Name: Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Poznaj metodę znakowania spinowego skierowanego w miejscu i spektroskopii EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym. Technika ta umożliwia badanie dynamiki dużych białek błonowych w fizjologicznym środowisku lipidowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy bardzo wdzięczni obecnym i byłym członkom laboratorium Chakrapani za krytyczną lekturę i komentarze na temat manuskryptu. Prace te były wspierane przez grant National Institutes of Health (1R01GM108921) i American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 12SDG12070069) oraz SC.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Spektroskopia EPR okazała się niezrównanym podejściem strukturalnym do ilościowego określania zmian konformacyjnych w białkach błonowych w środowisku zbliżonym do natywnego. Takie podejście pozwala nam zajrzeć w molekularne szczegóły dynamiki białek, które są ukryte w strukturach o wysokiej rozdzielczości z krystalografii rentgenowskiej i mikroskopii krioelektronowej. Należy jednak wziąć pod uwagę techniczne ograniczenia tego podejścia, które mogą mieć wpływ na ogólne zastosowanie do innych systemów, a także pamiętać o p...

W ciągu ostatniej dekady, zrozumienie struktury pentamerycznych kanałów jonowych bramkowanych ligandem (pLGIC) wzrosło skokowo, dzięki mnogości struktur o wysokiej rozdzielczości kilku członków rodziny. Kluczowe czynniki, które doprowadziły do obecnych postępów w tej dziedzinie, obejmują odkrycie prokariotycznych kanałów pLGIC,1-3 znaczne postępy w ekspresji białek błony eukariotycznej,4-6 oraz ogromne przełomy w podejściach do określania struktury. 7 Struktury te zapewniają wyraźny konsensus co do ogólnej ochrony trójwymiarowej architektury pLGIC. Jednak dwa główne obszary, które wydają się pozostawać w tyle, to funkcjonalna charakterystyka tych preparatów kanałowych i mechanistyczny opis funkcji kanału.
Bramkowanie zmiany konformacyjne są złożone i zachodzą na przestrzeni 60 A wzdłuż długości kanału, a przejścia te są intensywnie modulowane przez lipidy błonowe. W szczególności wykazano, że ujemne lipidy, cholesterol i fosfolipidy modulują funkcję pLGIC8-11. Chociaż dokładna rola tych składników lipidowych w funkcjonowaniu kanałów pozostaje nieznana, pełne zrozumienie molekularnego bramkowania wymagałoby zbadania tych kanałów w ich naturalnym środowisku. Site-Directed Spin Labeling (SDSL) i spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) to techniki z wyboru do badania dynamiki białek w odtworzonych układach. Spektroskopia EPR nie jest ograniczona wielkością cząsteczki (jak w przypadku NMR) ani właściwościami optycznymi próbki (jak spektroskopia fluorescencyjna), a tym samym umożliwia pomiary pełnowymiarowych konstruktów odtworzonych w natywnych warunkach lipidowych. Technika ta jest niezwykle czuła i ma stosunkowo niskie wymagania dotyczące próbek (w zakresie piko-kretów). Oba te aspekty sprawiają, że technika ta dobrze nadaje się do badania dużych białek błonowych, które są trudne do ekspresji w ilościach przekraczających miligram.
Użycie spektroskopii EPR w połączeniu z kierunkowym znakowaniem spinowym zostało opracowane przez Wayne'a Hubbella i współpracowników i zostało dostosowane do badania różnych typów białek. Dane 12-24 EPR wykorzystano do zbadania struktur drugorzędowych, zmian w konformacji białka, głębokości insercji błony oraz interakcji białko-białko/białko-ligand.
Metoda polega na podstawianiu cysteiny w interesujących miejscach poprzez mutagenezę ukierunkowaną. Aby zapewnić etykietowanie specyficzne dla miejsca, konieczne jest zastąpienie natywnych cystein innym aminokwasem (np. seryną) w celu stworzenia matrycy bez cysteiny. Zdecydowanie najpopularniejszą etykietą spinową jest specyficzny dla tiolu MTSL: (1-oksylo-2,2,5,5-tetrametylo-Δ3-pirolino-3-metylo) metanetiosiulfonian, który przyłącza się do białka poprzez mostek wiązania dwusiarczkowego. Ze względu na wysoką specyficzność, stosunkowo mały rozmiar (nieco większy niż tryptofan) i elastyczność regionu łącznikowego, wykazano, że ta etykieta spinowa ma doskonałą reaktywność nawet z zakopaną cysteiną. Ponadto, aby zmaksymalizować reaktywność, reakcja znakowania białka odbywa się w postaci rozpuszczonej w detergentach. Po oddzieleniu nadmiaru wolnego spinu za pomocą chromatografii wykluczania wielkości, białko jest odtwarzane w liposomach lub dwuwarstwowych systemach naśladujących o określonym składzie lipidowym. Ogólnie rzecz biorąc, mutageneza cysteiny jest dobrze tolerowana w większości części białka, a stosunkowo mały rozmiar sondy spinowej powoduje minimalne zaburzenia struktur drugorzędowych i trzeciorzędowych. Aby upewnić się, że modyfikacja zachowała funkcje typu dzikiego, oznakowane i odtworzone kanały można badać za pomocą pomiarów patch-clamp.
Białko funkcyjne jest następnie poddawane pomiarom spektroskopowym, które zasadniczo dostarczają trzech głównych typów informacji:12,14,15,20,22,23,25-27 dynamika spin-probe poprzez analizę kształtu linii; dostępność sondy dla paramagnetycznych środków relaksacyjnych; oraz rozkład odległości. 27 Odległości EPR mierzy się na dwa różne sposoby. Pierwsza z nich opiera się na technice fali ciągłej (CW), w której do wyznaczenia odległości wykorzystuje się poszerzenie widma wynikające z oddziaływań dipolarnych między znacznikami spinowymi (w zakresie odległości 8 - 20 A). 28,29 Druga to metoda impulsowego EPR, w której pomiary odległości można rozszerzyć do 70 A. 30-34 W podwójnym rezonansie elektronowym (DEER) oscylacje amplitudy spin-echo są analizowane w celu określenia odległości i rozkładów odległości. Tutaj echo spinowe jest modulowane przy częstotliwości oddziaływania dipolarnego. Łącznie parametry te są wykorzystywane do określenia topologii białka, drugorzędowych elementów strukturalnych i zmian konformacyjnych białek.

<table><tbody><tr><td>Mutageneza ukierunkowana i mutacje</td><td></td><td></td><td></td>Cys</tr><tr><td>10x bufor reakcyjny PfuUltra HF</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-52</td><td></td></tr><tr><td>dNTPS</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>N0447L</td><td>10 mM każdy dNTP</td></tr><tr><td>pfu Ultra DNA polimeraza</td><td>Agilent Technologies</td><td>600380-51</td><td>2,5 U/ul</td></tr><tr><td>DPNI</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>R0176S</td><td>20 000 U/ml</td></tr><tr><td>XL10 GOLD</td><td>Agilent Technologies</td><td>200314</td><td></td></tr><tr><td>podłoża SOC</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>B9020S</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP905</td><td></td></tr><tr><td>LB media</td><td>Invitrogen</td><td>127957084</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprepu</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>C43 kompetentne komórki</td><td>Lucigen</td><td>60446</td><td></td></tr><tr><td>Ekspresja i oczyszczanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glukozy</td><td>Fisher Scientfic</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Amresco</td><td>J850</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0705</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Amresco</td><td>0781</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropylo-tio-&beta;-galaktozyd)</td><td>Złoto Biotechnologia</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Life Science</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Life Science</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Amresco</td><td>M145</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>Amresco</td><td>J580</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna</td><td>Amresco</td><td>J583</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecyl-&beta;-D-Maltopyranoside)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Żywica amylozowa</td><td>New England BioLabs Inc&lrm;</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Amresco</td><td>K831</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientfic</td><td>BP118</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>Acros Organics</td><td>329915000</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td></td></tr><tr><td>Pusta polipropylenowa kolumna chromatograficzna</td><td>BioRad</td><td>731-1550</td><td></td></tr><tr><td>Site-Directed Spin Labeling</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-oksylo-2,2,5,5-tetrametylo-3-pirolino-3-metylo) Metanetylosulfonian</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>(1-acetoksy-2,2,5,5-tetrametylo-&Delta; 3-pirolino-3-metylo)metanetiosiulfonian</td><td>Toronto Reaserch chemicals Inc</td><td>A167900</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>J.T. Baker</td><td>9224-01</td><td></td></tr><tr><td>Rekonstytucja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipid asolektyny</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Biokulki (kulki polistyrenu)</td><td>Bio Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Chemikalia Fisher</td><td>A413</td><td></td></tr><tr><td>FRET</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceinowo-maleimidowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-150</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametylorodamino-maleimidowy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T-6027</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti polarne lipidy Inc</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>POPG</td><td>Avanti polarne lipidy Inc</td><td>840457C</td><td></td></tr><tr><td> E.coli polarny ekstrakt lipidowy</td><td>Avanti polar lipids Inc</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Life Science</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Pomiar</td><td></td><td></td><td></td>EPR</tr><tr><td>Kapilary plastikowe TPX</td><td>Bruker</td><td>ER221</td><td></td></tr><tr><td>EDDA (Kwas etylenodiamino-N, N'-diacetowy)</td><td>Aldrich</td><td>158186</td><td></td></tr><tr><td>Ni(OH)2</td><td>Aldrich</td><td>283622</td><td></td></tr></tbody></table>

znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe epr kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Site Directed Spin Labeling and EPR Spectroscopic Studies of Pentameric Ligand-Gated Ion Channels

Bramkowanie kanałów jonowych to sterowana bodźcem orkiestracja ruchów białek, która prowadzi do przejść między stanami zamkniętymi, otwartymi i odczulenymi. Fundamentalne znaczenie dla tych przemian ma wewnętrzna elastyczność białka, która jest krytycznie modulowana przez skład lipidowy błony. Aby lepiej zrozumieć strukturalne podstawy funkcji kanałów, konieczne jest zbadanie dynamiki białek w fizjologicznym środowisku błonowym. Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest ważnym narzędziem do charakteryzowania przejść konformacyjnych między stanami funkcjonalnymi. W porównaniu z NMR i krystalografią rentgenowską, informacje uzyskane z EPR mają z natury niższą rozdzielczość. Jednak w przeciwieństwie do innych technik, w EPR nie ma górnej granicy masy cząsteczkowej białka, wymagania dotyczące próbki są znacznie niższe, a co ważniejsze, białko nie jest ograniczone siłami sieci krystalicznej. W związku z tym EPR doskonale nadaje się do badania dużych kompleksów białkowych i białek w odtworzonych układach. W tym artykule omówimy ogólne protokoły znakowania spinowego kierowanego w miejscu i rekonstytucji błony przy użyciu prokariotycznego, bramkowanego protonami, pentamerycznego kanału jonowego bramkowanego ligandem (pLGIC) z Gloeobacter violaceus (GLIC) jako przykładu. Opisana zostanie kombinacja podejścia EPR do fali ciągłej w stanie ustalonym (CW) i impulsowego (rezonans elektronów podwójnych elektronów-DEER), które umożliwi pełną ilościową charakterystykę dynamiki kanałów.

Charakterystyka biochemiczna mutantów GLIC znakowanych spinowo
Postępowanie zgodnie z powyższym protokołem zazwyczaj pozwala na uzyskanie białka fuzyjnego GLIC-MBP w zakresie 10 - 12 mg/L hodowli. Chociaż wartość ta może się różnić w zależności od konkretnego mutanta, szczególnie w przypadku pozycji ukrytych wewnątrz białka, wydajność może być znacznie obniżona. W takich przypadkach może zajść konieczność zwięks...

Ten artykuł opisuje metody znakowania spinów kierowanych przez miejsce i odtwarzania pentamerycznych kanałów bramkowanych ligandem do badań elektronowego rezonansu paramagnetycznego. Protokół ten można dostosować do dowolnego białka błonowego. Opisana tutaj metoda rekonstytucji może być również stosowana do pomiarów patch-clamp prądów makroskopowych i jednokanałowych w zdefiniowanym układzie lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie oczyszczania, ukierunkowanego znakowania spinowego oraz rekonstytucji penamerycznego kanału sterowanego ligandem do badań z wykorzystaniem rezonansu paramagnetycznego elektronów. Badanie dynamiki białek błonowych w środowisku fizjologicznie istotnym jest kluczowe dla pełnego zrozumienia mechanizmu działania tego białka transportowego. Ze względu na te potrzeby, uważam, że technika ukierunkowanego znakowania spinowego oraz EPR jest rozwiązaniem idealnie dopasowanym.Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest ona ograniczona rozmiarem białka. W związku z tym ukierunkowane znakowanie spinowe oraz spektroskopia EPR będą technikami pierwszego wyboru, jeśli chcą Państwo badać dynamikę dużych białek lub białka zrekonstytuowane w błonach. Wprowadź pojedyncze mutacje cysteinowe w genie GLIC za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.Przygotować kulturę nocną mutanta cysteinowego GLIC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie do autoklawowanego pożywki terrific broth dodać 100 mililitrów sterylnego buforu fosforanowego potasu. Potem dodać sterylną glukozę, Kanamycynę oraz 10 mililitrów kultury nocnej.Inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarkach przy 250 rpm. Dodać 50 ml glicerolu i kontynuować wytrząsanie hodowli, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 1,0 do 1,2. Po indukowaniu komórek 200 µM IPTG, ponownie ustawić wytrząsarkę na 250 rpm i inkubować przez kolejne około 16 godzin w temperaturze 18 °C.Zbiór komórek należy przeprowadzić w litrowych butelkach do wirówki, wirując przy 8500 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odlać nadsącz i zważyć butelkę z osadem komórkowym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Osad bakteryjny resuspender w 150 mL lodowatego buforu A na każdy jeden litr hodowli.Zhomogenizuj komórki, przepuszczając je przez homogenizator komórkowy w pomieszczeniu chłodniczym o temperaturze 4°C. Powtórz ten proces trzy razy, aby zlizować większość bakterii. Odwiruj komórki przy 14 000 ×g przez 15 minut.Następnie pipetą pobierz supernatant i przenieś go do czystej probówki do wirowania. Po odwirowaniu supernatnatu z prędkością 168 000 ×g przez jedną godzinę, ostrożnie odlej supernatant, nie naruszając osadu błonowego. Pobierz osad błonowy z jednego litra hodowli i resuspenduj go w Buforze A, uzupełnionym o 10% glicerolu, do końcowej objętości 50 ml.Do zawiesiny błonowej dodać 0,5 g DDM i inkubować na nutatorze przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Po solubilizacji błon usunąć szczątki komórkowe z lizatu poprzez wirowanie przy 168 000 ×g przez jedną godzinę. W międzyczasie przygotować żywicę amylozową.Za pomocą pipety przenieś trzy mililitry żywicy do pustej polipropylenowej kolumny chromatograficznej. Przemyj żywicę, przepuszczając trzykrotnie 10 objętości złoża wody, a następnie 10 objętości złoża Buforu A zawierającego 0,5 milimola DDM. Po wirowaniu ostrożnie pobierz nadsącz za pomocą pipety i przenieś go do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.W celu wiązania okresowego dodaj uprzednio równoważoną żywicę amylozową do probówki stożkowej. Przywiąż wyekstrahowane białko do żywicy amylozowej, poddając mieszaninę nutacji przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przepuść całą zawiesinę przez kolumnę chromatograficzną i zbierz frakcję przepływową.Rozcieńczyć białko GLIC w 10 mililitrach Buforu A zawierającego 40 milimolarną maltozę oraz 0,5 milimolarnego DDM i 0,5 milimolarnego TCEP. TCEP zapobiega utlenianiu łańcuchów bocznych cysteiny. Zebrać cały eluat.Skoncentruj eluat białkowy za pomocą koncentratora odśrodkowego do stężenia od 4 mg/mL do 6 mg/mL. Dodaj proteazę HRV 3C i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Aby przeprowadzić ukierunkowane znakowanie spinowe, dodaj najpierw dziesięciokrotną nadwyżkę molową znacznika spinowego MTSL do próbki trawionej proteazą, tak aby stosunek molowy monomeru GLIC do MTSL wynosił 1:10.Po jednej godzinie inkubacji należy dodać kolejną porcję znacznika spinowego w pięciokrotnym nadmiarze molowym i inkubować przez kolejną godzinę. Próbkę należy przepuścić przez kolumnę do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) z wykluczaniem sterycznym, uprzednio równoważoną Buforem A oraz 0,5 mM DDM, aby oddzielić odcięty znacznik MBP i nadmiar wolnego znacznika spinowego od pentamerów GLIC. Roztwór białka należy zagęścić za pomocą koncentratora odwirującego do końcowego stężenia około 8–10 mg/mL i umieścić na lodzie.Próbka jest teraz gotowa do rekonstytucji. Aby przygotować liposomy, opłucz czystą kolbę okrągłodenną o pojemności 25 mililitrów pięcioma mililitrami chloroformu, a następnie wysusz kolbę strumieniem gazowego azotu w dygestorium. Następnie przenieś 10 miligramów asolektyny do kolby i wysusz lipidy pod ciągłym strumieniem gazowego azotu.Po odparowaniu chloroformu umieść kolbę w próżni na jedną godzinę, aby zapewnić całkowite wysuszenie. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do rekonstytucji A do wysuszonych lipidów i energicznie wymieszaj kolbę w vortexie, aby doprowadzić pellet lipidowy do zawieszenia. W celu przygotowania małych pęcherzyków jednowarstwowych poddaj zawiesinę lipidową sonikacji w chłodzącym sonicatorze kąpielowym, aż roztwór pęcherzyków stanie się w przybliżeniu półprzezroczysty i nie będą widoczne żadne grudki.Do mieszaniny tej dodać DDM do stężenia końcowego 4 mM i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W celu rekonstytucji białka dodać oczyszczone białko do mieszaniny lipidowej. Po inkubacji próbki w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę przy łagodnym mieszaniu obrotowym, rozcieńczyć próbkę do 15 ml za pomocą Buforu A. Usunąć pozostały detergent z zawiesiny, używając kulek polistyrenowych z hydrophobicznymi porami, które wiążą detergent.Dodaj 80 mg czystych kulek i inkubuj zawiesinę liposomów przez noc w nutatorze w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przenieś liposomy do probówki do ultrawirówki o pojemności 25 ml, używając filtra kolumnowego do usunięcia kulek, a następnie rozcieńcz próbkę do 25 ml. Po wirowaniu próbek przy 168 000 ×g przez dwie godziny, odlej supernatant i resuspenduj osad w 100 µl Buforu B. Aby przeprowadzić spektroskopię EPR w trybie ciągłym, najpierw przenieś zawiesinę liposomów do probówki o pojemności 200 µl i odwiruj próbki w wirówce.Po odlaniu supernatantu próbka jest gotowa do pomiarów EPR. Należy usunąć z próbki liposomów jak najwięcej buforu. Aby przeprowadzić wymianę buforu, przenieś 20 µL osadu z liposomów do probówki do mikrowirówki za pomocą pipety.Dodaj 180 µL Buforu D i inkubuj w temperaturze 42 °C przez pięć minut. Odwiruj próbkę, usuń nadsącz za pomocą pipety i powtórz ten proces trzy razy, aby zapewnić całkowitą wymianę buforu. Plastikowe kapilary przepuszczalne dla gazów są odpowiednie do pomiarów zarówno kształtów linii widmowych, jak i dostępności rozpuszczalnika.Przyciśnij kapilarę do osadu proteoliposomów, aby pobrać próbkę do wnętrza, a następnie uszczelnij koniec woskiem kostnym. Przedstawiona tutaj charakterystyka biochemiczna mutantów GLIC znakowanych spinowo opiera się na chromatogramie filtracji żelowej znakowanego spinowo białka GLIC po proteolitycznym odcięciu znacznika MBP. Piki odpowiadają pentamerowi GLIC oraz wolnemu MBP.Żel SDS-PAGE przedstawia niepociętą monomericzną białko fuzyjne GLIC-MBP przed filtracją żelową, a także frakcje MBP i GLIC wyodrębnione podczas filtracji żelowej. Przeprowadzono test oparty na FRET w celu monitorowania stanu agregacji GLIC zrekonstytuowanego w różnych lipidach błonowych. Pomiary FRET wykonano dla próbek po całonocnej rekonstytucji oraz po wielokrotnych cyklach zamrażania i rozmrażania próbek.Wewnątrz-na-zewnątrz (inside-out) patch wyciętym z rekonstruowanych pęcherzyków asolektynowych GLIC jest aktywowany poprzez skoki pH przy użyciu szybkiej wymiany roztworu. Zaobserwowano, że kanały aktywują się w ciągu około 10 milisekund i ulegają desensytyzacji z stałą czasową od jednej do trzech sekund. Podczas aktywacji kanału obserwowane są przegrupowania strukturalne.Tutaj widma ciągłego rezonansu paramagnetycznego elektronów dla pozycji w wyściełającej por helisy M2 wykazują zmiany amplitudy i kształtów w odpowiedzi na zmiany pH. Spektroskopia EPR jest niezrównanym podejściem strukturalnym do pomiaru zmian konformacyjnych białek błonowych w ich naturalnym środowisku i pozwala wglądu w szczegóły molekularne dynamiki białek, które są niewidoczne w strukturach rentgenowskich o wysokiej rozdzielczości lub strukturach cryo-EM. Pracując z tą techniką, należy pamiętać, że mutacje często prowadzą do niskiej i słabej stabilności oligomerycznej białka.W związku z tym konieczne może być opracowanie strategii walki z tymi problemami. Połączenie wyników tych badań EPR z pomiarami funkcjonalnymi może dostarczyć pełniejszego obrazu służącego do badania zależności między strukturą a funkcją, a przyszłe postępy technologiczne są nakierowane na wykorzystanie tego potężnego podejścia do badania bardziej złożonych kanałów ludzkich w bardziej zaawansowanych warunkach lipidowych.

site-directed-spin-labeling-epr-spectroscopic-studies-pentameric

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisujemy prosty protokół służący do identyfikacji białek mózgowych wiążących się z pełną sekwencją końca C receptorów P2X2 bramkowanych przez ATP. Przewiduje się, że rozszerzenie i systematyczne zastosowanie tego podejścia do wszystkich receptorów P2X doprowadzi do lepszego zrozumienia sygnalizacji receptorów P2X.

Proteomika w celu identyfikacji białek oddziałujących z ligandowo-bramkowanymi kanałami kationowymi P2X2

Opiszemy metodę służącą do pomiaru kinetyki transportu jonów przez białka błonowe wraz z analizą zmian konformacyjnych w konkretnych miejscach z wykorzystaniem fluorescencji w pojedynczych komórkach. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku kanałów jonowych, transporterów i pomp jonowych, a także może być wykorzystana do określenia ograniczeń odległości między podjednostkami białek.

Badanie dynamiki konformacyjnej białek błonowych in situ z wykorzystaniem ukierunkowanego znakowania fluorescencyjnego

Kodujemy genetycznie nienaturalny aminokwas, p-azydo-L-fenyloalaninę w różnych docelowych miejscach w GPCR i pokazujemy wszechstronność grupy azydologicznej w różnych zastosowaniach. Obejmują one ukierunkowaną technologię fotosieciowania w celu identyfikacji reszt w kieszeni wiążącej ligand GPCR oraz specyficzną dla miejsca bioortogonalną modyfikację GPCR za pomocą znacznika peptydowo-epitopowego lub sondy fluorescencyjnej.

Genetycznie kodowane sondy molekularne do badania receptorów sprzężonych z białkiem G

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Przedstawiono protokół zastosowania spektroskopii NMR wzmacniającej relaksację paramagnetyczną do wykrywania słabych i przejściowych interakcji między- i wewnątrzcząsteczkowych w białkach wewnętrznie nieuporządkowanych.

Wzmocnienie relaksacji paramagnetycznej do wykrywania i charakteryzowania samoasocjacji wewnętrznie nieuporządkowanych białek

To badanie przedstawia szczegółową procedurę przeprowadzania eksperymentów z transferem energii rezonansu fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFRET) na receptorach sprzężonych z białkiem G (GPCR) przy użyciu znakowania specyficznego dla miejsca poprzez inkorporację nienaturalnych aminokwasów (UAA). Protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący przygotowania próbek, eksperymentów i analizy danych smFRET.

Wizualizacja dynamiki konformacyjnej receptorów błonowych za pomocą jednocząsteczkowego FRET

Ten protokół wprowadza dostępne narzędzia do modelowania ligandów małocząsteczkowych na mapach krioEM makromolekuł.

Modelowanie ligandów na mapach pochodzących z kriomikroskopii elektronowej

Elektrofizjologia to złoty standard w badaniu aktywności kanałów jonowych. Istnieje jednak wiele alternatywnych podejść, w tym metod optycznych. W tym miejscu opisujemy metodę monitorowania aktywności bogatego w leucynę powtórzenia zawierającego 8-kanałowe (LRRC8) kanały anionowe utworzone przy użyciu metody opartej na rezonansowym transferze energii Förstera (FRET) między podjednostkami.

Monitorowanie aktywności powtórzeń bogatych w leucynę zawierających 8 kanałów (LRRC8/VRAC) przy użyciu transferu energii rezonansowej Förstera z emisją uczuloną (SE-FRET)

Poznaj metodę znakowania spinowego skierowanego w miejscu i spektroskopii EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym. Technika ta umożliwia badanie dynamiki dużych białek błonowych w fizjologicznym środowisku lipidowym.

Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Przeglądaj więcej filmów