Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Ogólnym celem tej procedury jest zaprojektowanie systemu dostarczania, który może dostarczać do mózgu leki małocząsteczkowe, takie jak siRNA. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurodegeneracji, takie jak: Czy siRNA jest realną opcją terapeutyczną w chorobach związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek? oraz Czy możemy zaprojektować niezawodny system dostarczania leków do mózgu?

Główną zaletą stworzenia liposomalnego systemu dostarczania leków jest to, że możemy dostarczyć nasze siRNA dożylnie lub przez krwiobieg, a nie bezpośrednio przez tkankę neuronalną, co powoduje uszkodzenie neuronów. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię i diagnostykę chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ technika ta pozwala na specyficzne dostarczanie przez barierę krew-mózg, w szczególności do neuronów wykazujących ekspresję acetylocholiny. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie, ponieważ wstrzykiwanie żyły ogona myszy jest trudne do nauczenia się ze względu na mały rozmiar żyły ogona myszy.

Zacznij od przygotowania stosunku jeden do jednego DOTAP do cholesterolu. W przypadku preparatu liposomu obcego zwierzęcia należy zmieszać dwa nanomole DOTAP i dwa nanomole cholesterolu w dziesięciu mililitrach roztworu chloroformu do metanolu jeden do jednego. Następnie odparować dziewięć mililitrów roztworu chloroformu i metanolu za pomocą gazowego azotu.

Odparuj ostatni mililitr rozpuszczalnika w dygestorium przez noc bez gazu. Następnego dnia na dnie kolby powinien być widoczny cienki film lipidowy. Podgrzej zarówno tę kolbę z filmem lipidowym, jak i dziesięć mililitrów dziesięcioprocentowego roztworu sacharozy do 55 stopni Celsjusza.

Następnie powoli odpipetować podgrzany roztwór sacharozy na cienki film lipidowy, delikatnie obracając kolbą. Następnie zmontuj ekstruder z filtrami o długości jednego mikronu zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanej zawiesiny liposomowej do jednej ze strzykawek na wytłaczarce.

Następnie przepuścić zawiesinę między dwiema strzykawkami 11 razy. Utrzymując zawiesinę liposomów w cieple w celu łatwiejszego sortowania, przetrzyj liposomy przez 45 mikronów i filtr 2 mikrony Aby wygenerować duże, jednolamowe pęcherzyki, następnie dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny liposomów czterech nanomoli do 200 mikrolitrów 20 mikromolowego roztworu siRNA i inkubuj przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 80 mikrolitrów 500-mikromolowego zapasu peptydu celującego RVG-9R do roztworu liposomu siRNA i inkubuj przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.

Przygotować zawiesinę lipsomoe obcych zwierząt, mieszając 2,2 nanomoli DSPE lub DOTAP z dziesięcioma mililitrami roztworu chloroformu do metanolu w proporcji dwa do jednego z 1,6 nanomola cholesterolu i 2 nanomoli peg DSPE. Następnie należy zastosować gazowy azot i po odparowaniu większości rozpuszczalnika pozostawić kolbę na noc w dygestorium. Następnie powoli dodaj dziesięć mililitrów 1X PBS podgrzanego do 75 stopni Celsjusza do cienkiego filmu lipidowego.

Pozwól lipidom nawodnić się w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę przed wielkością. Po zaklejeniu zawiesiny liposomowej za pomocą ekstrudera jak poprzednio, odpipetować 20 mikrolitrów każdej z czterech zawiesin liposomów nanomolowych do jednorazowych podwielokrotności i liofilizować przez 30 minut za pomocą liofilizatora stołowego. Następnie dodaj 1,4 mikrolitra 26,6 mikromolowego roztworu siarczanu protaminy do 200 mikrolitrów 20 mikromolowego podstawowego roztworu siRNA i inkubuj przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej w celu skondensacji siRNA.

Po inkubacji należy ponownie uwodnić palety DSPE za pomocą 201,4 mikrolitrów roztworu protaminy siRNA. Ponownie nawodnić palety DOTAP 200 mikrolitrami roztworu siRNA dla obcych zwierząt. Inkubuj każdy liposomowy roztwór siRNA przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj dziesięć mikrolitrów 60-milimolowego roztworu EDC do każdej probówki uwodnionych liposomów. Następnie dodaj dziesięć mikrolitrów 150-milimolowego roztworu sulfo-NHS do liposomowego roztworu siRNA zarówno dla palet DOTAP, jak i DSPE. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Na koniec dodaj 80 mikrolitrów 500 mikromolowych zapasów peptydu RVG-9R do roztworu sieciującego liposom siRNA i inkubuj przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Po znieczuleniu myszy za pomocą dwóch do trzech procent izofluranu w tlenie, przykryj oczy myszy maścią aptalmiczną i potwierdź znieczulenie, wykonując szczypanie palca u nogi. Kontynuuj tylko wtedy, gdy nie ma reakcji.

Utrzymując znieczulenie, umieść mysz na plecach lub na boku, aby uzyskać dostęp do żyły ogonowej. Przetrzyj ogon 70-procentowym etanolem, a następnie użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 26, aby wstrzyknąć 300 mikrolitrów LSPC lub palet do żyły ogonowej. Wstrzyknięcie należy rozpocząć dystalnie i poruszać się proksymalnie, jeśli żyła zapadnie się lub pęknie.

Umieść mysz w czystej klatce, aż utrzyma pozycję leżącą mostka. Należy obserwować zwierzę przez kilka godzin po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że znieczulenie ustąpi i nie wystąpią żadne złe skutki leczenia. Po pozostawieniu LSPC lub palet do krążenia przez co najmniej 24 godziny, a następnie eutanazji myszy, należy wyciąć pół półkuli mózgu.

Następnie umieść półpółkulę i 2,5 mililitra buforu faksowego na sitku do komórek o siatce 40 mikronów i użyj tłoka strzykawki, aby przecisnąć tkankę przez filtr na szalkę Petriego. Przepłucz sitko komórkowe i szalkę Petriego dodatkowymi 2,5 mililitrami buforu faksu. Następnie przenieś zawiesinę jednokomórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i umieść na lodzie.

Następnie odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do probówki mikrowirówki i wirować przez pięć minut przy 350 razy G. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze bufora faksowego i ponownie odwirować. Następnie dodaj kolejny mililitr buforu faksu i umieść zawiesinę komórek na lodzie. Teraz inkubuj komórki w 100 mikrolitrach szczurzego bloku Fc przeciwko myszom w buforze faksowym przez 30 do 60 minut na lodzie.

Po granulowaniu i umyciu jak poprzednio, dodać 100 mikrolitrów fluorescencyjnego pierwszorzędowego roztworu przeciwciał i umieścić na lodzie na 30 do 60 minut. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze buforu do lizy RVC na jedną minutę. Następnie rozpylić komórki.

Po wyrzuceniu buforu ponownie zawiesić w jednym mililitrze buforu faksu i umieścić na lodzie. Komórki są teraz gotowe do analizy faksu. Myszy leczone siRNA dostarczanym za pośrednictwem LSPC wykazały znaczny spadek poziomu komórkowych białek prionowych w porównaniu z kontrolą PBS, która pokazuje poziomy białek prionowych typu komórkowego.

Myszy leczone LSPC wykazywały poziomy komórkowych białek prionowych zbliżone do myszy z białkiem prionowym. W trzech eksperymentach myszy leczone LSPC wykazały znaczny spadek poziomu komórkowych białek prionowych w porównaniu z PBS podczas kontroli typu. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że liposomy można przechowywać w lodówce przez kilka miesięcy, ale kompletne LSPC należy zużyć w ciągu 24 godzin po złożeniu.

Po jego opracowaniu, generacja LSPC lub palet utoruje naukowcom drogę do zbadania większej liczby opcji terapeutycznych w dziedzinie chorób neurodegeneracyjnych.