Wytwarzanie niedojrzałych, dojrzałych i tolerogennych komórek dendrytycznych o różnych fenotypach metabolicznych
22 czerwca 2016
Niedojrzałe komórki dendrytyczne mogą być selektywnie różnicowane w tolerogenne lub dojrzałe komórki dendrytyczne, aby regulować równowagę między odpornością a tolerancją. W pracy przedstawiono sposób generowania z niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (moDC), tolerogennych in vitro i dojrzałych moDC, które różnią się fenotypami metabolicznymi.
Ogólnym celem tego protokołu jest wygenerowanie tolerogennych i dojrzałych komórek dendrytycznych z monocytów do eksperymentów lub opracowania szczepionki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, dostarczając modelu do badania rozwoju, dojrzewania i prezentacji antygenu komórek dendrytycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona generowanie dużej liczby komórek dendrytycznych in vitro do celów eksperymentalnych.
Wzbogacanie monocytów należy rozpocząć od zmieszania 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanej komórki monojądrowej krwi obwodowej lub zawiesiny komórek PBMC z 20 mikrolitrami błękitu trypanowego, aby policzyć liczbę żywych komórek za pomocą cytometru. Następnie odwirować zawiesinę komórkową. Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy do stężenia 80 mikrolitrów buforu barwiącego na 10 do siódmych komórek.
Dodaj 20 mikrolitrów mikrokulek CD-4 na 10 do siódmych komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj komórki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Umyj komórki jednym mililitrem buforu barwiącego na 10 do siódmych komórek i odwiruj komórki.
Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy. Uzyskać kolumnę pożywki na maksymalnie dwa razy od 10 do ósmej całkowitej liczby komórek i umieścić kolumnę w polu magnetycznym separatora. Następnie przepłukać kolumnę 500 mikrolitrami buforu barwiącego.
Odpipetować zawiesinę komórek na kolumnę i zebrać nieoznakowane komórki, które przechodzą przez kolumnę, w 15-mililitrowej probówce. Wymień nową 15-mililitrową rurkę pod kolumną i umyj kolumnę trzykrotnie 500 mikrolitrami buforu barwiącego. Upewnij się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem nowego bufora barwiącego między praniami.
Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na świeżej 15-mililitrowej probówce. Odpipetować jeden mililitr buforu barwiącego na kolumnę i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny. Następnie powtórz etapy separacji magnetycznej, używając zilustrowanej frakcji w nowej kolumnie, aby zwiększyć czystość komórek CD14 plus.
Zasiaj cztery zestawy CD14 plus monocyty w stężeniu od punktu zerowego od trzech do punktu zerowego pięć razy 10 do szóstego na mililitr pożywki do hodowli komórkowej IL-4 w sześciu płytkach dołkowych. Inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2. Czwartego dnia usuń 850 mikrolitrów pożywki z kultury i odwiruj.
Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki do hodowli komórkowych. Dodaj mieszaninę komórek z powrotem do hodowli. Piątego dnia dodaj jeden mikrolitr bulionu witaminy D3 i jeden mikrolitr wywaru deksametazonu na jeden litr pożywki do dwóch zestawów, aby wytworzyć tolerogenne moDC.
Szóstego dnia dodaj 200 nanogramów na mililitr GMCSF i 200 nanogramów na mililitr IL-4 do wszystkich zestawów. Dodaj jeden mikrogram na mililitr LPS do jednego z zestawów potraktowanych tylko GMCSF i IL-4, aby wygenerować dojrzałe moDC. Dodaj jeden mikrogram na mililitr LPS do jednego zestawu tolerogennych moDC, aby wygenerować tolerogenne moDC LPS.
Wreszcie, w siódmym dniu, zbierz różne rodzaje moDC, przepłukując naczynie hodowlane PVS EDTA. Niedojrzałe moDC zostały wygenerowane przez dodanie GMCSF i IL-4 do oczyszczonych monocytów CD-14 plus w dniach zero, czwartym i szóstym. Dodanie witaminy D3 i deksametazonu po GMCF i IL-4 spowodowało różnicowanie niedojrzałych moDC w tolerogenne moDC.
LPS dodano w celu wywołania dojrzewania niedojrzałych moDC do dojrzałych moDC. Tolerogenne moDC stymulowano LPS w celu sprawdzenia odporności na dojrzewanie. Analiza markerów powierzchniowych DC wykazała, że dojrzałe moDC wyrażają najwyższe poziomy markerów dojrzewania HLA-DR, CD80, CD83 i CD86.
I odwrotnie, tolerogenne moDC wykazywały zwiększoną ekspresję transkryptów CD14, BDCA3 i immunoglobulinopodobnych w porównaniu z niedojrzałymi i dojrzałymi moDC. Używając czerwonego CMXRos do odzwierciedlenia aktywności mięśniowej, zaobserwowano, że tolerogenne moDC mają wyższą aktywność mytokondrialną w porównaniu z innymi podtypami różnicującymi moDC. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie immunologii do zbadania cech metabolicznych komórek dendrytycznych w celu opracowania szczepionek i immunoterapii.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół generowania tolerogennych oraz dojrzałych komórek dendrytycznych z monocytów, które mogą być wykorzystane w badaniach immunologicznych i opracowywaniu szczepionek. Metoda ta pozwala na różnicowanie niedojrzałych komórek dendrytycznych pochodzenia monocytowego (moDCs) w odrębne fenotypy o różnych charakterystykach metabolicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórek dendrytycznych
- Różnicowanie komórek
Wstęp
- Komórki dendrytyczne odgrywają kluczową rolę w regulacji odporności i tolerancji.
- Zrozumienie różnicowania moDC może dostarczyć wiedzy na temat odpowiedzi immunologicznych.
- Tolerogenne komórki dendrytyczne mogą być pomocne w opracowywaniu terapii chorób autoimmunologicznych.
- Dojrzałe komórki dendrytyczne są niezbędne do skutecznej prezentacji antygenu.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody generowania wysokiej liczby komórek dendrytycznych in vitro.
- Zbadanie cech metabolicznych komórek dendrytycznych podczas różnicowania.
- Stworzenie modelu do badania dojrzewania i funkcji komórek dendrytycznych.
Zastosowane metody
- Wzbogacanie monocytów z mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs).
- Separacja magnetyczna w celu izolacji monocytów CD14+.
- Hodowla monocytów z zastosowaniem specyficznych cytokin i związków w celu indukcji różnicowania.
- Analiza markerów powierzchniowych komórek dendrytycznych oraz aktywności metabolicznej.
Główne wyniki
- Tolerogenne moDCs wykazały wyższą aktywność mitochondrialną w porównaniu z innymi subtypami.
- Dojrzałe moDCs wykazywały podwyższony poziom markerów dojrzewania, takich jak HLA-DR i CD80.
- Tolerogenne moDCs wykazały zwiększoną ekspresję CD14 oraz transkrypty podobne do immunoglobulin.
- Protokół różnicowania skutecznie wygenerował odrębne populacje komórek dendrytycznych do celów badawczych.
Wnioski
- Metoda ta umożliwia efektywną generację komórek dendrytycznych do badań immunologicznych.
- Zrozumienie profili metabolicznych komórek dendrytycznych może pomóc w opracowywaniu szczepionek.
- Wyniki te przyczyniają się do wiedzy na temat biologii komórek dendrytycznych oraz ich roli w regulacji odpowiedzi immunologicznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Generowanie komórek dendrytycznych o zdefiniowanych fenotypach immunogennych lub tolerogennych umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów odpornościowych istotnych dla immunoterapii i opracowywania szczepionek. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną na wczesnym etapie walidacji celu i zmniejsza ryzyko programów translacyjnych poprzez zapewnienie ustandaryzowanych, skalowalnych modeli komórkowych. Podejście to jest bezpośrednio istotne dla zespołów portfelowych dążących do uzgodnienia biologii odkrywczej z późniejszą translacją kliniczną w zakresie modulacji odporności.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badania mechanistyczne procesów dojrzewania komórek dendrytycznych oraz szlaków prezentacji antygenów.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów immunologicznych poprzez generowanie odrębnych fenotypów DC in vitro.
- Ułatwia biologiczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie wpływu stanu metabolicznego na funkcje odpornościowe.
- Zapewnia powtarzalny system do weryfikacji hipotez dotyczących mechanizmów tolerancji immunologicznej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Dostarcza zwalidowane, fenotypowo odmienne populacje komórek dendrytycznych do dalszych procesów przesiewowych.
- Standaryzuje charakterystykę markerów powierzchniowych i fenotypu metabolicznego w celu zapewnienia powtarzalności testów.
- Umożliwia ilościową ocenę prezentacji antygenów oraz potencjału aktywacji limfocytów T.
- Wspiera skalowalne przygotowanie DC dla platform przesiewowych związków lub antygenów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli DC in vitro do strategii modulacji immunologicznej istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację immunoterapii oraz interwencji tolerogennych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka w procesie rozwoju poprzez dostarczenie danych prognostycznych dotyczących funkcji DC i fenotypu metabolicznego.
- Ułatwia badanie biomarkerów translacyjnych powiązanych z dojrzewaniem i tolerancją DC.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając generowanie i charakteryzację subtypów komórek dendrytycznych na potrzeby badań nad modulacją odporności.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących dojrzewania komórek dendrytycznych, prezentacji antygenu oraz indukcji tolerancji.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, zdefiniowane fenotypowo komórki dendrytyczne do opracowywania testów i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia uzyskanie ilościowych odczytów markerów powierzchniowych i aktywności metabolicznej do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskanymi in vitro z modelami przedklinicznymi interwencji immunologicznych i opracowywania szczepionek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat postępowania w celu generowania komórek dendrytycznych w ramach wielu programów immunologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów immunologicznych i ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje generowanie i charakterystykę komórek DC w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Poprawia decyzje typu go/no-go dla programów immunomodulacyjnych i zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację aktywów immunomodulacyjnych i kandydatów translacyjnych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie izolacji monocytów, hodowli komórkowych oraz immunofenotypowania.
- Niezbędny jest dostęp do cytometrii przepływowej i testów aktywności metabolicznej w celu charakterystyki DC.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów dotyczących cytokin i dojrzewania między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Możliżna jest konieczność adaptacji metody dla różnych źródeł dawców lub modeli chorób.
- Ograniczenia obejmują zmienność źródeł pierwotnych komórek oraz potencjalne efekty serii.
