Name: Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj szybką strategię izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis. Ta metoda wykorzystuje floss-cytometrię do szybszej i bardziej wrażliwej detekcji lizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Pobieranie próbek
<ol>
	<li>Zbierz 70 próbek z różnych środowisk i regionów. W tym przypadku należy użyć: 5 próbek brudnej wody z miejscowości Saint Pierre de Meyzoargues (Francja), 15 próbek z jeziora w Parc Borély w Marsylii (Francja); 15 próbek wody morskiej z osadami ze skalistych zatoczek w Samena w Marsylii (Francja), 25 próbek wody rzecznej z Alp (Francja) i wreszcie 10 próbek ścieków w La Ciotat (Francja).</li>
	<li>Wirować próbki do homogenizacji przed inokulacją, przez jedną minutę w temperaturze pokojowej bez żadnej obróbki.</li>
</ol>
2. Procedura izolacji
<ol>
	<li>Przygotowanie żywiciela do procedur ślepej hodowli i inokulacji próbki
	<ol>
		<li>Użyj V. vermiformis (szczep CDC19) jako podpory komórkowej dla kokultury.</li>
		<li>Utrzymać amebę w temperaturze 28 °C w kolbie do hodowli komórkowych o długości 75cm2 z 30 ml pożywki glukozowej (PYG) z ekstraktem z proteazy-peptonu-drożdży. Proszę sprawdzić skład PYG w tabeli 1. 
		Uwaga: Po 48 godzinach ameby są oznaczane ilościowo za pomocą normalnego liczenia za pomocą szkiełek zliczających (np. Kovaslides).</li>
		<li>Zebrać komórki o stężeniu 5 x 105 do 106 komórek/ml i granulować ameby przez odwirowanie przy 720 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant przez aspirację i ponownie zawiesić osad ameby w 30 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej Page'a (PAS) Tabela 1. Powtórz tę procedurę płukania.</li>
		<li>Zawiesić ameby w 30 ml pożywki głodowej za pomocą mieszaniny antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych o stężeniu około10-6 ameby/ml. Pożywka głodowa jest pożywką przetrwania dla ameby, umożliwiając jej pozostanie przy życiu bez otorbienia lub namnażania. Sprawdź skład w tabeli 1. 
		Uwaga: Mieszanina środków przeciwdrobnoustrojowych zawierała 10 μg/ml wankomycyny, 10 μg/ml imipenemu, 20 μg/ml cyprofloksacyny, 20 μg/ml doksycykliny i 20 μg/ml worykonazolu. Mieszanka ta służyła do zmniejszenia zanieczyszczenia bakteryjnego i grzybiczego, które może zmniejszać lub zmieniać namnażanie się wirusa.</li>
		<li>Bezpośrednio zaszczepić 25 μl każdej próbki na 200 μl monowarstwy ameby w 96-dołkowej płaskiej płytce, sprzyjającej przyleganiu ameby i inkubować w temperaturze 30 °C w wilgotnym środowisku (wilgotne środowisko polega na umieszczeniu mokrego kompresu wewnątrz worka zawierającego płytkę w celu uniknięcia parowania). To jest pierwotna kultura. Pozostaw dwie studzienki ameb bez zaszczepiania próbki; Działa to jak kontrola negatywna. Inkubuj tę pierwotną kulturę przez trzy dni.</li>
		<li>Trzy dni po pierwszym zaszczepieniu należy przeprowadzić subhodowlę na płytce pierwotnej na świeżych amebach, jak opisano powyżej, bez żadnej obserwacji mikroskopowej. Inkubuj nową płytkę przez trzy dni w tych samych warunkach, co pierwotna kultura.</li>
		<li>Wykonaj końcową hodowlę po tych trzech dniach inkubacji w taki sam sposób, jak w przypadku primo- i subkultury. Inkubuj końcową kulturę przez dwa dni. Następnie przejdź do wykrywania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie lizy za pomocą automatycznej cytometrii przepływowej 
	Uwaga: Posiew ślepej próby w połączeniu z cytometrią przepływową różni się od poprzedniego standardowego systemu izolacji. Jest bardziej czuły, precyzyjny i zautomatyzowany. Do celów detekcji zastosowaliśmy nową technikę opracowaną w celu wykrywania lizy z najwyższą prędkością i bez obserwacji mikroskopowej. Technika ta jest korzystna w przypadku badań przesiewowych próbek i ma lepszą czułość niż starsze techniki. 7-9
	<ol>
		<li>Użyj 96-dołkowej płytki końcowej kokultury, aby wykryć lizę.</li>
		<li>Włącz cytometr i uruchom cykl czyszczenia i płukania, aby uzyskać niższy szum tła zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Uruchom próbnik o wysokiej przepustowości (HTS) w połączeniu z cytometrem przepływowym, aby automatycznie załadować próbki z płytki 96-dołkowej i przeprowadzić całkowicie automatyczną akwizycję w ciągu 40 minut, zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Ustaw HTS w następujący sposób: objętość próbki 150 μl, objętość mieszania 50 μl, prędkość mieszania 180, liczba mieszanek 5, objętość płukania między każdą próbką 400 μl, natężenie przepływu 2,5 μl/s, liczba zarejestrowanych zdarzeń 10 000.</li>
		<li>Najpierw należy ocenić studzienki kontroli ujemnej końcowej mikropłytki z kokultury, aby zabramować populację ameb i określić procent tych gospodarzy komórkowych zgodnie z ich cechami fizycznymi. Upewnij się, że masz jednorodną populację ameb i drugą populację o niższym poziomie zdarzeń odpowiadających szczątkom i hałasowi. 
		Uwaga: Ta procedura bramkowania rozróżnia subkomórkowe szczątki i grudki od pojedynczych komórek według wielkości, oszacowanej na podstawie rozproszenia do przodu. Dlatego ważne jest, aby dokładnie określić odsetek każdej populacji przy użyciu najlepszej możliwej procedury bramkowania. Te wartości procentowe mogą się różnić, zwłaszcza jeśli wykorzystuje się wiele rodzajów pierwotniaków, dlatego ważne jest, aby zawsze mieć kontrolę ujemną, którą można wykorzystać jako populację referencyjną dla pozostałych próbek.</li>
		<li>Rozpocznij bramkowanie, klikając pozycję Pobierz próbkę.</li>
		<li>Rejestruj liczbę zdarzeń nie mniejszą niż 10 000 zdarzeń.</li>
		<li>Zlokalizuj interesującą populację ameb za pomocą strzałki. W ten sposób należy zdefiniować bramki.</li>
		<li>Po bramkowaniu pozwól HTS dostrzec lub zlokalizować płytę, klikając "Home", a następnie uruchom całą płytę automatycznie. Przeprowadzaj akwizycję i analizę danych zgodnie z parametrami wielkości i struktury (odpowiednio FSC (rozproszenie do przodu) i SSC (rozproszenie boczne). 
		Uwaga: Wykrycie utraty populacji bramkowanej amebą sygnalizuje obecność czynnika chorobotwórczego odpowiedzialnego za lizę ameby. Liza pierwotniaków związana z zakażeniem wirusem jest wykrywana za pomocą arbitralnie zaprojektowanego progu 50% lizy populacji ameb bramkowanego przez analizator i porównywanego z tą samą populacją niezakażoną, którą stosuje się jako wiarygodną kontrolę negatywną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Charakterystyka nowych izolatów po wykryciu lizy
<ol>
	<li>Wstępne barwienie w celu ujawnienia obecności gigantycznych wirusów
	<ol>
		<li>Po wykryciu lizy za pomocą cytometrii przepływowej należy pipetować zlizowane kokultury, aby zawiesić pozostałe ameby. Następnie bezpośrednio cytowirować 50 μl zawiesiny o stężeniu 800 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Po odwirowaniu zamocuj szkiełka czystym roztworem metanolu. Wybarwić szkiełka za pomocą komercyjnego szybkiego barwienia Eozyny/niebieskiego Azura i barwienia DAPI i obserwować pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 1000x w celu sprawdzenia obecności fabryk wirusów.
		<ol>
			<li>W celu szybkiego barwienia zanurzyć szkiełka w pierwszym roztworze eozyny (4 sekundy powtórzone trzy razy), a następnie przejść bezpośrednio, aby zanurzyć szkiełka w drugim roztworze utrwalającym zawierającym niebieskie Azur na 6 sekund, a na koniec płukać szkiełka przez 45 sekund roztworem buforu fosforanowego o pH 7,2. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, a następnie przystąp do obserwacji.</li>
			<li>W przypadku barwienia DAPI nanieść 15 μl komercyjnego roztworu podstawowego DAPI na utrwalony suchy szkiełko. Chroń przed światłem, a następnie przystąp do obserwacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia elektronowa
	<ol>
		<li>Po pierwszej identyfikacji na szkiełkach oceń obecność gigantycznego wirusa poprzez obserwację mikroskopii elektronowej kultur supernatantów.</li>
		<li>Umieścić 5 μl próbki dodatniej na siatce rozżarzonej. Odczekaj około 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dokładnie wysusz siatkę i nałóż na nią niewielką kroplę 1% molibdenianu amonu na 10 sekund. Pozostaw siatkę do wyschnięcia na 5 minut.</li>
		<li>Przejdź do mikroskopii elektronowej przy 200 keV.</li>
		<li>Umieść siatkę na uchwycie, a następnie włóż uchwyt do mikroskopu. Sprawdź przegląd odkurzacza, klikając odpowiednią ikonę. Zamknij zawory i rozpocznij obserwację przy plamce o rozmiarze 5 i powiększeniu x 25 000.</li>
		<li>Zmierz gigantycznego wirusa za pomocą ImageJ lub bezpośrednio na mikroskopie za pomocą narzędzia pomiarowego mikroskopu znajdującego się na ekranie akwizycji. 
		Uwaga: Zaklasyfikować próbkę do grupy faustowirusów o wielkości kapsydu około 200 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Biologia molekularna 
	Uwaga: Po tej identyfikacji, testy biologii molekularnej miały kluczowe znaczenie dla potwierdzenia w celu odróżnienia faustowirusa od wirusa Marsylii, który ma ten sam rozmiar kapsydu i wygląd pod mikroskopem elektronowym, chociaż nie mają tej samej specyficzności gospodarza. Wirus marsylii nie może rosnąć na Vermamoeba, Faustowirus jest specyficzny dla Vermamoeba i wszystkie próby wyhodowania go na innych amebach, takich jak Acanthamoeba, nie powiodły się do tej pory. Zaprojektowanie i zastosowanie specyficznych systemów starter/sonda wymienionych w pracach Reteno i wsp. umożliwiło bardziej precyzyjną wstępną klasyfikację nowo wyizolowanych wirusów poprzez amplifikację i sekwencjonowanie genów wirusa.
	<ol>
		<li>Ekstrahować DNA z dodatnich próbek hodowli za pomocą automatycznego systemu ekstrakcji zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym za pomocą termocyklera, jak opisano w Reteno i wsp.Rozdział 19</li>
		<li>Sekwencja przy użyciu tych samych starterów, które zostały użyte do amplifikacji. Użyj starterów ukierunkowanych na gen podjednostki 1 polimerazy RNA skierowanej do DNA: Fstv_S2F 5'-CCA GGA CAT GAT GGT CAC ATA G-3' (do przodu) i Fstv_S2R 5'-TTG CAC CTC CGC AGT TAA A-3' (do tyłu) z sondą Fstv_S2P FAM-TATGCTCCAATGGCCCCCCCAACGACA-TAMRA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Produkcja, oczyszczanie i sekwencjonowanie genomu wirusa
<ol>
	<li>Subkultura hodowla ameby pojedynczego wirusa do klonowania w rozcieńczeniu punktu końcowego.</li>
	<li>Do produkcji: przygotować 20 kolb zawierających 30 ml PYG, 10 ml Vermamoeba vermiformis i 5 ml wyizolowanego wirusa już przeniesionego z dołków do małych kolb.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 30 °C aż do całkowitej lizy ameby. Obserwuj codziennie za pomocą odwróconej mikroskopii optycznej, aż wszystkie ameby zostaną zlożone.</li>
	<li>Po całkowitej lizie zebrać wszystkie kolby w jednym pojemniku. Filtruj z filtrem 0,45 μm, aby wyeliminować zanieczyszczenia.</li>
	<li>Rozpocznij oczyszczanie przez ultrawirowanie przy 89 800 x g przez 75 minut. Upewnij się, że skalibrowałeś wagę probówek przed rozpoczęciem wirowania.</li>
	<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant z każdej probówki przez aspirację i ponownie zawiesić osad w PAS o tej samej objętości, co do kalibracji, przed powtórzeniem wirowania.</li>
	<li>Jak wyżej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić wszystkie granulki w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Oczyść wytworzony wirus przy użyciu 25% sacharozy (27,5 g sacharozy w 100 ml PBS, przefiltrowanej na filtrze 0,22 μm).
	<ol>
		<li>Użyć 8 ml sacharozy i 2 ml zawiesiny wirusa. Wirować przy 89 800 x g przez 1 godzinę 15 min. Zawiesić osad w 1 ml PBS. Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Raoult, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+1.2-megabase+genome+sequence+of+Mimivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus.</a> Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).</li>
<li>Claverie, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+viruses+in+the+oceans%3A+the+4th+Algal+Virus+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop.</a> Virol J. 2, 52-52 (2004).</li>
<li>Monier, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+mimivirus+relatives+are+probably+large+algal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Audio%2C+Transactions+of+the+IRE+Professional+Group+on%22%5BJournal%5D)">Marine mimivirus relatives are probably large algal viruses.</a> Audio, Transactions of the IRE Professional Group on. 5, 12-12 (2007).</li>
<li>Monier, A., Claverie, J. M., Ogata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+distribution+of+large+DNA+viruses+in+the+sea%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Taxonomic distribution of large DNA viruses in the sea.</a> Genome Biol. , (2008).</li>
<li>Claverie, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimivirus+and+Mimiviridae%3A+Giant+viruses+with+an+increasing+number+of+potential+hosts%2C+including+corals+and+sponges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mimivirus and Mimiviridae: Giant viruses with an increasing number of potential hosts, including corals and sponges.</a> J Invertebr Pathol. 101 (3), 9-9 (2009).</li>
<li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+the+megavirome+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence of the megavirome in humans.</a> J Clin Virol. 57 (3), 191-200 (2013).</li>
<li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+characterization+of+new+environmental+giant+viruses+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Tentative characterization of new environmental giant viruses by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> Intervirology. 53 (5), 344-353 (2010).</li>
<li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ Microbiol. , (2012).</li>
<li>Pagnier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+improvements+in+mimiviridae+and+marseilleviridae+isolation+from+amoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">A decade of improvements in mimiviridae and marseilleviridae isolation from amoeba.</a> Intervirology. 56 (6), 354-363 (2012).</li>
<li>Philippe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandoraviruses%3A+Amoeba+Viruses+with+Genomes+Up+to+2.5+Mb+Reaching+That+of+Parasitic+Eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pandoraviruses: Amoeba Viruses with Genomes Up to 2.5 Mb Reaching That of Parasitic Eukaryotes.</a> Science. 341 (6143), 281-286 (2013).</li>
<li>Legendre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thirty-thousand-year-old+distant+relative+of+giant+icosahedral+DNA+viruses+with+a+pandoravirus+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology.</a> PNAS. , (2014).</li>
<li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+Isolation+of+Mimivirus+in+a+Patient+With+Pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">First Isolation of Mimivirus in a Patient With Pneumonia.</a> Clin Infect Dis. , (2013).</li>
<li>Saadi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shan+virus%3A+a+new+mimivirus+isolated+from+the+stool+of+a+Tunisian+patient+with+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Intervirology%22%5BJournal%5D)">Shan virus: a new mimivirus isolated from the stool of a Tunisian patient with pneumonia.</a> Intervirology. 56 (6), 424-429 (2013).</li>
<li>Claverie, J. -M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimivirus%3A+the+emerging+paradox+of+quasi-autonomous+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet+%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Mimivirus: the emerging paradox of quasi-autonomous viruses.</a> Trends Genet : TIG. 26 (10), 431-437 (2010).</li>
<li>Colson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viruses+with+more+than+1%2C000+genes%3A+Mamavirus%2C+a+new+Acanthamoeba+polyphaga+mimivirus+strain%2C+and+reannotation+of+Mimivirus+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Viruses with more than 1,000 genes: Mamavirus, a new Acanthamoeba polyphaga mimivirus strain, and reannotation of Mimivirus genes.</a> Genome Biol Evol. 3 (0), 737-742 (2010).</li>
<li>Claverie, J. -M., Abergel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+questions+about+giant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Open questions about giant viruses.</a> Adv Virus Res. 85, 25-56 (2013).</li>
<li>Fischer, M. G. M., Allen, M. J. M., Wilson, W. H. W., Suttle, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+virus+with+a+remarkable+complement+of+genes+infects+marine+zooplankton%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton.</a> PNAS. 107 (45), 19508-19513 (2010).</li>
<li>Van Etten, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+really%2C+really+big+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Another really, really big virus.</a> Viruses. 3 (1), 32-46 (2011).</li>
<li>Reteno, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faustovirus%2C+an+asfarvirus-related+new+lineage+of+giant+viruses+infecting+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22J.Virol%22%5BJournal%5D)">Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae.</a> J.Virol. , (2015).</li>
<li>Coşkun, K. A., Ozçelik, S., Tutar, L., Elaldı, N., Tutar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+free-living+amoebae+from+tap+water+in+Sivas%2C+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+res+Int%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of free-living amoebae from tap water in Sivas, Turkey.</a> Biomed res Int. 2013, 675145(2013).</li>
<li>Bradbury, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-living+amoebae+recovered+from+human+stool+samples+in+Strongyloides+agar+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+microbiol%22%5BJournal%5D)">Free-living amoebae recovered from human stool samples in Strongyloides agar culture.</a> J Clin microbiol. 52 (2), 699-700 (2014).</li>
<li>Pagnier, I., Valles, C., Raoult, D., La Scola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Vermamoeba+vermiformis+and+associated+bacteria+in+hospital+water%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Isolation of Vermamoeba vermiformis and associated bacteria in hospital water.</a> Microb Pathog. 80, 14-20 (2015).</li>
<li>Ogata, H., Toyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remarkable+sequence+similarity+between+the+dinoflagellate-infecting+marine+girus+and+the+terrestrial+pathogen+African+swine+fever+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Remarkable sequence similarity between the dinoflagellate-infecting marine girus and the terrestrial pathogen African swine fever virus.</a> Virol J. 6, 178-178 (2008).</li>
<li>Tarutani, K., Nagasaki, K., Itakura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+virus+infecting+the+novel+shellfish-killing+dinoflagellate+Heterocapsa+circularisquama%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Microb+Ecol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a virus infecting the novel shellfish-killing dinoflagellate Heterocapsa circularisquama.</a> Aquat Microb Ecol. 23, 103-111 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Możliwość, że faustowirus może być pierwszym członkiem nowej rodziny Megavirales blisko ASFV, została po raz pierwszy zasugerowana przez Reteno i wsp., ale nadal można wyróżnić pewne różnice. Wydaje się niejasne, czy faustowirus powinien dołączyć do rodziny Asfarviridae, czy też powinien zamiast tego utworzyć nową przypuszczalną rodzinę wirusów. Zagadnienie to będzie wymagało dalszych badań, w szczególności bardziej wszechstronnej charakterystyki jego morfologii, zakresu gospodarzy, cyklu replikacji i...

Odkrycie gigantycznych wirusów, zwłaszcza tych należących do rzędu Megavirales, całkowicie zmieniło świat wirusów pod względem wielkości cząsteczek i złożoności genomu. Wcześniej uważano, że wirusy to małe jednostki, a Mimivirus wydawał się łamać wszystkie zasady. 1 Dane metagenomiczne sugerują wszechobecność gigantycznych wirusów nie tylko w środowisku, ale także u ludzi. 6 W związku z tym nadal istnieje potrzeba poszukiwania tych wirusów na dużą skalę. Różnorodność tych gigantycznych wirusów oceniono nie tylko poprzez pobieranie próbek z różnych środowisk wodnych i związanych z nimi osadów na całym świecie,7-11 ale także poprzez badania przesiewowe różnych próbek ludzkich12,13 i próbek środowiskowych. 7,9 Mimiwirus Acanthamoeba polyphaga został wyizolowany przez wspólną hodowlę przy użyciu protistów fagocytarnych, głównie Acanthamoeba spp.14-16 Cała kolekcja gigantycznych wirusów została następnie również wyizolowana z tego określonego gospodarza protistów, co skłoniło społeczność naukową do ograniczenia procedury badań i izolacji Acanthamoeba Spp. Najwyraźniej to poleganie na jednym gatunku żywiciela spowodowało, że duża część wirusów została przeoczona. Fakt, że gigantyczny wirus, CroV, został wyizolowany z wysoce ruchliwym pierwotniakiem morskim Cafeteria roenbergensis,17,18 pokazuje potrzebę wykorzystania szerszego zakresu pierwotniaków w celu odkrycia nowych linii lub rodzin gigantycznych wirusów. Reteno i wsp. udało mu się wyselekcjonować inne pierwotniaki jako gospodarzy komórek, które nigdy wcześniej nie były używane, i wyizolować nową linię gigantycznych wirusów związaną z Asfar (nowo nazwaną Faustowirusem). Rozdział 19
Próbując wyizolować nowe genotypy wirusa Fausto, aby poszerzyć członków tej linii wirusa, zmodyfikowaliśmy nasze procedury izolacji i użyliśmy ich do badania próbek środowiskowych zdolnych do zbierania nowych faustowirusów. Następnie opisaliśmy cały protokół, aby scharakteryzować nowe izolaty. Oceniliśmy Vermamoeba vermiformis, najpowszechniejszego wolno żyjącego protista występującego w środowisku ludzkim,20-22 który jest już używany w izolacji pierwszego prototypu Faustowirusa E12. 19 Ten protista jest obecnie nadal specyficzny dla gospodarza dla Faustowirusa. Wiedzieliśmy, że żaden ze znanych gigantycznych wirusów nie był chorobotwórczy dla tej ameby, ponieważ żadne próby wyhodowania innych gigantycznych wirusów w naszym laboratorium nie wykazały lizy ameby ani wzrostu wirusa. Z tego powodu uważamy, że V. vermiformis jest najlepszym i najbardziej unikalnym wsparciem komórkowym, o którym wiadomo, że izoluje nowe faustowirusy.

<table><tbody><tr><td>Cytometr LSR FORTESSA&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>Francja&nbsp;</td><td>Numer katalogowy: 649225B4</td></tr><tr><td>TECNAI G2 F20</td><td>FEI</td><td>Niemcy&nbsp;</td><td>5027/11</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop optyczny</td><td>leica&nbsp;</td><td>Francja</td><td>72643</td></tr><tr><td>Ekstrakcja DNA</td><td>Qiagen EZ1 Zaawansowany robot do ekstrakcji XL</td><td>Francja&nbsp;</td><td>L106A0452</td></tr><tr><td>PCR Cycler CFX96</td><td>Bio rad</td><td>France</td><td>785BR06298</td></tr><tr><td>Pożywka do PYG, PAS, Pożywka głodowa</td><td>Własna produkcja laboratoryjna&nbsp;</td><td>Marsylia URMITE</td><td>x</td></tr><tr><td>Amoeba szczep CDC-19</td><td>ATCC</td><td>Francja</td><td>50237</td></tr><tr><td>Płytki</td><td>Cellstar</td><td>France</td><td>655180</td></tr><tr><td>Materiały PCR, startery.&nbsp;</td><td>eurogentec</td><td>France</td><td>Elementarze cytowane w rękopisie</td></tr><tr><td>szkłem slajd 10 z siatkami</td><td>Kova&nbsp;</td><td>USA</td><td>H899871441F</td></tr><tr><td>Eozyna/niebieska plama Azur-Hemacolor</td><td>Merck milipore&nbsp;</td><td>Francja</td><td>111955,6,57,109468</td></tr><tr><td>Filtry próżniowe</td><td>Thermo scientific</td><td>Francja</td><td>BPV4550 / 20170115</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Thermo Fisher scientific&nbsp;</td><td>Francja&nbsp;</td><td>Numer katalogowy 10010-023</td></tr><tr><td>Technologie życia plamy DAPI</td><td>&nbsp;</td><td>Francja&nbsp;</td><td>Zobacz materiał D1306</td></tr><tr><td>cytospin 4 cytowirówka cytocentryczna</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>France</td><td>10522013JT184-31</td></tr><tr><td>Pojedynczy tunel cytologiczny</td><td>Polimery biomedyczne inc.</td><td>Francja</td><td>BMP-cyto-S50</td></tr><tr><td>Siatki węglowe&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>Francja&nbsp;</td><td>FCF400NI</td></tr><tr><td>Molibdan amonu</td><td>VWR międzynarodowyanl&nbsp;</td><td>Francja&nbsp;</td><td>21276185</td></tr><tr><td>Kolby&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>Niemcy</td><td>833911</td></tr><tr><td>0,22 &mu; M Filtry&nbsp;</td><td>Milex millipor&nbsp;</td><td>Francja</td><td>SE2M229104</td></tr><tr><td>Ultrawirówka Sorval WX 80</td><td>Thermo scientific</td><td>France</td><td>9102448</td></tr><tr><td>Filtry szybkoprzepływowe</td><td>Nalgene</td><td>France</td><td>450-0020</td></tr></tbody></table>

szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu vermamoeba vermiformis

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

Izolacja gigantycznych wirusów jest bardzo interesująca w tej nowej erze wirusologii, zwłaszcza że te gigantyczne wirusy są spokrewnione z protistami. Gigantyczne wirusy mogą być potencjalnie chorobotwórcze dla wielu gatunków protistów. Należą do niedawno opisanego rzędu Megavirales. Nowa linia wirusa Fausto, która została wyizolowana z próbek ścieków, jest daleko spokrewniona z patogenem ssaków, wirusem afrykańskiego pomoru świń. Wirus ten jest również specyficzny dla swojego gospodarza amebowego, Vermamoeba vermiformis, protista powszechnego w systemach wodnych opieki zdrowotnej. Kluczowe znaczenie ma kontynuowanie izolowania nowych genotypów faustowirusa w celu powiększenia jego kolekcji genotypów i zbadania jego pangenomu. Opracowaliśmy nowe strategie izolacji dodatkowych szczepów poprzez poprawę stosowania kombinacji antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych w celu uniknięcia skażenia bakteryjnego i grzybiczego kokultury ameb i sprzyjania namnażaniu się wirusa. Wdrożyliśmy również nową pożywkę głodową, aby utrzymać V. vermiformis w optymalnych warunkach do kohodowli wirusów. Na koniec zastosowaliśmy cytometrię przepływową, a nie obserwację mikroskopową, która jest czasochłonna, aby wykryć efekt cytopatogenny. Uzyskaliśmy dwa izolaty z próbek ścieków, udowadniając skuteczność tej metody, a tym samym poszerzając zbiór faustowirusów, aby lepiej zrozumieć ich środowisko, specyfikę gospodarza i zawartość genetyczną.

System opisany w niniejszej pracy potwierdził swoją koncepcję poprzez wyizolowanie dwóch nowych Faustowirusów. Z 70 przebadanych próbek w dwóch wykryto epizody lizy, co stanowiło kontrast do naszych wiarygodnych kontroli negatywnych. Kontrola negatywna dla lizy zawierała 86% populacji ameb. W przeciwieństwie do niej, próbki pozytywne (ST1 dla Saint Pierre de Meyzoargues oraz LC9 dla La Ciotat Sample 9) wykazały gwałtowny spadek liczby wyselekcjonowanych ameb; uległo lizie ponad 60% ameb z...

Opisujemy tutaj najnowsze osiągnięcia w izolacji wirusów w celu scharakteryzowania nowych genotypów wirusa Faustowirusa, nowej linii gigantycznych wirusów związanej z asfarwirusem. Protokół ten może być stosowany do wysokoprzepustowej izolacji wirusów, zwłaszcza gigantycznych wirusów infekujących ameby.

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Ogólnym celem tej nowej strategii izolacji jest zwiększenie liczby nowych izolatów wirusów w celu zbadania pangenomu tej nowej rodziny wirusów oraz lepszego zrozumienia ich ekosystemów i potencjalnej patogenności dla ludzi. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, wspierając wirusologów na całym świecie zainteresowanych poszukiwaniem wirusów olbrzymich, a w szczególności Faustowirusów. Główną zaletą tej techniki jest wprowadzenie ulepszeń na wielu etapach, takich jak skład mieszaniny antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, nowe podłoże głodzeniowe dostosowane do ameb oraz zastosowanie cytometrii przepływowej w celu szybszego i bardziej czułego wykrywania lizy. Po pobraniu próbek zanieczyszczonej wody zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować komórki gospodarza, V. vermiformis, dodając ameby do kolby do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm² zawierającej 30 ml pożywki z ekstraktem drożdżowym, peptonem, proteazą i glukozą (podłoże PYG), a następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez 48 godzin. Do zliczenia ameb należy użyć komór liczących; gdy osiągną one stężenie od 5 × 10⁵ do 10⁶ komórek/ml, należy zebrać komórki poprzez wirowanie

a-rapid-strategy-for-isolation-new-faustoviruses-from-environmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych z wykorzystaniem Vermamoeba vermiformis

Badanie opisuje kosztowo efektywną metodę identyfikacji źródła zanieczyszczenia kałowego/moczowego lub zanieczyszczenia azotanami w wodzie z wykorzystaniem qPCR do specyficznej kwantyfikacji ludzkich/świńskich/bydlęcych wirusów DNA, adenowirusów i poliomawirusów, proponowanych jako narzędzia MST.

Kosztowo efektywna metoda śledzenia źródeł mikrobów z wykorzystaniem specyficznych wirusów ludzkich i zwierzęcych

Źródło: Bou Khalil, J. Y., et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).W niniejszym filmie zaprezentowano obrazowanie cząsteczek faustowirusa z zainfekowanej hodowli ameb przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Materiał obejmuje przygotowanie siateczki, barwienie negatywne molibdanem amonu w celu zwiększenia kontrastu oraz wizualizację wirusa pod mikroskopem. Protokół kończy się pomiarem...

Wizualizacja i ocena rozmiaru Faustovirusa przy użyciu mikroskopii elektronowej

Źródło: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek metodą fluorescencyjną w celu rozdzielenia mieszaniny wirusów olbrzymich. J. Vis. Exp. (2019)Film ten demonstruje mikroaspirację pojedynczych komórek w celu izolacji i namnożenia pojedynczej populacji wirusa olbrzymiego z mieszanej populacji wirusowej przy użyciu ameb jako komórek gospodarza.

Izolacja pojedynczego wirusa olbrzymiego z mieszanej populacji wirusowej z wykorzystaniem ameb

Źródło: Bou Khalil, J. Y.,et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)W niniejszym filmie zaprezentowano wzbogacanie próbek wirusów olbrzymich z wodnych próbek środowiskowych przy użyciu kokultury z amebami, co umożliwia ich późniejszą detekcję i analizę.

Wzbogacanie próbek wody środowiskowej w kierunku wirusów olbrzymich z wykorzystaniem ameb

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Tutaj prezentujemy VirWaTest, który jest prostą, niedrogą i przenośną metodą koncentracji i wykrywania wirusów z próbek wody w miejscu użycia.

VirWaTest, metoda punktowa do wykrywania wirusów w próbkach wody

Tutaj opisujemy metodę mikroaspiracji pojedynczych komórek do separacji zainfekowanych ameb. W celu oddzielenia subpopulacji wirusów w Vermamoeba vermiformis zakażonych faustowirusami i nieznanymi gigantycznymi wirusami, opracowaliśmy protokół opisany poniżej i wykazaliśmy jego zdolność do oddzielania dwóch nowych wirusów gigantycznych o niskiej liczebności.

Mikroaspiracja pojedynczych komórek jako alternatywna strategia dla sortowania komórek aktywowanych fluorescencją w celu separacji gigantycznych mieszanin wirusów

Ten protokół przedstawia metodę efektywnego wydobywania żywych nicieni z naturalnych substratów w terenie.

Szybka izolacja dzikich nicieni za pomocą lejka Baermanna

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Poznaj szybką strategię izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis. Ta metoda wykorzystuje floss-cytometrię do szybszej i bardziej wrażliwej detekcji lizy.

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

Przeglądaj więcej filmów