Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Ogólnym celem tego protokołu jest wygenerowanie tolerogennych i dojrzałych komórek dendrytycznych z monocytów do eksperymentów lub opracowania szczepionki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, dostarczając modelu do badania rozwoju, dojrzewania i prezentacji antygenu komórek dendrytycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona generowanie dużej liczby komórek dendrytycznych in vitro do celów eksperymentalnych.

Wzbogacanie monocytów należy rozpocząć od zmieszania 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanej komórki monojądrowej krwi obwodowej lub zawiesiny komórek PBMC z 20 mikrolitrami błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru. Następnie odwirować zawiesinę komórkową. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy do stężenia 80 mikrolitrów buforu barwiącego na 10 do siódmych komórek.

Dodaj 20 mikrolitrów mikrokulek CD-4 na 10 do siódmych komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki jednym mililitrem buforu barwiącego na 10 do siódmych komórek i odwiruj komórki.

Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy. Uzyskać kolumnę pożywki na maksymalnie dwa razy od 10 do ósmej całkowitej liczby komórek i umieścić kolumnę w polu magnetycznym separatora. Następnie przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami buforu barwiącego.

Odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę i zebrać nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę, w 15-mililitrowej probówce. Wymień nową 15-mililitrową rurkę pod kolumną i umyj kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu barwiącego. Upewnij się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem nowego bufora barwiącego między praniami.

Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na świeżej 15-mililitrowej probówce. Odpipetować jeden mililitr buforu barwiącego na kolumnę i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny. Następnie powtórz etapy separacji magnetycznej, używając zilustrowanej frakcji w nowej kolumnie, aby zwiększyć czystość komórek CD14 plus.

Zasiaj cztery zestawy CD14 plus monocyty w stężeniu od punktu zerowego od trzech do punktu zerowego pięć razy 10 do szóstego na mililitr pożywki do hodowli komórkowej IL-4 w sześciu płytkach dołkowych. Inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2. Czwartego dnia usuń 850 mikrolitrów pożywki z kultury i odwiruj.

Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki do hodowli komórkowych. Dodaj mieszaninę komórek z powrotem do hodowli. Piątego dnia dodaj jeden mikrolitr bulionu witaminy D3 i jeden mikrolitr wywaru deksametazonu na jeden litr pożywki do dwóch zestawów, aby wytworzyć tolerogenne moDC.

Szóstego dnia dodaj 200 nanogramów na mililitr GMCSF i 200 nanogramów na mililitr IL-4 do wszystkich zestawów. Dodaj jeden mikrogram na mililitr LPS do jednego z zestawów potraktowanych tylko GMCSF i IL-4, aby wygenerować dojrzałe moDC. Dodaj jeden mikrogram na mililitr LPS do jednego zestawu tolerogennych moDC, aby wygenerować tolerogenne moDC LPS.

Wreszcie, w siódmym dniu, zbierz różne rodzaje moDC, przepłukując naczynie hodowlane PVS EDTA. Niedojrzałe moDC zostały wygenerowane przez dodanie GMCSF i IL-4 do oczyszczonych monocytów CD-14 plus w dniach zero, czwartym i szóstym. Dodanie witaminy D3 i deksametazonu po GMCF i IL-4 spowodowało różnicowanie niedojrzałych moDC w tolerogenne moDC.

LPS dodano w celu wywołania dojrzewania niedojrzałych moDC do dojrzałych moDC. Tolerogenne moDC stymulowano LPS w celu sprawdzenia odporności na dojrzewanie. Analiza markerów powierzchniowych DC wykazała, że dojrzałe moDC wyrażają najwyższe poziomy markerów dojrzewania HLA-DR, CD80, CD83 i CD86.

I odwrotnie, tolerogenne moDC wykazywały zwiększoną ekspresję transkryptów CD14, BDCA3 i immunoglobulinopodobnych w porównaniu z niedojrzałymi i dojrzałymi moDC. Używając czerwonego CMXRos do odzwierciedlenia aktywności mięśniowej, zaobserwowano, że tolerogenne moDC mają wyższą aktywność mytokondrialną w porównaniu z innymi podtypami różnicującymi moDC. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania cech metabolicznych komórek dendrytycznych w celu opracowania szczepionek i immunoterapii.