Name: Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów CD14+. Technika umożliwia badanie metabolizmu i prezentacji antygenów w immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Agencję ds. Nauki, Technologii i Badań Naukowych (dla J.E.C.).

<ol><li>Jolles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paul+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paul Langerhans.</a> J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).</li>
<li>Steinman, R. M., Cohn, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+cell+type+in+peripheral+lymphoid+organs+of+mice.+I.+Morphology%2C+quantitation%2C+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution.</a> J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).</li>
<li>Steinman, R. M., Swanson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endocytic+activity+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The endocytic activity of dendritic cells.</a> J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).</li>
<li>Hemmi, H., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+and+the+function+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">TLR signalling and the function of dendritic cells.</a> Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).</li>
<li>Mueller, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+maintaining+peripheral+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms maintaining peripheral tolerance.</a> Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+phagocytosed+cellular+fragments+on+the+major+histocompatibility+complex+class+II+products+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells.</a> J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).</li>
<li>Caux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B70%2FB7-2+is+identical+to+CD86+and+is+the+major+functional+ligand+for+CD28+expressed+on+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells.</a> J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).</li>
<li>Paavonen, J., Lehtinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+human+papillomavirus+and+other+sexually+transmitted+agents+in+the+etiology+of+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer.</a> Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).</li>
<li>Ohtani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+target+of+rapamycin+and+glycogen+synthase+kinase+3+differentially+regulate+lipopolysaccharide-induced+interleukin-12+production+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells.</a> Blood. 112 (3), 635-643 (2008).</li>
<li>Wilde, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+in+renal+biopsies+of+patients+with+ANCA-associated+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis.</a> Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).</li>
<li>Al-Hello, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enterovirus+strain+isolated+from+diabetic+child+belongs+to+a+genetic+subcluster+of+echovirus+11%2C+but+is+also+neutralised+with+monotypic+antisera+to+coxsackievirus+A9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9.</a> J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), 74-80 (2010).</li>
<li>Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+blood+CD11c%28%2B%29+dendritic+cells+and+monocyte-derived+dendritic+cells+differ+in+their+ability+to+stimulate+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes.</a> Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).</li>
<li>Reynolds, G., Haniffa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Mononuclear+Phagocyte+Networks%3A+A+Tale+of+Two+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species.</a> Front Immunol. 6, (2015).</li>
<li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes%3A+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).</li>
<li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+monocytes+by+double+gradient+centrifugation+and+their+differentiation+to+macrophages+in+teflon-coated+cell+culture+bags%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags.</a> J Vis Exp. (91), (2014).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+human+granulocyte+and+monocyte+isolation+procedures+on+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies.</a> Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Faresjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+useful+guide+for+analysis+of+immune+markers+by+fluorochrome+%28Luminex%29+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique.</a> Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).</li>
<li>Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+a+capture+ELISA+to+a+Luminex+xMAP+assay+using+a+multiplex+antibody+screening+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Defawe, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+qualification+of+a+multiplex+bead+array+to+assess+cytokine+and+chemokine+production+by+vaccine-specific+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells.</a> J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congenital+self-healing+Langerhans+cell+histiocytosis+with+pulmonary+involvement%3A+spontaneous+regression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Assoc+Thai%22%5BJournal%5D)">Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression.</a> J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).</li>
<li>Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+dendritic+cells+from+human+bone+marrow+mononuclear+cells%3A+advantages+for+clinical+application+in+comparison+to+peripheral+blood+monocyte+derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells.</a> Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).</li>
<li>Felzmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapharesis+products+for+the+generation+of+DCs+by+plastic+adherence%2C+or+by+positive+or+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection.</a> Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).</li>
<li>Berger, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+elutriation+of+monocytes+within+a+closed+system+%28Elutra%29+for+clinical-scale+generation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells.</a> J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Sallusto, F., Lanzavecchia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+presentation+of+soluble+antigen+by+cultured+human+dendritic+cells+is+maintained+by+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+plus+interleukin+4+and+downregulated+by+tumor+necrosis+factor+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha.</a> J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).</li>
<li>Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Langerhans+cell+histiocytosis+of+the+lacrimal+gland+in+an+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult.</a> Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).</li>
<li>Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaper+dermatitis%3A+a+review+and+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Diaper dermatitis: a review and update.</a> Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).</li>
<li>Gebhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cutaneous+Rosai-Dorfman+disease+refractory+to+imatinib+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Dermatol%22%5BJournal%5D)">A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy.</a> Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).</li>
<li>Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neural+tyrosine+hydroxylase%2C+via+modulation+of+endocrine+pancreatic+precursors%2C+is+required+for+normal+development+of+beta+cells+in+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas.</a> Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).</li>
<li>Pellacani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+melanoma+types+based+on+reflectance+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy.</a> Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+involvement+of+Langerhans+cell+histiocytosis+in+children--imaging+findings+of+computed+tomography%2C+magnetic+resonance+imaging+and+magnetic+resonance+cholangiopancreatography%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Radiol%22%5BJournal%5D)">Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography.</a> Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).</li>
<li>Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy-resistant+swelling+of+the+upper+eyelid+in+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmologe%22%5BJournal%5D)">Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood.</a> Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).</li>
<li>Haidinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+role+of+mammalian+target+of+rapamycin+in+human+dendritic+cell+function+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation.</a> J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).</li>
<li>Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+properties+of+rapamycin-conditioned+monocyte-derived+dendritic+cells+and+their+role+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Res%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation.</a> Transplant Res. 1 (1), 16(2012).</li>
<li>Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+rapamycin+in+the+induction+of+tolerogenic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Exp+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells.</a> Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).</li>
<li>Nicolette, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+for+active+immunotherapy%3A+optimizing+design+and+manufacture+in+order+to+develop+commercially+and+clinically+viable+products%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products.</a> Vaccine. 25, 47-60 (2007).</li>
<li>Han, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+3+clinical+dendritic+cell+maturation+protocols+containing+lipopolysaccharide+and+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma.</a> J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).</li>
<li>Paananen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+biological+analysis+of+echovirus+9+strain+isolated+from+a+diabetic+child%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child.</a> J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).</li>
<li>HC, O. N., Wilson, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+with+in+vitro+production+of+dendritic+cells+using+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).</li>
<li>Mest, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+insulin+secretion+is+potentiated+by+a+new+imidazoline+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn+Schmiedebergs+Arch+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound.</a> Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).</li>
<li>Puc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+activity+after+cold+preservation+of+pancreatic+islet+cells+treated+with+pefloxacin+%28PFX%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Transplant%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX).</a> Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).</li>
<li>Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+differentially+regulated+processing+of+proinsulin+in+developing+chick+pancreas%2C+liver+and+neuroretina%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina.</a> FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).</li>
<li>Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+Hand-Schuller-Christian+syndrome+by+a+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody.</a> Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
</ol>

Opłaty za otwarty dostęp do tego artykułu zostały zapewnione przez firmę Agilent Technologies.

W artykule opisano metodę wytwarzania z monocytów niedojrzałych moDC, tolerogennych moDC i dojrzałych moDC. Ważne kroki w tym protokole zostały szczegółowo omówione w poniższych punktach. Ważne jest, aby pamiętać, że ludzka krew obwodowa jest używana jako materiał wyjściowy w tym protokole i należy stosować uniwersalne środki ostrożności przy obchodzeniu się z ludzką krwią. Chociaż technicznie wykonalne jest wyprowadzenie DC ze szpiku kostnego u ludzi 24, różnicowanie DC in vitro z komórek znajdujących się we krwi obwodowej jest preferowane ze względu na dostępność krwi obwodowej w porównaniu ze szpikiem kostnym. Wśród komórek znajdujących się we krwi obwodowej, hematopoetyczne komórki macierzyste i monocyty CD34 + są powszechnie stosowane do wytwarzania DC in vitro . Hematopoetyczne komórki macierzyste CD34 + są hodowane z GM-CSF i TNF-α w celu uzyskania podzbiorów CD1a + i CD14 + , które są następnie dalej różnicowane w komórki Langerhansa i komórki dendrytyczne. I odwrotnie, monocyty są hodowane w GM-CSF i IL-4 w celu wytworzenia niedojrzałych moDC. Do wzbogacania monocytów z krwi obwodowej stosuje się kilka protokołów; Na przykład poprzez przyleganie do plastikowych naczyń, zestawów do elutriacji i izolacji 25, 26. Zaletą protokołu przestrzegania zaleceń lekarskich jest minimalne uszkodzenie komórek i stosunkowo opłacalność, jednak czystość komórek może być zagrożona; Wymagany jest dodatkowy krok, aby odłączyć komórki do dalszych eksperymentów. Elutriacja to technika polegająca na rozdzielaniu komórek na podstawie ich wielkości i gęstości. Zaletą elutriacji jest żywotność komórek, a monocyty mogą być łatwo wykorzystywane do dalszych eksperymentów; jednak technika ta jest ograniczona dostępnością elutriatora i niemożnością oddzielenia różnych populacji komórek (limfocytów T i monocytów) o podobnych parametrach sedymentacji. Dostępne na rynku zestawy izolacyjne wykorzystują mikrokulki magnetyczne do pozytywnej lub negatywnej selekcji populacji monocytów. Niektóre protokoły są nastawione na izolację monocytów przy użyciu selekcji negatywnej, ponieważ izolowane monocyty pozostają "nietknięte" (nie są związane markerami lub mikrogranulkami). W tym protokole kulki CD14 zostały użyte do pozytywnej selekcji ludzkich monocytów z PBMC. CD14 nie ma domeny cytoplazmatycznej, a wiązanie przeciwciała z CD14 nie wyzwala transdukcji sygnału. Co więcej, mikrogranulki odrywają się od monocytów po hodowli, a tym samym nie utrudniają procesu różnicowania. Ponadto CD14 ulega silnej ekspresji na większości monocytów i słabo na neutrofilach i niektórych szpikowych komórkach dendrytycznych, stąd ta metoda izolacji skutkuje wyższą czystością komórek niż inne metody17.
Monocyty krwi mogą być różnicowane w DC lub makrofagi, a los monocytów w dużej mierze zależy od środowiska cytokin. W tym artykule moDC są generowane przez dodanie czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF) i interleukiny 4 (IL-4) do ludzkich monocytów krwi obwodowej. GM-CSF jest wymagany do przeżycia monocytów, a IL-4 wywiera działanie hamujące na różnicowanie makrofagów; a kombinatoryczne dodawanie GM-SCSF i IL-4 do monocytów daje wyższy odsetek niedojrzałych moDC w porównaniu z pojedynczą cytokiną27. Istnieją inne protokoły, które generują moDC poprzez dodanie czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α), interferonu alfa (IFN-α) i interleukiny 13 (IL-13) do monocytów krwi obwodowej 28,29,30. Połączenie GM-CSF i IL-4 zostało zoptymalizowane w latach 90. i obecnie jest akceptowanym protokołem, który generuje plastikowe niedojrzałe DC zróżnicowane na immunogenne lub tolerogenne moDC i spolaryzowane na moDC promujące Th1, Th2 lub Th17.
Niedojrzałe moDC różnicują się w tolerogenne moDC przez dodanie witaminy D3 i deksametazonu. Istnieje kilka protokołów generowania tolerogennych DC, na przykład poprzez hamowanie czynnika jądrowego-kappa B (NF-kB), aktywację β-kateniny, witaminę D3, deksametazon i rapamycynę 31,32,33,34,35,9,36,37. Chociaż donoszono, że zarówno witamina D3, jak i sam deksametazon wywołują działanie tolerogenne na DC, połączenie witaminy D3 i deksametazonu powoduje większe zahamowanie alloproliferacji niż w przypadku stosowania pojedynczych leków. W związku z tym istniejący protokół wytwarzania tolerogennych DC został zmodyfikowany na kombinację witaminy D3 i deksametazonu. Metoda ta jest obecnie akceptowana jako model dla ludzkich tolerogennych DC o użyteczności terapeutycznej. Ważne jest również, aby pamiętać, że odtworzona witamina D3 i deksametazon mają krótki okres przydatności do spożycia.
W tym protokole dodano lipopolisacharydy (LPS) jako induktor dojrzewania DC. Niedojrzałe moDC można również indukować do dojrzewania za pomocą koktajlu prozapalnego: (TNF-α), Interleukiny 1 beta (IL-1β), Interleukiny 6 (IL-6) i prostaglandyny E2) lub cytokin prozapalnych (TNF-α i interferonu gamma (IFN-Γ)). Koktajl prozapalny generuje dojrzałe moDC o wysokich funkcjach kostymulujących i migracyjnych, ale wytwarzają one stosunkowo niski poziom IL-1238. Sama TNF-α lub IFN-Γ nie jest w stanie indukować stabilnego fenotypu dendrytycznego 39. LPS stymuluje receptor Toll-podobny 4 (TLR4), pośredniczy w aktywacji kinaz białkowych aktywowanych NF-kB i mitogenem (MAPK) w celu indukowania dojrzewania DC. Dojrzewanie DC indukowane przez LPS wykazuje regulację w górę markerów dojrzewania DC (CD83, CD86, HLA-DR), a także doprowadziło do produkcji IL-12p70. Ponadto etap ten może być dalej modyfikowany w celu sparowania LPS z agonistami TLR3 w celu wytworzenia dojrzałych DC do klinicznych szczepionek przeciwnowotworowych. W niniejszej pracy wykazano, że tolerogenne DC są oporne na dojrzewanie po leczeniu LPS. Te półdojrzałe, takie jak DC, nie są immunogenne i nie uwalniają cytokin prozapalnych 40.
Ograniczenia tego protokołu polegają na procesie różnicowania. Proces trwa 8 dni od dnia 0 do dnia 7, co stanowi trudność w dostosowaniu do analiz o wysokiej przepustowości. Modyfikacja protokołu jest wymagana, aby skrócić proces różnicowania, a jednocześnie uzyskać dużą liczbę żywotnych DC w różnych stanach. Po drugie, DC są generowane przez dodanie cytokin w tym protokole, a cytokiny te nie utrzymują populacji DC przez długi okres czasu. Co więcej, cytokiny są stosowane w stężeniach znacznie wyższych niż in vivo i mogą powodować tendencyjny rozwój szlaków, które nie są fizjologicznie identyczne z DC in vivo . Na przykład wykazano, że hodowle prekursorów DC in vitro reagują na GM-CSF, który nie jest niezbędną cytokiną do prawidłowego różnicowania DC in vivo41. Niemniej jednak stymulacja cytokin może być użyteczną metodą generowania dużej liczby DC in vitro do eksperymentów. Możliwość poddania tych komórek wygenerowanych w tym protokole innym analizom, takim jak barwienie immunofluorescencyjne, cytometria przepływowa, badania reakcji allo i badania metaboliczne, zwiększa użyteczność tej metody. Te DC in vitro służą jako dobry model do poszerzania wiedzy na temat rozwoju, dojrzewania i prezentacji antygenu DC, co wcześniej było trudne do wykonania w przypadku rzadkiej liczby DC in vivo .
Zdolność DC do regulowania odporności immunologicznej w porównaniu z tolerancją czyni je atrakcyjnymi kandydatami w terapiach przeciwko nowotworom i chorobom autoimmunologicznym 42,43,44,45. Immunogenne DC wygenerowane w tym protokole mogą być wykorzystane do poprawy skuteczności szczepień przeciwko chorobom zakaźnym i nowotworom; podczas gdy tolerogenne DC mogą być stosowane do kontrolowania niepożądanych odpowiedzi limfocytów T i zapobiegania odrzuceniom po przeszczepie. Skomplikowana równowaga między odpornością a tolerancją zależy w ogromnym stopniu od statusu różnicowania DC. Różnicowanie DC to skoordynowany program komórkowy, który jest regulowany przez wiele szlaków sygnałowych i los metaboliczny. Różne stany różnicowania DC różnią się potrzebami bioenergetycznymi i biosyntezowymi; na przykład aktywowane DC wymagają bardziej energetycznych adaptacji metabolicznych ważnych dla przetrwania i migracji w porównaniu z DC w stanie spoczynku. Ważne jest, aby pamiętać, że witamina D3, deksametazon i rapamycyna są znane ze swojej zdolności do indukowania tolerogennych DC i opisano wpływ na metabolizm DC. W niniejszej pracy scharakteryzowano metabolizm energetyczny moDC z różnych stanów różnicowania za pomocą analizatorów strumienia zewnątrzkomórkowego, przy czym tolerogenne moDC wykazywały najwyższą plastyczność metaboliczną, a dojrzewanie wywołane LPS zmniejszało tę plastyczność. Metabolizm anaboliczny wspomaga dojrzewanie DC, podczas gdy metabolizm kataboliczny wpływa na tolerogenne funkcje DC46. Centra prądu wygenerowane za pomocą tego protokołu można wykorzystać do oceny, czy zmiana stanu metabolicznego DC jest kluczem do modyfikacji odporności i tolerancji w terapiach. Podsumowując, przedstawiliśmy protokół generowania niedojrzałych, tolerogennych i dojrzałych moDC, kluczowy dla badania funkcji immunoregulacyjnych DC.

DC został po raz pierwszy opisany przez Paula Langerhansa (komórki Langerhansa) pod koniec XIX wieku, jak wspomina Jolles 1 i scharakteryzowany przez Ralpha Steinmana i Zanvila Cohna w 1973 roku, którzy rozpoznali je jako profesjonalne komórki prezentujące antygen 2. DC znajdują się we krwi obwodowej i w większości tkanek ciała, szczególnie obficie w tkankach narażonych na działanie środowiska zewnętrznego, takich jak skóra (obecna jako komórki Langerhansa) oraz w wyściółce nosa, płuc, żołądka i jelit, które umożliwiają im napotkanie antygenów zewnętrznych. Niedojrzałe DC mają zdolność endocytarną, ale stosunkowo niską zdolność do stymulacji limfocytów T 3. Niedojrzałe DC wyrażają różne receptory rozpoznawania wzorców (PRR), które wychwytują wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP) lub wzorce molekularne związane z uszkodzeniem (DAMP) 4. Aktywacja sygnałów niebezpieczeństwa napędza dojrzewanie w kierunku immunogennych DC, podczas gdy własne cząsteczki powodują brak odpowiedzi limfocytów T i apoptozę 5. Immunogenne DC charakteryzują się regulacją w górę cząsteczek MHC i kostymulujących cząsteczek powierzchniowych oraz ich zdolnością do przygotowania naiwnych limfocytów T 6,7.
Niedojrzali DC mogą również dojrzewać do stanu indukującego Treg lub tolerogennego w odpowiedzi na metabolit witaminy D3 1a,25(O)2D3 i niektóre środki immunosupresyjne, takie jak interleukina-10 (IL-10), deksametazon i rapamycyna 8-9. Tolerogenne DC charakteryzują się ekspresją immunoreceptorowych motywów hamujących opartych na tyrozynie (ITIM) zawierających receptory powierzchniowe i ligandy. Transdukcja sygnału ITIM zawierających członków rodziny ILT, ILT3 i ILT4 w tolerogennych DC hamuje alloproliferację i napędza ekspansję Foxp3 + Treg 10,11. Te unikalne właściwości tolerogennych DC prowadzą do ich głębokiej siły działania in vivo, a mianowicie zdolności do wywoływania trwałej tolerancji na przeszczepione przeszczepy allogeniczne i hamowania rozwoju chorób autoimmunologicznych. Tolerogenne DC mogą być zatem postrzegane jako podtyp dojrzałych spolaryzowanych DC, które działają w hamowaniu aktywacji immunologicznej.
Obecnie istnieją dwa ogólne podzbiory komórek dendrytycznych w ludzkiej krwi obwodowej: plazmocytoidy DC i mieloidalne DC 12. Krążące DC są rzadkie, stanowią mniej niż 2% leukocytów w ludzkiej krwi, co stanowi trudność w izolacji odpowiedniej liczby DC w celu zbadania ich funkcji immunoregulacyjnych. Aby przezwyciężyć ten problem, DC zróżnicowane monocytami są wykorzystywane jako model in vitro do badania funkcji komórek dendrytycznych. Te DC in vitro mają podobne receptory i funkcje w porównaniu do DC in vivo. Szczegółowe porównanie DC in vivo i DC pochodzących z monocytów in vitro (moDC) jest badane przez inne laboratoria 13,14,15. Poinformowano również, że moDC i CD1c + DC były równoważne w prezentowaniu antygenu i indukowaniu funkcji limfocytów T15.
W tym artykule opisujemy metodę generowania niedojrzałych moDC z monocytów krwi obwodowej, a następnie różnicowania ich na immunogenne i tolerogenne DC. Te komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów (moDC) charakteryzują się markerami powierzchniowymi, profilem cytokin, funkcjami immunoregulacyjnymi i stanami metabolicznymi. Immunogenne i tolerogenne komórki dendrytyczne wytwarzają różne cytokiny, które powodują ekspansję allogenicznych limfocytów T lub limfocytów T regulatorowych. W niniejszej pracy profilowanie cytokin jest wykonywane za pomocą systemów wykorzystujących technologię multipleksową. Pożywkę wzrostową komórek inkubuje się z unieruchomionymi kolorowymi kulkami unieruchomionymi przeciwciałami i odczytuje w kompaktowym analizatorze. Stany metaboliczne DC są analizowane za pomocą analizatorów strumienia zewnątrzkomórkowego, które mierzą szybkość zużycia tlenu, wskaźnik oddychania komórkowego i szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, która odzwierciedla strumień glikolityczny w komórkach dendrytycznych. Pomiar tych wskaźników bioenergetycznych zapewnia środki do śledzenia zmian w metabolizmie komórkowym, które są niezbędne w rozwoju i funkcjonowaniu komórek dendrytycznych.

<table><tbody><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Becton, Dickinson</td><td>302832</td><td>Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>1,5 ml probówka wirówkowa</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>PBMC</td></tr><tr><td>15 ml probówka sokoła</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>izolacja PBMC</td></tr><tr><td>50 ml rurka falcon</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Izolacja PBMC</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PBMC izolacja</td></tr><tr><td>0,2 i mikro; Filtr m</td><td>Sartorius stedim biotech</td><td>17597</td> Zestaw MAC <td>do izolacji</td></tr><tr><td>PBMC</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-201</td><td>Wzbogacanie monocytów</td></tr><tr><td>Separator MiniMACS</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-042-102</td><td>Wzbogacanie monocytów</td></tr><tr><td>Woda klasy hodowli komórkowej</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td></td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070103</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15140</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Fosforan Buforowana sól fizjologiczna</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10010-031</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11140-040</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15575</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>11360-070</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-868</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-093-924</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Witamina D3</td><td>Sigma</td><td>D1530</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D2915</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>l2755</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>trypan niebieski</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Inksamitan PerCP HLADR&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>307628</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>CD80 sprzężona z PE</td><td>Nauki biologiczne</td><td>557227</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>CD83 sprzężona z PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>556855</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>CD86 sprzężona z PE&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>555665</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>CD11c sprzężona z APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340544</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>CD14 sprzężona z PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-242</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>BDCA3 sprzężona z PE&nbsp;</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-090-514</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>ILT3 sprzężona z APC&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-5139-73</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>Dopasowany izotyp PerCP- sprzężony Mab</td><td>BioLegend</td><td>400250</td><td>Dopasowany izotyp cytometrii</td></tr><tr><td> PE - sprzężony Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-835</td><td>Dopasowany izotyp cytometrii</td></tr><tr><td> APC- sprzężony Mab</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-091-836</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>BD LSR II Cytometr przepływowy</td><td>BD Pharmingen</td><td>BD LSR II&nbsp;</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>cytofix/cytoperm</td><td>Cytometria 554714 Biosciences</td><td></td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>APC/CY7-sprzężone CD25</td><td>BD pharmingen</td><td>557753</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>PE/CY7-sprzężona CD4</td><td>Biolegend</td><td>300512</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>CD3 sprzężona z PerCP</td><td>Biolegend</td><td>300428</td><td>Cytometria</td></tr><tr><td>EasySep Zestaw do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19052</td><td>Badanie alloreakcji</td></tr><tr><td>Magnes EasySep&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td>Badanie alloreakcji</td></tr><tr><td>Cell Trace Zestaw do proliferacji komórek CFSE</td><td>Sondy molekularne</td><td>C34554</td><td>Badanie alloreakcji</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>14025092</td><td>Badanie alloreakcji</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 sprzężony FoxP3</td><td>BD Biosciences</td><td>560889</td><td></td></tr><tr><td>Milliplex MAP Human Cytokina/Chemokine panel z kulkami magnetycznymi</td><td>Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td>Analiza cytokin</td></tr><tr><td>5 ml Rurka polistyrenowa</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td>Analiza cytokin</td></tr><tr><td>Luminex Scover Fluid&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td>Analiza cytokin</td></tr><tr><td>System FLEXMAP 3D z oprogramowaniem xPONENT</td><td>Luminex Corporation</td><td>FLEXMAP</td><td>Analiza cytokin</td></tr><tr><td>3D MitoTracker Red CMXRos</td><td>Cell Signalling</td><td>9082</td><td>Aktywność mitochondrialna</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>Aktywność mitochondrialna</td></tr><tr><td>XF Assay Medium (OCR)</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102352-000</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr><tr><td>Glukoza&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr><tr><td>XF Podłoże podstawowe (ECAR)</td><td>Konik morski</td><td>Bioscience 102353-100</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr><tr><td>Calibrant</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100840-000&nbsp;</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr><tr><td>XF Cell Mito Stress kit</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103015-100</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr><tr><td>XF Zestaw stresu glikolizy</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>103020-100</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr><tr><td>Konik morski&nbsp;</td><td>Konik morski</td><td>Bioscience XFe96</td><td>Adaptacja metaboliczna</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Odpowiedź immunologiczna wynika ze złożonej interakcji między niespecyficznym wrodzonym układem odpornościowym antygenu a adaptacyjnym układem odpornościowym specyficznym dla antygenu. Układ odpornościowy to stała równowaga w utrzymywaniu tolerancji na własne molekuły i szybkim reagowaniu na patogeny. Komórki dendrytyczne (DC) są potężnymi profesjonalnymi komórkami prezentującymi antygen, które łączą wrodzony układ odpornościowy z adaptacyjnym układem odpornościowym i równoważą odpowiedź adaptacyjną między sobą a nie-sobą. W zależności od sygnałów dojrzewania, niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie stymulowane do różnicowania się w immunogenne lub tolerogenne DC. Immunogenne komórki dendrytyczne dostarczają sygnały proliferacji do limfocytów T specyficznych dla antygenu w celu ekspansji klonalnej; podczas gdy tolerogenne komórki dendrytyczne regulują tolerancję poprzez delecję limfocytów T specyficznych dla antygenu lub klonalną ekspansję regulatorowych komórek T. Ze względu na tę unikalną właściwość komórki dendrytyczne są bardzo poszukiwane jako środki terapeutyczne w leczeniu nowotworów i chorób autoimmunologicznych. Komórki dendrytyczne mogą być ładowane specyficznymi antygenami in vitro i wstrzykiwane do organizmu ludzkiego w celu wytworzenia specyficznej odpowiedzi immunologicznej, zarówno immunogennej, jak i tolerogennej. W niniejszej pracy przedstawiono sposób wytwarzania in vitro z monocytów, niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych i dojrzałych moDC, które różnią się ekspresją markerów powierzchniowych, funkcją i fenotypami metabolicznymi.

Oczyszczanie monocytów i różnicowanie komórek dendrytycznych
Monocyty oczyszczono z PBMC poprzez wirowanie krwi obwodowej w gradiencie gęstości (Rysunek 1A), a następnie przeprowadzono magnetyczną separację z selekcją pozytywną CD14+ (Rysunek 1B). Komórki hodowano w pożywce kompletnej w obecności GM-CSF i IL-4 w celu uzyskania niedojrzałych komórek dendrytycznych (Rysunek 2A). Dodanie witaminy D3 i deksametazonu po GM-CSF i IL-4 doprowadziło do różnicowania niedojrzałych moDC w tolerogenne moDC (Rysunek 2B). LPS dodano w celu indukcji dojrzewania niedojrzałych moDC dojrzałych moDC (Rysunek 2C), natomiast tolerogenne moDC stymulowano LPS, aby zweryfikować ich oporność na dojrzewanie (Rysunek 2D). Próbki krwi wykorzystane w tej pracy pobrano od zdrowych dawców po uzyskaniu uprzedniej świadomej zgody.
Charakterystyka moDC
Charakterystyka markerów powierzchniowych metodą cytometrii przepływowej
Analiza markerów powierzchniowych DC wykazała, że dojrzałe moDC wykazują najwyższy poziom markerów dojrzewania HLA-DR, CD83 i CD86 w porównaniu z tolerogennymi moDC traktowanymi LPS, tolerogennymi moDC oraz niedojrzałymi moDC (Rysunek 3). Wyniki te dowiodły, że tolerogenne moDC były bardziej oporne na dojrzewanie w porównaniu z niedojrzałymi moDC po stymulacji LPS. Ponadto tolerogenne moDC traktowane LPS oraz tolerogenne moDC wykazywały zwiększoną ekspresję CD14, BDCA3 (CD141) oraz transkryptu podobnego do immunoglobuliny (ILT)3 w porównaniu z niedojrzałymi i dojrzałymi moDC. Tolerogenne moDC wygenerowane w niniejszej pracy są zgodne z wcześniejszymi doniesieniami 23.
Charakterystyka funkcjonalna moDC
moDC indukowane do dojrzewania stają się immunogenne i uwalniają cytokiny, które promują proliferację limfocytów T CD4+. Oceńiono immunogenność różnych podtypów moDC poprzez pomiar proliferacji współhodowanych limfocytów T. Tolerogenne moDC wykazały niską immunogenność w porównaniu z dojrzałymi moDC, co objawiało się niską alloproliferacją limfocytów T CD4+ (Rysunek 4A). Tolerogenne moDC charakteryzują się niską produkcją cytokin IFN-Γ i IL-12p40 oraz wysoką produkcją IL-10 w współhodowcach alloreakcyjnych z limfocytami T CD4+ (Rysunek 4B). Ponadto zwiększenie liczby tolerogennych moDC w współhodowcach z dojrzałymi moDC, które indukowały allospecyficzne limfocyty T CD4+, zwiększyło częstotliwość występowania regulacyjnych limfocytów T CD25high Foxp3+ (Rysunek 4C).
Analiza aktywności mitochondrialnej
Red CMXRos jest wykorzystywany do obrazowania aktywności mitochondriów w celu analizy poziomu potencjału błony mitochondrialnej w moDC. Zaobserwowano, że tolerogenne moDC wykazują wyższą aktywność mitochondrialną w porównaniu z innymi podtypami zróżnicowanych moDC (Rysunek 5A). Następnie, za pomocą bioanalizatora, oceniono tempo mitochondrialnego zużycia tlenu (OCR) dla różnych podtypów moDC. Pomiary OCR umożliwiają uzyskanie wysokiej rozdzielczości wglądu w profil metaboliczny, dostarczając informacji obejmujących, między innymi, oddychanie podstawowe, rezerwową wydolność oddechową, przeciek protonowy oraz oddychanie pozamitochondrialne. Pomiar OCR stanowi sposób oceny zdolności komórek do reagowania na stres. Komórki poddawane są perturbacjom metabolicznym poprzez sukcesywne dodawanie trzech różnych związków. Pierwszą iniekcją jest oligomycyna (sprzęgacz ATP), która hamuje kompleks V łańcucha transportu elektronów (ETC), blokując syntezę ATP. Krok ten pozwala określić procent tlenu zużywanego na syntezę ATP oraz procent tlenu zużywanego na pokonanie przecieku protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną. Druga iniekcja to FCCP (akcelerator ETC), który zaburza syntezę ATP, transportując jony wodoru przez błonę mitochondrialną zamiast przez kanał protonowy Kompleksu V. Spadek potencjału błony mitochondrialnej prowadzi do szybkiego zużycia energii i tlenu bez generowania ATP. Leczenie FCCP może być wykorzystane do obliczenia rezerwowej wydolności oddechowej komórek. Zachowanie rezerwowej wydolności oddechowej w warunkach stresu jest kluczowe dla przetrwania komórek. Wydolność ta jest determinowana przez kilka czynników, w tym dostępność substratu oraz zdolność funkcjonalną enzymów zaangażowanych w ETC. Trzecia iniekcja to kombinacja rotenonu, inhibitora Kompleksu I, oraz antymycyny A, inhibitora Kompleksu III. Kombinacja ta całkowicie hamuje oddychanie mitochondrialne, w wyniku czego obserwuje się spadek OCR spowodowany upośledzeniem funkcji mitochondriów (Rysunek 5C). Tolerogenne moDC wykazywały wyższe podstawowe poziomy OCR niż dojrzałe moDCs (Rysunek 5D). Ponadto tolerogenne, LPS-tolerogenne i niedojrzałe moDCs wykazały zwiększoną rezerwową wydolność oddechową w porównaniu z dojrzałymi moDCs (Rysunek 5E).
Charakterystyka metaboliczna moDC
Ponieważ podczas glikolizy z komórek uwalniane są kwas mlekowy i protony, przeanalizowano aktywność glikolityczną moDC, wykonując analizę tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) w czasie rzeczywistym (Rysunek 6B). W obecności glukozy tempo glikolizy wszystkich moDC wzrosło w porównaniu ze stanem podstawowym, przy czym dojrzałe moDC wykazywały wyższe tempo glikolizy niż niedojrzałe moDC (Rysunek 6D). Tolerogenne i niedojrzałe moDC wykazały wyższą maksymalną glikolizę (indukowaną oligomycyną w obecności glukozy) w porównaniu z moDC traktowanymi LPS (Rysunek 6B). Wydajność glikolityczna tolerogennych i niedojrzałych moDC była wyższa niż w przypadku dojrzałych moDC (Rysunek 6E). W przeciwieństwie do wysokiego tempa glikolizy, rezerwa glikolityczna była najniższa w dojrzałych moDC (Rysunek 6F).
<img alt="Schemat frakcjonowania krwi i separacji komórek CD14 z wykorzystaniem wirowania i kolumn magnetycznych." src="/files/ftp_upload/54128/54128fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1: Oczyszczanie monocytów z krwi obwodowej. (A) Przed wirowaniem do każdej probówki o pojemności 50 ml ostrożnie nanosi się 25 ml krwi na 15 ml Ficollu. Po wirowaniu gradientowym PBMC koncentrują się w warstwie poniżej osocza. (B) Komórki PBMC inkubuje się z mikrokuleczkami sprzężonymi z monoklonalnymi przeciwciałami przeciwko ludzkiemu CD14 (izotyp: mysi IgG2a), a następnie nanosi się je na kolumnę umieszczoną w polu magnetycznym separatora w celu izolacji CD14+ monocyty <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopowe etapów różnicowania moDC: niedojrzałe, tolerogenne, dojrzałe, LPS-tolerogenne." src="/files/ftp_upload/54128/54128fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Charakterystyka morfologiczna moDC. (A) Do oczyszczonych komórek CD14 dodaje się 20 ng/ml GM-CSF oraz IL-4+ monocyty w dniu 0, 4 i 6 w celu wygenerowania niedojrzałych moDC; oraz (B) dodatkowy etap stymulacji 10 nM witaminą D3 i 10 nM deksametazonem w 5. dniu pozwala na otrzymanie tolerogennych moDC. Niedojrzałe moDC oraz tolerogenne moDC są stymulowane za pomocą 1 µg/ml LPS w 6. dniu w celu wygenerowania (C) dojrzałe moDC i (D) LPS-tolerogenne moDC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histogramy cytometrii przepływowej dla HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD1c, CD14, BDCA3, ILT3; profilowanie immunologiczne." src="/files/ftp_upload/54128/54128fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rysunek 3: Charakterystyka markerów powierzchniowych metodą cytometrii przepływowej. Poziomy ekspresji markerów powierzchniowych HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD1, CD14, BDCA3 i LT3 w tolerogennych (zielone), LPS-tolerogennych (czarne), niedojrzałych (czerwone) i dojrzałych (niebieskie) moDC. Kontrole izotypowe przedstawiono w kolorze szarym. Dla każdego typu komórek naniesiono na siebie poszczególne histogramy z liczbą komórek na osi Y i logarytmem intensywności fluoroforu na osi X. Wszystkie histogramy są reprezentatywne dla czterech niezależnych eksperymentów. Rysunek został zmodyfikowany z J Immunol 194 (1), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.130316 (1 czerwca 2015). Powielone i ponownie opublikowane za zgodą właściciela praw autorskich. Copyright 2015. The American Association of Immunologists, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny. </a>

<img alt="Proliferacja komórek CD4+ vs moDCs; wykresy przedstawiają zmienność odpowiedzi immunologicznej (A-D); analiza w immunologii." src="/files/ftp_upload/54128/54128fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Charakterystyka funkcjonalna moDC. (A) Ilościowe oznaczenie częstotliwości alloproliferacji komórek CD4+ Limfocyty T indukowane w kokulturze z rosnącą liczbą tolerogennych (TOL; zielony), LPS-tolerogennych (L-TOL; czarny), niedojrzałych (IMM; czerwony) i dojrzałych (MAT; niebieski) moDC. Dane złączono z czterech niezależnych eksperymentów; średnia + S.E.M. Różnice statystyczne między wszystkimi moDC a dojrzałymi moDC analizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Dunnetta dla porównań wielokrotnych. (B) Analiza cytokin IFN-Γ (panel lewy), IL-12p40 (panel środkowy) i Il-10 (panel prawy) w supernatantach z alloreakcji między CD4+ Limfocyty T współhodowane z rosnącą liczbą moDC o charakterze tolerogennym (zielony), niedojrzałym (czerwony) lub dojrzałym (niebieski). Dane zrzucono z sześciu niezależnych eksperymentów; średnia ± S.E.M. (C) CD4+ Alloproliferacja limfocytów T oraz ekspansja limfocytów T regulacyjnych indukowane kokulturą z dojrzałymi moDC w obecności rosnącej liczby tolerogennych moDC. Lewa oś Y, częstość CD4+ Proliferacja limfocytów T. Prawa oś Y, częstość występowania CD25wysoki Foxp3+ komórki bramkowane na proliferujące CD4+ Limfocyty T. Dane zostały zgromadzone z trzech niezależnych eksperymentów; średnia ± S.E.M. Różnice statystyczne pomiędzy obecnością a brakiem tolerogennych moDC analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post hoc Dunnetta dla porównań wielokrotnych. (D) Alloproliferacja limfocytów T CD4+ (lewo) oraz częstość występowania komórek CD25highFoxP3+ (prawo) indukowana współhodowlą z tolerogennymi moDC w obecności rosnącej liczby dojrzałych moDC. Dane zrzucono z dwóch do trzech niezależnych eksperymentów; średnia ± S.E.M. Różnice statystyczne między obecnością a brakiem dojrzałych moDC analizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Dunnetta dla porównań wielokrotnych. Rysunek został zmodyfikowany z J Immunol 194 (1), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.130316 (1 czerwca 2015). Reprodukowano i przedrukowano za zgodą właściciela praw autorskich. Copyright 2015. The American Association of Immunologists, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza oddychania komórkowego; wykresy słupkowe i liniowe, dane OCR, pojemność oddechowa, efekty hamowania lekami." src="/files/ftp_upload/54128/54128fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Analiza aktywności mitochondrialnej moDC. (A) Poziomy potencjału błony mitochondrialnej (Red CMXRos) w moDC wyznaczono za pomocą analizy cytometrycznej. Połączono dane z czterech niezależnych eksperymentów. Średnia ± błąd standardowy średniej (S.E.M.). (B) Schematyczne przedstawienie oddychania mitochondrialnego w czasie rzeczywistym. Analiza OCR rozpoczynająca się od oddychania podstawowego, a następnie po dodaniu oligomycyny (inhibicja kompleksu V), FCCP (indukcja oddychania maksymalnego) oraz mieszaniny rotenonu i antymycyny A (inhibicja łańcucha transportu elektronów [ETC]). Mitochondrialna SRC (wynik odjęcia oddychania podstawowego od maksymalnego) jest wyznaczana z krzywej OCR. (C) Reprezentatywna analiza kinetyczna OCR mitochondriów (pmol/min) w moDC tolerogennych (TOL, zielony), LPS-tolerogennych (L-TOL, czarny), niedojrzałych (IMM, czerwony) i dojrzałych (MAT, niebieski) przy zastosowaniu sekwencyjnego dodawania oligomycyny (Olig), FCCP oraz rotenonu/antymycyny A (Rot-AA). (D) Ilościowe oznaczenie OCR podstawowego oddychania moDC i (E) rezerwy wydolności oddechowej moDC. Dane zostały zgromadzone z pięciu niezależnych eksperymentów. Średnia ± B.S.E. Rysunek został zmodyfikowany z J Immunol 194 (1), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.130316 (1 czerwca 2015). Powielone i przedrukowane za zgodą właściciela praw autorskich. Copyright 2015. The American Association of Immunologists, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<img alt="Analiza szybkości zakwaszania zewnątrzkomórkowego; wykresy ECAR; porównanie szybkości, wydolności i rezerwy glikolitycznej." src="/files/ftp_upload/54128/54128fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rycina 6: Charakterystyka metaboliczna moDC. (A) Schematyczne przedstawienie glikolizy w czasie rzeczywistym. Analiza ECAR rozpoczyna się od podstawowego poziomu ECAR, w którym komórki inkubowano w pożywce bez glukozy, po czym następowało dodanie glukozy (indukcja glikolizy), oligomycyny (która indukuje maksymalną glikolizę komórkową i hamuje kompleks V), a na koniec 2-deoxy-D-glukozy (hamowanie glikolizy). Z krzywej ECAR wyznacza się tempo glikolizy (indukcja glikolizy pomniejszona o podstawowy poziom ECAR), wydolność glikolityczną (glikoliza maksymalna pomniejszona o podstawowy poziom ECAR) oraz rezerwę glikolityczną (glikoliza maksymalna pomniejszona o indukcję glikolizy). (B) Reprezentatywne badanie kinetyczne ECAR (mpH/min) zależnego od glikolizy w tolerogennych (TOL, zielony), LPS-tolerogennych (L-TOL, czarny), niedojrzałych (IMM, czerwony) i dojrzałych (MAT, niebieski) moDC przy zastosowaniu sekwencyjnego dodawania glukozy (Gluc), oligomycyny (Olig) i 2-DG. (C) Słupki przedstawiają bazowe poziomy ECAR (D) tempo glikolizy (E) zdolność glikolityczna, a (F) rezerwa glikolityczna moDC. Dane zostały zgrupowane z trzech niezależnych eksperymentów; średnia ± SEM. Różnice statystyczne przeanalizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post hoc Tukeya dla porównań wielokrotnych. Rysunek zmodyfikowano na podstawie J Immunol 194 (1), 5174-5186, doi: 10.4049/jimmunol.130316 (1 czerwca 2015). Powielone i ponownie opublikowane za zgodą właściciela praw autorskich. Copyright 2015. The American Association of Immunologists, Inc. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>

Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wygenerowanie tolerogennych i dojrzałych komórek dendrytycznych z monocytów do eksperymentów lub opracowania szczepionki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, dostarczając modelu do badania rozwoju, dojrzewania i prezentacji antygenu komórek dendrytycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona generowanie dużej liczby komórek dendrytycznych in vitro do celów eksperymentalnych.Wzbogacanie monocytów należy rozpocząć od zmieszania 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanej komórki monojądrowej krwi obwodowej lub zawiesiny komórek PBMC z 20 mikrolitrami błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru. Następnie odwirować zawiesinę komórkową. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy do stężenia 80 mikrolitrów buforu barwiącego na 10 do siódmych komórek.Dodaj 20 mikrolitrów mikrokulek CD-4 na 10 do siódmych komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki jednym mililitrem buforu barwiącego na 10 do siódmych komórek i odwiruj komórki.Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy. Uzyskać kolumnę pożywki na maksymalnie dwa razy od 10 do ósmej całkowitej liczby komórek i umieścić kolumnę w polu magnetycznym separatora. Następnie przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami buforu barwiącego.Odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę i zebrać nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę, w 15-mililitrowej probówce. Wymień nową 15-mililitrową rurkę pod kolumną i umyj kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu barwiącego. Upewnij się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem nowego bufora barwiącego między praniami.Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na świeżej 15-mililitrowej probówce. Odpipetować jeden mililitr buforu barwiącego na kolumnę i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny. Następnie powtórz etapy separacji magnetycznej, używając zilustrowanej frakcji w nowej kolumnie, aby zwiększyć czystość komórek CD14 plus.Zasiaj cztery zestawy CD14 plus monocyty w stężeniu od punktu zerowego od trzech do punktu zerowego pięć razy 10 do szóstego na mililitr pożywki do hodowli komórkowej IL-4 w sześciu płytkach dołkowych. Inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2. Czwartego dnia usuń 850 mikrolitrów pożywki z kultury i odwiruj.Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki do hodowli komórkowych. Dodaj mieszaninę komórek z powrotem do hodowli. Piątego dnia dodaj jeden mikrolitr bulionu witaminy D3 i jeden mikrolitr wywaru deksametazonu na jeden litr pożywki do dwóch zestawów, aby wytworzyć tolerogenne moDC.Szóstego dnia dodaj 200 nanogramów na mililitr GMCSF i 200 nanogramów na mililitr IL-4 do wszystkich zestawów. Dodaj jeden mikrogram na mililitr LPS do jednego z zestawów potraktowanych tylko GMCSF i IL-4, aby wygenerować dojrzałe moDC. Dodaj jeden mikrogram na mililitr LPS do jednego zestawu tolerogennych moDC, aby wygenerować tolerogenne moDC LPS.Wreszcie, w siódmym dniu, zbierz różne rodzaje moDC, przepłukując naczynie hodowlane PVS EDTA. Niedojrzałe moDC zostały wygenerowane przez dodanie GMCSF i IL-4 do oczyszczonych monocytów CD-14 plus w dniach zero, czwartym i szóstym. Dodanie witaminy D3 i deksametazonu po GMCF i IL-4 spowodowało różnicowanie niedojrzałych moDC w tolerogenne moDC.LPS dodano w celu wywołania dojrzewania niedojrzałych moDC do dojrzałych moDC. Tolerogenne moDC stymulowano LPS w celu sprawdzenia odporności na dojrzewanie. Analiza markerów powierzchniowych DC wykazała, że dojrzałe moDC wyrażają najwyższe poziomy markerów dojrzewania HLA-DR, CD80, CD83 i CD86.I odwrotnie, tolerogenne moDC wykazywały zwiększoną ekspresję transkryptów CD14, BDCA3 i immunoglobulinopodobnych w porównaniu z niedojrzałymi i dojrzałymi moDC. Używając czerwonego CMXRos do odzwierciedlenia aktywności mięśniowej, zaobserwowano, że tolerogenne moDC mają wyższą aktywność mytokondrialną w porównaniu z innymi podtypami różnicującymi moDC. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania cech metabolicznych komórek dendrytycznych w celu opracowania szczepionek i immunoterapii.

generation-immature-mature-tolerogenic-dendritic-cells-with-differing

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film pokazuje wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych (DC) z ludzkich monocytów. Inkubacja monocytów z czynnikami wzrostu i cytokinami prowadzi do produkcji niedojrzałych DC. W odpowiedzi na cząsteczki regulatora immunologicznego niedojrzałe DC różnicują się w tolerogenne i dojrzałe DC.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów

Ten film demonstruje metodę przekształcania komórek dendrytycznych (DC) w tolerogenne DC (TolDCs) za pomocą immunomodulującego środka farmakologicznego. Konwersja ta jest potwierdzana przez ocenę funkcji TolDC poprzez ich immunosupresyjne działanie na limfocyty T CD4 +.

Wpływ immunomodulującego środka farmakologicznego na interakcję między komórkami dendrytycznymi a limfocytami T CD4+

Opisano najczęściej używaną metodę generowania dużej liczby autologicznych komórek dendrytycznych (DC) do wykorzystania w immunoterapii nowotworów.  Metoda wykorzystuje IL-4 i GM-CSF do różnicowania DC od monocytów.  Niedojrzałe DC są stymulowane do dojrzewania, a następnie ładowane antygenami przed wstrzyknięciem z powrotem pacjentowi.

Przygotowanie dojrzałych komórek dendrytycznych obciążonych antygenem nowotworowym do immunoterapii

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj metodę wytwarzania niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych z monocytów CD14+. Technika umożliwia badanie metabolizmu i prezentacji antygenów w immunologii.

Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych

Przeglądaj więcej filmów