		<li>Znieczulić zwierzę 4% inhalacją izofluranu. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, oceniając brak reakcji na szczypanie palca. Po znieczuleniu zwierzę należy odpowiednio znieczulić przez cały czas trwania zabiegu 2% izofluranem.</li>
		<li>Umieść zwierzę w pozycji leżącej na podkładce rozgrzewającej i nałóż sterylny lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji.</li>
		<li>Za pomocą elektrycznej maszynki do golenia ogol obie pachwiny i usuń włosy kawałkiem wilgotnej gazy.</li>
		<li>Przygotować miejsca operacyjne roztworem chlorheksydyny/70% etanolu i owinąć zwierzę sterylnymi ręcznikami. Podawać pojedynczą dawkę karprofenu (5 mg/kg, podskórnie) jako środek przeciwbólowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Żniwo przeszczepu żyły udowej
	<ol>
		<li>Za pomocą ostrza #15 wykonaj 4-centymetrowe nacięcie skóry w lewej pachwinie równolegle do więzadła pachwinowego. To odsłania pachwinową poduszeczkę tłuszczową.</li>
		<li>Przeciąć poduszeczkę tłuszczową nożyczkami, pozostawiając ją przymocowaną do szypułki naczyniowej opartej na naczyniach nadbrzusza.</li>
		<li>Za pomocą mikronożyczek uwolnij zrosty tkanki łącznej między ścianą brzucha a leżącymi pod nią naczyniami udowymi.</li>
		<li>Umieść retraktor na ścianie brzucha i pociągnij przyśrodkowo. Odsłania to więzadło pachwinowe i całą długość naczyń udowych.</li>
		<li>Za pomocą mikrokleszczyków i zakrzywionych nożyczek wypreparuj żyłę nadbrzusza i odizoluj ją od otaczającego tłuszczu, delikatnie ciągnąc i przecinając. Żyła ta działa jak linka podczas konstruowania pętli.</li>
		<li>Za pomocą mikrokleszczyków i zakrzywionych mikronożyczek otwórz osłonkę okołonaczyniową zawierającą naczynia udowe i nerw na całej długości od więzadła pachwinowego do jego rozwidlenia dystalnego do gałęzi nadbrzusza.</li>
		<li>Za pomocą mikrokleszczy podnieś żyłę udową za jej przydankę i delikatnie oddziel ją od otaczających tkanek i towarzyszącej im tętnicy. Zrób to za pomocą mikro kleszczyków i zakrzywionych okrągłych mikronożyczek, rozsuwając tkankę i przecinając ją. 
		UWAGA: Nigdy nie chwytaj za całą grubość ściany żyły, ponieważ może to spowodować uraz błony wewnętrznej, czyniąc ją podatną na zakrzepicę.</li>
		<li>Podwiązywać boczne gałęzie znalezione podczas preparowania za pomocą nylonowego szwu 10/0 lub koagulować je za pomocą koagulatora bipolarnego.</li>
		<li>Gdy żyła udowa jest całkowicie wolna, podwiąż jej bliższe i dalsze końce za pomocą jedwabnych szwów 4/0. Upewnij się, że uzyskałeś przeszczep żyły o długości co najmniej 10 mm i zawiera około 0,5 cm długości gałęzi nadbrzusza, która ma być używana jako linka odciągowa do utrzymywania otwartej pętli w komorze.</li>
		<li>Za pomocą mikro kleszczyków i prostych mikronożyczek przytnij przydankę z końców przeszczepu, delikatnie ciągnąc i tnąc. Można to również zrobić później, przed zespoleniami mikrochirurgicznymi.</li>
		<li>Przepłukać przeszczep żylny heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej (10 j./ml heparyny) i pozostawić go do spoczynku w roztworze. Zamknij ranę za pomocą ciągłego jedwabnego szwu 4/0 oraz dwóch lub trzech dodatkowych prostych przerywanych szwów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stworzenie pętli tętniczo-żylnej i implantacja komory
	<ol>
		<li>Powtórzyć kroki od 1.2.1 do 1.2.4 dokładnie w ten sam sposób na kończynie przeciwległej.</li>
		<li>Za pomocą mikrokleszczy wypreparuj i wyizoluj zarówno tętnicę nadbrzusza, jak i żyłę, tworząc otaczającą poduszeczkę tłuszczową. Zrób to, delikatnie odciągając tkankę od naczyń</li>
		<li>Za pomocą mikrokleszczy podnieś tętnicę udową za jej przydankę i uwolnij ją od otaczających tkanek. Zrób to za pomocą mikro kleszczyków i zakrzywionych okrągłych mikronożyczek, rozsuwając tkankę i przecinając ją. Zwijać lub koagulować jego boczne gałęzie.</li>
		<li>Podwiązać tętnicę udową i żyłę dystalnie do pojawienia się naczyń nadbrzusza za pomocą jedwabnego szwu 4/0.</li>
		<li>Umieść pojedynczy zacisk proksymalnie na każdej tętnicy i żyle udowej. Za pomocą ostrych, prostych mikronożyczek wykonaj czyste poprzeczne cięcie w każdym naczyniu dystalnie do pojawienia się gałęzi nadbrzusza. Umieść sterylne plastikowe kontrastowe tło pod naczyniami.</li>
		<li>Energicznie przepłukać naczynia dużą ilością heparynizowanej soli fizjologicznej, aż cała krew zostanie usunięta ze światła.</li>
		<li>Wprowadzić przeszczep żyły do pola operacyjnego i w razie potrzeby usunąć zbędne przydanki z końców naczyń zgodnie z krokiem 1.2.10.</li>
		<li>Oba zespolenia mikrochirurgiczne należy wykonać za pomocą nylonowego szwu 10/0. Zespolenie bliższego końca przeszczepu żyły z żyłą udową i dystalnym końcem z tętnicą udową. Umożliwi to przepływ krwi od strony tętniczej do żylnej bez oporu ze strony zastawek wewnątrz przeszczepu żyły. 
		UWAGA: Upewnij się, że naczynia udowe i przeszczep żylny spoczywają w swojej naturalnej pozycji bez żadnych skrętów.</li>
		<li>Sprawdź, czy nie ma przecieków w obu miejscach zespolenia. Rozwiąż małe wycieki, które wyglądają jak niepulsująca krew wypływająca z miejsca zespolenia, umieszczając mały kawałek tłuszczu na wierzchu i delikatnie uciskając przez 5-10 minut. Większe pulsujące nieszczelności, które szybko zalewają całe pole, będą wymagały dodatkowych szwów.</li>
		<li>Sprawdź drożność pętli tętniczo-żylnej. Delikatne zamknięcie tętnicy udowej powinno spowodować jej obkurczenie, natomiast to samo w żyle udowej powinno ją spowodować.</li>
		<li>Umieść podstawę komory inżynierii tkankowej pod pętlą tętniczo-żylną, tak aby ta ostatnia spoczywała w swojej naturalnej pozycji bez skrętów i załamań.</li>
		<li>Przymocuj podstawę komory do więzadła pachwinowego i leżącej pod nim powięzi mięśniowej za pomocą nylonowych szwów 6/0.</li>
		<li>Umieść pokrywę na podstawie tak, aby naczynia udowe wchodziły do komory przez wcięcie (okienko z boku komory). Zamykając pokrywę, upewnij się, że chwyta ona gałęzie nadbrzusza, między podstawą komory a pokrywą, które działają jak pęta, utrzymując pętlę tętniczo-żylną na miejscu.</li>
		<li>Zamknij ranę za pomocą ciągłego jedwabnego szwu 4/0 oraz dwóch lub trzech dodatkowych prostych przerywanych szwów.</li>
		<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na podkładce rozgrzewającej. </li>
		<li>Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku. Podobnie, nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, w towarzystwie innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone. 24 godziny później podać kolejną pojedynczą dawkę karprofenu (5 mg/kg mc., podskórnie) jako środek przeciwbólowy.</li>
		<li>Leczyć ranę miejscową maścią z antybiotykiem przez 5 dni. Jeśli rana jest otwarta, znieczulić zwierzę jak w krokach od 1.1.2 do 1.1.5 i zamknąć ranę jak w 1.3.14. Codziennie monitoruj stan zdrowia zwierzęcia. Poddać zwierzę eutanazji za pomocą śmiertelnej dawki dootrzewnowego wstrzyknięcia lethabarbu (163 mg/kg w igle 0,25 ml na 23 G), jeśli zwierzę wykazuje więcej niż jeden umiarkowany objaw nieprzytomności, słabego apetytu, utraty masy ciała i utraty koloru.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przepływowa komora pedikularna (dwie komory na zwierzę)
<ol>
	<li>Przygotowanie zwierzęcia do operacji
	<ol>
		<li>Powtórz kroki od 1.1.1 do 1.1.4. Dwie komory można wszczepić w obie okolice pachwiny jednego szczura.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja naczyń udowych i wprowadzenie komory
	<ol>
		<li>Powtórz kroki od 1.2.1 do 1.2.8.</li>
		<li>Gdy zarówno tętnica, jak i żyła są całkowicie wolne od otaczających tkanek, a ich gałęzie są podwiązane, przenieś komorę na pole operacyjne.</li>
		<li>Umieść każde z nienaruszonych naczyń udowych na odpowiedniej szczelinie podstawy komory, upewniając się, że nie ma skrętów ani załamań.</li>
		<li>Zamknij komorę, przymocowując pokrywę do podstawy. Zamknij ranę za pomocą ciągłego jedwabnego szwu 4/0 plus dwa lub trzy dodatkowe proste przerywane szwy i pozwól zwierzęciu dojść do siebie, jak opisano wcześniej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zbiór komór i przetwarzanie tkanek
<ol>
	<li>Po osiągnięciu punktów czasowych doświadczenia (4-6 tygodni po implantacji) znieczulij zwierzę jak w kroku 1.1.2 i powtórz kroki od 1.1.3 do 1.1.5.</li>
	<li>Otwórz ranę za pomocą ostrza #15 i przetnij tkanki nożyczkami, aż komora zostanie całkowicie odsłonięta.</li>
	<li>Wystaw naczynia udowe proksymalnie na konstrukcję i przetestuj drożność naczyń: delikatnie zatkaj naczynie dwoma mikrokleszkami, następnie wydoić krew w kierunku dystalnym, a na koniec zwolnij kleszcze proksymalne. Jeśli naczynie ponownie wypełni się krwią, potwierdza to drożność. Podwiązać naczynia udowe proksymalnie w przypadku pętli tętniczo-żylnej oraz zarówno proksymalnie, jak i dystalnie w przypadku konfiguracji przepływowej, a następnie usunąć komory z tkanką zawierającą en bloc.</li>
	<li>Pod koniec eksperymentu należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą śmiertelnej dawki dootrzewnowego wstrzyknięcia lethobarbu (163 mg/kg w igle 0,25 ml na 23 G).</li>
	<li>Utrwalić tkanki w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Podzielić tkanki na wiele przekrojów poprzecznych (o grubości 1-2 mm) i zatopić w wosku parafinowym lub związku o optymalnej temperaturze cięcia odpowiednio dla skrawków parafinowych (5 μm) lub zamrożonych (10 μm). 3,4,8,17,22,24</li>
	<li>Wykonaj rutynowe barwienie histologiczne, takie jak hematoksylina i eozyna, aby zbadać ogólną morfologię tkanek. Wykonaj barwienie immunohistochemiczne specyficznym przeciwciałem w celu zidentyfikowania typu komórki będącej przedmiotem zainteresowania,3,4,8,17,22,24,29, na przykład barwienie immunologiczne troponiny sercowej T dla kardiomiocytów.</li>
</ol>

<ol><li>Spiliopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+mechanical+circulatory+support%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Current status of mechanical circulatory support: A systematic review.</a> Cardiol Res Pract. , 574198(2012).</li>
<li>Hsu, P. L., Parker, J., Egger, C., Autschbach, R., Schmitz-Rode, T., Steinseifer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+circulatory+support+for+right+heart+failure%3A+Current+technology+and+future+outlook%5BTitle%5D)+AND+%22Artif+Organs%22%5BJournal%5D)">Mechanical circulatory support for right heart failure: Current technology and future outlook.</a> Artif Organs. 36 (4), 332-347 (2012).</li>
<li>Lokmic, Z., Stillaert, F., Morrison, W. A., Thompson, E. W., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+arteriovenous+loop+in+a+protected+space+generates+a+permanent%2C+highly+vascular%2C+tissue-engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">An arteriovenous loop in a protected space generates a permanent, highly vascular, tissue-engineered construct.</a> FASEB J. 21 (2), 511-522 (2007).</li>
<li>Morritt, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+engineering+in+an+in+vivo+vascularized+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber.</a> Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).</li>
<li>Tanaka, Y., Tsutsumi, A., Crowe, D. M., Tajima, S., Morrison, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+autologous+tissue+%28matrix%29+flap+by+combining+an+arteriovenous+shunt+loop+with+artificial+skin+in+rats%3A+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22B+J+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Generation of an autologous tissue (matrix) flap by combining an arteriovenous shunt loop with artificial skin in rats: preliminary report.</a> B J Plast Surg. 53 (1), 51-57 (2000).</li>
<li>Cronin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+murine+model+of+spontaneous+autologous+tissue+engineering%2C+combining+an+arteriovenous+pedicle+with+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">New murine model of spontaneous autologous tissue engineering, combining an arteriovenous pedicle with matrix materials.</a> Plast Reconstr Surg. 113 (1), 260-269 (2004).</li>
<li>Forster, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prevascularized+tissue+engineering+chamber+supports+growth+and+function+of+islets+and+progenitor+cells+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">A prevascularized tissue engineering chamber supports growth and function of islets and progenitor cells in diabetic mice.</a> Islets. 3 (5), 271-283 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., Matsuda, K., Dusting, G. J., Morrison, W. A., Dilley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+cardiac+tissue+in+vivo+from+human+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering cardiac tissue in vivo from human adipose-derived stem cells.</a> Biomaterials. 31 (8), 2236-2242 (2010).</li>
<li>Jeyaraj, R., G, N., Kirby, G., Rajadas, J., Mosahebi, A., Seifalian, A. M., Tan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularisation+in+regenerative+therapeutics+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Vascularisation in regenerative therapeutics and surgery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 54, 225-238 (2015).</li>
<li>Dew, L., Macneil, S., Chong, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularization+strategies+for+tissue+engineers%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Vascularization strategies for tissue engineers.</a> Regen Med. 10 (2), 211-224 (2015).</li>
<li>Weigand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+vascularized+bone+tissue-engineered+constructs+in+a+large+animal+model+combining+intrinsic+and+extrinsic+vascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Acceleration of vascularized bone tissue-engineered constructs in a large animal model combining intrinsic and extrinsic vascularization.</a> Tissue Eng Part A. 21 (9-10), 1680-1694 (2015).</li>
<li>Vacanti, J. P., Langer, R., Upton, J., Marler, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+cells+in+matrices+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Transplantation of cells in matrices for tissue regeneration.</a> Adv Drug Deliv Rev. 33 (1-2), 165-182 (1998).</li>
<li>Beahm, E. K., Walton, R. L., Patrick, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+adipose+tissue+construct+development%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Plast+Surg%22%5BJournal%5D)">Progress in adipose tissue construct development.</a> Clin Plast Surg. 30 (4), 547-558 (2003).</li>
<li>Vunjak-Novakovic, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Challenges in cardiac tissue engineering.</a> Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 169-187 (2010).</li>
<li>Garcia, J. R., Garcia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterial-mediated+strategies+targeting+vascularization+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Biomaterial-mediated strategies targeting vascularization for bone repair.</a> Drug Deliv Transl Res. , (2015).</li>
<li>Forster, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+hepatocytic+differentiation+of+liver+progenitor+cells+in+vivo+using+a+vascularized+tissue+engineering+chamber+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Expansion and hepatocytic differentiation of liver progenitor cells in vivo using a vascularized tissue engineering chamber in mice.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17 (3), 359-366 (2011).</li>
<li>Tilkorn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+myoblast+survival+is+dependent+on+the+degree+of+vascularization+in+a+novel+delayed+implantation%2Fprevascularization+tissue+engineering+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Implanted myoblast survival is dependent on the degree of vascularization in a novel delayed implantation/prevascularization tissue engineering model.</a> Tissue Eng Part A. 16 (1), 165-178 (2010).</li>
<li>Chang, Q., Lu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+for+creating+a+large+amount+of+engineered+fat+tissue+with+an+axial+vascular+pedicle+and+a+prefabricated+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Med+hypotheses%22%5BJournal%5D)">A novel strategy for creating a large amount of engineered fat tissue with an axial vascular pedicle and a prefabricated scaffold.</a> Med hypotheses. 79 (2), 267-270 (2012).</li>
<li>Walton, R. L., Beahm, E. K., Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+adipose+formation+in+a+vascularized+engineered+construct%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurg%22%5BJournal%5D)">De novo adipose formation in a vascularized engineered construct.</a> Microsurg. 24 (5), 378-384 (2004).</li>
<li>Debels, H., Gerrand, Y. W., Poon, C. J., Abberton, K. M., Morrison, W. A., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adipogenic+gel+for+surgical+reconstruction+of+the+subcutaneous+fat+layer+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">An adipogenic gel for surgical reconstruction of the subcutaneous fat layer in a rat model.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2015).</li>
<li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Engineering the microcirculation.</a> Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 87-103 (2008).</li>
<li>Yap, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+liver+progenitor+cell+survival+and+differentiation+in+vivo+by+spheroid+implantation+in+a+vascularized+tissue+engineering+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced liver progenitor cell survival and differentiation in vivo by spheroid implantation in a vascularized tissue engineering chamber.</a> Biomaterials. 34 (16), 3992-4001 (2013).</li>
<li>Findlay, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+breast+reconstruction%3A+Bridging+the+gap+toward+large-volume+tissue+engineering+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered breast reconstruction: Bridging the gap toward large-volume tissue engineering in humans.</a> Plast Reconstr Surg. 128 (6), 1206-1215 (2011).</li>
<li>Tee, R., Morrison, W. A., Dusting, G. J., Liu, G. S., Choi, Y. S., Hsiao, S. T., Dilley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+engineered+cardiac+muscle+flaps+in+syngeneic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats.</a> Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 1992-1999 (2012).</li>
<li>Dolderer, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+of+adipose+tissue+generated+from+a+vascularized+pedicled+fat+flap+inside+a+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Long-term stability of adipose tissue generated from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber.</a> Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2283-2292 (2011).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+coculture+within+tissue-engineered+cardiomyocyte+sheets+enhances+neovascularization+and+improves+cardiac+function+of+ischemic+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell coculture within tissue-engineered cardiomyocyte sheets enhances neovascularization and improves cardiac function of ischemic hearts.</a> Circulation. 118, (14 Suppl) 145-152 (2008).</li>
<li>Ting, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipogenic+potential+of+various+extracellular+matrices+under+the+influence+of+an+angiogenic+growth+factor+combination+in+a+mouse+tissue+engineering+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The adipogenic potential of various extracellular matrices under the influence of an angiogenic growth factor combination in a mouse tissue engineering chamber.</a> Acta Biomater. 10 (5), 1907-1918 (2014).</li>
<li>Zhan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-synthesized+extracellular+matrix+contributes+to+mature+adipose+tissue+regeneration+in+a+tissue+engineering+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">Self-synthesized extracellular matrix contributes to mature adipose tissue regeneration in a tissue engineering chamber.</a> Wound Repair Regen. 23 (3), 443-452 (2015).</li>
<li>Messina, A., Bortolotto, S. K., Cassell, O. C., Kelly, J., Abberton, K. M., Morrison, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+vascularized+organoid+using+skeletal+muscle+as+the+inductive+source%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Generation of a vascularized organoid using skeletal muscle as the inductive source.</a> FASEB J. 19 (11), 1570-1572 (2005).</li>
<li>Lim, S. Y., Hernández, D., Dusting, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+vascularized+heart+tissue+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Growing vascularized heart tissue from stem cells.</a> J Cardiovasc Pharmacol. 62 (2), 122-129 (2013).</li>
<li>Poon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+an+adipogenic+hydrogel+from+subcutaneous+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Preparation of an adipogenic hydrogel from subcutaneous adipose tissue.</a> Acta Biomater. 9 (3), 5609-5620 (2013).</li>
<li>Dilley, R. J., Morrison, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularisation+to+improve+translational+potential+of+tissue+engineering+systems+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vascularisation to improve translational potential of tissue engineering systems for cardiac repair.</a> Int J Biochem Cell Biol. 56, 38-46 (2014).</li>
<li>Lesman, A., Koffler, J., Atlas, R., Blinder, Y. J., Kam, Z., Levenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vessel-like+networks+within+multicellular+fibrin-based+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs.</a> Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).</li>
<li>Hussey, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+pancreatic+islets+into+prevascularized+tissue+engineering+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Seeding of pancreatic islets into prevascularized tissue engineering chambers.</a> Tissue Eng Part A. 15 (12), 3823-3833 (2009).</li>
<li>Chen, X., Aledia, A. S., Popson, S. A., Him, L., Hughes, C. C., George, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+anastomosis+of+endothelial+progenitor+cell-derived+vessels+with+host+vasculature+is+promoted+by+a+high+density+of+cotransplanted+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Rapid anastomosis of endothelial progenitor cell-derived vessels with host vasculature is promoted by a high density of cotransplanted fibroblasts.</a> Tissue Eng Part A. 16 (2), 585-594 (2010).</li>
<li>Lin, R. Z., Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+facilitates+rapid+anastomosis+formation+between+bioengineered+human+vascular+networks+and+living+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 facilitates rapid anastomosis formation between bioengineered human vascular networks and living vasculature.</a> Methods. 56 (3), 440-451 (2012).</li>
<li>Dolderer, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+large+volume+adipose+tissue+generation+from+a+vascularized+pedicled+fat+flap+inside+a+chamber+space%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Spontaneous large volume adipose tissue generation from a vascularized pedicled fat flap inside a chamber space.</a> Tissue Eng. 13 (4), 673-681 (2007).</li>
<li>Wei, F. C., Lin Tay, S. K. Principles and techniques of microvascular surgery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWei%2C+FC+%22Plastic+Surgery.+Volume+1%22">Plastic Surgery. Volume 1</a>. Neligan, P. C., Gurtner, G. C. , Elsevier. Chapter 26 587-620 (2013).</li>
<li>Sekine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fabrication+of+functional+three-dimensional+tissues+with+perfusable+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Comm%22%5BJournal%5D)">In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels.</a> Nat.Comm. 4 (1399), 1-10 (2013).</li>
<li>Lim, S. Y., Sivakumaran, P., Crombie, D. E., Dusting, G. J., Pébay, A., Dilley, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichostatin+A+enhances+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiogenic+cells+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Trichostatin A enhances differentiation of human induced pluripotent stem cells to cardiogenic cells for cardiac tissue engineering.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (9), 715-725 (2013).</li>
<li>Lim, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tissue+engineering+chamber+supports+human+induced+pluripotent+stem+cell+survival+and+rapid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In vivo tissue engineering chamber supports human induced pluripotent stem cell survival and rapid differentiation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 422 (1), 75-79 (2012).</li>
<li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3 (7), 787-791 (2014).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Inżynieria mikrokrążenia jest obecnie badana zasadniczo za pomocą dwóch podejść. Pierwszy z nich polega na opracowaniu wysoce połączonej sieci naczyniowej w obrębie konstruktu in vitro , tak aby po wszczepieniu naczynia włosowate z łożyska naczyniowego gospodarza łączyły się z naczyniami przeszczepionego konstruktu w procesie zwanym inoskkulacją, zapewniając w ten sposób dostarczanie składników odżywczych nie tylko na obrzeża, ale także do rdzenia. 21,32,33 Nazywa się to prewaskularyzacją. Drugie pode...

Wytwarzanie funkcjonalnej unaczynionej tkanki za pomocą podejścia inżynierii tkankowej to nowy paradygmat w medycynie regeneracyjnej. 1,2 Opracowano wiele podejść do inżynierii nowych i zdrowych tkanek w celu zastąpienia uszkodzonej tkanki lub wadliwych narządów,3-6 eksperymentalnie na małych modelach zwierzęcych o obiecującym potencjale klinicznym. 7,8 Jednak unaczynienie pozostaje jednym z największych wyzwań dla inżynierii tkankowej, ograniczając jej potencjał do wzrostu tkanek o klinicznie istotnych rozmiarach. 9
Obecne podejścia do unaczynienia tkanki podążają albo ścieżką zewnętrzną, gdzie nowe naczynia wyrastają z łożyska naczyniowego odbiorcy i atakują przez wszczepione tkanki, konstrukty10, albo wewnętrzną ścieżką unaczynienia, gdzie układ naczyniowy rośnie i rozszerza się wraz z nowo rozwijającą się tkanką. 11 Podejście zewnętrzne tradycyjnie polega na wysiewaniu komórek na rusztowaniu in vitro i wszczepianiu kompletnego konstruktu żywemu zwierzęciu w oczekiwaniu, że składniki odżywcze, wcześniej dostarczane przez pożywki hodowlane, będą pochodzić z krążenia. 12,13 Koncepcja jest uproszczona, ponieważ wrastanie naczyń jest zbyt wolne i tylko bardzo cienkie implanty (<1-2 mm grubości) pozostaną żywotne. Dostarczanie składników odżywczych i tlenu poprzez wystarczające i szybkie unaczynienie jest podstawą wszelkich udanych prób wyhodowania bardziej złożonych i większych substytutów inżynierii tkankowej, takich jak kości, mięśnie, tłuszcz i narządy stałe. 14,15 Unaczynienie wewnętrzne stwarza możliwość rozwoju większych konstruktów poprzez postępujący wzrost tkanki współmierny do jej rozszerzającego się dopływu krwi. Jednym z nich jest implantacja in vivo do komory szypułki naczyniowej z rusztowaniem wysiewanym komórkami lub bez niego. 5,6 Utorowało to drogę do nowych procedur generowania grubszych, wewnętrznie unaczynionych tkanek. Pytania z dnia 16,17 na dzień
Ostatnio opracowano strategie wstępnego unaczyniania przeszczepów tkanek przed implantacją. Te włączone sieci naczyń krwionośnych mają na celu inokulację naczyń gospodarza podczas implantacji, co pozwala na szybkie zapewnienie pełnego dopływu krwi w celu poprawy przeżywalności wszystkich części przeszczepionego grubego przeszczepu tkankowego. Rozdział 18
Byliśmy pionierami w modelu inżynierii tkankowej in vivo unaczynionej u małych zwierząt, która obejmuje podskórnie wszczepioną półsztywną, zamkniętą komorę zawierającą perfundowaną szypułkę naczyniową i biomateriały zawierające komórki. Komora tworzy środowisko niedokrwienne, które stymuluje angiogenne kiełkowanie z wszczepionych naczyń. 3 Szypułka naczyniowa może być zrekonstruowaną pętlą tętniczo-żylną lub nienaruszoną tętnicą i żyłą przepływową. 3-6,19 Ta szypułka naczyniowa wyrasta funkcjonalna i rozległa sieć tętniczo-kapilarno-żylna, która łączy się zarówno na tętniczce, jak i na końcach żylnych z szypułką naczyniową. 3,20 Ponadto otaczająca pusta komora nośna chroni rozwijającą się tkankę przed potencjalnie deformującymi siłami mechanicznymi i przedłuża popęd niedokrwienny, zwiększając unaczynienie. 3,21,22 Jeśli szypułka naczynia zostanie po prostu wszczepiona w normalną tkankę, a nie w chronionej przestrzeni komory, kiełkowanie angiogenne ustaje w tym samym czasie, co normalna rana i wokół szypułki nie gromadzi się żadna nowa tkanka. Badacze wykorzystali tę konfigurację in vivo do wytworzenia trójwymiarowych, funkcjonalnych, unaczynionych konstruktów tkankowych z podporą unaczynienia i o klinicznie istotnych rozmiarach. 4,23 pkt.Co więcej, zmodyfikowane unaczynione konstrukcje tkankowe z nienaruszoną szypułką naczyniową mogą być pobierane w celu późniejszego przeszczepu w miejscu urazu. 24,25 Bardziej wykonalnym klinicznie scenariuszem byłoby stworzenie komory w docelowym miejscu do rekonstrukcji, takim jak pierś. W związku z tym to podejście oparte na inżynierii tkankowej de novo może mieć potencjał kliniczny, aby zapewnić nowe źródło funkcjonalnej tkanki docelowej dla chirurgii rekonstrukcyjnej. 26-28 Rozdział 26-28 
Poniższy protokół dostarczy ogólnego przewodnika do budowy in vivo unaczynionej komory inżynierii tkankowej u szczura, która może być zaadaptowana w różnych modelach zwierzęcych i wykorzystana do zbadania skomplikowanych procesów angiogenezy, produkcji macierzy oraz migracji i różnicowania komórek.

<table><tbody><tr><td>1 skalpel z ostrzem 15</td><td>Braun</td><td>BB515</td><td></td></tr><tr><td>1 pęseta Adsona z ząbkami</td><td>Braun</td><td>BD527R</td><td></td></tr><tr><td>1 igłotrzymacz</td><td>Braun</td><td>BM201R</td><td></td></tr><tr><td>1 koagulator bipolarny&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>US335</td><td></td></tr><tr><td>1 mikroigłotrzymacz B-15-8.3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00763</td><td></td></tr><tr><td>1 mikropęseta rozszerzająca D-5a.2</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00125</td><td></td></tr><tr><td>1 mikropęseta jubilerska JF-5</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00108</td><td></td></tr><tr><td>1 mikronożyczki proste SAS-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00098</td><td></td></tr><tr><td>1 mikronożyczki zakrzywione SDC-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00090</td><td></td></tr><tr><td>2 klamry pojedyncze B-3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00400</td><td></td></tr><tr><td>2 nici nylonowe 10/0</td><td>S &amp;amp; T</td><td>03199</td><td></td></tr><tr><td>1 nić nylonowa 6/0</td><td>Braun</td><td>G2095469</td><td></td></tr><tr><td>2 nici jedwabne 4/0</td><td>Braun</td><td>C0760145</td><td></td></tr><tr><td>Ksylokaina 1%</td><td>Dealmed</td><td>150733</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Dealmed</td><td>272301</td><td>5,000 UI/ml</td></tr><tr><td>Mleczan Ringera</td><td>Baxter</td><td>JB2323</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>1 kopułkowa komora do inżynierii tkankowej</td><td>wykonanie własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 komora przepływowa</td><td>wykonanie własne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lektyna I, Griffonia Simplicifolia&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1105</td><td>1.67 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw troponinie T</td><td>Abcam</td><td>Ab8295</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało specyficzne dla ludzkiego Ku80</td><td>Abcam</td><td>Ab80592</td><td>0.06 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw desminie</td><td>Dako</td><td>M0760</td><td>2.55 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Barwnik Cell Tracker CM-DiI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-7000</td><td>3 mg/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; komórek</td></tr><tr><td>Lethabarb (pentobarbital sodu)</td><td><a href="www.virbac.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Virbac Animal Health</a></td><td>LETHA450</td><td>325 mg/ml</td></tr><tr><td>Elastyczna mata grzewcza</td><td><a href="http://www.redzoneheating.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Redzone Heating</a></td><td>RZ/Medium</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

W chirurgii rekonstrukcyjnej istnieje kliniczna potrzeba alternatywy dla obecnych metod rekonstrukcji autologicznej, które są skomplikowane, kosztowne i wymieniają jedną wadę na drugą. Inżynieria tkankowa daje nadzieję na zaspokojenie tego rosnącego zapotrzebowania. Jednak większość strategii inżynierii tkankowej nie jest w stanie wygenerować stabilnych i funkcjonalnych substytutów tkanek z powodu słabego unaczynienia. W artykule skoncentrowano się na modelu wewnętrznego unaczynienia w komorze inżynierii tkankowej in vivo, w którym perfundowana tętnica i żyła, jako pętla tętniczo-żylna lub konfiguracja przeszypułkowa przepływowa, jest kierowana do chronionej pustej komory. W tym systemie komorowym dochodzi do angiogennego kiełkowania z naczyń tętniczo-żylnych, a układ ten przyciąga endogenną migrację komórek napędzaną niedokrwieniem i stanem zapalnym, która stopniowo wypełnia przestrzeń komory tkanką włóknisto-naczyniową. Egzogenna implantacja komórki/macierzy w momencie budowy komory zwiększa przeżywalność komórek i określa specyficzność tworzonych tkanek. Nasze badania wykazały, że ten model komory może z powodzeniem generować różne tkanki, takie jak tłuszcz, mięsień sercowy, wątroba i inne. Konieczne są jednak modyfikacje i udoskonalenia, aby zapewnić spójne i powtarzalne tworzenie tkanki docelowej. W tym artykule opisano znormalizowany protokół wytwarzania dwóch różnych unaczynionych modeli komór inżynierii tkankowej in vivo.

Mikrochirurgiczne tworzenie komór inżynierii tkankowej przeprowadzono zgodnie z opisem w powyższym protokole. Tkanki wytworzone wewnątrz komór można zbadać histologicznie, jak opisano w kroku 3 protokołu. Za pomocą unaczynionej komory in vivo pomyślnie stworzono różne rodzaje tkanek (Rysunek 2). Obejmują one tkankę serca z kardiomiocytami noworodka szczura (Rysunek 2A), tkankę mięśniową z mioblastami szkieletowymi szczura (Rysunek 2B</str...

To jest wytyczne do konstruowania in vivo unaczynionej tkanki za pomocą mikrochirurgicznej pętli tętniczo-żylnej lub przepływowej konfiguracji szypułki wewnątrz komory inżynierii tkankowej. Powstałe unaczynione tkanki mogą być wykorzystane do regeneracji narządów i wymiany ubytków tkanek, a także do testowania leków i modelowania chorób.

Inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie przestrzeni, w której tkanka może rosnąć i rozszerzać się równolegle z rozwojem silnego ukrwienia, co ostatecznie prowadzi do wytworzenia unaczynionego, dużego, trójwymiarowego bloku tkanki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące inżynierii unaczynionych tkanek do celów rekonstrukcyjnych, a także do wymiany i naprawy narządów. Główną zaletą tej techniki jest to, że nowo powstała tkanka jest w sposób naturalny zaopatrywana przez własną sieć naczyniową, bez konieczności polegania na dyfuzji z otoczenia w celu przetrwania.Procedurę zaprezentują Sue McKay i Liliana Pepe. Zanurz szczura o masie co najmniej 250 g w anestezji i oceń głębokość znieczulenia, wykonując ucisk palca u nogi. Jeśli szczur nie reaguje, utrzymuj sedację przy użyciu 2% isofluranu przez cały czas trwania procedury.Następnie na oczy nanieś maść Epsomową. Potem, ułożone na plecach szczura, użyj trymerek elektrycznych, aby ogolić pachwiny, a następnie usuń włosy za pomocą zwilżonej gazy. Następnie oczyść miejsca operacyjne roztworem chlorheksydyny zawierającym 70% etanolu.Na koniec przykryj zwierzę jałowymi ręcznikami i przystąp do operacji. Używając ostrza nr 15, wykonaj nacięcie skóry o długości czterech centymetrów w lewym pachwinie, równolegle do więzadła pachwinowego. Następnie nożyczkami przetnij obwodowo odsłoniętą tkankę tłuszczową pachwiny, pozostawiając ją przytwierdzoną do szypuły naczyniowej zbudowanej z naczyń nadbrzusznych.Następnie, za pomocą mikronożyczek, uwolnić błoniaste zrosty tkanki łącznej między ścianą brzucha a leżącymi pod nią naczyniami udowymi. Potem umieścić retraktor na ścianie brzucha i odciągnąć ją w kierunku przyśrodkowym, aby odsłonić więzadło pachwinowe oraz całą długość naczyń udowych. W dalszej kolejności, używając mikropincety i zakrzywionych nożyczek, wypreparować żyłę nadbrzuszną i odizolować ją od otaczającej tkanki tłuszczowej.Żyła ta będzie pełnić funkcję uwiązania. Następnie należy otworzyć pochewkę naczyniowo-nerwową zawierającą naczynia udowe oraz nerw. Otwórz ją na całej długości, od więzadła pachwinowego aż do miejsca rozwidlenia dystalnie względem odgałęzienia epigastrycznego.Na tym etapie, jak i w trakcie całej procedury, kluczowe jest delikatne obchodzenie się z naczyniami udowymi. Ich uszkodzenie może doprowadzić do zakrzepicy i niepowodzenia całego eksperymentu. Następnie, używając mikropincety, chwyć żyłę udową za błonę zewnętrzną i ostrożnie oddziel ją od otaczających tkanek oraz towarzyszącej jej tętnicy.Podczas tego kroku nie należy chwytać całej grubości ściany żyły, ponieważ mogłoby to spowodować uraz błony wewnętrznej, zwiększając tym samym skłonność żyły do zakrzepicy. W tym samym kroku należy podwiązać odgałęzienia boczne nicią nylonową 10-0 lub koagulować je za pomocą koagulatora bipolarnego. Po całkowitym uwolnieniu żyły udowej, należy podwiązać ją proksymalnie i dystalnie jedwabnymi nićmi 4-0, aby uzyskać przeszczep żylny o długości co najmniej 10 mm, obejmujący około pół centymetra długości gałęzi nadbrzusznej.Gałązka pełni funkcję linki napinającej, która utrzymuje pętlę w otwartej pozycji w komorze. Następnie należy usunąć błonę zewnętrzną z końców przeszczepu. W razie potrzeby ten etap można przełożyć na czas przed wykonaniem mikrochirurgicznych anastomoz.Zakończ przygotowanie przeszczepu żylnego, przemywając go roztworem soli fizjologicznej z heparyną i pozostawiając do odpoczynku wypełnionym tym roztworem. Następnie zamknij ranę, stosując ciągły szew jedwabny 4-0 oraz dwa lub trzy dodatkowe proste szwy przerywane. Aby rozpocząć, odsłoń więzadło pachwinowe oraz cały odcinek naczyń udowych kończyny przeciwstawnej, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Następnie, używając mikro-pincety, wypreparować i wyizolować tętnicę oraz żyłę nadbrzuszną z otaczającej tkanki tłuszczowej. Należy zachować ostrożność podczas odsuwania tkanki od naczyń. Kontynuować, chwytając tętnicę udową za błonę zewnętrzną i uwalniając ją z otaczających tkanek.W tym procesie należy podwiązać lub koagulować boczne odgałęzienia tętnicy. Następnie należy założyć zacisk proksymalnie zarówno na tętnicę, jak i żyłę udową. Teraz, używając nici jedwabnej 4-0, należy podwiązać tętnicę i żyłę udową dystalnie względem ujścia naczyń nadbrzusznych.Następnie umieść sterylne plastikowe tło kontrastowe pod naczyniami i za pomocą ostrych, prostych mikronożyczek przetnij każde naczynie w poprzek. Po przecięciu energicznie wypłucz naczynia dużymi ilościami soli fizjologicznej z heparyną, aż do całkowitego usunięcia krwi z światła naczyń. Teraz wprowadź przeszczep żylny do pola operacyjnego.Ustaw przeszczep żylny w taki sposób, aby koniec proksymalny był przygotowany do anastomozy z żyłą udową biorcy, a koniec dystalny z tętnicą udową biorcy. Pozwoli to na przepływ krwi ze strony tętniczej do żylnej bez oporu ze strony zastawek znajdujących się wewnątrz przeszczepu żylnego. Upewnij się, że naczynia udowe i przeszczep żylny spoczywają w swojej naturalnej pozycji, bez żadnych skręceń.Używając nici nylonowej 10-0, wykonaj anastomozę chirurgiczną po obu stronach. Kluczem jest prawidłowe i atraumatyczne wykonanie mikrochirurgicznej anastomozy. Uszkodzenie błony wewnętrznej naczynia, wysuszenie naczyń lub nieprawidłowo położone szwy sprawiają, że miejsce anastomozy staje się podatne na tworzenie się zakrzepów.Następnie należy sprawdzić, czy nie występują nieszczelności w obu miejscach anastomozy. Małe nieszczelności, objawiające się niepulsacyjnym wyciekiem krwi z miejsca anastomozy, należy usunąć, przykładając niewielki kawałek tkanki tłuszczowej lub gąbkę i delikatnie uciskając przez 5 do 10 minut. Większe, pulsujące wycieki, które szybko zalewają całe pole operacyjne, będą wymagały dodatkowych szwów.Następnie należy sprawdzić drożność pętli tętniczo-żylnej. Delikatne zamknięcie tętnicy udowej powinno spowodować jej obkurczenie. I odwrotnie, zamknięcie żyły udowej powinno doprowadzić do przekrwienia pętli.Teraz umieść podstawę komory do inżynierii tkankowej pod pętlą tętniczo-żylną. Upewnij się, że pętla spoczywa w naturalnej pozycji, bez żadnych skręceń ani załamań. Następnie, używając szwów nylonowych 6-0, przymocuj podstawę komory do więzadła pachwinowego i leżącej pod nim powięzi mięśniowej.Następnie nałóż pokrywę na podstawę komory. Przyciśnij gałęzie nadrzebrowe pod pokrywą, aby utrzymać pętlę w odpowiedniej pozycji. Następnie zamknij ranę, stosując ciągły szew jedwabny 4-0 oraz dwa lub trzy dodatkowe proste szwy przerywane.Na koniec należy pozwolić zwierzęciu wybudzić się z narkozy w oddzielnej klatce i podać jednorazową dawkę karprofenu podskórnie jako środek przeciwbólowy. Przygotować zwierzę do zabiegu w taki sam sposób jak poprzednio. W jednym szczurze można zaimplantować dwie komory, po jednej w każdym pachwinie.Następnie wyizoluj naczynie udowe zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Po całkowitym uwolnieniu tętnicy i żyły z otaczających tkanek oraz podwiązaniu ich odgałęzień, wprowadź komorę do pola operacyjnego. Następnie umieść każde z nienaruszonych naczyń udowych w odpowiednich szczelinach podstawy komory.Upewnij się, że żadna z nich nie jest skręcona ani załamana. Następnie zamknij komorę, mocując pokrywę do podstawy. Następnie zamknij ranę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie, zgodnie z wcześniejszym opisem.Mikrochirurgiczne tworzenie komór do inżynierii tkankowej przeprowadzono zgodnie z opisem. Różne rodzaje tkanek zostały pomyślnie wytworzone przy użyciu unaczynionej komory in vivo, w tym tkanka serca z kardiomiocytami szczura noworodkowego, tkanka mięśniowa z mioblastami szkieletowymi szczura oraz tkanka tłuszczowa z hydrogelem pochodzącym z macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki tłuszczowej. System stereologiczny umożliwia obiektywną kwantyfikację objętości konkretnych tkanek.Na przykład do szacowania objętości naczyniowych wykorzystano komórki śródbłonka barwione lektynami w przekrojach poprzecznych. Po implantacji in vivo komórek znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi można śledzić ich losy. Na przykład kardiomiocyty noworodka szczura znakowane barwnikiem i wykryto w konstruktach tkankowych trzy dni po implantacji.Alternatywnie, w badaniach nad ksenotransplantacją można wykorzystać przeciwciała specyficzne dla gatunku do identyfikacji wszczepionych komórek. Na przykład, ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste wszczepione szczurom z niedoborem odporności mogłyby zostać zidentyfikowane w tkance pobranej z komory. Po opanowaniu techniki, implantacja komory przepływowej oraz pętli tętniczo-żylnej zajmuje odpowiednio około 20 i 90 minut.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie sterylności przez cały czas oraz podjęcie niezbędnych środków w przypadku wystąpienia kontaminacji. Należy pamiętać, że delikatne obchodzenie się z naczyniami krwionośnymi oraz atraumatyczna anastomoza mikrochirurgiczna są kluczowe dla zapewnienia sukcesu. W związku z tym zalecamy podstawowe przeszkolenie z zakresu mikrochirurgii przed przystąpieniem do tej procedury, w szczególności w zakresie konstruowania pętli tętniczo-żylnej.

tissue-engineering-intrinsic-vascularization-an-vivo-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nasz zespół opracował system hodowli w bioreaktorze, który naśladuje fizjologiczne naprężenia pulsacyjne układu sercowo-naczyniowego w celu regeneracji wszczepialnych zastążek naczyniowych o małej średnicy.

Projektowanie biologicznych przeszczepów naczyniowych z wykorzystaniem bioreaktora pulsacyjnego

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Opisano metody tworzenia ludzkich tkanek nowotworowych 3D jako systemów testowych. Technologie te opierają się na bezkomórkowym biologicznym rusztowaniu unaczynionym (BioVaSc), pierwotnych komórkach ludzkich i linii komórek nowotworowych, które mogą być hodowane zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych w bioreaktorze przepływowym.

Inżynieria tkankowa ludzkiego systemu badań 3D nowotworów in vitro

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Protokół krok po kroku do międzypozycyjnego umieszczania naczyń TEV (Tissue Engineered Departments) w tętnicy szyjnej owcy za pomocą zespolenia end-to-end i cyfrowej oceny w czasie rzeczywistym in vivo, aż do uśmiercenia zwierzęcia.

Technika chirurgiczna implantacji przeszczepów naczyniowych wykorzystujących inżynierię tkankową, a następnie monitorowanie in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Opisujemy mikrochirurgiczne podejście do generowania pętli tętniczo-żylnej (AV) jako model do analizy unaczynienia in vivo w izolowanym i dobrze scharakteryzowanym środowisku. Model ten jest nie tylko przydatny do badania angiogenezy, ale jest również optymalnie przystosowany do inżynierii osiowo unaczynionych i przeszczepialnych tkanek.

Pętla tętniczo-żylna (AV) w małym modelu zwierzęcym do badania angiogenezy i inżynierii tkanek unaczynionych

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Ten protokół przedstawia fizjologicznie istotny model guza na chipie do przeprowadzenia wysokoprzepustowych podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem u ludzi, postępu w badaniach przesiewowych leków, modelowania chorób i spersonalizowanych podejść medycznych z opisem procedur ładowania, konserwacji i oceny.

Ustanowienie fizjologicznego unaczynionego modelu mikroguza człowieka do badań nad rakiem

Poznaj metodę inżynierii tkankowej z wewnętrznym unaczynieniem w komorze in vivo. Technika ta umożliwia generowanie dużych, trójwymiarowych bloków tkanki z własną siecią naczyniową.

Inżynieria tkankowa poprzez wewnętrzne unaczynienie w komorze inżynierii tkankowej in vivo

Przeglądaj więcej filmów