Synteza sond hybrydyzacyjnych DNA zmieniających długość fali przy użyciu fotostabilnych barwników cyjaninowych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja transferu energii z jednej nici DNA zmodyfikowanej barwnikiem do drugiej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biologii molekularnej. Takich jak interferencja RNA poprzez monitorowanie przetwarzania i integralności siRNA w żywych komórkach w czasie rzeczywistym.

Główną zaletą tej techniki jest łatwość monitorowania zasięgu kwitnienia i zmiany koloru, co daje wyraźny efekt. W ten sposób eliminowane są wyniki fałszywie dodatnie. Rozpocznij tę procedurę, dodaj odpowiednie odczynniki, jak wskazano w protokole tekstowym, do 20-mililitrowej kolby okrągłodennej, wyposażonej w mieszadło magnetyczne i kondensator zwrotny.

Następnie dodaj punkt zerowy zero sześć mililitrów piperydyny. I podgrzej mieszaninę reakcyjną do 80 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po schłodzeniu reakcji do temperatury pokojowej zebrać powstały osad przez filtrację.

I umyj trzykrotnie eterem dietylowym. Następnie dodaj sto mililitrów eteru dietylowego do supernatantu. I zbierz powstały osad przez filtrację.

Po trzykrotnym przemyciu eterem dietylowym połączyć osad z wyizolowanym ciałem stałym z pierwszej filtracji. Za pomocą komputera, podłączonego do syntezatora DNA, wprowadź żądaną sekwencję DNA i metodę sprzężenia. Postępuj zgodnie z instrukcjami z protokołu producenta.

Następnie należy zamontować w syntezatorze kolumnę zawierającą kontrolowaną szklankę do nalewania, która jest modyfikowana jednym mikro molem pierwszej ściany. Teraz rozpocznij syntezę na syntezatorze DNA. Po przetworzeniu nici DNA, dodaj odpowiednich regentów, jak wskazano w protokole tekstowym, do dietyloizowanej, zmodyfikowanej próbki DNA.

Inkubować próbkę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez jeden punkt przez pięć godzin. Następnie przenieś próbkę do 10-mililitrowej probówki. Po schłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 150 mikrolitrów pięciomolowego roztworu soli disodowej EDTA w punkcie zerowym i 50 mikrolitrów roztworu octanu sodu w punkcie zerowym i trzech molowych w punkcie zerowym do próbki DNA.

Następnie dodaj 10 mililitrów etanolu do próbki. I utrzymuj go w temperaturze minus 32 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnie odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze tysiąc razy G. Po zakończeniu usunąć supernatant.

Umyj powstałą osadkę DNA dwoma mililitrami zimnego 80% etanolu. Następnie wysuszyć granulat pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą liofilizatora. Oczyść surową granulkę DNA za pomocą HP LC.Monitoruj przebieg, sprawdzając 260 nanometrów i 459 nanometrów dla Dye one.

Lub 542 nanometry dla Dye dwa. Zbierz frakcje, które wykazują absorpcję w obu kanałach długości fali. W przypadku pomiarów jednoniciowej spektroskopii absorpcyjnej należy zanotować ślepą próbę zawierającą tylko 200 milimolowy bufor chlorku sodu i 50 milimolowy bufor fosforanu sodu.

Następnie przenieś wcześniej przygotowany roztwór DNA1 do jednocentymetrowej kuwety ze szkła kwarcowego. Zapisz absorpcję. Następnie określ maksymalną wartość wchłaniania barwnika.

W przypadku pomiarów jednoniciowej spektroskopii fluorescencyjnej należy zarejestrować ślepą próbę zawierającą tylko 200 milimolowy chlorek sodu i 50 milimolowy fosforan sodu, używając długości fali wzbudzenia Dye one. Następnie umieść kuwetę z roztworem DNA1 w spektrometrze. Zapisz widmo kwiatescencji.

Aby wykonać pomiar dwuniciowej spektroskopii fluorescencyjnej, umieść kuwetę z dwuniciową roztworem DNA1 i DNA2 w spektrometrze. Następnie zarejestruj widmo fluorescencyjne za pomocą długości fali wzbudzenia Dye one. Aby lepiej zrozumieć, co pokazują zarejestrowane widma, należy naświetlić kuwety ręcznymi lampami UV.

Obserwuj zmianę koloru kwiatostanu z jednoniciowego na dwuniciowy DNA. Zarejestrowane widma absorpcyjne pokazują maksima na poziomie 465 nanometrów dla jednoniciowego DNA1 i 546 nanometrów dla jednoniciowego DNA2. Wyżarzona podwójna nić DNA1 i DNA2 wykazuje maksima zarówno przy 469, jak i 567 nanometrach.

Oba maksima absorpcji wykazują przesunięcie bataohromiczne. A najmniejsze zmiany spektroskopowe są wynikiem oddziaływań ekscytonowych między barwnikami w architekturze podwójnej helisy DNA. Odpowiednie widma fluorescencyjne wykazują maksima na poziomie 537 nanometrów dla jednoniciowego DNA1.

Przy 607 nanometrach dla jednoniciowego DNA2. I przy 615 nanometrach dla wyżarzanej, podwójnej nici DNA1 i DNA2. Dwuniciowy DNA1 i DNA2 pokazuje wyłącznie maksimum emisji barwnika drugiego, chociaż barwnik pierwszy jest selektywnie wzbudzony, co dowodzi, że transfer energii zachodzi efektywnie od barwnika pierwszego do barwnika drugiego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetycznie modyfikować DNA przez parę reakcji katalitycznych nici DNA znakowanej alkinami ze stroną A.