Zapobieganie niekorzystnym skutkom stresu cieplnego u szczurów przez szczep Bacillus subtilis

Opisaliśmy protokół zapobiegania skutkom stresu cieplnego u szczurów poprzez doustne wstępne leczenie pożytecznymi bakteriami. Protokół ten może być modyfikowany i stosowany do różnych dróg podawania oraz do analizy różnych związków.

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena prewencyjnego działania szczepu B.subtilis BSB3 przeciwko powikłaniom po stresie cieplnym. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w zakresie zapobiegania niekorzystnym skutkom stresu cieplnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do oceny różnych podejść do łagodzenia powikłań stresu cieplnego.

Demonstruje to zabieg Ludmiła Globa. I Oleg Pusovyy, współpracownicy naukowi z naszego laboratorium. Na początek od pojedynczej kolonii Bacillus subtilis BSB3, która została wyhodowana przez noc na płycie z agarem odżywczym.

Zaszczepić dziesięć mililitrów bulionu odżywczego w kolbie. Uprawiaj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj 500 mililitrów pożywki do zarodnikowania zgodnie z przepisem pokazanym tutaj.

I autoklaw w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut. Pozwól pożywce ostygnąć do 50 stopni Celsjusza przed dodaniem następujących sterylnych roztworów. W sterylnej szafce przygotowane podłoże schłodzić w temperaturze pokojowej do 40 stopni Celsjusza przez 20 minut.

I wlej 25 mililitrów do każdej z 20 sterylnych szalek Petriego. Pozostaw podłoże do zestalenia się przez noc. Następnie rozprowadź 0,5 mililitra nocnej kultury Bacillus subtilis BSB3 na powierzchni płytek pożywki zarodnikowej.

Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć dni, aż do 90% zarodnikowania. Następnie użyj mikroskopii o wysokiej rozdzielczości, aby sprawdzić, czy nie ma zarodników jasnych fazowo. Aby zebrać bakterie, dodaj jeden mililitr PBS do płytek i użyj sterylnego rozsiewacza komórek, aby zeskrobać bakterie z powierzchni.

Przechowywać zawiesinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, gdy będzie potrzebna. Potwierdzić żywotność bakterii, posiewając 0,1 mililitra odpowiedniego rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej na płytkach pożywki zarodnikowej i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Za pomocą licznika kolonii policz kolonie bakteryjne i oblicz miano bakterii w badanej zawiesinie.

Następnie przygotować zawiesinę bakteryjną w PBS o końcowym stężeniu od jednego razy dziesięć do ośmiu CFU na mililitr. Po leczeniu szczurów przez zgłębnik doustny B.subtilis BSB3 lub PBS przez dwa dni, a następnie podziale zwierząt i zmierzeniu im temperatury, należy trzymać szczury z grupy pierwszej i drugiej w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Umieść zwierzęta z grupy trzeciej i czwartej w komorze klimatycznej o temperaturze 45 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 55% na 25 minut.

Po ponownym zmierzeniu temperatury w odbycie każdego szczura, umieść wszystkie zwierzęta w temperaturze pokojowej na cztery godziny. Następnie, po eutanazji zwierząt, pobraniu krwi z tułowia i wyizolowaniu narządów zgodnie z protokołem tekstowym, umieść każdą próbkę narządu w wstępnie zważonych sterylnych probówkach i zważ. Dodać sterylny PBS do każdej probówki, aby uzyskać rozcieńczenie próbki od 1 do dziesięciu wagowych na objętość, a następnie użyć sterylnego homogenizatora do tkanek szklanych w celu wytworzenia jednorodnych zawiesin tkankowych.

Następnie użyj sterylnego PBS, aby wykonać seryjne rozcieńczenia każdej próbki. Następnie rozłóż 0,1 mililitra wszystkich rozcieńczeń na powierzchni MacConkeya i 5% agaru z krwią. I agar z krwią brucelozy z heminą i witaminą K1. Po inkubacji płytek użyj licznika kolonii, aby policzyć kolonie na każdej grupie płytek.

Wyraż wyniki jako liczbę jednostek tworzących kolonie lub jtk na gram tkanki. Po przygotowaniu i wybarwieniu odcinków jelita cienkiego zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą mikroskopu o wysokiej rozdzielczości zmierz kosmki jelitowe i całkowitą grubość ścianek błony śluzowej. Przeanalizuj co najmniej cztery próbki od każdego szczura i wykonaj co najmniej 20 pomiarów w każdej próbce.

Aby przeprowadzić mikroskopię świetlną o wysokiej rozdzielczości próbek krwi, należy użyć platformy wibroizolacyjnej jako podstawy systemu mikroskopowego z kamerą wideo i komputerem do rejestrowania obrazów na żywo. Po skalibrowaniu obrazów testowych zgodnie z protokołem tekstowym, umieść siedem mikrolitrów świeżo pobranej krwi od każdego szczura na szklanym szkiełku i dodaj szkiełko nakrywkowe. Następnie sfotografuj i zapisz dziesięć klatek obrazu o wymiarach 72 na 53,3 mikrometra do kwadratu w każdej próbce.

Na koniec, korzystając z oprogramowania, które zapewnia obrazy optyczne o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, zmierz stężenie pęcherzyków. Średnia temperatura ciała zwierząt przed i bezpośrednio po stresie cieplnym wynosiła odpowiednio 36,7 plus minus 07 stopni Celsjusza i 40,3 plus minus 0,17 stopni Celsjusza. Narażenie szczurów na ciepło spowodowało znaczne zahamowanie wysokości kosmków i całkowitej grubości błony śluzowej.

Jednak leczenie szczepem BSB3 przed stresem chroniło jelito przed szkodliwym działaniem ciepła. Pod kątem translokacji bakterii z jelit analizowano krezkowe węzły chłonne, wątrobę i śledzionę. Jak pokazano tutaj, bakterie izolowano w stężeniu 1,7 razy dziesięć do trzech plus minus 4,6 razy dziesięć do dwóch CFU na gram tkanki tylko w próbkach z węzłów chłonnych krezkowych i wątroby szczurów leczonych PBS wystawionych na działanie ciepła.

Z drugiej strony, wszystkie badane próbki od zwierząt kontrolnych i zestresowanych cieplnie, które otrzymały szczep BSB3, były sterylne. Nie zarejestrowano zmian w poziomach cytokin IL 1beta, IL-6, TNFalpha lub interferonu gamma u szczurów narażonych na stres cieplny. Jednak poziomy IL-10 i LPS były podwyższone u zwierząt traktowanych PBS przed obróbką cieplną.

W związku z tym wstępna obróbka B.subtilis BSB3 zapobiegła wzrostowi IL-10 i LPS w surowicy po obróbce cieplnej. Wreszcie, znaczny wzrost stężenia wolnych pęcherzyków stwierdzono we krwi szczurów, które otrzymywały PBS przed stresem cieplnym, ale nie u zwierząt leczonych BSB3. Ważne jest, aby pamiętać o użyciu materiałów pirogennych do pobierania krwi i precyzji utrzymywania płynów w surowicy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przy wielokrotnym zamrażaniu i rozmrażaniu, a także o przestrzeganiu sterylnej procedury podczas analizy translokacji bakteryjnej.

Postępowanie zgodnie z tą procedurą, podobnie jak podawanie bakterii po stresie cieplnym, może być wykonane w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące powikłań stresu cieplnego.