Name: Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metodę zapobiegania niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów za pomocą szczepu Bacillus subtilis BSB3. Protokół obejmuje doustne podawanie bakterii i ocenę odpowiedzi fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusz Uniwersytetu Auburn FOP 101002-139294-2050.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Auburn w Auburn w stanie Alabama.
1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, potraw i kultur bakteryjnych
<ol>
	<li>Zaszczepić 10 ml bulionu odżywczego w kolbie pojedynczą kolonią kultury Bacillus subtilis BSB3, wyhodowaną przez noc na pożywnej płytce agarowej.</li>
	<li>Przygotować 500 ml pożywki zarodnikowej19 (na litr: bulion Bacto Nutrient Broth, 8 g; 10% (m/v) KCl, 10 ml; 1,2% (w/v) MgSO,4 x 7H2O, 10 ml; agar, 15 g) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 oC przez 20 min. Pozostawić do ostygnięcia do 50 oC i dodać następujące sterylne roztwory: 1 M Ca(NO3)2, 1 ml; 0,01 M MnCl2, 1 ml; 1 mM FeSO4, 1 ml.</li>
	<li>Schłodzić przygotowane podłoże do temperatury 40 oC przez 20 minut w temperaturze pokojowej i wlać 25 ml do każdej z 20 sterylnych szalek Petriego w sterylnej szafce. Pozwól pożywce zestalić się przez noc.</li>
	<li>Rozprowadzić 0,5 ml nocnej kultury Bacillus subtilis BSB3 na powierzchni pożywki na szalkach Petriego. Inkubować kulturę w temperaturze 37 oC przez 5 dni aż do 90% zarodnikowania. Ujawnij zarodniki jasne fazowo za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości.</li>
	<li>Zebrać bakterie, dodając 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) do płytki i zeskrobując bakterie z powierzchni za pomocą sterylnego rozsiewacza komórek. Zawiesinę należy przechowywać w lodówce do czasu, gdy będzie potrzebna.</li>
	<li>Potwierdzić żywotność bakterii przez posiew 0,1 ml odpowiedniego rozcieńczenia (10-5 do 10-6) zawiesiny bakteryjnej na płytkach pożywki zarodnikowej, a następnie inkubację przez 18-24 godzin w temperaturze 37 oC.</li>
	<li>Policz kolonie bakterii na płytkach za pomocą licznika kolonii i oblicz miano bakterii w badanej zawiesinie. Przygotować zawiesinę bakteryjną o końcowym stężeniu 1 x10,8 jtk/ml w PBS.</li>
</ol>
2. Zwierzęta
<ol>
	<li>Użyj 32 samców szczurów Sprague-Dawley (250 - 300 g). Utrzymuj zwierzęta w określonych warunkach wolnych od patogenów ze swobodnym dostępem do standardowej karmy granulowanej i wody. Ustalić średnią temperaturę (21 ± 1 oC), wilgotność (50 ± 5%) i 12-godzinny cykl jasny-ciemny</li>.
</ol>
3. Projekt eksperymentalny
<ol>
	<li>Leczenie zwierząt przez zgłębnik doustnynależy rozpocząć 11 po 2 dniach aklimatyzacji. Użyć strzykawki z doustną igłębnikiem. Podawaj 16 szczurom zawiesinę B. subtilis BSB3 (1 ml na szczura) dwa razy dziennie przez dwa dni (grupa B. subtilis). Podawaj 16 szczurom PBS (1 ml na szczura) dwa razy dziennie przez dwa dni (grupa PBS) (ryc. 1).</li>
	<li>Po leczeniu podzielić każdą grupę (8 szczurów na grupę): Grupa 1 – grupa kontrolna (PBS / brak stresu), grupa 2 – B. subtilis (B. subtilis / brak stresu), grupa 3 – stres (PBS / stres cieplny) i grupa 4 – B. subtilis + stres (B. subtilis / stres cieplny).</li>
	<li>Zmierz temperaturę w odbycie każdego szczura za pomocą elektronicznego termometru cyfrowego. Szczury z grup 1 i 2 należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Umieścić zwierzęta z grup 3 i 4 w komorze klimatycznej w temperaturze 45 oC i wilgotności względnej 55% na 25 minut.</li>
	<li>Następnie zmierz temperaturę w odbycie każdego szczura we wszystkich grupach za pomocą elektronicznego termometru cyfrowego. Umieść wszystkie zwierzęta w temperaturze pokojowej na 4 godziny.</li>
	<li>Znieczulenie szczurów izofluranem (2 - 4%) w zamykanym słoiku do znieczulenia i obserwowanie, aż szczury zostaną głęboko znieczulone (brak reakcji na uszczypnięcie palca). Eutanazja szczurów przez szybkie ścięcie głowy za pomocą gilotyny.</li>
	<li>Pobrać krew z tułowia każdego szczura20 (15 - 16 ml) za pomocą pipet apirogennych do probówek apirogennych w celu uzyskania surowicy i natychmiast pobrać próbki krwi (7 μl od każdego szczura) za pomocą pipety do badania mikroskopowego.</li>
	<li>Umieść probówki z krwią w lodówce na co najmniej 30 minut, aby umożliwić krzepnięcie. Odwirować probówki w temperaturze 20 oC, 7 000 x g przez 10 min i szybko usunąć surowicę za pomocą pipety. Podwielokrotność surowicy otrzymanej od każdego szczura w objętości 50 μl i przechowywać w temperaturze -20 oC do czasu oznaczenia.</li>
</ol>
4. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Obetnij/przytnij całe futro z brzucha i klatki piersiowej od spodu tuszy za pomocą nożyc elektrycznych. Umieść tuszę w sterylnej szafce i potraktuj ogoloną powierzchnię tuszy 70% alkoholem.</li>
	<li>Użyj sterylnego skalpela, aby wykonać nacięcie w linii środkowej brzucha. Usuń wątrobę, krezkowe węzły chłonne, śledzionę i jelito cienkie od każdego szczura za pomocą sterylnej pęsety.</li>
</ol>
5. Analiza translokacji bakteryjnej 
<ol>
	<li>Umieść każdą próbkę wątroby, krezkowych węzłów chłonnych i śledziony w wstępnie zważonych sterylnych probówkach i zważ. Obliczyć masę próbki jako różnicę między masą probówki z próbką a masą pustej probówki.</li>
	<li>Dodać sterylny PBS do probówki, aby uzyskać rozcieńczenie próbki w stosunku 1:10 (w/v) i homogenizować każdą próbkę sterylnym homogenizatorem tkanek szklanych w celu uzyskania jednorodnej zawiesiny21.</li>
	<li>Wykonać seryjne rozcieńczenia (10-1 do 10-4) każdej próbki w sterylnym PBS. Umieść 0,1 ml wszystkich rozcieńczeń każdej tkanki na powierzchni MacConkey's i 5% agaru z krwią i agarem z krwią Brucella z heminą (0,005 g / l) i witaminą K1 (0,01 g / l).</li>
	<li>Inkubować tlenowo płytki MacConkeya i 5% agar z krwią oraz płytki z agarem z krwią Brucella w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 oC 22.</li>
	<li>Policz kolonie bakterii tlenowych po 24 godzinach i kolonie bakterii beztlenowych po 48 godzinach inkubacji za pomocą licznika kolonii. Wyraź wyniki jako liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) w gramie tkanki.</li>
</ol>
6. Analiza histologiczna 
<ol>
	<li>Usunąć próbki jelita cienkiego od każdego szczura za pomocą zabiegu chirurgicznego (kroki 4.1 - 4.2). Utrwalić próbki w utrwalaczu Bouina, zatopić w parafinie, przygotować skrawki 6 μm i barwić skrawki hematoksyliną i eozyną przy użyciu standardowych procedur23.</li>
	<li>Użyj systemu mikroskopowego o wysokiej rozdzielczości do pomiaru wysokości kosmków jelitowych i całkowitej grubości błony śluzowej w każdej próbce (powiększenie 100X)24. Przeanalizuj 4 próbki od każdego szczura i wykonaj co najmniej dwadzieścia pomiarów w każdej próbce. Ekspresowe wyniki w mikrometrach.</li>
</ol>
7. Test cytokin
<ol>
	<li>Używaj komercyjnych zestawów ELISA dla szczurów dla IL-1β; Ił-6; TNF-α; INF-γ i IL-10 do pomiaru poziomu cytokin w surowicy zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wygeneruj krzywe wzorcowe dla każdego zestawu próbek oznaczanych przy użyciu wzorców dla odpowiedniego zestawu. Określ poziom cytokin w każdej próbce poprzez porównanie danych doświadczalnych z odpowiednią krzywą wzorcową.</li>
</ol>
8. Test lipopolisacharydowy
<ol>
	<li>Przeanalizuj poziom LPS w surowicy za pomocą zestawu LPS ELISA dla szczurów zgodnie z protokołem producenta. Oszacować stężenie LPS w próbkach przez porównanie uzyskanych wartości z wartościami krzywej wzorcowej.</li>
</ol>
9. Mikroskopia świetlna krwi o wysokiej rozdzielczości
<ol>
	<li>Użyj systemu mikroskopu opisanego wcześniej25,26. Użyj platformy wibroizolacyjnej jako podstawy dla systemu mikroskopowego oraz kamery wideo i komputera25 do rejestrowania obrazów na żywo. Skalibruj obrazy testowe za pomocą szkiełka Richardsona, jak opisano wcześniej27.</li>
	<li>Umieść 7 μl świeżo pobranej krwi od każdego szczura na szkiełku podstawowym, szkiełku nakrywkowym, sfotografuj i zapisz dziesięć klatek obrazu o rozmiarach od 72 × 53,3μm2 w każdej próbce (powiększenie 1,700X).</li>
	<li>Mierz stężenie pęcherzyków za pomocą oprogramowania, które zapewnia obrazy optyczne o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Zbadaj co najmniej 20 klatek obrazu dla każdego warunku eksperymentalnego28.</li>
</ol>
10. Statystyki
<ol>
	<li>Wyraż wszystkie wartości jako średnią i odchylenie standardowe. Wykonuj analizę statystyczną i wykresy. Przeanalizuj wyniki za pomocą testu t dla dwóch prób, ustaw poziom istotności na 0,05, aby zdefiniować istotność statystyczną.</li>
</ol>

<ol><li>Crandall, C. G., Gonzalez-Alonso, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+function+in+the+heat-stressed+human%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular function in the heat-stressed human.</a> Acta Physiol. 199, 407-423 (2010).</li>
<li>Lambert, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gastrointestinal+permeability+in+exertional+heatstroke%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc.+Sport+Sci.+Rev%22%5BJournal%5D)">Role of gastrointestinal permeability in exertional heatstroke.</a> Exerc. Sport Sci. Rev. 32, 185-190 (2004).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat+stress+on+the+porcine+small+intestine%3A+A+morphological+and+gene+expression+study%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A-Mol.+Integr.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study.</a> Comp. Biochem. Physiol. A-Mol. Integr. Physiol. 156, 119-128 (2010).</li>
<li>Moseley, P. L., Gisolfi, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Frontiers+in+Thermoregulation+and+Exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Med%22%5BJournal%5D)">New Frontiers in Thermoregulation and Exercise.</a> Sports Med. 16, 163-167 (1993).</li>
<li>Lambert, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+gastrointestinal+barrier+dysfunction+and+its+inflammatory+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress-induced gastrointestinal barrier dysfunction and its inflammatory effects.</a> J. Anim. Sci. 87, 101-108 (2009).</li>
<li>Berg, A., Muller, H. M., Rathmann, S., Deibert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastrointestinal+system+-+An+essential+target+organ+of+the+athlete%27s+health+and+physical+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Exerc.+Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The gastrointestinal system - An essential target organ of the athlete's health and physical performance.</a> Exerc. Immunol. Rev. 5, 78-95 (1999).</li>
<li>Khan, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes%2C+intestinal+inflammation+and+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Gastroent%22%5BJournal%5D)">Microbes, intestinal inflammation and probiotics.</a> Expert Rev Gastroent. 6, 81-94 (2012).</li>
<li>Quigley, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prebiotics+and+Probiotics%3A+Their+Role+in+the+Management+of+Gastrointestinal+Disorders+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Prebiotics and Probiotics: Their Role in the Management of Gastrointestinal Disorders in Adults.</a> Nutr Clin Pract. 27, 195-200 (2012).</li>
<li>Gore, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+secondary+prevention+effects+of+the+probiotics+Lactobacillus+paracasei+or+Bifidobacterium+lactis+on+early+infant+eczema%3A+randomized+controlled+trial+with+follow-up+until+age+3+years%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Treatment and secondary prevention effects of the probiotics Lactobacillus paracasei or Bifidobacterium lactis on early infant eczema: randomized controlled trial with follow-up until age 3 years.</a> Clin Exp Allergy. 42, 112-122 (2012).</li>
<li>Gomes, A. C., Bueno, A. A., de Souza, R. G. M., Mota, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiota%2C+probiotics+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr.+J%22%5BJournal%5D)">Gut microbiota, probiotics and diabetes.</a> Nutr. J. 13, (2014).</li>
<li>Eutamene, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+Lactobacillus+paracasei+and+its+bacterial+products+to+counteract+stress-induced+gut+permeability+and+sensitivity+increase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Synergy between Lactobacillus paracasei and its bacterial products to counteract stress-induced gut permeability and sensitivity increase in rats.</a> J. Nutr. 137, 1901-1907 (2007).</li>
<li>Ait-Belgnaoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactobacillus+farciminis+treatment+attenuates+stress-induced+overexpression+of+Fos+protein+in+spinal+and+supraspinal+sites+after+colorectal+distension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Lactobacillus farciminis treatment attenuates stress-induced overexpression of Fos protein in spinal and supraspinal sites after colorectal distension in rats.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 585-593 (2009).</li>
<li>Fujiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+subtilis+quorum-sensing+molecule+CSF+contributes+to+intestinal+Homeostasis+via+OCTN2%2C+a+host+cell+membrane+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal Homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter.</a> Cell Host Microbe. 1, 299-308 (2007).</li>
<li>Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacillus+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacillus probiotics.</a> Food Microbiol. 28, 214-220 (2011).</li>
<li>Pinchuk, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+anti-Helicobacter+pylori+activity+of+the+probiotic+strain+Bacillus+subtilis+3+is+due+to+secretion+of+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Ch%22%5BJournal%5D)">In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics.</a> Antimicrob Agents Ch. 45, 3156-3161 (2001).</li>
<li>Sorokulova, I. B., Kirik, D. L., Pinchuk, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotics+against+Campylobacter+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Travel+Med%22%5BJournal%5D)">Probiotics against Campylobacter pathogens.</a> J. Travel Med. 4, 167-170 (1997).</li>
<li>Gracheva, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficacy+of+the+new+bacterial+preparation+biosporin+in+treating+acute+intestinal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Zh+Mikrobiol+Epidemiol+Immunobiol%22%5BJournal%5D)">The efficacy of the new bacterial preparation biosporin in treating acute intestinal infections.</a> Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. , 75-77 (1996).</li>
<li>Horosheva, T. V., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Bacillus+probiotics+in+prevention+of+antibiotic-associated+diarrhoea%3A+a+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JMM+Case+Report%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Bacillus probiotics in prevention of antibiotic-associated diarrhoea: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial.</a> JMM Case Report. 1, (2014).</li>
<li>Sorokulova, I. B., Krumnow, A. A., Pathirana, S., Mandell, A. J., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Methods+for+Storage+Stability+and+Release+of+Bacillus+Spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Novel Methods for Storage Stability and Release of Bacillus Spores.</a> Biotechnol. Prog. 24, 1147-1153 (2008).</li>
<li>Vogel, H. G., Vogel, W. H. Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogel%2C+HG+%22eds+H.G.+Vogel+%26+W.H.+Vogel%22">eds H.G. Vogel & W.H. Vogel</a>. Vogel, H. G., Vogel, W. H. , 658-659 (1997).</li>
<li>Bailey, M. T., Engler, H., Sheridan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induces+the+translocation+of+cutaneous+and+gastrointestinal+microflora+to+secondary+lymphoid+organs+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Stress induces the translocation of cutaneous and gastrointestinal microflora to secondary lymphoid organs of C57BL/6 mice.</a> J. Neuroimmunol. 171, 29-37 (2006).</li>
<li>Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+commensal+microflora+by+toll-like+receptors+is+required+for+intestinal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis.</a> Cell. 118, 229-241 (2004).</li>
<li>Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+cytokine%2C+corticosterone%2C+and+tissue+injury+responses+in+mice+during+heat+strain+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery.</a> J. Appl. Physiol. 100, 1400-1409 (2006).</li>
<li>Ribeiro, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weight+loss+and+morphometric+study+of+intestinal+mucosa+in+rats+after+massive+intestinal+resection.+Influence+of+a+glutamine-enriched+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Hosp.+Cl%C3%ACn.+Fac.+Med.+S.+Paulo%22%5BJournal%5D)">Weight loss and morphometric study of intestinal mucosa in rats after massive intestinal resection. Influence of a glutamine-enriched diet.</a> Rev. Hosp. Clìn. Fac. Med. S. Paulo. 59, 349-356 (2004).</li>
<li>Vainrub, A., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+90+nm+%28lambda%2F5%29+in+an+optical+transmission+microscope+with+an+annular+condenser%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Resolution of 90 nm (lambda/5) in an optical transmission microscope with an annular condenser.</a> Opt Lett. 31, 2855-2857 (2006).</li>
<li>Moore, T., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+administration+of+Bacillus+subtilis+strain+BSB3+can+prevent+heat+stress-related+adverse+effects+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral administration of Bacillus subtilis strain BSB3 can prevent heat stress-related adverse effects in rats.</a> J Appl Microbiol. 117, 1463-1471 (2014).</li>
<li>Richardson, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Test+slides%3A+Diatoms+to+divisions-What+are+you+looking+at%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Roy+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Test slides: Diatoms to divisions-What are you looking at.</a> Proc Roy Microsc Soc. 22, 3-9 (1988).</li>
<li>Moore, T., Sorokulova, I., Pustovyy, O., Globa, L., Vodyanoy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+evaluation+of+vesicles+shed+by+rat+erythrocytes+at+elevated+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Therm+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic evaluation of vesicles shed by rat erythrocytes at elevated temperatures.</a> J Therm Biol. 38, 487-492 (2013).</li>
<li>Leon, L. R., Helwig, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+stroke%3A+Role+of+the+systemic+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Heat stroke: Role of the systemic inflammatory response.</a> J. Appl. Physiol. 109, 1980-1988 (2010).</li>
<li>Kumar, Y., Chawla, A., Tatu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+Shock+Protein+70+as+a+Biomarker+of+Heat+Stress+in+a+Simulated+Hot+Cockpit%5BTitle%5D)+AND+%22Aviat+Space+Env+Med%22%5BJournal%5D)">Heat Shock Protein 70 as a Biomarker of Heat Stress in a Simulated Hot Cockpit.</a> Aviat Space Env Med. 74 (7), 711-716 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Narażenie na wysoką temperaturę skutkuje poważnymi schorzeniami29. Zapobieganie i wczesne wykrywanie powikłań związanych ze stresem cieplnym ma kluczowe znaczenie30. Przedstawiony protokół może być wykorzystany do oceny skuteczności różnych podejść do zapobiegania niekorzystnym skutkom stresu cieplnego.
Krytyczne etapy w ramach tego protokołu obejmują: procedurę obróbki cieplnej (45 oC, 25 min); stosowanie materiałów apirogennych podczas pobie...

Różne czynniki stresogenne wpływają na zdrowie ludzi i zwierząt. Temperatura jest jednym z najbardziej stresujących czynników, powodującym przewlekłe, ostre, a nawet śmiertelne choroby1. W wielu przypadkach udokumentowano zmiany w morfologii jelit i utratę integralności bariery jelitowej po stresie cieplnym2,3. Ta bariera ochronna odpowiada za obronę przed translokacją bakterii jelitowych i ich toksyn, w szczególności lipopolisacharydów (LPS), ze światła do krążenia wewnętrznego4,5. Stabilność mikrobioty jelitowej znacząco wpływa na funkcję bariery jelitowej, odpowiedź immunologiczną gospodarza i tolerancję na warunki stresowe6. W związku z tym modulacja mikrobioty jelitowej może stanowić nowatorskie podejście do zapobiegania niekorzystnym skutkom związanym ze stresem. 
Pożyteczne bakterie zostały wykorzystane jako obiecująca strategia modyfikacji mikroflory jelitowej w celu skutecznego leczenia różnych stanów klinicznych, takich jak biegunka, nieswoiste zapalenie jelit, atopowe zapalenie skóry, zaburzenia metaboliczne7-10. Działanie probiotyczne pożytecznych bakterii obejmuje produkcję niezbędnych metabolitów wspierających zdrowie jelit, stymulację układu odpornościowego, promowanie tolerancji laktozy, przywrócenie dysfunkcji nabłonka. Probiotyki były skuteczne w zapobieganiu powikłaniom związanym ze stresem in vitro i w modelach zwierzęcych11,12. 
Badacze poświęcili więcej uwagi bakteriom Bacillus jako probiotykom, ponieważ bakterie te wspierają homeostazę jelit13 i mają korzystny wpływ na gospodarza14. Nasze wcześniejsze dane wykazały wysoką skuteczność probiotyków Bacillus przeciwko patogenom in vitro15,16 oraz w badaniach klinicznych17,18. W tym miejscu naszym celem jest ocena prewencyjnego działania szczepu B. subtilis BSB3 przeciwko powikłaniom po stresie cieplnym.

<table><tbody><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich,&nbsp;St. Louis, MO</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy&nbsp;</td><td>Pharmco products Inc. Brookfield, CT, Stany Zjednoczone&nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>97064-334</td><td></td></tr><tr><td>Płytki agarowe MacConkey</td><td>VWR</td><td>470180-742</td><td></td></tr><tr><td>Płytki agarowe 5% z krwią</td><td>VWR</td><td>89405-024</td><td></td></tr><tr><td>Płytka z agarem z krwią brucella z heminem i witaminą K</td><td>VWR</td><td>89405-032</td><td></td></tr><tr><td>Bouin' s Nauka o Stabilnej</td><td>Mikroskopii Elektronowej, Hatfield, PA, USA</td><td>15990</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 Zestaw ELISA dla szczurów</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0101</td><td></td></tr><tr><td>IL-1beta Zestaw ELISA dla szczurów</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0011</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 Zestaw ELISA dla szczurów</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC0061</td><td></td></tr><tr><td>INF-gamma Szczur Zestaw ELISA</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td></td><td></td>KRC4021</tr><tr><td>TNF-alpha Zestaw ELISA dla szczurów</td><td>Invitrogen, Camarillo, CA, USA</td><td>KRC3011</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA dla szczurów LPS</td><td>NeoBioLab, MA, USA</td><td>RL0275</td><td></td></tr><tr><td>Komora środowiskowa 6020-1</td><td>Caron, Marietta, OH, USA</td><td>6020-1</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, Stany Zjednoczone</td><td>Optima L-90K</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny system optyczny</td><td>CitoViva Technology Inc., Auburn, AL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Licznik kolonii</td><td>Fisher Scientific , Pittsburgh, PA, USA</td><td>RE-3325</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td>Haier, Brooklyn, NY, USA</td><td>HCMO50LA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra mikropłytka czytnik</td><td>Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td><td>ELx 808</td><td></td></tr><tr><td>Auto Strip</td><td>Washer Bio-Tek Instrument, Winooski, VT, USA</td> Pipety <td>ELx50</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gilson, Pipetman, Francja</td><td>P100, P200, P1000</td><td></td></tr><tr><td>C24 Wytrząsarka do inkubatora</td><td>New Brunswick Scientific, Enfield, CT, USA</td><td>Klasyczna</td> wytrząsarka bujana C24<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Reliable Scientific, Inc., Nesbit, MS, Stany Zjednoczone</td><td>55</td><td></td></tr><tr><td>szalek Petriego</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>SterilGard III Advance</td><td>The Baker Company, Sanford, ME, USA</td><td>SG403</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do uprawy kultur</td><td>Corning Incorporated, Corning, NY, USA</td><td>4995</td><td>PYREX 250 ml Kolby Erlenmeyera</td></tr><tr><td>Spektrometr optyczny Genesys 20</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone.</td><td>4001</td><td></td></tr><tr><td>Sony DXC-33 Kamera wideo</td><td>Szkiełko</td> testowe Sony <td></td><td></td></tr><tr><td>Richardson</td><td>Mikroskopia elektronowa Science, Hatfield, PA, USA</td><td>80303</td><td></td></tr><tr><td>System oczyszczania wody Millipore</td><td>Oprogramowanie</td><td>Direct-Q</td><td></td></tr><tr><td>Image-Pro Plus</td><td>Media Cybernetics, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triple Beam Balance</td><td>OHAUS Corporation, Parsippany, NJ, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy, Dounce</td><td>VWR</td><td>71000-518</td><td></td></tr></tbody></table>

zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep bacillus subtilis

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

To badanie miało na celu ocenę ochronnego działania szczepu Bacillus subtilis przed powikłaniami związanymi ze stresem cieplnym. W badaniu wykorzystano trzydzieści dwa szczury rasy Sprague-Dawley. Zwierzęta podawano doustnie dwa razy dziennie przez dwa dni szczepem B. subtilis BSB3 lub PBS. Następnego dnia po ostatnim zabiegu każdą grupę podzielono i dwie grupy eksperymentalne (jedną leczoną PBS i jedną leczoną B. subtilis) umieszczono w temperaturze 45 oC na 25 minut. Dwie grupy kontrolne przebywały przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Wszystkie szczury zostały poddane eutanazji i przeanalizowano różne parametry we wszystkich grupach. Niekorzystne skutki stresu cieplnego rejestruje się poprzez zmniejszenie wysokości kosmków i całkowitej grubości błony śluzowej w nabłonku jelitowym; translokacja bakterii ze światła; zwiększenie pęcherzyków erytrocytów i podwyższenie poziomu lipopolisacharydów (LPS) we krwi. Skuteczność ochronną leczenia ocenia się poprzez zapobieganie tym skutkom ubocznym. Protokół został opracowany do doustnego leczenia szczurów bakteriami w celu zapobiegania powikłaniom stresu cieplnego, ale protokół ten może być modyfikowany i stosowany do innych dróg podawania oraz do analizy różnych związków.

Średnia temperatura ciała zwierząt przed i bezpośrednio po stresie cieplnym wynosiła odpowiednio 36,7 ± 0,07 oC oraz 40,3 ± 0,17 oC (P &lt; 0,05). Poddanie szczurów działaniu wysokiej temperatury (grupa 3) spowodowało istotne zahamowanie wzrostu wysokości kosmków oraz całkowitej grubości błony śluzowej (Ryciny 2, 3). Podawanie doustne szczepu BSB3 przed wystąpieniem stresu chroniło jelita przed szkodliwym działaniem ciepła.
<p class="jove_content...

Opisaliśmy protokół zapobiegania skutkom stresu cieplnego u szczurów poprzez doustne wstępne leczenie pożytecznymi bakteriami. Protokół ten może być modyfikowany i stosowany do różnych dróg podawania oraz do analizy różnych związków.

Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena efektu zapobiegawczego szczepu B.subtilis BSB3 przeciwko powikłaniom po stresie cieplnym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące zapobiegania niekorzystnym skutkom stresu cieplnego. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania jej do oceny różnych podejść mających na celu łagodzenie powikłań wynikających ze stresu cieplnego.Procedurę tę zaprezentują Ludmila Globa oraz Oleg Pusovyy, pracownicy naukowi z naszego laboratorium. Na początek wykorzystamy pojedynczą kolonię Bacillus subtilis BSB3, która była hodowana przez noc na płytce z agarem odżywczym.Zaszczep dziesięć mililitrów pożywki Nutrient Broth w kolbie. Hoduj kulturę przez noc w temperaturze 37 °C. Przygotuj 500 mililitrów pożywki do sporulacji zgodnie z recepturą przedstawioną tutaj.Następnie sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do 50 °C przed dodaniem poniższych sterylnych roztworów. W komorze sterylnej chłodzić przygotowaną pożywkę w temperaturze pokojowej do 40 °C przez 20 minut.Następnie wlej 25 mililitrów do każdej z 20 sterylnych szalek Petriego. Pozostaw podłoże do zast

prevention-heat-stress-adverse-effects-rats-bacillus-subtilis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie zaprezentowano indukcję oraz ocenę kliniczną modelu zwierzęcego stwardnienia rozsianego: przewlekłego nawracającego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia u szczurów linii DA. Choroba, wywołana immunizacją szczurów emulsją zawierającą cały rdzeń kręgowy szczura i pełny adiuwant Freunda, wykazuje objawy kliniczne przypominające przebieg choroby u ludzi.

Indukcja i ocena kliniczna przewlekłej postaci nawrotowej eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia

Źródło: Sorokulova, I., et al. Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia szczury wstępnie potraktowane pożytecznymi bakteriami lub solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i wystawione na stres cieplny w celu oceny integralności bariery jelitowej. Mniej kolonii bakteryjnych pochodzenia jelitowego z wątroby leczonych szczurów, w przeciwieństwie do licznych kolonii u szczurów kontrolnych, wskazuje...

Ocena wpływu pożytecznych bakterii na translokację mikrobiologiczną jelit u szczurów narażonych na stres cieplny

Źródło: Sorokulova, I., i in. Zapobieganie niepożądanym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia analizy histologiczne i mikroskopii krwi służące do oceny ochronnych efektów Bacillus subtilis u szczurów narażonych na stres cieplny.

Analizy histologiczne i hematologiczne mające na celu ocenę skutków Bacillus subtilis u szczurów poddanych stresowi cieplnemu

W tym filmie opisujemy krok po kroku protokół badania wysiłkowego udaru cieplnego (EHS) w modelu mysim.

Wysiłkowy model myszy z udarem cieplnym: protokół badania mechanizmów leżących u podstaw wysiłkowego udaru cieplnego

Przedstawiamy protokół do indukowania i wykrywania CMH spowodowanych wstrzyknięciem LPS u szczurów Sprague-Dawley, który może być wykorzystany w przyszłych badaniach nad patogenezą CMH.

Podostre mikrokrwotoki mózgowe wywołane wstrzyknięciem lipopolisacharydu u szczurów

Tutaj opisujemy protokół i implementację Methyl-Seq, platformy epigenomicznej, wykorzystującej model szczura do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z przewlekłym narażeniem na stres. Wyniki pokazują, że platforma Methyl-Seq u szczurów jest w stanie wykryć różnice w metylacji, które wynikają z ekspozycji na stres u szczurów.

Szczurza platforma sekwencyjna metylu do identyfikacji zmian epigenetycznych związanych z ekspozycją na stres

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Protokół opisuje rozwój standardowego, powtarzalnego, przedklinicznego modelu wysiłkowego udaru cieplnego (EHS) u myszy wolnych od niekorzystnych bodźców zewnętrznych, takich jak porażenie prądem. Model stanowi platformę do badań mechanistycznych, prewencyjnych i terapeutycznych.

Przedkliniczny model wysiłkowego udaru cieplnego u myszy

W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu ustanowienie indukowanego antybiotykiem, pseudo-wolnego od zarazków modelu zapalenia jelita grubego wywołanego siarczanem dekstranu sodu w celu zbadania roli mikrobioty jelitowej w regulacji pozytywnego wpływu Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego.

Badanie łagodzącego wpływu podawania Bacillus cereus na zapalenie jelita grubego poprzez modulację mikrobioty jelitowej

Mikroby jelitowe mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na zdrowie swojego gospodarza poprzez specyficzne lub konserwatywne mechanizmy. Caenorhabditis elegans to wygodna platforma do badań przesiewowych pod kątem takich drobnoustrojów. Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowe badania przesiewowe 48 izolatów bakteryjnych pod kątem wpływu na odporność nicieni na stres, wykorzystywane jako wskaźnik zdrowia robaków.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe izolatów drobnoustrojów mające wpływ na zdrowie Caenorhabditis elegans

Ten protokół przedstawia model chronicznego nieprzewidywalnego łagodnego stresu (CUMS) dla depresji oparty na mongolskiej teorii medycznej, wraz z metodami walidacji testów behawioralnych.

Przewlekły nieprzewidywalny łagodny stres u szczurów na podstawie medycyny mongolskiej

Poznaj metodę zapobiegania niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów za pomocą szczepu Bacillus subtilis BSB3. Protokół obejmuje doustne podawanie bakterii i ocenę odpowiedzi fizjologicznych.

Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis

Przeglądaj więcej filmów