Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach
1 sierpnia 2016
Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.
Ogólnym celem tej eksperymentalnej metody jest umożliwienie badania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania FRET komórek osadzonych w trójwymiarowych hydrożelach, które naśladują naturalne tkanki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwojowej, farmakologii i medycyny regeneracyjnej, takie jak opracowywanie optymalnych biomateriałów i wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków w zmodyfikowanych mikrotkankach 3D. Główną zaletą tej techniki jest to, że FRET może być stosowany na dużej liczbie komórek w wielu typach hydrożelu przy użyciu konwencjonalnych systemów mikroskopów szerokokątnych.
Po wytworzeniu form do odlewania hydrożelu i zawieszeniu hodowanych komórek w roztworze hydrożelu, zgodnie z protokołem tekstowym, w kapturze do hodowli tkankowej dodać komórkę zawierającą prekursor do form odlewniczych techniką sterylną. Przed sieciowaniem należy umieścić komórki zawieszone w prekursorze hydrożelu, aby zoptymalizować obrazowanie, ograniczając komórki do jednej płaszczyzny ogniskowej i minimalizując sygnał poza płaszczyzną. Następnie, aby usieciować hydrożele PC, użyj źródła światła UVA o czasie ekspozycji równym 3,2 dżuli na centymetr kwadratowy na milimetr grubości, aby napromieniować komórkę zawierającą prekursor.
Alternatywnie użyj tańszej ręcznej lampy dentystycznej. Unikaj prześwietlania hydrożelu, ponieważ zmniejszy to żywotność komórek. Fizycznie sieciujące hydrożele umieszcza się natomiast w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Po usieciowaniu należy wyjąć formę odlewniczą hydrożelu PDMS i zastąpić ją wcześniej przygotowaną naczynią PDMS. Użyj sterylnej szpatułki, aby docisnąć PDMS do szkła, aby je przykleić. Dodaj pożywkę bez fenolu, pozbawioną surowicy lub chemicznie zdefiniowaną pożywkę do dołka utworzonego w naczyniu PDMS z szkiełkiem nakrywkowym, aby utrzymać hydrożel zanurzony.
Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po zabezpieczeniu naczynia PDMS z hydrożelem na stoliku mikroskopu i nałożeniu oleju na obiektyw, użyj światła przechodzącego, aby znaleźć co najmniej 15 komórek do obrazowania i sprawdź transfekcję za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. W oprogramowaniu mikroskopu skonfiguruj ustawienia kamery dla kanałów obrazu FRET, wybierając jedną z kilku komórek w pobliżu środka pola widzenia, a następnie zoptymalizuj ekspozycję i wzmocnienie dla każdego kanału obrazu zgodnie z protokołem tekstowym.
Wybierz ogniwa, które znajdują się blisko środka hydrożelu, w stosunkowo płaskim polu oświetlenia, które nie są ani zbyt jasne, ani zbyt ciemne, i mają współczynnik FRET między 00 a 1,0. Następnie wybierz wiele pól widzenia, aby uzyskać obrazy dla co najmniej 15 transfekowanych komórek. Wyłącz światło po zakończeniu, aby ograniczyć ekspozycję.
Aby skonfigurować szybkość przechwytywania dla akwizycji obrazów poklatkowych, wprowadź częstotliwość przechwytywania. Do przechwytywania sygnału wyjściowego należy stosować szybką szybkość, np. co pięć sekund na pole widzenia, oraz wolniejszą szybkość do późniejszej kinetyki sygnalizacji długoterminowej. Wybierz opcję Uruchom teraz, aby rozpocząć akwizycję obrazu i rejestrować obrazy przez pięć minut, aby ustalić linię bazową dla odpowiedzi sondy w wyznaczonym polu view.
Po pięciu minutach od uzyskania obrazu należy wprowadzić pipetę do żądanego agonisty lub antagonisty, wymieszać pipetując i kontynuować obrazowanie. Po przeprowadzeniu kalibracji FRET zgodnie z protokołem tekstowym, w oprogramowaniu mikroskopu wybierz strzałkę na ikonie obszaru zainteresowania tła i wybierz opcję Narysuj eliptyczny obszar zainteresowania tła. Narysuj i wyznacz jeden obszar zainteresowania (ROI) dla każdego pola widzenia w pobliżu komórek, aby zdefiniować poziom tła.
Upewnij się, że wybrano opcję Kontynuuj aktualizację przesunięcia tła, a następnie aktywuj wyświetlanie obszaru zainteresowania w tle, klikając ikonę Obszar zainteresowania w tle. Można też wybrać ikonę obszaru zainteresowania i ustawić właściwości obszaru zainteresowania jako Użyj jako obszaru zainteresowania tła, a Obszary zainteresowania są różne w każdym punkcie wielofunkcyjnym. Korzystając z ikony tła obszaru zainteresowania, wybierz opcję Odejmij tło za pomocą obszaru zainteresowania.
W wyskakującym okienku, w obszarze Odejmij obszar zainteresowania tła, wybierz opcję Każdy obraz, a następnie w obszarze Zastosuj do wybierz opcję Wszystkie ramki. Dla każdego pola widzenia, aby zdefiniować obszar zainteresowania wokół komórki przy użyciu kanału emisji akceptora i maski binarnej, użyj menu Binarny, Zdefiniuj próg i wybierz opcję Zastosuj do bieżącej klatki. Następnie dostosuj dolny próg, aby zaznaczyć komórki.
Następnie, jeśli to konieczne, użyj funkcji Binary Close, aby wypełnić w masce binarnej. Następnie użyj ikony Region zainteresowania, aby wybrać opcję Kopiuj plik binarny do regionu zainteresowania, aby zapisać maskę binarną jako obszary zainteresowania. Dołącz obszary zainteresowania dla kolejnych pól widzenia do istniejącej puli regionów zainteresowania.
Usuń wszystkie podejrzane obszary zainteresowania. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na Regiony zainteresowania i sprawdź, czy ich właściwości to Użyj jako standardowego regionu zainteresowania i Regiony zainteresowania są różne w każdym punkcie wielokrotności. Obszar komórek zainteresowania można narysować ręcznie, ale należy zachować ostrożność, aby usunąć fałszywe wartości.
Protokół zawiera procedury dla komórek, które znajdują się poza płaskim polem oświetlenia oraz dla mikroskopów, które nie mają płaskiego pola. Odwirowanie prekursorów hydrożelu przed żelowaniem zmaksymalizowało liczbę komórek w jednej płaszczyźnie ogniskowej w pobliżu szkiełka nakrywkowego. Zminimalizowało to szumy tła i zwiększyło przepustowość obrazowania.
W tym eksperymencie FRET, dla obliczenia współczynnika wygaszonej emisji lub QE, FRET, wymagane były tylko dwa obrazy dla sondy binarnej ICUE1 z pojedynczym łańcuchem, w tym QE równa się CFP CFP dla wzbudzenia i emisji, a emisja akceptora jest równa YFP YFP dla wzbudzenia i emisji. Wybrano wiele pól widzenia, w których kilka komórek znajdowało się w jednorodnym obszarze oświetlenia, jak pokazano tutaj. Zwroty z inwestycji dla korekcji tła sygnałów kanałowych i dla analizy komórek zostały wyznaczone przy użyciu progowych obrazów emisji akceptorowej od początku eksperymentów.
Ponadto, jak pokazano tutaj, wybrano komórki, które wyrażały wystarczającą sondę. Obliczono QE i współczynniki emisji uczulonej FRET na piksel oraz średni współczynnik FRET na komórkę. Obliczono odwrotność współczynnika SE i oba współczynniki znormalizowano.
Pod stymulacją forskoliny, zarówno QE, jak i SE oparte na współczynnikach Fret wykrywają zwiększoną cykliczną aktywność AMP w chondrocytach. Zarówno fizycznie usieciowane, jak i chemicznie usieciowane żele wykazały wzrost współczynnika QE FRET w czasie, co wskazuje na zwiększoną cykliczną odpowiedź sygnalizacyjną AMP na dodanie forskoliny. Procedura ta może być stosowana z innymi technikami mikroskopowymi, takimi jak FRAP, fret flim oraz pomiar progów i anizotropii, aby odpowiedzieć na pytania, takie jak, jakie są różnice w przepuszczalności i izolacji komórkowej między różnymi typami mikrotkanek.
Ponieważ sieciowanie jest hartowane w pobliżu PDMS, ważne jest, aby pamiętać o zaprojektowaniu form do fotosieciowania hydrożeli o nieco większej średnicy niż same hydrożele.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę Förster resonance energy transfer (FRET) imaging komórek w trójwymiarowych środowiskach żelowych. Technika ta umożliwia badania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym i może być zastosowana przy użyciu konwencjonalnej mikroskopi epifluorescencyjnej.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Biologia rozwojowa
- Farmakologia
Tło
- FRET imaging jest cennym narzędziem do badania procesów komórkowych.
- Trójwymiarowe żele mogą naśladować naturalne środowiska tkankowe.
- Metoda umożliwia wysokowydajną analizę wielu komórek.
- Konwencjonalne techniki mikroskopowe mogą być wykorzystane w tym podejściu.
Cel badania
- Aby umożliwić obserwację sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym.
- Aby ułatwić rozwój biomateriałów dla medycyny regeneracyjnej.
- Aby poprawić procesy przesiewowe leków w inżynieryzowanych mikrotkankach.
Zastosowanie metod
- Wykonanie form do odlewu żelu.
- Zawieszenie hodowane komórek w roztworze żelu.
- Sieciowanie żeli za pomocą światła UVA lub lamp stomatologicznych.
- Konfiguracja ustawień mikroskopu dla FRET imaging.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja komórek osadzonych w żelach.
- Optymalizacja warunków obrazowania w celu zminimalizowania szumów tła.
- Ustanowienie sygnałów bazowych dla analizy FRET.
- Skuteczna eksploatacja obszarów zainteresowania do korekcji tła.
Wnioski
- Metoda zwiększa zdolność badania sygnalizacji komórkowej w środowiskach 3D.
- Stanowi ramy dla przyszłych badań w różnych dziedzinach biologii.
- FRET imaging w żelach może prowadzić do postępów w odkrywaniu leków.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
FRET imaging in three-dimensional hydrogels enables real-time quantification of intracellular signaling within physiologically relevant microenvironments, directly addressing the limitations of traditional 2D assays. This capability enhances predictive confidence in early discovery and supports mechanistic de-risking for drug screening and biomaterial development. The method's compatibility with standard widefield microscopy and high-throughput workflows positions it as a scalable asset for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of intracellular signaling pathways in 3D, supporting functional target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling tissue-like environments for hypothesis testing.
- Improves predictive confidence by capturing context-dependent cellular responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream compound screening workflows.
- Supports assay standardization and reproducibility through ratiometric FRET quantification.
- Enables high-throughput imaging and analysis of multiple cells across hydrogel types.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro signaling measurements with disease-relevant 3D microenvironments.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by modeling tissue-specific responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing material-dependent signaling differences.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET imaging method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, bridging the gap between in vitro assays and physiologically relevant models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in 3D cellular contexts.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound evaluation in engineered microtissues.
- Analytics: Provides ratiometric FRET measurements and background-corrected outputs for robust data comparison.
- Translational Research: Enables alignment of in vitro findings with in vivo-like tissue responses.
- Enterprise Reuse: Adaptable to various hydrogel systems and compatible with multiple microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by modeling relevant biology early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in FRET probe design and quantitative imaging analysis.
- Needs access to widefield epifluorescence microscopy and compatible hydrogel fabrication tools.
- Demands cross-team standardization of imaging parameters and data processing workflows.
- Adaptable across different hydrogel chemistries and cell types with protocol optimization.
- Throughput and imaging depth may be limited by hydrogel opacity and microscope configuration.
