Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

Ogólnym celem tej nowej strategii izolacji jest zwiększenie liczby nowych izolatów wirusów w celu zbadania pangenomu tej nowej rodziny wirusów oraz lepszego zrozumienia ich ekosystemów i potencjalnej patogenności dla ludzi. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wirusologii, wspierając wirusologów na całym świecie zainteresowanych poszukiwaniem wirusów olbrzymich, a w szczególności Faustowirusów. Główną zaletą tej techniki jest wprowadzenie ulepszeń na wielu etapach, takich jak skład mieszaniny antybiotyków i środków przeciwgrzybiczych, nowe podłoże głodzeniowe dostosowane do ameb oraz zastosowanie cytometrii przepływowej w celu szybszego i bardziej czułego wykrywania lizy. Po pobraniu próbek zanieczyszczonej wody zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować komórki gospodarza, V. vermiformis, dodając ameby do kolby do hodowli komórkowej o powierzchni 75 cm² zawierającej 30 ml pożywki z ekstraktem drożdżowym, peptonem, proteazą i glukozą (podłoże PYG), a następnie inkubować w temperaturze 28 °C przez 48 godzin. Do zliczenia ameb należy użyć komór liczących; gdy osiągną one stężenie od 5 × 10⁵ do 10⁶ komórek/ml, należy zebrać komórki poprzez wirowanie przy 720 ×g przez 10 minut.

Odssać nadsącz i użyć 30 ml sterylnego roztworu soli Page'a (PAS) do resuspensji osadu ameb. Po ponownym przemyciu osadu użyć 30 ml pożywki głodzeniowej, zawierającej antybiotyk i środek przeciwgrzybiczy, aby resuspenderować komórki do stężenia około 10⁶ ameb na ml. Pożywka głodzeniowa pozwala amebom przeżyć bez cystowania lub namnażania się.

Następnie w dołkach płaskodنnej płytki 96-dołkowej wysieje się 200 µL ameb i inkubuje w temperaturze 30 °C przez 30 minut. Po wymieszaniu próbek wody w wirówce typu vortex przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, do komórek ameb inokuluje się 25 µL każdej próbki, pozostawiając dwa dołki bez próbki jako kontrole negatywne. Aby zapobiec odparowaniu, płytkę z kulturą pierwotną umieszcza się w woreczku z mokrym kompresem, a tak przygotowaną komorę wilgotnościową z płytką wkłada do inkubatora w temperaturze 30 °C.

Trzy dni po pierwszej inokulacji, przenieś kulturę pierwotną na nową płytkę 96-dołkową z amebami, zgodnie z wcześniejszą instrukcją, bez przeprowadzania obserwacji mikroskopowych. Inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy dni. Następnie, wykorzystując tę subkulturę, zaszczep trzecią płytkę w opisany wcześniej sposób i inkubuj przez dwa dni.

Aby wykryć lizę na końcowej płytce z ko-kulturą, należy włączyć cytometr i przeprowadzić procedurę czyszczenia oraz płukania zgodnie z protokołem producenta w celu zredukowania szumu tła. Aby przeprowadzić 40-minutową, w pełni zautomatyzowaną akwizycję, należy uruchomić próbnik wysokoprzepustowy (HTS), aby automatycznie pobrać próbki z płytki 96-dołkowej zgodnie z protokołem producenta. Zaprogramować ustawienia HTS zgodnie z poniższą listą: objętość próbki 150 µL, objętość mieszania 50 µL, prędkość mieszania 180, liczba cykli mieszania 5, objętość przemywania między próbkami 400 µL, szybkość przepływu 2,5 µL/s oraz liczbę rejestrowanych zdarzeń 10 000. Kliknąć przycisk home, aby HTS mógł zlokalizować płytkę. Następnie w pierwszej kolejności ocenić dołki kontroli negatywnej zawierające komórki ameby gospodarza, aby wyznaczyć bramkę (gate) dla populacji ameb i określić procent komórek na podstawie ich charakterystyki fizycznej. Należy upewnić się, że uzyskano homogeniczną populację ameb oraz drugą populację o mniejszej liczbie zdarzeń, odpowiadającą zanieczyszczeniom i szumowi. Następnie rozpocząć bramkowanie, klikając acquire sample.

Następnie, używając strzałki definiującej bramki, zlokalizuj interesującą populację ameb. Po wyznaczeniu bramek dla co najmniej 10 000 zdarzeń, kliknij run, aby system HTS automatycznie przeanalizował całą płytkę. Przeprowadź akwizycję i analizę danych w oparciu o parametr wielkości (forward scatter) oraz parametr struktury (side scatter). Dodatkowe szczegóły znajdują się w tekście.

Po wykryciu lizy metodą cytometrii przepływowej, pipetuj lizowane kokultury, aby zawiesić pozostałe ameby. Po naniesieniu 50 µL każdej próbki na szkiełka, poddaj zawiesinę bezpośrednio cytocentryfugacji przy 800 ×g przez 10 minut.

Następnie należy utrwalić preparaty na szkiełkach za pomocą czystego metanolu, a potem pozostawić je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu szkiełka należy zanurzyć w roztworze ESN trzykrotnie po 4 s każde, a następnie umieścić w barwniku błękit azurowy na 6 s. Na koniec szkiełka należy zanurzyć w PBS na 45 s.

Pozostaw preparaty do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przed przystąpieniem do obserwacji. Aby zbarwić nowe utrwalone preparaty DAPI, nanieś pipetą 15 µL DAPI na wyschnięte szkiełka. Obserwuj preparaty pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 1000x w celu sprawdzenia obecności fabryk wirusowych.

Aby przeprowadzić badanie za pomocą mikroskopii elektronowej, nanieś 5 µL próbki pozytywnej na siatkę poddaną wyładowaniom koronowym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez około 20 minut. Ostrożnie wysusz siatkę, a następnie dodaj niewielką ilość 1% molibdenianu amonu i inkubuj przez 10 sekund. Po ostrożnym usunięciu kropli pozostaw siatkę do wyschnięcia na pięć minut. Następnie ustaw mikroskop elektronowy na 200 keV. Umieść siatkę w uchwycie, a uchwyt wprowadź do mikroskopu. Kliknij ikonę przeglądu próżni i sprawdź poziom próżni. Następnie zamknij zawory, ustaw rozmiar plamki (spot size) na 5 oraz powiększenie 25 000 przed rozpoczęciem obserwacji. Po zlokalizowaniu wirusa olbrzymiego na ekranie akwizycji, użyj narzędzia pomiarowego, aby zmierzyć wirusa.

Należy przeprowadzić analizy biologii molekularnej oraz sekwencjonowanie genomu wirusa zgodnie z protokołem tekstowym.

Rysunek ten przedstawia wyniki detekcji dwóch Faustowirusów w porównaniu z wiarygodnymi kontrolami negatywnymi. Kontrola negatywna dla lizy zawierała 86% populacji ameb. W przeciwieństwie do niej, uległo lizie ponad 60% ameb, przy czym najwyższy odsetek debris odnotowano w próbkach pozytywnych.

Jak widać tutaj, barwienia ESN i blue-azur wykazują jądra komórkowe niezainfekowanych i zainfekowanych ameb oraz obecność fabryk wirusowych wewnątrz zainfekowanych komórek. Barwienie DAPI również potwierdza obecność fabryk wirusowych wewnątrz ameb. Na tych obrazach mikroskopia elektronowa ujawnia obecność Faustovirus o typowym wyglądzie mega-wirusa, składającego się z kapsydu ikosaedrycznego pozbawionego włókien, o rozmiarze 200 nanometrów.

Po opanowaniu techniki i przeprowadzeniu kokultury, wykrywanie lizy oraz charakterystyka wirusa mogą zostać wykonane w ciągu godziny, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas realizacji tej procedury ważne jest, aby kontrolować żywotność ameb oraz sprawdzać ewentualne zanieczyszczenia. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak biologia molekularna skierowana przeciwko wirusom olbrzymim, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. dotyczące rodziny lub genotypu wirusa.

Po opracowaniu technika ta utorowała badaczom z dziedziny wirusologii drogę do eksploracji tej rodziny wirusów, ich specyficznych gospodarzy oraz potencjalnej patogenności. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak łatwo izolować wirusy olbrzymie poprzez zwiększenie liczby i różnorodności próbek oraz poprzez wybór optymalnej komórki gospodarza i najlepszych warunków hodowli. Należy pamiętać, że praca z wirusami potencjalnie patogennymi dla ludzi może być niezwykle niebezpieczna, szczególnie w przypadku próbek ścieków.

W związku z tym podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak praca w laboratoriach SB2 w bezpiecznych warunkach.