Name: Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Odkryj syntezę sond DNA z fotostabilnymi barwnikami cyjaninowymi do wizualizacji hybrydyzacji. Ta metoda umożliwia obserwację transferu energii i zmiany koloru fluorescencji w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Podziękowania finansowe ze strony Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386/17-1), Research Training Group GRK 2039 (finansowanej przez DFG) oraz KIT.

Uwaga: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Kilka substancji chemicznych stosowanych w tych syntezach jest toksycznych i rakotwórczych. Należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, które są zwykle wymagane w laboratoriach chemii organicznej, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, okularów ochronnych i rękawic.
1. Synteza barwników
Uwaga: Oba barwniki mogą być syntetyzowane przez te same typy reakcji. Rysunek 2 przedstawia przegląd tych reakcji.
<ol>
	<li>Synteza jodku 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-1H-indol-3-ylo)winylo)pirydyno-1-iodku (barwnik 1)
	<ol>
		<li>Synteza jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopirydyno-1-iowego jodku (rysunek 2A, etap a)
		<ol>
			<li>Rozpuścić 466 mg 4-pikoliny i 5,91 g 1,3-dijodopropanu w 10 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową i szczelnie zamknąć pokrywą przegrody.</li>
			<li>Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą parownika obrotowego.</li>
			<li>Dodać 20 ml octanu etylu do pozostałego oleju i poddać mieszaninę działaniu w łaźni ultradźwiękowej o mocy 120 W przez 3 minuty.</li>
			<li>Zebrać powstały osad przez filtrację i przemyć pięciokrotnie octanem etylu. Wysuszyć stały produkt w próżni O/N.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Synteza 1-(3-azydopropylo)-4-metylopirydyno-1-ium (rysunek 2A, krok b)
		<ol>
			<li>Rozpuścić 900 mg jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopirydyno-1-iowego w 12 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową, dodać 376 mg azydku sodu i szczelnie zamknąć pokrywą przegrody.</li>
			<li>Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury suchej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.</li>
			<li>Dodać 15 ml dichlorometanu do pozostałości.</li>
			<li>Odfiltrować i wyrzucić powstały osad.</li>
			<li>Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać produkt w postaci brązowego oleju.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Synteza 1-metylo-1H-indolo-3-karbaldehydu (Rysunek 2A, krok c)
		<ol>
			<li>W atmosferze gazu obojętnego (argonu) rozpuścić 1,45 g indolo-3-karbaldehydu, 1,52 g węglanu potasu i 2,70 g węglanu dimetylu w 10 ml absolutnego dimetyloformamidu w 50 ml kolby okrągłodennej wyposażonej w chłodnicę zwrotną.</li>
			<li>Mieszać mieszaninę w temperaturze 130 °C przez 19 godzin.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury mokrej, a następnie wlać mieszaninę na lód.</li>
			<li>Usunąć warstwę wodną trzykrotnie za pomocą 150 ml octanu etylu.</li>
			<li>Połączyć warstwy organiczne, umyć je wodą, wysuszyć na siarczanie sodu i usunąć rozpuszczalnik w temperaturze 50 °C pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sprzężenie z jodkiem 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-1H-indol-3-ylo)winylo)pirydyno-1-iodowego (barwnik 1) (Rysunek 2A, krok d)
		<ol>
			<li>Pracuj w argonie i bez wilgoci. Rozpuścić 90 mg 1-(3-azydopropylo)-4-metylopirydyno-1-ium i 48 mg 1-metylo-1H-indolo-3-karbaldehydu w 4 ml etanolu w kolbie okrągłodennej o pojemności 20 ml wyposażonej w chłodnicę zwrotną.</li>
			<li>Dodać 0,07 ml piperydyny i podgrzewać do temperatury 80 °C przez 4 godziny.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT.</li>
			<li>Zebrać powstały osad przez filtrację i przemyć trzykrotnie eterem dietylowym.</li>
			<li>Dodać eter dietylowy do supernatantu i zebrać powstały osad przez filtrację. Umyć trzy razy eterem dietylowym.</li>
			<li>Połącz osady.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza jodku 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-2-fenylo-1H-indol-3-ylo)winylo)chinolino-1-iowego jodku (barwnik 2)
	<ol>
		<li>Synteza jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopilinolin-1-iowego (Rysunek 2B, krok a)
		<ol>
			<li>Rozpuścić 715 mg 4-metylochinoliny i 5,91 g 1,3-dijodopropanu w 10 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową i szczelnie zamknąć pokrywą z przegrodą.</li>
			<li>Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury suchej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.</li>
			<li>Dodać 20 ml octanu etylu do pozostałego oleju i poddać mieszaninę działaniu w łaźni ultradźwiękowej o mocy 120 W przez 3 minuty.</li>
			<li>Zebrać powstały osad przez filtrację i przemyć pięciokrotnie octanem etylu. Wysuszyć stały produkt w próżni O/N.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Synteza 1-(3-azydopropylo)-4-metylopinolino-1-ium (Rysunek 2B, krok b)
		<ol>
			<li>Rozpuścić 900 mg jodku 1-(3-jodopropylo)-4-metylopilinolin-1-ium w 12 ml acetonitrylu w 20 ml fiolki z przestrzenią nad głową, dodać 333 mg azydku sodu i szczelnie zamknąć pokrywą przegrody.</li>
			<li>Podgrzewać do 85 °C przez 16 godzin.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury suchej, a następnie usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.</li>
			<li>Dodać 15 ml dichlorometanu do pozostałości.</li>
			<li>Odfiltrować i wyrzucić powstały osad.</li>
			<li>Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać produkt w postaci brązowego oleju.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Synteza 1-metylo-2-fenylo-1H-indolo-3-karbaldehydu (rysunek 2B, krok c)
		<ol>
			<li>W atmosferze gazu obojętnego (argonu) rozpuścić 1,45 g 2-fenylo-1H-indolo-3-karbaldehydu, 0,996 g węglanu potasu i 1,77 g węglanu dimetylu w 10 ml absolutnego dimetyloformamidu w 50 ml kolbie okrągłodennej wyposażonej w chłodnicę zwrotną.</li>
			<li>Mieszać mieszaninę w temperaturze 130 °C przez 19 godzin.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury mokrej, a następnie wlać mieszaninę na lód.</li>
			<li>Usunąć warstwę wodną trzykrotnie za pomocą 150 ml octanu etylu.</li>
			<li>Połączyć warstwy organiczne, umyć je wodą, wysuszyć na siarczanie sodu i usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Sprzężenie z jodkiem 1-(3-azydopropylo)-4-(2-(1-metylo-2-phe nyl-1H-indol-3-ylo)winylo)chinolino-1-iodowego (Rysunek 2B, krok d)
		<ol>
			<li>Pracuj w argonie i bez wilgoci. Rozpuścić 90 mg 1-(3-azydopropylo)-4-metylochinolino-1-ium i 59,7 mg 1-metylo-2-fenylo-1H-indolo-3-karbaldehydu w 4 ml etanolu w kolbie okrągłodennej o pojemności 20 ml wyposażonej w chłodnicę zwrotną.</li>
			<li>Dodać 0,06 ml piperydyny i podgrzewać do temperatury 80 °C przez 4 godziny.</li>
			<li>Pozostawić do ostygnięcia do temperatury RT.</li>
			<li>Zebrać powstały osad przez filtrację i trzykrotnie przemyć eterem dietylowym.</li>
			<li>Dodać eter dietylowy do supernatantu i zebrać powstały osad przez filtrację. Umyć trzy razy eterem dietylowym.</li>
			<li>Połącz osady.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Synteza nici DNA
Uwaga: Synteza nici DNA odbywa się metodą fosforamidytu na fazie stałej, jak to opisał M. Caruthers11 na syntezatorze DNA. Działanie syntezatora jest testowane przed zabiegiem syntezy, a odczynniki są w razie potrzeby odnawiane.
<ol>
	<li>Wstępne ustalenia
	<ol>
		<li>Rozpuścić dostępny w handlu 2'-O-propargyl-deoksyurydynofosforamidyt (cU) w 1,2 ml rozcieńczalnika amidytowego (ekstra suchy acetonitryl). Przenieść roztwór z fiolki do fiolki syntezatora i wkręcić do syntezatora.</li>
		<li>Wykonaj "próbę szczelności" (zgodnie z instrukcjami producenta), aby upewnić się, że nie ma wycieku argonu. Jeśli "próba szczelności" nie powiedzie się, należy mocniej przykręcić fiolkę.</li>
		<li>Zalać roztwór cU, napełniając rurkę łączącą się z komorą syntezy w fazie stałej.</li>
		<li>Umyj wszystkie linie acetonitrylem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza nici DNA
	<ol>
		<li>Użyj podłączonego komputera, aby wprowadzić sekwencję DNA i metodę sprzężenia, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole producenta. Krok sprzężenia bloku konstrukcyjnego cU trwa 168 sekund przy 7 impulsach (każdy impuls ma 16 μl) w porównaniu do 40 sekund przy 7 impulsach dla konwencjonalnego fosforoamidytu jako elementów budulcowych.</li>
		<li>Zamontuj kolumnę zawierającą CPG (szkło o kontrolowanych porach) jako fazę stałą, która jest modyfikowana 1 μmolem pierwszej zasady (syntezę DNA przeprowadza się od 3' do 5') do syntezatora.</li>
		<li>Rozpocznij syntezę na syntezatorze DNA11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie zsyntetyzowanych nici DNA
	<ol>
		<li>Wysuszyć kolumny ze zsyntetyzowanymi niciami DNA w próżni O/N.</li>
		<li>Użyj szczypiec, aby otworzyć kolumnę i uwolnić CPG do fiolki reakcyjnej. Dodać 700 μl stężonego wodnego roztworu amoniaku, aby zdeprotect oligonukleotyd i uwolnić nić DNA z CPG.</li>
		<li>Zamknąć fiolkę i nałożyć pokrywkę zabezpieczającą na naczynie reakcyjne, aby zapobiec jego pęknięciu, a następnie podgrzewać do temperatury 50 °C przez 18 godzin.</li>
		<li>Usunąć amoniak przez odwirowanie pod zmniejszonym ciśnieniem (100 mbar) w temperaturze 30 °C przez 30 minut.</li>
		<li>Rozpocznij filtrację od CPG: Naczynie wirówkowe o sile 11 000 x g przez 3 min. Weź supernatant i przenieś go do urządzenia odśrodkowego o wielkości porów 0,45 μm. Wirować przy 1.000 x g przez 4 min.</li>
		<li>W międzyczasie dodać 300 μl podwójnie destylowanej wody do CPG, wirować przez 20 sekund i wirować przy 11 000 x g przez 3 min. Przenieść supernatant do urządzenia odśrodkowego i wirować przy 1 000 x g przez 4 min. Powtórzyć tę procedurę mycia dwukrotnie.</li>
		<li>Usunąć wodę z połączonych roztworów wodnych przez odwirowanie w temperaturze 0,1 mbar i temperaturze O/N w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Procedura "Klikania"
<ol>
	<li>Do liofilizowanej próbki DNA modyfikowanego alkinem dodać 50 μl podwójnie destylowanej wody, 25 μl roztworu askorbinianu sodu (0,4 M w wodzie), 34 μl tris-[(1-benzylo-1H-1,2,3-triazol-4-ylo)metylo]aminy (0,1 M w DMSO/tBuOH 3:1), 114 μl azydku (0,01 M w DMSO/tBuOH 3:1) i 17 μl roztworu tetrakis(acetonitrylu) miedzi(I)heksafluorofosforanu (0,1 M w DMSO/tBuOH 3:1).</li>
	<li>Inkubować próbkę w temperaturze 60 °C przez 1,5 godziny.</li>
	<li>Chłodny do RT.</li>
	<li>Dodać 150 μl Na2EDTA (0,05 M w wodzie) i 450 μl octanu sodu (0,3 M w wodzie) do próbki DNA i przenieść do probówki o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Dodać 10 ml etanolu (100%) i przechowywać w temperaturze -32 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Odwirować naczynie przez 15 minut przy 1 000 x g i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przemyć osad DNA 2 ml zimnego etanolu (80%).</li>
	<li>Suchy pellet pod zmniejszonym ciśnieniem.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie HPLC
Uwaga: Przed rozdzieleniem nici DNA upewnij się, że HPLC działa prawidłowo, dostępna jest wystarczająca ilość rozpuszczalnika i kolumna jest czysta. Przepłukać kolumnę początkowym stężeniem buforu/acetonitrylu.
<ol>
	<li>Rozpuścić surowy osad DNA w 250 μl podwójnie destylowanej wody i przenieść do fiolki HPLC.</li>
	<li>Rozpocznij 45-minutowy przebieg HPLC od gradientu od 0% acetonitrylu do 15% acetonitrylu dla barwnika 1 i gradientu od 0% acetonitrylu do 17% acetonitrylu dla barwnika 2. Monitoruj przebieg, sprawdzając 260 nm (absorpcja DNA) i 459 nm (barwnik 1) lub 542 nm (barwnik 2). Zbierz te frakcje, które wykazują absorpcję w obu kanałach długości fali.</li>
	<li>Sprawdź zebrane frakcje pod kątem właściwej masy za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą desorpcją i jonizacją (MALDI) przy użyciu matrycy składającej się z kwasu 3-hydroksypikolinowego (3HPA) i wodorocytrynianu diamonu.
	<ol>
		<li>Przygotować matrycę, mieszając 900 μl nasyconego roztworu 3-HPA w mieszaninie acetonitrylu i wody w stosunku 1:1 ze 100 μl roztworu wodorocytrynianu dwuamonu (100 g/l) w wodzie.</li>
		<li>Odpipetować 1-2 μl sondy DNA na tarczy i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Dodać 0,2 μl matrycy 3-HPA/wodorocytrynianu diamonu do próbki i mieszać aż do jej krystalizacji.</li>
		<li>Wykonaj spektrometrię mas MALDI.</li>
		<li>Połącz te frakcje HPLC, które wykazują odpowiednią masę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Oznaczanie stężenia
Uwaga: Stężenie określa się poprzez pomiar absorpcji przy 260 nm za pomocą spektrofotometru UV/Vis, na podstawie współczynników ekstynkcji (ε260) zasad DNA i barwnika.
<ol>
	<li>Rozpuść DNA w 100 - 200 μl podwójnie destylowanej wody.</li>
	<li>Nanieść 1 μl roztworu DNA na spektrofotometr UV/Vis.</li>
	<li>Zmierzyć absorpcję przy 260 nm. Powtórz trzy razy.</li>
	<li>Weź średnią wartość, aby obliczyć stężenie roztworu. Do obliczenia współczynników ekstynkcji należy użyćε 260 nm z czterech naturalnych zasad12 i ε260 nm zakupionego bloku budulcowego cU (uznawanego za naturalną urydynę)12, aby uzyskać ε260 nm całej nici DNA. Dla barwnika 1 użyj ε260 nm = 10 200 L * mol-1 * cm-1 i dla barwnika 2 użyj ε260 nm = 13 100 L * mol-1 * cm-1. Obliczyć stężenie roztworu zgodnie z prawem Lamberta-Beersa na podstawie współczynników ekstynkcji i zmierzonych absorbancji. 13</li>
</ol>
6. Przygotowanie próbki i spektroskopia
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek jednoniciowych
	<ol>
		<li>Przygotować oddzielnie 1 ml 2,5 μM roztworów każdego ze zmodyfikowanych DNA1 i DNA2 w 200 mM NaCl, 50 mM NaPi buforze, pH = 7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek dwuniciowych
	<ol>
		<li>Przygotować 1 ml roztworu zawierającego 2,5 μM DNA1 i 2,5 μM DNA2 w 200 mM NaCl, 50 mM NaPi buforze, pH = 7 w naczyniu reakcyjnym.</li>
		<li>Zabezpiecz pokrywę nasadką zabezpieczającą i podgrzewaj do 90 °C przez 10 minut. Następnie wyłącz ogrzewanie i pozostaw do ostygnięcia do RT O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spektroskopia absorpcyjna 
	Uwaga: W celu określenia długości fali wzbudzenia dla spektroskopii fluorescencyjnej rejestrowane są widma absorpcyjne.
	<ol>
		<li>Pomiary pojedynczej nici
		<ol>
			<li>Zapisać ślepą próbę zawierającą tylko 200 mM NaCl, 50 mM NaPi bufor, pH = 7.</li>
			<li>Przenieś przygotowany roztwór DNA1 do kuwety ze szkła kwarcowego o średnicy 1 cm i zapisz absorpcję. Skoryguj pomiar względem pustych danych. Określ maksymalną wartość wchłaniania barwnika.</li>
			<li>Powtórz dla DNA2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spektroskopia fluorescencyjna
	<ol>
		<li>Pomiary pojedynczej nici
		<ol>
			<li>Zapisać ślepą próbę zawierającą tylko 200 mM NaCl, 50 mM NaPi bufor, pH = 7; stosując długość fali wzbudzenia barwnika 1.</li>
			<li>Przenieś roztwór DNA1 do 1-centymetrowej kuwety ze szkła kwarcowego.</li>
			<li>Zapisz widmo fluorescencji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Pomiar podwójnej nici
		<ol>
			<li>Przenieś roztwór dwupasmowy do kuwety ze szkła kwarcowego.</li>
			<li>Zapisz widmo fluorescencji przy użyciu długości fali wzbudzenia barwnika 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymenty z wizualizacją 
	Uwaga: Należy nosić odpowiednią ochronę oczu, aby uniknąć uszkodzenia oczu przez promieniowanie UV!
	<ol>
		<li>Aby lepiej zrozumieć, co pokazują zarejestrowane widma, należy naświetlić kuwety ręcznymi lampami UV (ryc. 5). Obserwuj zmianę koloru fluorescencji z jednoniciowego na dwuniciowy DNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+for+fluorescent+probe+design+in+medical+diagnostic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging.</a> Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).</li>
<li>Berezin, M. Y., Achilefu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Lifetime+Measurements+and+Biological+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging.</a> Chem. Rev. 110 (5), 2641-2684 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., Vendrell, M., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity-oriented+optical+imaging+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Diversity-oriented optical imaging probe development.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15 (6), 760-767 (2011).</li>
<li>Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+molecular+beacons+for+allele+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicolor molecular beacons for allele discrimination.</a> Nat. Biotechnol. 16 (1), 49-53 (1998).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%3B%3A+Concept+of+Wavelength-Shifting+DNA+Probes+and+Application+in+an+Aptasensor%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">#34;DNA Traffic Lights&#34;: Concept of Wavelength-Shifting DNA Probes and Application in an Aptasensor.</a> ChemBioChem. 13 (8), 1136-1138 (2012).</li>
<li>Holzhauser, C., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%3A+Synthetic+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Probes+Based+on+Nucleic+Acid+Base+Substitutes+for+Molecular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA &#34;Traffic Lights&#34;: Synthetic Wavelength-Shifting Fluorescent Probes Based on Nucleic Acid Base Substitutes for Molecular Imaging.</a> J. Org. Chem. 78 (15), 7373-7379 (2013).</li>
<li>Berndl, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Color+Readout+of+DNA+Hybridization+with+Thiazole+Orange+as+an+Artificial+DNA+Base%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Color Readout of DNA Hybridization with Thiazole Orange as an Artificial DNA Base.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (13), 2418-2421 (2009).</li>
<li>Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+Photostable+Energy-Transfer+Pair+for+%26%2334%3BDNA+Traffic+Lights%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a Photostable Energy-Transfer Pair for &#34;DNA Traffic Lights&#34.</a> Eur. J. Org. Chem. 34, 7547-7551 (2014).</li>
<li>Walter, H. K., Bohländer, P. R., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Wavelength-Shifting+Fluorescent+Module+for+the+Adenosine+Aptamer+Using+Photostable+Cyanine+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22ChemistryOpen%22%5BJournal%5D)">Development of a Wavelength-Shifting Fluorescent Module for the Adenosine Aptamer Using Photostable Cyanine Dyes.</a> ChemistryOpen. 4 (2), 92-96 (2015).</li>
<li>Gierlich, J., Burley, G. A., Gramlicj, P. M. E., Hammond, D. M., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+chemistry+as+a+reliable+method+for+the+high-density+postsynthetic+functionalization+of+alkyne-modified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Click chemistry as a reliable method for the high-density postsynthetic functionalization of alkyne-modified DNA.</a> Org. Lett. 8 (17), 3639-3642 (2006).</li>
<li>Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+deoxyoligonucleotides+on+a+polymer+support%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthesis of deoxyoligonucleotides on a polymer support.</a> J. Am. Chem. Soc. 103 (11), 3185-3191 (1981).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%2C+Volume+1%3A+Nucleic+Acids%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Volume 1: Nucleic Acids</a>. Fasman, G. D. , CRC Press. 589(1975).</li>
<li>Puglisi, J. D., Tinoco, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorbance+melting+curves+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Absorbance melting curves of RNA.</a> Meth. Enzymol. 180, 304-325 (1989).</li>
<li>Johansson, M. K., Fidder, H., Dick, D., Cook, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+Dimers%3A+A+New+Strategy+to+Fluorescence+Quenching+in+Dual-Labeled+Oligonucleotide+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Intramolecular Dimers: A New Strategy to Fluorescence Quenching in Dual-Labeled Oligonucleotide Probes.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 6950-6956 (2002).</li>
<li>Barrois, S., Wörner, S., Wagenknecht, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Duplex+Stability+for+Wavelength-Shifting+Fluorescent+DNA+Probes%3A+Energy+Transfer+vs+Excition+Interactions+in+DNA+%26%2334%3BTraffic+Lights%26%2334%3B%2C+Photochem%5BTitle%5D)+AND+%22Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The Role of Duplex Stability for Wavelength-Shifting Fluorescent DNA Probes: Energy Transfer vs Excition Interactions in DNA &#34;Traffic Lights&#34;, Photochem.</a> Photobiol. Sci. 13, 1126-1129 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia pełną procedurę znakowania DNA po syntezie za pomocą CuAAC za pomocą barwników fluorescencyjnych modyfikowanych azydkiem. Obejmuje to syntezę barwników i DNA modyfikowanego alkinami, a także procedurę znakowania.
Synteza barwników przebiega w czterech etapach. Wszystkie produkty można uzyskać przez dość proste wytrącanie ze względu na ich ładunek dodatni i nie jest potrzebna czasochłonna chromatografia kolumnowa. Wprowadzenie funkcji azydku przed centralnymi etapami sp...

Obrazowanie molekularne stanowi podstawową technikę do zrozumienia procesów biologicznych w żywych komórkach. 1-3 Rozwój sond fluorescencyjnych opartych na kwasach nukleinowych do takich zastosowań chemiczno-biologicznych stał się rozwijającą się dziedziną badań. Te sondy fluorescencyjne muszą spełniać kilka wymagań, aby stać się odpowiednimi narzędziami do obrazowania komórek. Po pierwsze, zastosowane barwniki powinny wykazywać fluorescencję o wysokiej wydajności kwantowej, duże przesunięcia Stokesa i, co najważniejsze, wysoką fotostabilność, aby umożliwić długoterminowe obrazowanie in vivo. A po drugie, powinny pokazywać wiarygodny odczyt fluorescencji. Konwencjonalne systemy wygaszania chromoforu opierają się na odczycie pojedynczej barwy fluorescencji poprzez proste zmiany intensywności fluorescencji. 4 Takie podejście niesie ze sobą ryzyko wyników fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych z powodu autofluorescencji składników wewnątrzkomórkowych lub niskiego stosunku sygnału do szumu z powodu niepożądanego wygaszania przez inne składniki. 4
Niedawno informowaliśmy o koncepcji "sygnalizacji świetlnej DNA", która pokazuje podwójne odczyty kolorów fluorescencji przy użyciu dwóch różnych chromoforów. 5-6 Koncepcja opiera się na transferze energii (ET) z barwnika donorowego do barwnika akceptorowego, który zmienia kolor fluorescencji (patrz rysunek 1). Pozwala to na bardziej wiarygodny odczyt, a tym samym zapewnia potężne narzędzie dla sond do obrazowania fluorescencyjnego. Znakowanie oligonukleotydów barwnikami fluorescencyjnymi można osiągnąć za pomocą dwóch różnych podejść. Barwniki mogą być włączane podczas chemicznej syntezy DNA w fazie stałej za pomocą odpowiednio zmodyfikowanych bloków budulcowych fosforoamidytu. 7 Metoda ta jest ograniczona do barwników, które są stabilne w standardowych warunkach fosforoamidytu i deprotekcji. Alternatywnie opracowano metodologie modyfikacji postsyntetycznej w chemii oligonukleotydów. Tutaj demonstrujemy syntezę jednej z naszych nowych par fotostabilnego transferu energii8,9 i postsyntetyczne znakowanie DNA za pomocą katalizowanej miedzią 1,3-cykloaddycji między azydkami a alkinami (CuAAC). 10

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silna>synteza</td></tr><tr><td>4-Picoline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239615</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Diiodopropan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238414</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>10660131</td><td>klasy HPLC</td></tr><tr><td>Octan etylu</td><td>Fisher Scientific</td><td>10456870</td><td>techniczny</td></tr><tr><td>klasy azydek</td> <td>soduSigma Aldrich</td><td>71290</td><td>p.a. grade</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>10626642</td><td>techniczny klasy</td></tr><tr><td>indolo-3-karboksyaldehyd; 98%</td><td>ABCR</td><td>AB112969</td><td></td></tr><tr><td>Węglan potasu, 99+%</td><td>Acros</td><td>424081000</td><td></td></tr><tr><td>węglan dimetylu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>517127</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetyloformamid, 99,8%, Extra Dry over Molecular Screen</td><td>Acros</td><td>348435000</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan sodu</td><td>Bernd Kraft</td><td>12623.46</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 99,5%</td> <td>Acros</td><td>397690010</td><td></td></tr><tr><td>Piperydyna, 99%</td> <td>Acros</td><td>147181000</td><td></td></tr><tr><td>Dietyllether</td><td>Fisher Scientific</td><td>10407830</td><td>techniczny</td></tr><tr><td>2-fenyloindolo-3-karboksyaldehyd; 97%</td><td>ABCR</td><td>AB125050</td><td></td></tr><tr><td>4-metylochinolina</td><td>ABCR</td><td>AB117222</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">synteza DNA</td></tr><tr><td>Expedite 8909 Syntezator kwasów nukleinowych</td><td>Applied Biosystems</td><td>&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dA(bz) Fosforoamidyn</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A111081</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dT Fosforoamidyn</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>T111081</tr><tr><td>DMT-dG(dmf) Fosforoamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G11508</td><td></td></tr><tr><td>DMT-dC(bz) Fosforoamidyn</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C11108</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik amidytowy do syntezy DNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010010</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysty acetonitryl do syntezy DNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L010400</td><td></td></tr><tr><td>Cap A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L840000</td><td></td></tr><tr><td>Cap B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L850000</td><td></td></tr><tr><td>CPG dT Kolumna 1.0&nbsp; &mikro; mole</td><td>Proligo Odczynniki</td><td>T461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dA(bz) Kolumna 1.0&nbsp; &mikro; mole</td><td>Proligo Odczynniki</td><td>A461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dG(ib) Kolumna 1.0&nbsp; &mikro; mole</td><td>Proligo Odczynniki</td><td>G461010</td><td></td></tr><tr><td>CPG dC(bz) Kolumna 1.0&nbsp; &mikro; mole</td><td>Proligo Odczynniki</td><td>C461010</td><td></td></tr><tr><td>amoniaku (roztwór wodny)&nbsp;</td><td>Fluka Analityczne</td><td>318612</td><td></td></tr><tr><td>urządzenia odśrodkowe o średnicy 0,45&nbsp; &mikro; m</td><td>Pall</td><td>ODGHPC34</td><td></td></tr><tr><td>5-(Benzylthio)-1H-tetrazol (Aktywator)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75666</td><td></td></tr><tr><td>2'-O-propargyl deoksyurydynofosforamidyt</td><td>Geny chemiczne</td><td>ANP-7754</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">workup</td></tr><tr><td>vacuum koncentrator</td><td>Christ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>clicking procedure </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis(acetonitryl)heksafluorofosforan miedzi(I)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>346276</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>TBTA-ligand</td><td>&nbsp;-</td><td>&nbsp;-</td><td>zsyntetyzowane zgodnie z procedurą literaturową1</td></tr><tr><td colspan="4">HPLC</td></tr><tr><td>HPLC-system</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MALDI-Biflex-IV spektrometr</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LC-318 C18 kolumna</td><td>Supelcosil przez Sigma Aldrich</td><td>58368</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">oznaczanie stężenia</td></tr><tr><td>ND 1000 Spektrofotometr</td><td>nanodrop</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">przygotowanie próbki i spektroskopia</td></tr><tr><td>Cary 100 Bio</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromax-3 fluorymetr</td><td>Jobin-Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.</td></tr></tbody></table>

synteza sond hybrydyzacyjnych dna zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

W tym protokole demonstrujemy metodę syntezy nici kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) modyfikowanego 2'-alkinem poprzez automatyczną syntezę fazy stałej przy użyciu standardowej chemii fosforamidytu. Oligonukleotydy są znakowane postsyntetycznie za pomocą dwóch nowych fotostabilnych barwników cyjaninowych przy użyciu katalizowanej miedzią chemii klikającej. Opisano syntezę zarówno barwnika donorowego, jak i akceptorowego, która odbywa się w trzech kolejnych etapach. Z DNA jako otaczającą architekturą, te dwa barwniki ulegają transferowi energii, gdy są zbliżane do siebie przez hybrydyzację. Dlatego wyżarzanie dwóch jednoniciowych nici DNA jest wizualizowane przez zmianę koloru fluorescencji. Ta zmiana koloru jest charakterystyczna dla spektroskopii fluorescencyjnej, ale można ją również bezpośrednio zaobserwować za pomocą ręcznej lampy ultrafioletowej (UV). Koncepcja podwójnego fluorescencyjnego odczytu koloru sprawia, że te sondy oligonukleotydowe są doskonałymi narzędziami do obrazowania molekularnego, zwłaszcza gdy stosowane są opisane barwniki fotostabilne. W ten sposób zapobiega się fotowybielaniu sond obrazujących, a procesy biologiczne można obserwować w czasie rzeczywistym przez dłuższy czas.

Widma absorpcji i fluorescencji jednoniciowego i dwuniciowego DNA zostały zarejestrowane, jak pokazano na Rysunku 4.
Zarejestrowane widma absorpcyjne (Rysunek 4 prawa) wykazują maksima absorpcji λmax przy 465 nm dla jednoniciowego DNA1 (barwnik 1) oraz 546 nm dla jednoniciowego DNA2 (barwnik 2). Wyżarzone DNA1_2 (barwnik 1 i barwnik 2) wykazuje maksima zarówno przy 469 nm, jak i 567 n...

Fotostabilne barwniki cyjaninowe są dołączane do oligonukleotydów w celu monitorowania hybrydyzacji poprzez transfer energii.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja transferu energii z jednej zmodyfikowanej barwnikiem nici DNA do drugiej. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych kwestii z zakresu biologii molekularnej, takich jak interferencja RNA poprzez monitorowanie przetwarzania i integralności siRNA w żywych komórkach w czasie rzeczywistym.Główną zaletą tej techniki jest łatwość monitorowania zasięgu fluorescencji oraz zmiany barwy, co pozwala uzyskać jednoznaczny wynik. Dzięki temu wyeliminowano wyniki fałszywie dodatnie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać odpowiednie odczynniki, wskazane w protokole tekstowym, do kolby okrągłodennej o pojemności 20 ml, wyposażonej w magnes mieszający i chłodnicę zwrotną.Następnie należy dodać 0,06 ml piperydyny i ogrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 80 °C przez cztery godziny. Po ostygnięciu mieszaniny do temperatury pokojowej otrzymany osad należy zebrać poprzez filtrację.Następnie trzy razy przemyć eterem dietylowym. Potem do nadsączu dodać sto mililitrów eteru dietylowego. Powstały osad zebrać poprzez filtrację.Po trzykrotnym przemyciu eterem etylowym połączyć osad z ciałem stałym wyizolowanym podczas pierwszej filtracji. Za pomocą

synthesis-wavelength-shifting-dna-hybridization-probes-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Opisana jest ilościowa metoda analizy czasu replikacji chromosomów. Metoda wykorzystuje inkorporację BrdU w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ (FISH) w celu oceny czasu replikacji chromosomów ssaków. Technika ta pozwala na bezpośrednie porównanie przegrupowanych i nieprzegrupowanych chromosomów w tej samej komórce.

Czas replikacji chromosomów w połączeniu z fluorescencyjną hybrydyzacją in situ

Film demonstruje metodę oceny sił receptorów wywieranych przez komórki odpornościowe za pomocą nanocząsteczek złota zakotwiczonych w glikolu polietylenowym i sond napinających spinki do włosów DNA. Interakcje limfocytów T CD8-dodatnich powodują rozwijanie sondy, emitując fluorescencję, podczas gdy nici blokujące podtrzymują sygnał do ilościowego określania sił wywieranych przez komórki odpornościowe.

Wykorzystanie sond napięcia opartych na DNA do oceny sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe

Opisujemy solidny i wszechstronny protokół do analizy architektury jądrowej za pomocą 3D DNA FISH przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond fluorescencyjnych.

Solidna ryba DNA 3D przy użyciu bezpośrednio znakowanych sond

Tutaj prezentujemy prostą metodę przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji DNA in situ (DNA ISH) w celu wizualizacji powtarzających się sekwencji heterochromatycznych na chromosomach montowanych na szkiełkach. Metoda wymaga minimalnej ilości odczynników i jest uniwersalna w użyciu z krótkimi lub długimi sondami, różnymi tkankami oraz detekcją za pomocą sygnałów fluorescencyjnych lub nieopartych na fluorescencji.

Prosta metoda fluorescencji DNA Hybrydyzacja in situ do zgniecionych chromosomów

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Tutaj prezentujemy protokół użycia oranżu tiazolowego do wykrywania DNA w eksperymentach z elektroforezą żelową. Zastosowanie oranżu tiazolowego pozwala na eliminację bromku etydyny, a detekcję fluorescencji można osiągnąć za pomocą światła UV lub niebieskiego.

Elektroforeza DNA z użyciem oranżu tiazolowego zamiast bromku etydyny lub alternatywnych barwników

Ten protokół opisuje zastosowanie hybrydyzacji in situ fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFISH) do pomiaru kinetyki in vivo syntezy i degradacji mRNA.

Sondowanie kinetyki mRNA w czasie i przestrzeni u Escherichia coli przy użyciu dwukolorowej hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół użycia sond napięcia opartych na DNA do obrazowania sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe. Takie podejście może mapować siły receptorowe &gt;4,7pN w czasie rzeczywistym i może integrować siły w czasie.

Sondy napięcia DNA do mapowania przejściowych sił receptora pikoningtona przez komórki odpornościowe

Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.

Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Odkryj syntezę sond DNA z fotostabilnymi barwnikami cyjaninowymi do wizualizacji hybrydyzacji. Ta metoda umożliwia obserwację transferu energii i zmiany koloru fluorescencji w czasie rzeczywistym.

Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Przeglądaj więcej filmów