Name: Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Poznaj obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach do badania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia analizę wielu komórek przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe Szkoły Medycyny Stomatologicznej Uniwersytetu w Pittsburghu, nagrodę National Institutes of Health AR062598 oraz przyznanie P30 DE030740. Autorzy dziękują również dr Jin Zhangowi za plazmid ICUE1, Wayne'owi Rasbandowi za opracowanie ImageJ i Michaelowi Cammerowi za makro ImageJ.

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konfliktów.

Praca ta pokazuje, w jaki sposób obrazowanie FRET może być wykorzystane do analizy sygnalizacji komórkowej w hydrożelach 3D. Podczas gdy wcześniejsze badania wykazały obrazowanie FRET komórek wysianych na podłożach hydrożelowych35-37, interakcji zewnątrzkomórkowych z hydrożelami38 oraz cząsteczek uwięzionych w hydrożelach39-41, jest to pierwsza publikacja opisująca analizę wewnątrzkomórkową opartą na obrazowaniu FRET komórek osadzonych w hydrożelach 3D. Praca rozwiązuje kilka problemów związanych z implementacją obrazowania FRET z 2D do 3D. Po pierwsze, obiektywy o dużej aperturze numerycznej są potrzebne do obrazowania FRET, aby zebrać wystarczający sygnał emisji, ale ograniczają one głębię ostrości. Komórki w tym miejscu mogą lekko osiąść poprzez wirowanie, aby zwiększyć liczbę komórek w płaszczyźnie ogniskowej w pobliżu szkła, aby to skompensować. Po drugie, rusztowania hydrożelowe 3D mogą dryfować w polu widzenia podczas obrazowania, co komplikuje analizę. Hydrożele w tym miejscu są przyklejane do szkiełka nakrywkowego, dzięki czemu pozostają utrwalone przez cały czas trwania eksperymentu. Po trzecie, dobór odpowiednich kompozycji hydrożelowych do 3D FRET jest niezbędny, ponieważ hydrożele mogą utrudniać wizualizację komórek. Tutaj stosuje się przezroczyste hydrożele PC-gel i TR-gel. Jednak zebranie komórek za pomocą wirowania do płaszczyzny ogniskowej w pobliżu szkiełka nakrywkowego można wykorzystać do obrazowania komórek w hydrożelach o większej dyfrakcji. Wybór hydrożelu zależy od warunków mikrośrodowiskowych, które należy zasymulować, które można znaleźć w przeglądzie hydrożeli42. Po czwarte, zastosowano alternatywne obliczenia dla współczynnika FRET jednołańcuchowej sondy ICUE1 (tj. EQE = QE/cAem) w celu zminimalizowania liczby kanałów obrazu wymaganych do analizy, a tym samym zminimalizowania fotowybielania. Średni współczynnik FRET na komórkę jest obliczany jako średnia współczynników na piksel w komórce, aby zminimalizować niedoszacowanie rzeczywistego współczynnika FRET. Na koniec opisano liniową analizę ratiometryczną i sposoby obliczania aktywowanej frakcji jednołańcuchowych sond binarnych.
Istnieje kilka krytycznych aspektów przeprowadzania udanych eksperymentów FRET przy użyciu mikroskopii szerokokątnej. Jeśli chodzi o sprzęt, kamera musi być wystarczająco czuła, aby wykryć niewielkie zmiany sygnału, co sprawia, że nowsze naukowe kamery CMOS i przetworniki CCD zwielokrotniające elektrony są lepiej przystosowane niż konwencjonalne CCD. Aby jak najlepiej przeanalizować rozkład przestrzenny współczynnika FRET, kamera musi mieć co najmniej dwukrotnie większą rozdzielczość przestrzenną niż funkcja rozrzutu punktów obiektywu (kryterium Nyquista). To sprawia, że systemy z podwójnym widokiem są mniej odpowiednie do tego zadania. Bardziej istotne jest dobranie odpowiedniej ekspozycji i szybkości akwizycji obrazu dla danej pary FRET, aby zminimalizować fotowybielanie fluoroforów. Zaleca się zmniejszenie współczynnika pozyskiwania wraz ze wzrostem czasu trwania eksperymentu. Zastosowanie szybkich kół filtrów zwiększa szybkość akwizycji i liczbę pól widzenia do analizy, jednocześnie unikając problemów z rejestracją obrazu w przypadku modułów filtrów z podwójnym widokiem i głowicą rewolwerową. Niejednorodne pole oświetlenia komplikuje korekcję fluorescencji tła, która powstaje w wyniku autofluorescencji próbki i szumu systemu kamery. Niektóre hydrożele, szczególnie te zawierające białka kolagenowe, są wysoce autofluorescencyjne43,44. Współczynniki FRET są niedoszacowane bez korekty tła. W tym przypadku stosujemy prostą metodę korekcji tła, która opiera się na stosunkowo płaskim polu oświetlenia, które często można skonfigurować z oświetleniem epi-fluorescencyjnym nad środkiem obrazu (Rysunek 3B, Krok 7.2). W związku z tym ta metoda ogranicza interesujące komórki do tych, które znajdują się w tym polu oświetlenia. Opisana tutaj korekcja tła nie uwzględnia autofluorescencji komórkowej w długościach fal odczytywanych dla sondy binarnej. W takim przypadku nieznakowane komórki (bez transfekcji sondą) powinny być obrazowane w tych samych warunkach i odjęte tło. Można użyć kombinacji komórek oznaczonych i nieoznaczonych, a komórki nieoznaczone wybrać do zwrotu z inwestycji w tle. Alternatywne metody, które zapewniają analizę komórek na całym polu obrazu, obejmują użycie maski cieniującej, wielu zwrotów z inwestycji w tle lub identycznych próbek bez komórek, a protokół jest dostępny na żądanie.
Specyficzna dla obrazowania 3D FRET, odpowiedź sondy jest bardzo wrażliwa na przepuszczalność hydrożelu dla analitu (ryc. 6). W związku z tym te same regiony hydrożelu są porównywane w różnych zabiegach eksperymentalnych, najlepiej w punkcie symetrii geometrycznej, takim jak w pobliżu środka rusztowania, jak to jest tutaj stosowane. Alternatywnie, komory mikroprzepływowe/bioreaktory mogą być stosowane do szybkiego i równomiernego perfuzji hydrożelu z roztworem analitu45. Sygnał FRET może nie zostać wykryty (stosunek sygnału do szumu jest zbyt niski), gdy autofluorescencja hydrożelu jest zbyt wysoka; Należy użyć cieńszego hydrożelu lub innej sondy (różne fluorofory). W odniesieniu do obrazowania 3D FRET w hydrożelach usieciowanych foto, zaleca się stosowanie minimalnej ekspozycji na promieniowanie i długości fal poza widmami wzbudzenia fluoroforów sondy. LAP może być używany z widzialnym źródłem światła o długości fali 405 nm, aby jeszcze bardziej zminimalizować potencjalne uszkodzenie komórek31,46. Zaleca się jednak stosowanie LAP z promieniowaniem 365 nm, ponieważ minimalizuje to bielenie sondy. 365 nm leży na końcu widma wzbudzenia dawcy CFP, podczas gdy 405 nm leży na szczycie wzbudzenia. Alternatywnie, ekspresja sondy może zostać odzyskana przez jeden dzień. Zastosowanie sond binarnych minimalizuje problemy związane z wrażliwością na różnice w poziomach ekspresji oraz w dyfuzji molekularnej fluoroforów donorowych i akceptorowych. Można stosować sondy niebinarne, ale z obrazowaniem SE zamiast QE i dodatkową korekcją na przebijanie widmowe widm wzbudzenia i emisji (patrz poniżej). Ponadto przeszkodą może być niska dostępność komercyjna i złożoność projektowania sond FRET. Najważniejszym czynnikiem decydującym o udanym eksperymencie pozostaje właściwa korekcja i analiza sygnałów fluorescencyjnych.
Alternatywne obliczenie współczynnika FRET jest wykorzystywane z kilku dodatkowych powodów, oprócz minimalizacji fotowybielania. W przypadku binarnych sond jednołańcuchowych powszechnie podawanym stosunkiem jest emisja akceptorowa pod wzbudzeniem donora (emisja uczulona, SE) do emisji donorowej pod wzbudzeniem donorowym (emisja wygaszona, QE), tj. stosunek FRET = SE/QE25,47,48. SE/QE jest nieliniowe w stosunku do zmian wydajności FRET21,22,47. Mianowicie, stosunek ten ma wykładniczo nieliniowy związek z wrodzoną wydajnością FRET sondy (Ei) (Donius, AE, Taboas, J. M. niepublikowana praca. (2015))), przy czym stosunek najbardziej liniowy dla Ei jest mniejszy niż około 15% . SE/QE będzie również niedoszacowywać frakcję aktywowanych sond (FAP , czyli frakcja sond wiążących analit). W związku z tym analiza SE/QE wymaga kłopotliwego badania równowagowej odpowiedzi na dawkę i dopasowania krzywej. Na szczęście stosunki SE lub QE do emisji akceptora pod wzbudzeniem akceptorowym (Aem) są liniowe względem Ei i FAP, czyli współczynników FRET SE/Aem i QE/Aem. SE / Aem jest często używany w sondach binarnych i wymaga jedynie kalibracji punktu końcowego (przy braku aktywności sondy i pełnej aktywności sondy), ale podstawowa sygnalizacja komórkowa utrudnia to. Aby wyeliminować potrzebę kalibracji punktu końcowego, SE można skorygować (cSE) pod kątem nakładania się widmowego widm wzbudzenia i emisji donorów i akceptorów (przebijanie spektralne) oraz pod kątem wydajności kwantowej i czułości spektralnej (QS) połączonego systemu obrazowania fluoroforów sondy i mikroskopu. Skorygowany współczynnik SE FRET oparty na cSE określa obserwowaną wydajność FRET sond w każdym pikselu obrazu, tj. ESE = cSE/Aem. Dostępne jest komercyjne i wolne oprogramowanie, które koryguje SE dla tych efektów, a czytelnik jest odsyłany do pracy Chena i Periasamy 2006 w celu szczegółowego wyjaśnienia metod50. Jednak obliczenie ESE wymaga uchwycenia trzech kanałów obrazu na punkt czasowy (SE, QE, Aem). Dlatego w tej pracy stosujemy również alternatywny stosunek FRET EQE = 1 - QE/cAem, który wymaga uchwycenia tylko dwóch kanałów obrazu (QE i Aem). Obliczenie EQE z tych kanałów wymaga jedynie skorygowania Aem dla QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem/Aem można łatwo oszacować za pomocą dwóch obrazów z jednej próbki kalibracyjnej, gdzie Dem jest emisją donora pod wzbudzeniem donorowym z bielonym akceptorem. FAP w dowolnym momencie można obliczyć, porównując E,SE lub EQE z Ei sondy.
Ostatecznie, wybór współczynnika FRET (ESE = cSE/Aem vs. EQE = QE/cAem) powinien opierać się na rozważeniu typu sondy i kanałów o najlepszym sygnale. Oba podejścia obejmują korekcję szumu tła obrazów na klatkę, jak opisano powyżej, w celu uwzględnienia zmian autofluorescencji w czasie. Zakładają one, że światło wzbudzenia Aem nie nakłada się na widmo wzbudzenia Dem, co często ma miejsce ze względu na konstrukcję sondy i konfigurację filtra mikroskopu. Sondy jednołańcuchowe mogą korzystać z jednego z nich, a wybór opiera się na najlepszym sygnale sondy (jasności), szumie kamery i sygnale tła na kanałach SE i QE. Dla sondy ICUE1 i zastosowanych tu warunków eksperymentalnych (typy ogniw i hydrożeli), SE ma silniejszy sygnał niż QE. Sondy dwułańcuchowe wymagają użycia ESE ze względu na nierównomolowy rozkład fluoroforów donorowych i akceptorowych. W przypadku sond, które zmniejszają FRET po związaniu analitu, takich jak ICUE1, wydajność FRET można "odwrócić", aby przedstawić dodatnią zmianę sygnalizacyjną po związaniu analitu, tak jak robimy to tutaj, gdzie ESE = 1 - cSE / Aem lub EQE = QE / (Aem x QS).
Analiza FAP jest wrażliwa na prawidłową korektę współczynników FRET oraz na oszacowanie Ei. Można go oszacować za pomocą tej samej próbki kalibracyjnej, która jest używana do QS i konwencjonalnego testu skuteczności FRET w punkcie końcowym, jako Ei = 1-(QE/Dem) (obraz QE, po którym następuje fotowybielanie akceptorowe i obraz Dem)28, ale należy zachować ostrożność, aby zminimalizować przypadkowe wybielanie dawcy. Opisujemy zmodyfikowaną wersję, w której podstawia się oszacowanie Dem na podstawie Aem skorygowane o QS, tj. Ei = 1 - (QE/(Aem x QS)). Alternatywnie można użyć Ei = cSE/Aem. Oszacowanie Ei w żywych komórkach wymaga, aby wszystkie sondy były doprowadzone do pełnego FRET. Jest to trudne do osiągnięcia w praktyce w przypadku sond, takich jak ICUE1, które zmniejszają FRET po związaniu analitu. Obliczanie Ei na podstawie in vitro przy użyciu lizatów komórkowych i oczyszczonego analitu jest najlepsze, ale wykracza poza zakres tej pracy. Tutaj zalecamy stosowanie 2′,5′-Dideoksyadenozyny w celu zmniejszenia cAMP w komórkach. Jednak względny FAP można obliczyć przy użyciu oszacowania Ei wyprowadzonego na podstawie podstawowego poziomu sygnalizacji. Z tych powodów w badaniach najczęściej podaje się współczynnik FRET (jak to zrobiono tutaj) lub względny FAP oparty na kalibracji punktu końcowego, gdzie linia bazowa sygnalizacji przed dodaniem agonisty jest dolną granicą, a sygnał po dodaniu drugiego agonisty, który nasyca sygnalizację, jest górną granicą. Forskolina jest często stosowana jako agonista kontroli do nasycenia sygnału cAMP. Alternatywnie można zastosować analog cAMP, taki jak 8-bromoadenozyno-3',5'-cykliczny monofosforan. Zaleca się stosowanie kontroli pozytywnych po zakończeniu badań w celu zidentyfikowania potencjalnych zmian w szlaku sygnałowym między eksperymentalnymi terapiami.
Obliczanie średniej odpowiedzi sygnalizacyjnej na komórkę wymaga uwzględnienia kilku czynników. Po pierwsze, średni współczynnik FRET powinien być obliczany jako średnia proporcji dla każdego piksela w komórce, tj. (∑(QE⁄cAem))/(liczba pikseli), a nie stosunek średniego QE i Aem w komórce, tj. (∑QE)⁄(∑cAem). Chociaż ten ostatni nie wymaga starannego maskowania, ponieważ szum tła jest niski, poważnie zaniża prawdziwy średni współczynnik FRET. Jednak proporcje pikseli wymagają obliczeń zmiennoprzecinkowych i starannego binarnego maskowania obszaru komórki w celu zdefiniowania ROI i uniknięcia uwzględniania fałszywych proporcji generowanych przez szum tła na zewnątrz komórki. Cała powierzchnia komórki musi być określona ilościowo, aby uniknąć stronniczości wyników w odniesieniu do kształtu komórki. Maskowanie może z czasem wymagać ponownego zdefiniowania w zależności od zmian w kształcie komórki i migracji. Alternatywnie, ROI większe niż komórka mogą być używane, jeśli kryteria wykluczenia są zdefiniowane w celu usunięcia proporcji pikseli z sygnałów QE i AEM, które spadają znacznie poniżej poziomów komórkowych i są bliskie poziomom tła. Opisane metody analizy szczegółowo opisują podstawowe kroki stosowane w tej pracy dla analizy FRET bez specjalistycznego oprogramowania/wtyczek. Producenci mikroskopów i inni dostawcy sprzedają moduły dodatkowe do swojego oprogramowania mikroskopowego, które obsługują zautomatyzowaną analizę ratiometryczną i FRET. Podobnie, oprogramowanie ImageJ w domenie publicznej ma kilka wtyczek dostępnych do analizy cząstek i FRET, takich jak RiFRET. Po drugie, średni współczynnik FRET oparty na pikselach zaniża rzeczywisty średni stosunek struktury komórkowej 3D, ponieważ używany jest obraz 2D. Sygnały 2D reprezentują i uśredniają wzdłuż osi z. Obliczanie rozkładu przestrzennego 3D współczynników FRET w żywych komórkach nie jest możliwe bez szybkiego obrazowania 3D (np. przy użyciu mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem). Jest to problem zarówno w przypadku kultur 2D, jak i 3D, ale ma większy wpływ w 3D, ponieważ większa część struktury komórkowej znajduje się poza płaszczyzną. Jest to bardzo niepokojące w przypadku sond, które lokalizują się w strukturach komórkowych, takich jak sonda EPAC1 z błoną plazmatyczną PM-ICUE. Zobacz Spiering et al. 2013, aby uzyskać sugestie dotyczące korekty wpływu grubości komórek na obliczenia współczynnika24. Analiza rozkładu Aem może być wykorzystana do wykrycia, czy sonda gromadzi się w obszarach komórki i dostosowanej płaszczyźnie obrazowania. Pomoże to również zinterpretować rozkład przestrzenny współczynników FRET i wyeliminować fałszywe wyniki, np. identyfikując nasycenie sondy (tj. region o niskim Aem będzie miał niskie stężenie sondy i może wykazywać nasycenie sondy i wysoki współczynnik FRET). Po trzecie, różne poziomy wyjściowe FRET mogą wskazywać na różnicę w wydajności transfekcji, ekspresji sondy lub podstawowej sygnalizacji między grupami eksperymentalnymi. "Analiza względna" (krok 10.1.1) pomaga usunąć dryft współczynnika FRET w czasie, jeśli występuje. Ułatwia to porównanie względnej wielkości odpowiedzi między próbami, ale utrudnia porównanie z przebiegiem czasowym odpowiedzi dla próby referencyjnej (wykres kontrolny jest płaską linią). "Analiza bezwzględna" (krok 10.1.2) ułatwia porównanie szybkości odpowiedzi między próbkami, ale utrudnia porównanie wielkości odpowiedzi, ponieważ każda linia jest skalowana przez niepodobną stałą. W badaniach często stosuje się regresję liniową na linii bazowej w celu skorygowania dryfu współczynnika FRET w czasie.
Opisana metoda 3D FRET jest użytecznym i praktycznym sposobem wytwarzania i wykonywania obrazowania poklatkowego hydrożeli 3D obciążonych komórkami, które można zastosować do innych sond i metod obrazowania. Inne systemy FRET poza jednołańcuchowymi sondami binarnymi będą wymagały bardziej złożonej korekcji sygnałów opartych na intensywności, jak omówiono powyżej. Alternatywnie, obrazowanie czasu życia fluorescencji FRET (FLIM-FRET) może być wykorzystane do obliczenia wydajności FRET poprzez zmianę czasu życia emisji donora sondy. W przeciwieństwie do FRET OPARTEGO NA INTENSYWNOŚCI, FLIM-FRET jest niewrażliwy na szum tła, przebijanie widma, wydajność kwantową i czułość spektralną detektora2. Jednak systemy FLIM są drogie, złożone i rzadkie, a najlepiej sprawdzają się z fluoroforami z pojedynczym rozpadem wykładniczym i bez spływu FLIM 49. Opisana metoda może być również stosowana z bardziej zaawansowanymi platformami mikroskopowymi (np. FRET-TIRF, anizotropia fluorescencji, korelacja spektralna FRET). Zastosowanie tej metody do obrazowania 3D za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej ułatwi analizę subkomórkowego rozkładu odpowiedzi sygnalizacyjnej i zwiększy dokładność analizy sygnalizacji. Ta metoda 3D FRET umożliwi zaawansowane badania biologii komórki w symulowanych mikrośrodowiskach komórkowych 3D. W związku z tym może być łatwo stosowany w farmakologii i medycynie regeneracyjnej, w tym w badaniu sygnalizacji międzykomórkowej i przesiewowej odpowiedzi na leki w zmodyfikowanych mikrotkankach na bazie hydrożelu.

Sygnalizacja komórkowa jest zarówno złożona, jak i istotna dla wielu dziedzin, w tym farmakologii, inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Potrzebne są użyteczne narzędzia badawcze, aby pogłębić naszą wiedzę na temat biologii komórki i opracować optymalne materiały do regeneracji tkanek. Obrazowanie rezonansowego transferu energii metodą Förstera (FRET) jest niezbędnym narzędziem umożliwiającym analizę aktywacji receptorów, konformacji molekularnej i oddziaływań supramolekularnych (np. kompleksacji białko/DNA) w żywych komórkach. FRET to rodzaj nieradiacyjnego transferu energii między fluoroforami1. Ma wydajność, która jest odwrotnie proporcjonalna do szóstej potęgi odległości między fluoroforem donorowym a fluoroforem akceptorowym. W ten sposób może dostarczyć informacji na temat odległości przestrzennej między dwiema różnymi cząsteczkami lub między regionami jednej cząsteczki w skali nanometrowej (zwykle 1 - 10 nm)2. Fluorofory donorowe i akceptorowe mogą być różnymi typami cząsteczek (hetero-FRET), w których donor ma wyższą emisję energii (krótsza długość fali) lub tego samego typu (homo-FRET). Obrazowanie FRET można wykonywać na stałych lub żywych komórkach, ale ogólnie rzecz biorąc, stałe komórki są używane do obrazowania interakcji molekularnych w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, gdy szybkie systemy konfokalne są niedostępne. Żywe komórki są wykorzystywane do badania interakcji i procesów, które są hamowane lub zmieniane przez fiksację, takich jak wewnątrzkomórkowa odpowiedź sygnalizacyjnaw czasie rzeczywistym 3.
Badania na żywych komórkach, które wykorzystują obrazowanie FRET, wykorzystują dwuwymiarowe (2D) hodowle komórkowe, częściowo ze względu na prostotę i niższe tło (brak emisji z komórek spoza płaszczyzny). Jednak hodowle 2D zmieniają również wiele procesów komórkowych w porównaniu z mikrośrodowiskiem fizjologicznym i kulturą trójwymiarową (3D)4,5. Na przykład natywne interakcje między komórkami i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa są drastycznie zmienione w hodowli 2D, co prowadzi do łatwych do zaobserwowania zmian w morfologii i polarności komórek6. Mikrodomeny błonowe (np. kaweole i tratwy lipidowe) oraz sygnalizacja receptora są silnie regulowane przez środowisko hodowli, częściowo dlatego, że wiążą składniki cytoszkieletu7,8, a kształt komórki i struktura cytoszkieletu są silnie regulowane przez przestrzenne środowisko hodowli9. Na mechanotransdukcję ma wpływ nie tylko matryca 3D, ale także bardziej złożone warunki obciążenia wtórnego powstające w środowiskach 3D w porównaniu z kulturami 2D10. Wreszcie, przepuszczalność matryc 3D jest mniejsza niż pożywki hodowlanej, na ogół ze zmniejszoną dyfuzją i zwiększonym wiązaniem cząsteczek sygnalizacji komórkowej w porównaniu z kulturami 2D. Dzięki kulturom 3D można stworzyć i obserwować mikrośrodowisko bardziej zbliżone do fizjologicznego w odniesieniu do sygnałów adhezyjnych, chemicznych i mechanicznych. Interakcje między komórkami mogą być promowane, a właściwości adhezyjne mogą być kontrolowane za pomocą struktury, składu i architektury (wzorów) materiału 3D11-13. Właściwości mechaniczne materiału można również dostosować do składu i struktury14,15. Hodowla komórek w hydrożelach pozwala zatem na badania FRET na komórkach pierwotnych, które w przeciwnym razie uległyby dedyferencjacji lub zmianie fenotypu przy użyciu konwencjonalnych technik, np. komórek z chrząstki stawowej. W związku z tym potrzebna jest metoda, która umożliwi testy FRET w żywych kulturach 3D.
Hydrożelowe rusztowania są idealne do badań 3D opartych na FRET, ponieważ mogą być optycznie przezroczyste i dostosowane do kontrolowania mikrośrodowiska i dostarczania sygnałów komórkowych. Hydrożele wykonane z naturalnych polimerów są stosowane w hodowlach komórkowych od dziesięcioleci, w tym żelatyna i fibryna16. Większą kontrolę nad mikrośrodowiskiem komórkowym można osiągnąć dzięki chemicznej modyfikacji tych polimerów oraz zastosowaniu polimerów syntetycznych17,18. Sztywność mechaniczną i przepuszczalność hydrożelu można kontrolować, zmieniając ich skład polimerowy i rozmiar oczek (gęstość polimeru i usieciowania)19,20. Co więcej, hydrożele mogą być bioaktywne poprzez włączenie czynników wzrostu i ligandów komórkowych. Ze względu na te możliwości, rozwój hydrożeli do zastosowań w biosensoryce, dostarczaniu leków i inżynierii tkankowej jest bardzo aktywnym obszarem badań21. Druk 3D hydrożeli jest również w trakcie opracowywania pod kątem wytwarzania mikrotkanek i narządów15. Tak więc obrazowanie komórek w hydrożelach metodą FRET jest nie tylko przydatne jako sposób na przybliżenie fizjologicznego zachowania komórek, ale także jako narzędzie do badania i optymalizacji wzrostu tkanek inżynieryjnych.
Binarne ratiometryczne sondy FRET są bardzo przydatne w badaniu sygnalizacji komórkowej i mogą być wykorzystywane w hodowlach hydrożelowych. Częściowa lista opublikowanych sond fluorescencyjnych i FRET znajduje się na stronie internetowej Cell Migration Consortium22. Najpopularniejszy typ sondy zawiera dwa różne fluorofory, które są skojarzone lub połączone przez element (elementy) rozpoznający (obszar wrażliwy na analit). Regiony te ulegają zmianie konformacyjnej, asocjacji lub dysocjacji po wykryciu analitu (np. wiązanie jonu lub cząsteczki, enzymatyczne rozszczepienie regionu), która zmienia odległość między fluoroforami, a tym samym wielkość FRET (wyższą lub niższą)23. Mniej powszechny, ale użyteczny typ sondy opiera się na wrażliwej na analit zmianie w nakładaniu się widmowym dwóch fluoroforów, co zmienia wielkość FRET. "Jednołańcuchowe" sondy ratiometryczne wykorzystują parę fluoroforów połączonych na pojedynczej cząsteczce. Sondy "dwułańcuchowe" wykorzystują pary fluoroforów na oddzielnych cząsteczkach, ale ich ekspresja może być sprzężona pod tą samą kasetą ekspresyjną24. W przeciwieństwie do badań z pojedynczą ekspresją fluoroforu (np. fluorescencyjne białka fuzyjne), badania z ratiometrycznymi sondami FRET nie wymagają podwójnej transfekcji w celu kontroli wydajności transfekcji lub żywotności komórek. Ratiometryczne sondy FRET są stosunkowo niewrażliwe na skuteczność transfekcji, gdy są wyrażone powyżej minimalnego progu (niewrażliwe na stężenie)23,25. Są niewrażliwe na fluktuacje źródła wzbudzenia i inne wewnątrzkomórkowe czynniki środowiskowe (np. pH, jony), o ile oba fluorofory reagują podobnie. Ponadto ich odpowiedź nie podlega opóźnieniu transkrypcji, w przeciwieństwie do fluorescencyjnych i bioluminescencyjnych konstruktów promotor-reporter26,27.
Ratiometryczne sondy FRET są łatwo i często stosowane w konwencjonalnych systemach mikroskopów epifluorescencyjnych o szerokim polu. Mikroskopy szerokokątne są preferowane w stosunku do liniowych skaningowych systemów konfokalnych do obrazowania żywych komórek ze względu na obawy dotyczące kosztów systemu, wybielania fluoroforów i wychwytywania zmian sygnału z wystarczającą rozdzielczością czasową. Ponadto możliwa jest analiza pojedynczych komórek na dużej populacji komórek za pomocą zmotoryzowanego stolika i przechwytywania obrazu w wielu polach widzenia. Mikroskopia szerokokątna wymaga analizy sygnałów sondy hetero-FRET opartej na intensywności. Chociaż analiza intensywności nie wymaga skomplikowanego sprzętu, jak w przypadku innych metod FRET, potrzebne są dalsze prace po akwizycji, aby skorygować wpływ zachowań fluoroforów i konfiguracji mikroskopu/systemu obrazowania28. Przechwycona intensywność emisji fluoroforu jest funkcją energii wzbudzenia, wydajności kwantowej fluoroforu oraz połączonej czułości widmowej i liniowości filtra i kamery/detektora2. Mogą one być różne dla dawcy i akceptora i będą wymagały kalibracji do analizy ilościowej. Ponadto na obrazowanie emisji akceptora ma wpływ nakładanie się widmowe fluoroforów (wzbudzenie akceptora przez światło wzbudzenia donora i przebijanie emisji donorowej do widm emisyjnych akceptora)2. Sondy "jednołańcuchowe" są wewnętrznie znormalizowane, ponieważ ich fluorofory są równomolowe w nanoskali, podczas gdy fluorofory sond "dwułańcuchowych" mogą występować w różnych stechiometriach w komórce25,28. Jeśli fluorofory sond "jednołańcuchowych" mają podobną jasność (w funkcji współczynnika ekstynkcji i wydajności kwantowej), efekty czułości detektora nieliniowego są niewielkie i potrzebna jest tylko poprawka na fluorescencję tła i sprzężoną wydajność kwantową/czułość detektora23. W związku z tym "jednołańcuchowe" ratiometryczne sondy FRET są najłatwiej stosowane w mikroskopii szerokokątnej24.
Ten artykuł opisuje prostą technikę wykonywania obrazowania FRET żywych komórek w hodowlach hydrożelowych 3D przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu epifluorescencyjnego o szerokim polu. Może być łatwo przyjęty przez laboratoria już przeprowadzające eksperymenty FRET w 2D, a także laboratoria zainteresowane sygnalizacją międzykomórkową w mikrotkankach. Tutaj demonstrujemy metodę z obrazowaniem FRET, pomiar poziomów cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) w żywych chondrocytach w hydrożelach fotosieciujących (PC-żel, dimetakrylan glikolu polietylenowego) i termoczułych (TR-gel, Matrigel). Ratiometryczna sonda FRET jest wykorzystywana na bazie EPAC1 (ICUE1) do wykrywania poziomów cAMP w odpowiedzi na forskolinę, chemicznego agonistę cyklazy adenylowej, która katalizuje konwersję ATP do cAMP. cAMP jest jednym z głównych drugich przekaźników pośredniczących w sygnalizacji receptora sprzężonego z białkiem G i aktywuje różne czynniki, w tym białka wymiany dalej aktywowane bezpośrednio przez cAMP (EPAC). Fluorofory rozsuwają się po związaniu cAMP z domeną EPAC, co powoduje zmniejszenie FRET. Opisano tutaj przygotowanie materiałów hydrożelowych, transfekcję komórek za pomocą sondy ICUE1 i zatopienie komórek w hydrożelach 3D. Wyjaśniono procedurę eksperymentu 3D FRET oraz analizę obrazu niezbędną do oceny aktywności sondy na komórkę. Omówiono również nieodłączne ograniczenia analizy FRET w 2D i 3D przy użyciu mikroskopii szerokokątnej. Przedstawiona tutaj technika stanowi ulepszenie w stosunku do istniejących metod 2D, ponieważ umożliwia analizę w bardziej fizjologicznym kontekście i wymaga mniej korekcji obrazu i kalibracji. Duża użyteczność polega na tym, że można użyć wielu przezroczystych materiałów, przy jednoczesnym zachowaniu preferencji komórkowych i transfekcyjnych.

<table><tbody><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) [Zestaw elastomerów Sylgard 184]</td><td>Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives)</td><td>NC0162601</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Dimetakrylan glikolu polietylenowego (PEGDM)</td><td>Przygotowany zgodnie z Lin-Gibson z PEG z Sigma Aldrich</td><td>95904</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>3-(Trimetoksysililo)propylu Metakrylan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6514</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>3- glicydoksypropylotrimetoksysilan</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 440167</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Dimetylofenylofosfonit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>149470-5g</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Chlorek 2,4,6-trimetylobenzoilu</td><td>Odczynniki Fisher Scientific</td><td>AC244280100</td><td></td></tr><tr><td>2-butanone</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC149670010</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Bromek litu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC199871000</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>190764</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Sigmacote (odczynnik silikonowyzujący)</td><td>Odczynniki Sigma Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Toluen&nbsp;</td><td>Odczynniki Fisher Scientific</td><td>AC36441-0010</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Odczynniki</td><td>do SH3025601</td> <td>hyklonów</td></tr><tr><td>Opti-MEM Zredukowana pożywka surowicy, bez czerwieni fenolowej (pożywka wolna od fenoli i surowicy)</td><td>Odczynniki Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji FuGENE HD (odczynnik do transfekcji)</td><td>Odczynniki Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>Cellstripper (komórka roztwór dysocjacyjny)</td><td>Odczynniki Corning</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu Zredukowany Matrigel, Odczynniki Corning 356231 bez fenolu</td><td></td><td></td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (10,200,1,000 &mu; l)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-474, 02-707-478, 02-707-480</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Bezpudrowe rękawice diagnostyczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-149-863B</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Dziurkacz do biopsji (3 mm)</td><td>Miltex</td><td>3332</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544C</td><td>Jednorazowy sprzęt</td></tr><tr><td>laboratoryjny Wstępnie powlekane szkiełka nakrywkowe (epoksysilan)</td><td>Arrayit</td><td>CCSL</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12550D</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Sterylne fiolki (15 ml, 50 ml stożkowe)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C, 14-959-49A</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (6- cóż)</td> <td>Falcon</td><td>351146</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny ze zmotoryzowanym stopniem</td><td>Nikon</td><td>MEA53100 (Eclipse TiE Inverted)</td><td>Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Regulowany uchwyt na próbki do stolika XY</td><td>Nikon</td><td>77011393</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td>Obiektyw</tr><tr><td>60X (1.3 NA) (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Źródło światła CFP/YFP i uchwyty filtrów wzbudzenia / emisji (źródło światła i koło lambda, system filtrów emisji lambda)</td><td>Nikon (sprzedawca Sutter Instrument)</td><td>77016231, 77016088</td><td>Niejednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów CYF/YFP</td><td>Nikon (Chroma Technology Corp)</td><td>77014928</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Aparat fotograficzny (ORCA Flash 4.0 v1)</td><td>Nikon (Hamamatsu sprzedawca)</td><td>77054076</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopowe NIS-Elements 40.20.02)</td><td>Nikon</td><td>MQS31100&nbsp;</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Prism (arkusz kalkulacyjny i oprogramowanie do tworzenia wykresów)</td><td>GraphPad Software, Inc</td><td>Version 6</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>System lamp punktowych UV UV do utwardzania OmniCure S1000 z filtrem 365nm lub innym źródłem światła (&lambda; = 365 lub 405)</td><td>OmniCure</td><td>S1000</td><td>Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Pomoc do pipet&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Co.&nbsp;</td><td>DP-100</td><td>Jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>Reichert Bright-Line 1475</td><td>Niejednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Próżniowa komora eksykatora/odgazowywacz&nbsp;</td><td>Dowolny</td><td></td><td>duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Kaptur do hodowli tkankowych&nbsp;</td><td>Dowolny</td><td></td><td>duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Okap chemiczny&nbsp;</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Duży/niejednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>Dowolna</td><td></td><td>Niejednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Zlewka</td><td>Dowolny</td><td></td><td>Niejednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr><tr><td>Inkubator&nbsp;</td><td>Dowolny</td><td></td><td>duży/jednorazowy sprzęt laboratoryjny</td></tr></tbody></table>

obrazowanie fret w trójwymiarowych hydrożelach

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Obrazowanie transferu energii rezonansu Förstera (FRET) to potężne narzędzie do badania biologii komórki w czasie rzeczywistym. W badaniach wykorzystujących FRET powszechnie stosuje się hodowlę dwuwymiarową (2D), która nie naśladuje trójwymiarowego (3D) mikrośrodowiska komórkowego. Przedstawiono metodę wykonywania obrazowania FRET z wygaszoną emisją przy użyciu konwencjonalnej szerokopolowej mikroskopii epifluorescencyjnej komórek w środowisku hydrożelowym 3D. W tym miejscu opisano metodę analizy dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji sondy. Pomiar wewnątrzkomórkowych cyklicznych monofosforanów adenozyny (cAMP) wykazano w chondrocytach pod wpływem stymulacji forskoliny za pomocą sondy do aktywacji EPAC1 (ICUE1) i zdolności do wykrywania różnic w sygnalizacji cAMP w zależności od rodzaju materiału hydrożelowego, w tym hydrożelu sieciującego foto(PC-żel, dimetakrylan glikolu polietylenowego) i hydrożelu termoresponsywnego (TR-żel). W porównaniu z metodami 2D FRET, metoda ta wymaga niewiele dodatkowego nakładu pracy. Laboratoria już wykorzystujące obrazowanie FRET w 2D mogą z łatwością zastosować tę metodę do wykonywania badań komórkowych w mikrośrodowisku 3D. Może być dalej stosowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków w zmodyfikowanych mikrotkankach 3D. Dodatkowo jest kompatybilny z innymi formami obrazowania FRET, takimi jak pomiar anizotropii i obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM), a także z zaawansowanymi platformami mikroskopowymi wykorzystującymi oświetlenie konfokalne, pulsacyjne lub modulowane.

Wszystkie prekursory hydrożeli, komórki oraz formy odlewnicze przygotowano zgodnie z powyższym opisem. Roztwory prekursorów z zawiesionymi komórkami odlewano w formach z PDMS, a następnie centrygowano przed żelowaniem/fotoutwardzaniem, aby unieruchomić komórki blisko szkiełka nakrywkowego i ułatwić analizę obrazowania FRET (Rysunek 1). Hydrożele z przytwierdzonymi szkiełkami nakrywowymi umieszczono w przygotowanych studzienkach obrazujących z PDMS do obrazowania mikroskopowego (Rysunek 2). Następnie skonfigurowano parametry optyczne i akwizycji obrazu, jak pokazano na Rysunku 3A. Zademonstrowano rejestrację wszystkich czterech kanałów obrazowania powiązanych z FRET dla par fluoroforów CFP-YFP (patrz w sekcji „Optical Conf.” na Rysunku 3), co jest wymagane w przypadku sond nieliniowych. Jednak w niniejszej pracy dla jednowałańcuchowej binarnej sondy ICUE1 wymagane są tylko dwa obrazy, gdzie QE = „CFP CFP” i Aem = „YFP YFP” (wzbudzenie emisja). Wybrano wiele pól widzenia (pozycje xy), w których w jednorodnym obszarze oświetlenia znajdowało się kilka komórek (Rysunek 3B). Po akwizycji w trybie poklatkowym wyeksportowano dane sygnału dla sondy. Regiony zainteresowania (ROI) do korekcji tła sygnałów kanałów oraz do analizy komórek wyznaczono za pomocą obrazów Aem po zastosowaniu progu z początku eksperymentów (Rysunek 4). Z puli komórek wybrano te, które wykazywały wystarczającą (nie zbyt słabą), ale nie zbyt wysoką (nadmiernie jasną) ekspresję sondy (Rysunek 4B). Stosunki FRET QE i SE na piksel dla każdej akwizycji obliczono, stosując dzielenie zmiennoprzecinkowe kanałów obrazu po odjęciu tła. Obliczono średni stosunek FRET na komórkę (t.j. na ROI), znormalizowano go do sygnału bazowego przed stymulacją (t.j. regresja z odejmowaniem linii bazowej ze wszystkich punktów czasowych) i przedstawiono na wykresie z paskami błędów jako błąd standardowy średniej (SEM). Zarówno stosunki FRET oparte na QE, jak i na cSE wykrywają zwiększoną aktywność cAMP w chondrocytach pod wpływem stymulacji forskoliną (100 nM, Rysunek 5). Stosunek FRET QE był bardziej wrażliwy na korekcję tła niż stosunek FRET cSE, ponieważ sygnał QE był niższy ze względu na niski podstawowy poziom aktywności cAMP w chondrocytach zatopionych w hydrożelach. Oba typy hydrożeli (TR-gel i PC-gel) wykazały wzrost stosunku FRET w czasie (Rysunek 6), co wskazuje na zwiększoną odpowiedź sygnalizacyjną cAMP po dodaniu forskoliny. Jak wskazuje stosunek FRET QE, chondrocyty w hydrożelach PC-gel wykazują większą zmianę poziomu cAMP (pokazano) oraz wyższy podstawowy poziom cAMP (EQE = 0.19 w PC-gel vs. EQE = 0.09 w TR-gel, niewykazano na rysunku z odjętą linią bazową).
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig1.jpg" /> 
Rysunek 1: Rozmieszczenie komórek w hydrożelu fotousieciowanym (PC-gel) 
A: Prekursor hydrożelu z zawieszonymi komórkami poddano wirowaniu, aby zmaksymalizować liczbę komórek w płaszczyźnie ogniskowej blisko szkiełka nakrywkowe. B: Zwiększa to liczbę komórek w polu widzenia (FOV) i minimalizuje sygnał tła pochodzący z komórek znajdujących się poza płaszczyzną. (Pasek skali = 200 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 2" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig2.jpg" /> 
Rysunek 2: Hydrożel w naczyniu z PDMS 
Hydrożel umieszczono w wysokiej studzience z PDMS (10-krotna objętość hydrożelu) z podstawką z szkiełka podstawowego w celu obrazowania mikroskopowego i stymulacji analitem. Hydrożele PC-gel są przezroczyste i przytwierdzone do szkiełka podstawowego, dzięki czemu pozostają na miejscu przez cały czas trwania analizy. Studzienka z PDMS może zostać wykonana w większym rozmiarze, aby pomieścić 10-krotnie więcej medium niż objętość hydrożelu, poprzez zastosowanie szerszego wycinaka do biopsji oraz grubszej warstwy PDMS. (Skala = 2 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig3.jpg" /> 
Rysunek 3: Konfiguracja akwizycji dla obrazowania FRET 
A: Akwizycję skonfigurowano tak, aby przechwytywać obrazy co 7 sec w wielu lokalizacjach. Dla obliczenia stosunku QE FRET w przypadku zastosowanej tutaj sondy ICUE1 (binarna sonda jednołańcuchowa) wymagane są tylko dwa kanały obrazowania, gdzie QE = &#34;CFP CFP&#34; oraz Aem = &#34;YFP YFP&#34; (pobudzenie emisja) w kolumnie &#34;Optical Conf.&#34; w zakładce &#160;λ oprogramowania mikroskopu. B: Wybrano pola widzenia (pozycje &#34;XY&#34;), w których kilka komórek znajdowało się w obszarze jednorodnego oświetlenia. Wykres poniżej obrazu przedstawia natężenie oświetlenia wzdłuż linii oznaczonej niebieską strzałką, przechodzącej przez środek pola widzenia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig4.jpg" /> 
Rycina 4: Wybór ROI do analizy obrazowania FRET 
A: W celu korekcji sygnału tła dla każdego kanału wybrano obszar zainteresowania (ROI) wolny od komórek. W przypadku wysokiej gęstości lub migracji komórek, bądź gdy komórki nie znajdują się w jednorodnym polu oświetlenia a nie stosowana jest maska cieniowania, do odjęcia tła można zamiast tego użyć obrazu hydrożelu bez komórek. B: ROI komórek wybrano za pomocą progowania obrazu i maskowania binarnego kanału Aem. Wybór ROI większego niż komórki negatywnie wpłynie na obliczenie średniego stosunku FRET na komórkę ze względu na uwzględnienie stosunków pozakomórkowych generowanych przez szum tła. Obliczanie komórkowego stosunku FRET przy użyciu średniej z każdego kanału na komórkę nie jest zalecane, ponieważ prowadzi to do niedoszacowania tego stosunku. (Pasek skali = 50 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Rycina 5" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig5.jpg" /> 
Rycina 5: Porównanie stosunków FRET w hydrożelu termowrażliwym (TR-gel) 
Zarówno stosunki FRET oparte na QE, jak i SE wykrywają zwiększoną aktywność cAMP w chondrocytach pod wpływem stymulacji forskoliną. Forskolina jest agonistą cyklazy adenylowej, który indukuje produkcję cAMP. FRET maleje, gdy sonda ICUE1 wiąże cAMP, w związku z czym stosunek QE FRET (EQE&#160;= sQE/(sAem x QS)) rośnie. I przeciwnie, stosunek SE FRET maleje i jest zatem przedstawiany jako ESE&#160;= 1 - cSE/sAem. W chondrocytach osadzonych w hydrożelu stosunek QE FRET jest bardziej wrażliwy na korekcję tła niż stosunek SE FRET, ponieważ sygnał QE jest niski ze względu na niską podstawową aktywność cAMP. Słupki błędów = SEM, n = 25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig5large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Rycina 6" src="/files/ftp_upload/54135/54135fig6.jpg" /> 
Rycina 6: Porównanie stosunku FRET w różnych hydrożelach 
Chondrocyty w obu typach hydrożeli zareagowały na stymulację forskoliną wzrostem aktywności cAMP, co wykazano poprzez wzrost stosunku QE FRET w czasie. Typ hydrożelu wpływa na odpowiedź komórkową poprzez kilka efektów, w tym różnice w przepuszczalności dla forskoliny oraz w podstawowej komórkowej aktywności cAMP (EQE = 0,19 w PC-gel vs. EQE = 0,09 w TR-gel, nie pokazano). Słupki błędów = SEM, n dla TR-gel = 25, n dla PC-gel = 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54135/54135fig6large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>

Obrazowanie metodą rezonansowego transferu energii (FRET) Förstera jest potężnym narzędziem do badań biologii komórki w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono metodę obrazowania komórek FRET w fizjologicznych trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach hydrożelowych z wykorzystaniem konwencjonalnej mikroskopii epifluorescencyjnej. Opisano analizę dla ratiometrycznych sond FRET, która daje współczynniki liniowe w zakresie aktywacji.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Ogólnym celem tej metody eksperymentalnej jest umożliwienie badania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym przy użyciu obrazowania FRET komórek osadzonych w trójwymiarowych hydrożelach naśladujących naturalne tkanki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, farmakologii i medycyny regeneracyjnej, takie jak opracowanie optymalnych biomateriałów oraz wysokoprzepustowy skrining leków w inżynieryjnych mikrotkankach 3D. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zastosowania FRET w przypadku dużej liczby komórek w wielu rodzajach hydrożeli przy użyciu konwencjonalnych systemów mikroskopii szerokopolowej.Po przygotowaniu form do odlewania hydrożeli i zawieszeniu hodowanych komórek w roztworze hydrożelu, zgodnie z protokołem tekstowym, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś prekursor zawierający komórki do form odlewniczych, stosując technikę sterylną. Przed sieciowaniem, odwiruj komórki zawieszone w prekursorze hydrożelu, aby zoptymalizować obrazowanie poprzez ograniczenie komórek do jednej płaszczyzny ogniskowej i zminimalizowanie sygnału poza płaszczyzną. Następnie, aby usieciować hydrożele PC, użyj źródła światła UVA, naświetlając prekursor zawierający komórki przez czas odpowiadający dawce 3,2 joules per centimeter squared na milimetr grubości.Alternatywnie można użyć tańszej ręcznej lampy stomatologicznej. Należy unikać nadmiernej ekspozycji hydrożelu, ponieważ zmniejszy to żywotność komórek. Hydrożele sieciowane fizycznie są natomiast umieszczane w temperaturze 37 °C.Po sieciowaniu należy usunąć formę odlewniczą z hydrożelu PDMS i zastąpić ją wcześniej przygotowaną szalką PDMS. Za pomocą sterylnej szpachelki dociśnij PDMS do szkła, aby zapewnić jego przyleganie. Do dołka utworzonego w szalce PDMS z ciekłym szkiełkiem należy dodać pożywkę bezsurowiczą i wolną od fenolu lub pożywkę chemicznie zdefiniowaną, aby utrzymać hydrożel w zanurzeniu.Inkubuj szalkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po zamocowaniu szalki z PDMS i hydrożelem na stoliku mikroskopu oraz naniesieniu olejku na obiektyw, użyj światła przechodzącego, aby zlokalizować co najmniej 15 komórek do obrazowania, a następnie zweryfikuj transfekcję za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. W oprogramowaniu mikroskopu skonfiguruj ustawienia kamery dla kanałów obrazowania FRET, wybierając kilka komórek w pobliżu centrum pola widzenia, a następnie zoptymalizuj czas ekspozycji i wzmocnienie dla każdego kanału obrazu zgodnie z protokołem tekstowym.Wybierz komórki znajdujące się blisko centrum hydrożelu, w obrębie stosunkowo płaskiego pola oświetlenia, które nie są ani zbyt jasne, ani zbyt ciemne, oraz których stosunek FRET mieści się w przedziale od 0,0 do 1,0. Następnie wybierz wiele pól widzenia, aby pozyskać obrazy dla co najmniej 15 przetransfekowanych komórek. Po zakończeniu wyłącz światło, aby ograniczyć ekspozycję.Aby skonfigurować częstotliwość przechwytywania obrazów w trybie time-lapse, należy wprowadzić okresowość ujęć. W przypadku rejestracji sygnału bazowego należy zastosować wysoką częstotliwość, np. co pięć sekund na pole widzenia, a w przypadku późniejszej długoterminowej kinetyki sygnalizacji – częstotliwość niższą. Wybierz Run now, aby rozpocząć akwizycję i rejestrować obrazy przez pięć minut w celu ustanowienia linii bazowej odpowiedzi sondy w wyznaczonym polu widzenia.Po pięciu minutach akwizycji obrazu, nanieś pipetą odpowiedni agonista lub antagonistę, wymieszaj poprzez pipetowanie i kontynuuj obrazowanie. Po przeprowadzeniu kalibracji FRET zgodnie z protokołem tekstowym, w oprogramowaniu mikroskopu wybierz strzałkę przy ikonie obszaru zainteresowania tła i wybierz opcję Rysuj eliptyczny obszar zainteresowania tła. Narysuj i wyznacz jeden obszar zainteresowania, czyli ROI, na każde pole widzenia w pobliżu komórek, aby zdefiniować poziom tła.Upewnij się, że opcja Keep Updating Background Offset jest zaznaczona, a następnie aktywuj podgląd obszaru zainteresowania tła, klikając ikonę Background Region of Interest. Alternatywnie można wybrać ikonę obszaru zainteresowania i ustawić właściwości obszaru zainteresowania jako Use as Background Region of Interest oraz Regions of interest are different in each Multi Point. Korzystając z ikony tła obszaru zainteresowania, wybierz Subtract Background Using Region of Interest.W oknie wyskakującym, w sekcji Subtract Background Region of Interest, wybierz Every Image, a w sekcji Apply To wybierz All Frames. Aby dla każdego pola widzenia zdefiniować obszar zainteresowania wokół komórki, wykorzystując kanał emisji akceptora i maskę binarną, użyj menu Binary, Define Threshold i wybierz Apply To Current Frame. Następnie dostosuj dolny próg, aby zaznaczyć komórki.Następnie, jeśli jest to konieczne, należy użyć funkcji Binary Close w celu wypełnienia otworów w masce binarnej. Następnie, korzystając z ikony Region of Interest, należy wybrać opcję Copy Binary to Region of Interest, aby zapisać maskę binarną jako obszary zainteresowania. Obszary zainteresowania dla kolejnych pól widzenia należy dopisać do istniejącego zbioru obszarów zainteresowania.Usuń wszelkie błędne obszary zainteresowania. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na obszary zainteresowania (Regions of Interest) i upewnij się, że ich właściwości są ustawione na Use as Standard Region of Interest oraz Regions of Interest are different in each Multi Point. Obszary zainteresowania komórek mogą być rysowane ręcznie, jednak należy zachować ostrożność, aby usunąć błędne wartości.Protokół zawiera procedury dla komórek znajdujących się poza polem równomiernego oświetlenia oraz dla mikroskopów, które nie posiadają płaskiego pola. Wirowanie prekursorów hydrożelu przed żelowaniem pozwoliło zmaksymalizować liczbę komórek w jednej płaszczyźnie ogniskowej blisko szkiełka podstawowego. Zminimalizowało to szum tła i zwiększyło wydajność obrazowania.W tym eksperymencie FRET, w celu obliczenia stosunku FRET dla wygaszonej emisji (QE), dla pojedynczej łańcuchowej binarnej sondy ICUE1 wymagane były tylko dwa obrazy: QE odpowiadające pobudzeniu i emisji CFP CFP oraz emisja akceptora odpowiadająca pobudzeniu i emisji YFP YFP. Wybrano wiele pól widzenia, w których kilka komórek znajdowało się w obszarze jednorodnego oświetlenia, jak pokazano tutaj. ROI do korekcji tła sygnałów kanałów oraz do analizy komórek wyznaczono przy użyciu obrazów emisji akceptora z zastosowaniem progowania na początku eksperymentów.Dodatkowo, jak pokazano tutaj, wyselekcjonowano komórki wykazujące wystarczającą ekspresję sondy. Obliczono wartości QE oraz stosunki emisji sensybilizowanej FRET na piksel, a także średni stosunek FRET na komórkę. Obliczono odwrotność stosunku SE, a następnie oba stosunki znormalizowano.Pod wpływem stymulacji forskoliną zarówno stosunki FRET oparte na QE, jak i SE wykryły zwiększoną aktywność cyklicznego AMP w chondrocytach. Zarówno żele sieciowane fizycznie, jak i chemicznie wykazały wzrost stosunku FRET QE w czasie, co wskazuje na zwiększoną odpowiedź sygnalizacyjną cyklicznego AMP po dodaniu forskoliny. Procedura ta może być stosowana z innymi technikami mikroskopowymi, takimi jak FRAP, FLIM-FRET oraz pomiary FRET i anizotropii, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące np. różnic w przepuszczalności i sygnalizacji komórkowej pomiędzy różnymi typami mikrotkanek.Ponieważ sieciowanie jest hamowane w pobliżu PDMS, należy pamiętać o zaprojektowaniu form do hydrożeli sieciowanych fotochemicznie o średnicy nieco większej niż same hydrożele.

fret-imaging-in-three-dimensional-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Ten protokół zawiera instrukcje dotyczące implementacji litografii wielofotonowej do wytwarzania trójwymiarowych matryc fluorescencyjnych znaczników referencyjnych osadzonych w hydrożelach na bazie poli(glikolu etylenowego) do wykorzystania jako platformy mikroskopii siły pociągowej bez odniesień. Korzystając z tych instrukcji, pomiar odkształcenia materiału 3D i obliczanie trakcji komórkowych jest uproszczone, aby ułatwić pomiary siły pociągowej o wysokiej przepustowości.

Wykonanie i wdrożenie bezreferencyjnej platformy mikroskopii sił trakcyjnych

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Obecny protokół opisuje eksperymentalną platformę do oceny wpływu sygnałów mechanicznych i biochemicznych na reakcje chemoterapeutyczne komórek glejaka pochodzących od pacjenta w hodowlach 3D matrix-mimetic przy użyciu specjalnie zaprojektowanego urządzenia do oświetlania UV, umożliwiającego wysokoprzepustowe fotosieciowanie hydrożeli o regulowanych cechach mechanicznych.

Matryce hydrożelowe umożliwiają zwiększenie przepustowości w celu badania przesiewowego efektów komponentów matrycy i środków terapeutycznych w modelach 3D nowotworów

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Poznaj obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach do badania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia analizę wielu komórek przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii.

Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Przeglądaj więcej filmów