Znakowanie spinowe skierowane w miejscu i badania spektroskopowe EPR kanałów jonowych bramkowanych ligandem pentamierycznym

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie oczyszczania, ukierunkowanego znakowania spinowego oraz rekonstytucji penamerycznego kanału sterowanego ligandem do badań z wykorzystaniem rezonansu paramagnetycznego elektronów. Badanie dynamiki białek błonowych w środowisku fizjologicznie istotnym jest kluczowe dla pełnego zrozumienia mechanizmu działania tego białka transportowego. Ze względu na te potrzeby, uważam, że technika ukierunkowanego znakowania spinowego oraz EPR jest rozwiązaniem idealnie dopasowanym.

Główną zaletą tej techniki jest to, że nie jest ona ograniczona rozmiarem białka. W związku z tym ukierunkowane znakowanie spinowe oraz spektroskopia EPR będą technikami pierwszego wyboru, jeśli chcą Państwo badać dynamikę dużych białek lub białka zrekonstytuowane w błonach. Wprowadź pojedyncze mutacje cysteinowe w genie GLIC za pomocą mutagenezy ukierunkowanej.

Przygotować kulturę nocną mutanta cysteinowego GLIC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie do autoklawowanego pożywki terrific broth dodać 100 mililitrów sterylnego buforu fosforanowego potasu. Potem dodać sterylną glukozę, Kanamycynę oraz 10 mililitrów kultury nocnej.

Inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarkach przy 250 rpm. Dodać 50 ml glicerolu i kontynuować wytrząsanie hodowli, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 1,0 do 1,2. Po indukowaniu komórek 200 µM IPTG, ponownie ustawić wytrząsarkę na 250 rpm i inkubować przez kolejne około 16 godzin w temperaturze 18 °C.

Zbiór komórek należy przeprowadzić w litrowych butelkach do wirówki, wirując przy 8500 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Odlać nadsącz i zważyć butelkę z osadem komórkowym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Osad bakteryjny resuspender w 150 mL lodowatego buforu A na każdy jeden litr hodowli.

Zhomogenizuj komórki, przepuszczając je przez homogenizator komórkowy w pomieszczeniu chłodniczym o temperaturze 4°C. Powtórz ten proces trzy razy, aby zlizować większość bakterii. Odwiruj komórki przy 14 000 ×g przez 15 minut.

Następnie pipetą pobierz supernatant i przenieś go do czystej probówki do wirowania. Po odwirowaniu supernatnatu z prędkością 168 000 ×g przez jedną godzinę, ostrożnie odlej supernatant, nie naruszając osadu błonowego. Pobierz osad błonowy z jednego litra hodowli i resuspenduj go w Buforze A, uzupełnionym o 10% glicerolu, do końcowej objętości 50 ml.

Do zawiesiny błonowej dodać 0,5 g DDM i inkubować na nutatorze przez dwie godziny w temperaturze 4 °C. Po solubilizacji błon usunąć szczątki komórkowe z lizatu poprzez wirowanie przy 168 000 ×g przez jedną godzinę. W międzyczasie przygotować żywicę amylozową.

Za pomocą pipety przenieś trzy mililitry żywicy do pustej polipropylenowej kolumny chromatograficznej. Przemyj żywicę, przepuszczając trzykrotnie 10 objętości złoża wody, a następnie 10 objętości złoża Buforu A zawierającego 0,5 milimola DDM. Po wirowaniu ostrożnie pobierz nadsącz za pomocą pipety i przenieś go do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów.

W celu wiązania okresowego dodaj uprzednio równoważoną żywicę amylozową do probówki stożkowej. Przywiąż wyekstrahowane białko do żywicy amylozowej, poddając mieszaninę nutacji przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przepuść całą zawiesinę przez kolumnę chromatograficzną i zbierz frakcję przepływową.

Rozcieńczyć białko GLIC w 10 mililitrach Buforu A zawierającego 40 milimolarną maltozę oraz 0,5 milimolarnego DDM i 0,5 milimolarnego TCEP. TCEP zapobiega utlenianiu łańcuchów bocznych cysteiny. Zebrać cały eluat.

Skoncentruj eluat białkowy za pomocą koncentratora odśrodkowego do stężenia od 4 mg/mL do 6 mg/mL. Dodaj proteazę HRV 3C i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Aby przeprowadzić ukierunkowane znakowanie spinowe, dodaj najpierw dziesięciokrotną nadwyżkę molową znacznika spinowego MTSL do próbki trawionej proteazą, tak aby stosunek molowy monomeru GLIC do MTSL wynosił 1:10.

Po jednej godzinie inkubacji należy dodać kolejną porcję znacznika spinowego w pięciokrotnym nadmiarze molowym i inkubować przez kolejną godzinę. Próbkę należy przepuścić przez kolumnę do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) z wykluczaniem sterycznym, uprzednio równoważoną Buforem A oraz 0,5 mM DDM, aby oddzielić odcięty znacznik MBP i nadmiar wolnego znacznika spinowego od pentamerów GLIC. Roztwór białka należy zagęścić za pomocą koncentratora odwirującego do końcowego stężenia około 8–10 mg/mL i umieścić na lodzie.

Próbka jest teraz gotowa do rekonstytucji. Aby przygotować liposomy, opłucz czystą kolbę okrągłodenną o pojemności 25 mililitrów pięcioma mililitrami chloroformu, a następnie wysusz kolbę strumieniem gazowego azotu w dygestorium. Następnie przenieś 10 miligramów asolektyny do kolby i wysusz lipidy pod ciągłym strumieniem gazowego azotu.

Po odparowaniu chloroformu umieść kolbę w próżni na jedną godzinę, aby zapewnić całkowite wysuszenie. Następnie dodaj jeden mililitr buforu do rekonstytucji A do wysuszonych lipidów i energicznie wymieszaj kolbę w vortexie, aby doprowadzić pellet lipidowy do zawieszenia. W celu przygotowania małych pęcherzyków jednowarstwowych poddaj zawiesinę lipidową sonikacji w chłodzącym sonicatorze kąpielowym, aż roztwór pęcherzyków stanie się w przybliżeniu półprzezroczysty i nie będą widoczne żadne grudki.

Do mieszaniny tej dodać DDM do stężenia końcowego 4 mM i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W celu rekonstytucji białka dodać oczyszczone białko do mieszaniny lipidowej. Po inkubacji próbki w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę przy łagodnym mieszaniu obrotowym, rozcieńczyć próbkę do 15 ml za pomocą Buforu A. Usunąć pozostały detergent z zawiesiny, używając kulek polistyrenowych z hydrophobicznymi porami, które wiążą detergent.

Dodaj 80 mg czystych kulek i inkubuj zawiesinę liposomów przez noc w nutatorze w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przenieś liposomy do probówki do ultrawirówki o pojemności 25 ml, używając filtra kolumnowego do usunięcia kulek, a następnie rozcieńcz próbkę do 25 ml. Po wirowaniu próbek przy 168 000 ×g przez dwie godziny, odlej supernatant i resuspenduj osad w 100 µl Buforu B. Aby przeprowadzić spektroskopię EPR w trybie ciągłym, najpierw przenieś zawiesinę liposomów do probówki o pojemności 200 µl i odwiruj próbki w wirówce.

Po odlaniu supernatantu próbka jest gotowa do pomiarów EPR. Należy usunąć z próbki liposomów jak najwięcej buforu. Aby przeprowadzić wymianę buforu, przenieś 20 µL osadu z liposomów do probówki do mikrowirówki za pomocą pipety.

Dodaj 180 µL Buforu D i inkubuj w temperaturze 42 °C przez pięć minut. Odwiruj próbkę, usuń nadsącz za pomocą pipety i powtórz ten proces trzy razy, aby zapewnić całkowitą wymianę buforu. Plastikowe kapilary przepuszczalne dla gazów są odpowiednie do pomiarów zarówno kształtów linii widmowych, jak i dostępności rozpuszczalnika.

Przyciśnij kapilarę do osadu proteoliposomów, aby pobrać próbkę do wnętrza, a następnie uszczelnij koniec woskiem kostnym. Przedstawiona tutaj charakterystyka biochemiczna mutantów GLIC znakowanych spinowo opiera się na chromatogramie filtracji żelowej znakowanego spinowo białka GLIC po proteolitycznym odcięciu znacznika MBP. Piki odpowiadają pentamerowi GLIC oraz wolnemu MBP.

Żel SDS-PAGE przedstawia niepociętą monomericzną białko fuzyjne GLIC-MBP przed filtracją żelową, a także frakcje MBP i GLIC wyodrębnione podczas filtracji żelowej. Przeprowadzono test oparty na FRET w celu monitorowania stanu agregacji GLIC zrekonstytuowanego w różnych lipidach błonowych. Pomiary FRET wykonano dla próbek po całonocnej rekonstytucji oraz po wielokrotnych cyklach zamrażania i rozmrażania próbek.

Wewnątrz-na-zewnątrz (inside-out) patch wyciętym z rekonstruowanych pęcherzyków asolektynowych GLIC jest aktywowany poprzez skoki pH przy użyciu szybkiej wymiany roztworu. Zaobserwowano, że kanały aktywują się w ciągu około 10 milisekund i ulegają desensytyzacji z stałą czasową od jednej do trzech sekund. Podczas aktywacji kanału obserwowane są przegrupowania strukturalne.

Tutaj widma ciągłego rezonansu paramagnetycznego elektronów dla pozycji w wyściełającej por helisy M2 wykazują zmiany amplitudy i kształtów w odpowiedzi na zmiany pH. Spektroskopia EPR jest niezrównanym podejściem strukturalnym do pomiaru zmian konformacyjnych białek błonowych w ich naturalnym środowisku i pozwala wglądu w szczegóły molekularne dynamiki białek, które są niewidoczne w strukturach rentgenowskich o wysokiej rozdzielczości lub strukturach cryo-EM. Pracując z tą techniką, należy pamiętać, że mutacje często prowadzą do niskiej i słabej stabilności oligomerycznej białka.

W związku z tym konieczne może być opracowanie strategii walki z tymi problemami. Połączenie wyników tych badań EPR z pomiarami funkcjonalnymi może dostarczyć pełniejszego obrazu służącego do badania zależności między strukturą a funkcją, a przyszłe postępy technologiczne są nakierowane na wykorzystanie tego potężnego podejścia do badania bardziej złożonych kanałów ludzkich w bardziej zaawansowanych warunkach lipidowych.