Name: Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę dostarczania terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych z peptydem neurotargetującym. Technika umożliwia przekroczenie bariery krew-mózg i zmniejsza uszkodzenia neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować następującym źródłom finansowania: CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) oraz program grantów badawczych NIH (R01 NS075214-01A1). Chcielibyśmy podziękować laboratorium Telling za zastosowanie ich przeciwciała monoklonalnego PRC5. Chcielibyśmy również podziękować laboratorium Dow za liposomy DOTAP i za podzielenie się swoją wiedzą w zakresie generowania liposomów.

Wszystkie myszy były hodowane i utrzymywane w Lab Animal Resources, akredytowane przez Association for Assessment and Accreditation of Lab Animal Care International, zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee na Colorado State University.
1. Przygotowanie LSPC
<ol>
	<li>Użyj stosunku DOTAP (1,2-dioleoilo-3-trimetyloamoniowo-propanowo-propanowo) do cholesterolu 1:1 dla LSPC. W przypadku preparatu liposomu o stężeniu 4 nmoli należy wymieszać 2 nmoli DOTAP i 2 nmoli cholesterolu z 10 ml roztworu chloroformu:metanolu w proporcji 1:1 w kolbie.</li>
	<li>Odparować 9 ml roztworu chloroformu:metanol przy użyciu gazuN2 w dygestorium. Odparować ostatni 1 ml rozpuszczalnika w dygestorium przez noc bez użycia gazu. Obserwować cienką warstwę lipidową na dnie kolby.</li>
	<li>Podgrzać 10 ml 10% roztworu sacharozy do temperatury 55 °C.</li>
	<li>Podgrzany 10% roztwór sacharozy wlewać na cienki film lipidowy powoli, tj. 1 ml/min, delikatnie obracając kolbą. Utrzymać 10% sacharozę i kolbę z lipidami w temperaturze 55 °C, tak aby cząsteczki lipidów pozostały w fazie żelowo-ciekłej. Rehydratacja powoduje tworzenie się pęcherzyków wielopłytkowych (MLV).</li>
	<li>Pozwól lipidom na ponowne nawodnienie w temperaturze 55 °C przez co najmniej jedną godzinę przed doborem wielkości liposomów.</li>
	<li>Zmontuj wytłaczarkę zgodnie z instrukcjami producenta z filtrami 1.0 μm lub użyj filtrów strzykawkowych 1.0 μm do wymiarowania.</li>
	<li>Dodać 1 ml podgrzanej zawiesiny liposomowej do jednej ze strzykawek na ekstruderze i przepuścić zawiesinę między dwiema strzykawkami 11 razy. Upewnić się, że zawiesina znajduje się w przeciwnej strzykawce niż strzykawka początkowa po 11 przejściach.</li>
	<li>Ponownie przepuść liposomy przez filtry 0,45 μm, a następnie 0,2 μm, aby wygenerować duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUV). Utrzymuj zawiesinę liposomową w cieple, aby ułatwić dobór rozmiaru.</li>
	<li>Inkubować 20 μl zawiesiny liposomów 4 nmol (200 μM) z 200 μl 20 μM (łącznie 4 nmol) podstawowego roztworu siRNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować 80 μl 500 μM (łącznie 40 nmol) podstawowego roztworu RVG-9r z roztworem siRNA/liposomu przez 10 minut w temperaturze pokojowej. LSPC należy użyć tak szybko, jak to możliwe, ale można je zużyć do kilku godzin po przygotowaniu. Przechowywać LSPC w temperaturze 4 °C przez kilka godzin po przygotowaniu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie PALET
<ol>
	<li>Dla PALET należy użyć stosunku molowego 55:40:5 DSPE (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminy):cholesterol:DSPE-PEG lub DOTAP:cholesterol:DSPE-PEG. W przypadku preparatu liposomowego o stężeniu 4 nmoli należy wymieszać 2,2 nmoli DSPE lub DOTAP, 1,6 nmoli cholesterolu i 0,2 moli DSPE-PEG w 10 ml roztworu chloroformu:metanolu w proporcji 2:1 w kolbie.</li>
	<li>Przygotuj zawiesinę liposomową dokładnie tak, jak opisano w krokach 1.1 i 1.2 powyżej. Uwodnić liposomy DSPE w 10 ml 1x PBS podgrzanym do 75 °C, dodając 1 ml/min. Pozwól lipidom na ponowne nawodnienie w temperaturze 75 °C przez co najmniej 1 godzinę przed doborem wielkości.</li>
	<li>Dopasuj rozmiar zawiesiny liposomów dokładnie tak, jak opisano w kroku 1.6-1.8.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl każdej z zawiesin liposomów o objętości 4 nmol (200 μM) do jednorazowych podwielokrotności po zwymiarowaniu liposomów DOTAP i DSPE i liofilizować przez 30 minut za pomocą liofilizatora stołowego (ryc. 2).</li>
	<li>Inkubować 200 μl 20 μM (łącznie 4 nmol) podstawowego roztworu siRNA z 1,4 μl 26,6 μM roztworu siarczanu protaminy przez 10 minut w temperaturze pokojowej dla siRNA, który ma być zamknięty w liposomach DSPE PALETS.</li>
	<li>Ponownie uwodnić liposomy DOTAP PALETS za pomocą 200 μl roztworu podstawowego siRNA o stężeniu 4 nmoli lub uwodnić liposomy DSPE PALETS za pomocą 201,4 μl roztworu siRNA/protaminy. Inkubować roztwór liposomu/siRNA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 10 μl 60 mM roztworu chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karmodiimidu (EDC) do roztworu liposomu/siRNA dla PALET DOTAP i DSPE.</li>
	<li>Dodać 10 μl 150 mM roztworu N-hydroksysulfobursztynimidu (sulfo-NHS) do roztworu liposomu/siRNA dla palet DOTAP i DSPE.</li>
	<li>Inkubować EDC i sulfo-NHS z zawiesiną siRNA/liposomów przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować 80 μl 500 μM (łącznie 40 nmol) roztworu podstawowego RVG-9r z roztworem sieciującym siRNA/liposom przez 10 minut w RT. 
	UWAGA: EDC/sulfo-NHS umożliwia RVG-9r kowalencyjne wiązanie się z lipidami PEG. Zużyć PALETS w ciągu kilku godzin po przygotowaniu. Przechowywać PALETY w temperaturze 4 °C przez kilka godzin po przygotowaniu.</li>
	<li>Aby określić skuteczność enkapsulacji siRNA PALETS:
	<ol>
		<li>Zmierzyć stężenie siRNA przed i po dodaniu protaminy i liposomów za pomocą spektrofotometru ustawionego na 260 nm.</li>
		<li>Przefiltrować niekapsułkowane siRNA z zawiesiny liposomowej/kapsułkowanej siRNA za pomocą filtrów odśrodkowych 50 kDa. Wirować przy 1 000 x g przez 20 min.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie niekapsułkowanego siRNA w filtracie i stężenie zamkniętego siRNA w retentacie za pomocą spektrofotometru przy 260 nm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wstrzykiwanie myszom LSPC lub PALETS
<ol>
	<li>Wystaw myszy na 5-10 minut na działanie lampy grzewczej, aby rozszerzyć naczynia krwionośne.</li>
	<li>Znieczulić mysz przepływem 2-3% izofluoranu/tlenu 5-10 minut przed wstrzyknięciem i w trakcie wstrzyknięcia. Potwierdź znieczulenie, gdy zwierzę nie jest już w ruchu, a oddechy zwolniły, wykonując szczypanie palca u nogi. Umieść mysz na plecach lub boku, aby uzyskać dostęp do żyły ogonowej. Użyj maści weterynaryjnej na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Wytrzyj/spryskaj ogon 70% EtOH i wstrzyknij 300 μl LSPC lub PALETS na żyłę ogonową myszy za pomocą strzykawki insulinowej 26 G. Wstrzyknąć dystalnie do żyły ogonowej i poruszać się proksymalnie, jeśli żyła zapadnie się lub pęknie.</li>
	<li>Umieść mysz w czystej klatce, aż utrzyma pozycję leżącą mostka. Nie umieszczaj myszy z innymi kolegami z klatki, dopóki w pełni nie dojdzie do siebie. Myszy powinny dojść do siebie w ciągu 5 do 15 minut. Można je umieścić na poduszce grzewczej lub pod lampą grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała, jeśli rekonwalescencja trwa dłużej. Myszy powinny być ściśle monitorowane, aby zabezpieczyć się przed przegrzaniem.</li>
	<li>Należy monitorować zwierzę kilka godzin po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że znieczulenie ustąpi i nie wystąpią żadne złe skutki leczenia. Pozwól LSPC lub PALETS krążyć przez co najmniej 24 godziny.</li>
</ol>
4. Analiza ekspresji białek za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Eutanazja myszy z natężeniem przepływu 20% CO2 przez 15 minut.</li>
	<li>Wypreparuj pół półkuli mózgu, odcinając skórę i czaszkę myszy za pomocą nożyczek. Oderwij pół półkuli mózgu od czaszki za pomocą szczypiec lub końca nożyczek.</li>
	<li>Przeciśnij pół półkuli mózgu każdej myszy przez siatkowy sitko o wielkości 40 μm, używając 2,5 ml buforu FACS (1x PBS, 1% płodowej surowicy bydlęcej, 10 mM EDTA) na szalce Petriego za pomocą tłoka strzykawki.</li>
	<li>Przepłukać sitko do komórek i szalkę Petriego dodatkowymi 2,5 ml buforu FACS. Zawiesinę jednokomórkową umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.</li>
	<li>Odmierzyć pipetą 100 μl 5 ml zawiesiny jednokomórkowej do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 350 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS. Wirować z prędkością 350 x g przez 5 min. Powtórzyć z kolejnym 1 ml buforu FACS. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Inkubować komórki w 100 μl rozcieńczenia 1:100 0,5 mg/ml przeciw-mysiego bloku Fc szczura w buforze FACS przez 30-60 minut na lodzie. Osadzać i myć komórki jak w kroku 4.5. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Inkubować komórki w 100 μl przeciwciała fluorescencyjnego o stężeniu 20 μg/ml przeciwko mysiemu PrPC w 7% surowicy myszy w buforze FACS na lodzie przez 30-60 min. Osadzać i myć komórki jak w kroku 4.5. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Osadzać i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy RBC (1x PBS, 155 mM NH4Cl, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) przez 1 minutę. Osad jak w kroku 4.5 i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu FACS. Zawiesinę komórkową należy przechowywać na lodzie.</li>
	<li>Analizować ekspresję PrPC za pomocą cytometru przepływowego, jak opisano wcześniej10. Bramka żywych komórek z całej populacji komórek. Bramka PrPC + komórki z żywej populacji komórek w celu określenia MFI (mediany intensywności fluorescencji).</li>
</ol>

<ol><li>Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).</li>
<li>McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease-resistant+protein+is+a+structural+component+of+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion.</a> Cell. 35 (1), 57-62 (1983).</li>
<li>Pruisner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+proteinaceous+infectious+particles+cause+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.</a> Science. 216 (4542), 136-144 (1982).</li>
<li>Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+sub-cellular+pathology+of+prion+diseases%3A+relationship+between+morphological+changes%2C+accumulation+of+abnormal+prion+protein+and+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease.</a> Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).</li>
<li>Büeler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+devoid+of+PrP+are+resistant+to+scrapie%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mice devoid of PrP are resistant to scrapie.</a> Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).</li>
<li>Pfeifer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivector-mediated+RNAi+efficiently+suppresses+prion+protein+and+prolongs+survival+of+scrapie-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice.</a> J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).</li>
<li>White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+treatment+with+RNAi+against+prion+protein+rescues+early+neuronal+dysfunction+and+prolongs+survival+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).</li>
<li>Gallozzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prnp+knockdown+in+transgenic+mice+using+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference.</a> Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).</li>
<li>Mallucci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+prion+protein+reverses+early+cognitive+deficits+and+neurophysiological+dysfunction+in+prion-infected+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice.</a> Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).</li>
<li>Pulford, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-siRNA-peptide+complexes+cross+the+blood-brain+barrier+and+significantly+decrease+PrPC+on+neuronal+cells+PrPRes+in+infected+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures.</a> PLoS One. 5 (6), (2010).</li>
<li>Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+liposome-mediated+RNA+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cationic liposome-mediated RNA transfection.</a> Proc Natl Acad Sci. 86, 6077-6081 (1989).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficiency+of+cationic+liposome-mediated+intravenous+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery.</a> Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).</li>
<li>Freimark, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipids+enhance+cytokine+and+cell+influx+levels+in+the+lung+following+administration+of+plasmid%3A+cationic+lipid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes.</a> J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).</li>
<li>Balzas, D. A., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+for+use+in+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Liposomes for use in gene delivery.</a> J Drug Deliv. , (2011).</li>
<li>Srinivasan, C., Burgess, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+anionic+lipoplexes+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery.</a> J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).</li>
<li>Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li>
<li>Tao, Y., Han, J., Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeting+gene+delivery+using+a+rabies+virus+glycoprotein+peptide+modulated+hollow+liposomes%3A+bio-behavioral+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mater+Chem%22%5BJournal%5D)">Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study.</a> J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).</li>
<li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li>
<li>Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes+for+intravenous+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery.</a> Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li>
<li>Voinea, M., Simionescu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+of+%27intelligent%27+liposomes+for+efficient+delivery+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+are+protected+from+excitotoxic+death+by+p53+antisense+oligonucleotides+delivered+in+anionic+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes.</a> J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).</li>
<li>Li, S., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+via+intravenous+administration+of+cationic+lipid-protamine-DNA+%28LPD%29+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes.</a> Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).</li>
<li>Büeler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+development+and+behaviour+of+mice+lacking+the+neuronal+cell-surface+PrP+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein.</a> Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).</li>
<li>Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+the+messenger%3A+short+RNAs+that+silence+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).</li>
<li>Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression+in+the+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus.</a> J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).</li>
<li>Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prion+proteins+are+synthesized+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Scrapie prion proteins are synthesized in neurons.</a> Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).</li>
<li>Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+prion+protein+gene+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the prion protein gene in glial cells.</a> Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).</li>
<li>Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+can+infect+primary+cultured+neurons+and+astrocytes+and+promote+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).</li>
<li>Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie-associated+prion+protein+accumulates+in+astrocytes+during+scrapie+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W niniejszym raporcie opisano protokół tworzenia dwóch ukierunkowanych systemów dostarczania, które skutecznie transportują siRNA do OUN. Poprzednie metody dostarczania siRNA do OUN obejmowały wstrzykiwanie wektorów siRNA/shRNA bezpośrednio do mózgu, dożylne wstrzykiwanie celowanego siRNA lub dożylne wstrzykiwanie niecelowanych kompleksów liposom-siRNA. Wstrzyknięcie wektorów siRNA/shRNA do OUN powoduje spadek docelowych poziomów ekspresji białka. Jednak siRNA/shRNA nie dyfunduje swobodnie przez OUN. Ponadto zastrzyki te...

Priony to poważne choroby neurodegeneracyjne, które wpływają na OUN. Choroby prionowe wynikają z nieprawidłowego fałdowania normalnego komórkowego białka prionowego, PrPC, przez zakaźny izomer zwany PrPRes. Choroby te dotykają wielu różnych gatunków, w tym gąbczastą encefalopatię bydła u krów, trzęsawkę owiec, przewlekłą chorobę wyniszczającą u jeleniowatych i chorobę Creutzfeldta-Jakoba u ludzi1-3. Priony powodują neurodegenerację, która zaczyna się od utraty synaps i przechodzi do wakuolizacji, glejozy, utraty neuronów i złogów blaszki miażdżycowej. Ostatecznie, co prowadzi do śmierci zwierzęcia/osobnika4. Przez dziesięciolecia naukowcy badali związki, które mają spowolnić lub zatrzymać postęp choroby prionowej. Jednak naukowcy nie znaleźli ani skutecznej terapii, ani skutecznego ogólnoustrojowego środka podawczego.
Endogenne wyrażenie PrPC jest wymagane do rozwoju chorób prionowych5. Dlatego zmniejszenie lub wyeliminowanie ekspresji PrPC może spowodować opóźnienie lub złagodzenie choroby. Kilka grup stworzyło transgeniczne myszy z obniżonym poziomem PrPC lub wstrzyknięto lentiwektory eksprymujące shRNA bezpośrednio do mysiej tkanki mózgowej w celu zbadania roli poziomów ekspresji PrPC w chorobie prionowej. Naukowcy odkryli, że zmniejszenie ilości neuronalnego PrPC spowodowało zatrzymanie postępującej neuropatologii chorób prionowych i wydłużyło życie zwierząto 6-9 lat. Informowaliśmy, że leczenie PrPC siRNA powoduje klirens PrPRes w komórkach nerwiaka zarodkowegomyszy 10. Badania te sugerują, że stosowanie terapii w celu zmniejszenia poziomu ekspresji PrPC, takich jak małe interferujące RNA (siRNA), które rozszczepia mRNA, może wystarczająco opóźnić postęp chorób prionowych. Jednak większość terapii badanych pod kątem chorób prionowych była dostarczana w sposób, który nie byłby praktyczny w warunkach klinicznych. Dlatego terapia siRNA wymaga ogólnoustrojowego systemu dostarczania, który jest dostarczany dożylnie i ukierunkowany na OUN.
Badacze badali wykorzystanie liposomów jako nośników produktów terapii genowej. Zarówno lipidy kationowe, jak i anionowe są wykorzystywane do tworzenia liposomów. Lipidy kationowe są szerzej stosowane niż lipidy anionowe, ponieważ różnica ładunków między lipidem kationowym a DNA/RNA pozwala na efektywne pakowanie. Kolejną zaletą lipidów kationowych jest to, że łatwiej przenikają przez błonę komórkową niż inne lipidy11-14. Jednak lipidy kationowe są bardziej immunogenne niż lipidy anionowe13,14. Dlatego naukowcy zaczęli przechodzić od stosowania lipidów kationowych do anionowych w liposomach. Produkty terapii genowej można skutecznie pakować w anionowe liposomy za pomocą dodatnio naładowanego peptydu siarczanu protaminy, który kondensuje cząsteczki DNA/RNA15-19. Ponieważ lipidy anionowe są mniej immunogenne niż lipidy kationowe, mogą mieć wydłużony czas krążenia i mogą być bardziej tolerowane w modelach zwierzęcych13,14. Liposomy są ukierunkowane na określone tkanki za pomocą peptydów celujących, które są przyłączone do liposomów. Neuropeptyd RVG-9r, który wiąże się z nikotynowymi receptorami acetylocholiny, został użyty do kierowania siRNA i liposomów do OUN17-20.
Ten raport przedstawia protokół do produkcji trzech nośników siRNA oraz do pakowania i dostarczania siRNA do komórek nerwowych (Rysunek 1). Kompleksy liposom-siRNA-peptydy (LSPC) składają się z liposomów z siRNA i peptydem celującym RVG-9r elektrostatycznie przyłączonym do zewnętrznej powierzchni liposomu. Terapeutyczne siRNA zamknięte w liposomach peptydowym (PALETS) składają się z siRNA i protaminy zamkniętych w liposomie, przy czym RVG-9r jest kowalencyjnie związany z lipidowymi grupami PEG. Korzystając z poniższych metod do generowania LSPC i PALETS, siRNA PrPC zmniejsza ekspresję PrPC do 90% w komórkach neuronalnych, co daje ogromną nadzieję na wyleczenie lub znaczne opóźnienie wystąpienia patologii choroby prionowej.

<table><tbody><tr><td>DOTAP lipid</td><td>Avanti Lipids</td><td>890890</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Lipids</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>DSPE</td><td>Avanti Lipidy</td><td>850715</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG</td><td>Avanti Lipidy</td><td>880125</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC268320010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>EMD Millipore</td><td>113351</td><td></td></tr><tr><td>N2 Gas</td><td>AirGas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza Fisher</td><td>Scientific</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>Wytłaczarka</td><td>Avanti Lipidy</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>1.0, 0.4 i 0.2 i #956; m filtry</td><td>Avanti Lipids</td><td>610010, 610007, 610006</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan protaminy</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN10275205</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>Podawany do jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>24510</td><td>Podany do jednorazowego użytku</td></tr><tr><td>40 &#956; m Sitko komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Szczurzy blok anty-mysi CD16/CD32 Fc</td><td>BD Pharmigen</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-PrP (PRC5)</td><td>Zastrzeżone - ChRL</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dostarczanie terapeutycznego sirna do oun za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Choroby prionowe wynikają z nieprawidłowego fałdowania normalnego, komórkowego białka prionowego (PrPC) do nieprawidłowego izomeru opornego na proteazy zwanego PrPRes. Pojawienie się chorób prionowych w populacjach dzikich zwierząt i ich rosnące zagrożenie dla zdrowia ludzkiego doprowadziło do wzmożonych wysiłków na rzecz znalezienia leczenia tych chorób. Ostatnie badania wykazały liczne związki antyprionowe, które mogą hamować zakaźny izomer PrPRes lub obniżać normalne komórkowe białko prionowe. Jednak większość z tych związków nie przekracza bariery krew-mózg, aby skutecznie hamować tworzenie PrPRes w tkance mózgowej, nie są specyficznie ukierunkowane na neuronalne PrPC i często są zbyt toksyczne, aby można je było stosować u zwierząt lub ludzi. 
Zbadaliśmy, czy siRNA dostarczane dorynkowo i ukierunkowane na neuronalne PrPC jest bezpieczniejszym i skuteczniejszym związkiem antyprionowym. W niniejszym raporcie przedstawiono protokół produkcji dwóch liposomalnych nośników siRNA oraz pakowania i dostarczania siRNA PrP do komórek neuronalnych. Dwa liposomalne nośniki dostarczania to 1) preparat liposomów skompleksowanego siRNA przy użyciu liposomów kationowych (LSPC) i 2) preparat liposomów kapsułkowanych siRNA przy użyciu liposomów kationowych lub anionowych (PALETS). W przypadku LSPC ujemnie naładowane siRNA jest elektrostatycznie związane z kationowym liposomem. Do kompleksu dodaje się dodatnio naładowany peptyd (RVG-9r [glikoproteina wirusa wścieklizny]), który specyficznie celuje w kompleksy liposom-siRNA-peptydy (LSPC) przez barierę krew-mózg (BBB) do neuronów eksprymujących acetylocholinę w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). W przypadku PALETS (terapeutyczne siRNA obudowane peptydem w kapsułkach) lipidy kationowe i anionowe zostały ponownie uwodnione przez siRNA PrP. Procedura ta powoduje enkapsulację siRNA w liposomach kationowych lub anionowych. Ponownie, neuropeptyd RVG-9r został związany z liposomami, aby skierować kompleksy siRNA/liposom do OUN. Korzystając z tych preparatów, z powodzeniem dostarczyliśmy siRNA PrP do neuronów wykazujących ekspresję AchR i zmniejszyliśmy ekspresję PrPC neuronów w OUN.

Aby zwiększyć wydajność enkapsulacji siRNA w anionowych PALETS, siRNA zmieszano z protaminą. W celu wyznaczenia optymalnego stężenia protaminy dla siRNA, siRNA zmieszano z różnymi stężeniami protaminy, w zakresie od 1:1 do 2:1 (Rycyna 3A). Wydajność enkapsulacji siRNA w liposomach anionowych bez użycia protaminy wynosiła 60-65%. Próbki o stosunkach molowych protamina:siRNA od 1:1 do 1,5:1 (133-266 nM) wykazywały 80-90% enkapsulacji siRNA. Stosunki molowe powyżej 1,5:1 pro...

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB. Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie systemu dostarczania, który umożliwi transport małocząsteczkowych leków, takich jak siRNA, do mózgu. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurodegeneracji, takie jak: Czy siRNA jest wykonalną opcją terapeutyczną w chorobach związanych z błędnym fałdowaniem białek? oraz Czy jesteśmy w stanie zaprojektować niezawodny system dostarczania leków do mózgu?Główną zaletą tworzenia liposomalnego systemu dostarczania leków jest możliwość podawania siRNA dożylnie lub poprzez krwiobieg, zamiast bezpośrednio do tkanki neuronalnej, co powoduje uszkodzenia neuronów. Zastosowania tej techniki obejmują terapię i diagnostykę chorób neurodegeneracyjnych, ponieważ pozwala ona na specyficzne dostarczenie substancji przez barierę krew-mózg, a konkretnie do neuronów wykazujących ekspresję acetylocholiny. Wizualna demonstracja tej techniki jest kluczowa, ponieważ iniekcje do żyły ogonowej myszy są trudne do opanowania ze względu na niewielki rozmiar tej żyły.Rozpocznij od przygotowania mieszaniny DOTAP i cholesterolu w stosunku 1:1. W celu przygotowania liposomów dla zwierząt obcych wymieszaj 2 nanomole DOTAP i 2 nanomole c

delivery-therapeutic-sirna-to-cns-using-cationic-anionic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kapsułkowanie leku zwiększa swoistość komórek nowotworowych i zmniejsza neurotoksyczność.

Wspomagane konwekcją dostarczanie naładowanych liposomów pokrytych glikolem polietylenowym do guza mózgu szczura

Źródło: Ullah, I., et.al. Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje precyzyjną technikę podawania donosowego w celu dostarczania ukierunkowanych na neurony kompleksów peptyd-siRNA do mózgu myszy za pomocą specjalistycznego urządzenia pozycjonującego. Znieczulone myszy są zabezpieczone w pozycji głowy w dół i do przodu, aby zoptymalizować wdychanie siRNA, jednocześnie...

donosowe podawanie siRNA do mózgu myszy za pomocą urządzenia pozycjonującego

Źródło: Bender, H. R., et.al. Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film pokazuje ukierunkowane dostarczanie siRNA białka prionowego (PrP) do neuronów za pomocą liposomalnych kompleksów siRNA-peptyd (LSPC). Liposomy kationowe wiążą elektrostatycznie siRNA ukierunkowane na PrP, które jest dodatkowo stabilizowane przez peptyd RVG-9r do transportu za pośrednictwem receptora przez barierę krew-mózg. Po dostaniu się do mózgu...

Ukierunkowane dostarczanie siRNA do neuronów w celu wyciszenia białek prionowych za pomocą kompleksów liposomalnych

Powtarzające się retro-orbitalne iniekcje kompleksów liposomów kationowych/siRNA/ITSN-1s u myszy, co 72 godziny przez 24 dni, skutecznie dostarczają duplex siRNA do mikrokrążenia płuc myszy, zmniejszając ekspresję mRNA i białka ITSN-1s o 75%. Technika ta jest wysoce powtarzalna w modelu zwierzęcym, nie ma żadnych skutków ubocznych i pozwala uniknąć ofiar śmiertelnych.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

Opisujemy metodę kierowania leków do ośrodkowego układu nerwowego poprzez wszczepienie cewnika lub wykonanie wstrzyknięcia bolusa do prawej bocznej komory u myszy. Skupiamy się w szczególności na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych. Technika ta można łatwo dostosować do innych leków i szczurów.

Bezpośrednie dokomorowe dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Dostarczanie pozostaje głównym wyzwaniem dla terapeutycznej implementacji małego interferującego RNA (siRNA). Protokół ten polega na wykorzystaniu wielofunkcyjnej i biokompatybilnej platformy dostarczania siRNA, składającej się z porowatych mikrocząstek krzemu szczepionych argininą i polietyleniną.

Porowate mikrocząsteczki krzemu do dostarczania terapii siRNA

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący urządzenie do pozycjonowania myszy, który umożliwia odpowiednie rozmieszczenie myszy do donosowego podawania preparatu peptydowo-siRNA ukierunkowanego na mózg, umożliwiając skuteczne wyciszanie genów w ośrodkowym układzie nerwowym.

Urządzenie pozycjonujące do umieszczania myszy podczas donosowego dostarczania siRNA do ośrodkowego układu nerwowego

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

Tutaj opisujemy metodę dostarczania leków do ośrodkowego układu nerwowego szczura poprzez wszczepienie cewnika w śródoponową przestrzeń lędźwiową kręgosłupa. Koncentrujemy się na dostarczaniu oligonukleotydów antysensownych, chociaż ta metoda nadaje się również do dostarczania innych metod terapeutycznych.

Dokanałowe dostarczanie oligonukleotydów antysensownych w ośrodkowym układzie nerwowym szczura

Poznaj metodę dostarczania terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych z peptydem neurotargetującym. Technika umożliwia przekroczenie bariery krew-mózg i zmniejsza uszkodzenia neuronów.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Przeglądaj więcej filmów