Obrazowanie FRET w trójwymiarowych hydrożelach

Ogólnym celem tej metody eksperymentalnej jest umożliwienie badania sygnalizacji wewnątrzkomórkowej w czasie rzeczywistym przy użyciu obrazowania FRET komórek osadzonych w trójwymiarowych hydrożelach naśladujących naturalne tkanki. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozwoju, farmakologii i medycyny regeneracyjnej, takie jak opracowanie optymalnych biomateriałów oraz wysokoprzepustowy skrining leków w inżynieryjnych mikrotkankach 3D. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zastosowania FRET w przypadku dużej liczby komórek w wielu rodzajach hydrożeli przy użyciu konwencjonalnych systemów mikroskopii szerokopolowej.

Po przygotowaniu form do odlewania hydrożeli i zawieszeniu hodowanych komórek w roztworze hydrożelu, zgodnie z protokołem tekstowym, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, nanieś prekursor zawierający komórki do form odlewniczych, stosując technikę sterylną. Przed sieciowaniem, odwiruj komórki zawieszone w prekursorze hydrożelu, aby zoptymalizować obrazowanie poprzez ograniczenie komórek do jednej płaszczyzny ogniskowej i zminimalizowanie sygnału poza płaszczyzną. Następnie, aby usieciować hydrożele PC, użyj źródła światła UVA, naświetlając prekursor zawierający komórki przez czas odpowiadający dawce 3,2 joules per centimeter squared na milimetr grubości.

Alternatywnie można użyć tańszej ręcznej lampy stomatologicznej. Należy unikać nadmiernej ekspozycji hydrożelu, ponieważ zmniejszy to żywotność komórek. Hydrożele sieciowane fizycznie są natomiast umieszczane w temperaturze 37 °C.

Po sieciowaniu należy usunąć formę odlewniczą z hydrożelu PDMS i zastąpić ją wcześniej przygotowaną szalką PDMS. Za pomocą sterylnej szpachelki dociśnij PDMS do szkła, aby zapewnić jego przyleganie. Do dołka utworzonego w szalce PDMS z ciekłym szkiełkiem należy dodać pożywkę bezsurowiczą i wolną od fenolu lub pożywkę chemicznie zdefiniowaną, aby utrzymać hydrożel w zanurzeniu.

Inkubuj szalkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po zamocowaniu szalki z PDMS i hydrożelem na stoliku mikroskopu oraz naniesieniu olejku na obiektyw, użyj światła przechodzącego, aby zlokalizować co najmniej 15 komórek do obrazowania, a następnie zweryfikuj transfekcję za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. W oprogramowaniu mikroskopu skonfiguruj ustawienia kamery dla kanałów obrazowania FRET, wybierając kilka komórek w pobliżu centrum pola widzenia, a następnie zoptymalizuj czas ekspozycji i wzmocnienie dla każdego kanału obrazu zgodnie z protokołem tekstowym.

Wybierz komórki znajdujące się blisko centrum hydrożelu, w obrębie stosunkowo płaskiego pola oświetlenia, które nie są ani zbyt jasne, ani zbyt ciemne, oraz których stosunek FRET mieści się w przedziale od 0,0 do 1,0. Następnie wybierz wiele pól widzenia, aby pozyskać obrazy dla co najmniej 15 przetransfekowanych komórek. Po zakończeniu wyłącz światło, aby ograniczyć ekspozycję.

Aby skonfigurować częstotliwość przechwytywania obrazów w trybie time-lapse, należy wprowadzić okresowość ujęć. W przypadku rejestracji sygnału bazowego należy zastosować wysoką częstotliwość, np. co pięć sekund na pole widzenia, a w przypadku późniejszej długoterminowej kinetyki sygnalizacji – częstotliwość niższą. Wybierz Run now, aby rozpocząć akwizycję i rejestrować obrazy przez pięć minut w celu ustanowienia linii bazowej odpowiedzi sondy w wyznaczonym polu widzenia.

Po pięciu minutach akwizycji obrazu, nanieś pipetą odpowiedni agonista lub antagonistę, wymieszaj poprzez pipetowanie i kontynuuj obrazowanie. Po przeprowadzeniu kalibracji FRET zgodnie z protokołem tekstowym, w oprogramowaniu mikroskopu wybierz strzałkę przy ikonie obszaru zainteresowania tła i wybierz opcję Rysuj eliptyczny obszar zainteresowania tła. Narysuj i wyznacz jeden obszar zainteresowania, czyli ROI, na każde pole widzenia w pobliżu komórek, aby zdefiniować poziom tła.

Upewnij się, że opcja Keep Updating Background Offset jest zaznaczona, a następnie aktywuj podgląd obszaru zainteresowania tła, klikając ikonę Background Region of Interest. Alternatywnie można wybrać ikonę obszaru zainteresowania i ustawić właściwości obszaru zainteresowania jako Use as Background Region of Interest oraz Regions of interest are different in each Multi Point. Korzystając z ikony tła obszaru zainteresowania, wybierz Subtract Background Using Region of Interest.

W oknie wyskakującym, w sekcji Subtract Background Region of Interest, wybierz Every Image, a w sekcji Apply To wybierz All Frames. Aby dla każdego pola widzenia zdefiniować obszar zainteresowania wokół komórki, wykorzystując kanał emisji akceptora i maskę binarną, użyj menu Binary, Define Threshold i wybierz Apply To Current Frame. Następnie dostosuj dolny próg, aby zaznaczyć komórki.

Następnie, jeśli jest to konieczne, należy użyć funkcji Binary Close w celu wypełnienia otworów w masce binarnej. Następnie, korzystając z ikony Region of Interest, należy wybrać opcję Copy Binary to Region of Interest, aby zapisać maskę binarną jako obszary zainteresowania. Obszary zainteresowania dla kolejnych pól widzenia należy dopisać do istniejącego zbioru obszarów zainteresowania.

Usuń wszelkie błędne obszary zainteresowania. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy na obszary zainteresowania (Regions of Interest) i upewnij się, że ich właściwości są ustawione na Use as Standard Region of Interest oraz Regions of Interest are different in each Multi Point. Obszary zainteresowania komórek mogą być rysowane ręcznie, jednak należy zachować ostrożność, aby usunąć błędne wartości.

Protokół zawiera procedury dla komórek znajdujących się poza polem równomiernego oświetlenia oraz dla mikroskopów, które nie posiadają płaskiego pola. Wirowanie prekursorów hydrożelu przed żelowaniem pozwoliło zmaksymalizować liczbę komórek w jednej płaszczyźnie ogniskowej blisko szkiełka podstawowego. Zminimalizowało to szum tła i zwiększyło wydajność obrazowania.

W tym eksperymencie FRET, w celu obliczenia stosunku FRET dla wygaszonej emisji (QE), dla pojedynczej łańcuchowej binarnej sondy ICUE1 wymagane były tylko dwa obrazy: QE odpowiadające pobudzeniu i emisji CFP CFP oraz emisja akceptora odpowiadająca pobudzeniu i emisji YFP YFP. Wybrano wiele pól widzenia, w których kilka komórek znajdowało się w obszarze jednorodnego oświetlenia, jak pokazano tutaj. ROI do korekcji tła sygnałów kanałów oraz do analizy komórek wyznaczono przy użyciu obrazów emisji akceptora z zastosowaniem progowania na początku eksperymentów.

Dodatkowo, jak pokazano tutaj, wyselekcjonowano komórki wykazujące wystarczającą ekspresję sondy. Obliczono wartości QE oraz stosunki emisji sensybilizowanej FRET na piksel, a także średni stosunek FRET na komórkę. Obliczono odwrotność stosunku SE, a następnie oba stosunki znormalizowano.

Pod wpływem stymulacji forskoliną zarówno stosunki FRET oparte na QE, jak i SE wykryły zwiększoną aktywność cyklicznego AMP w chondrocytach. Zarówno żele sieciowane fizycznie, jak i chemicznie wykazały wzrost stosunku FRET QE w czasie, co wskazuje na zwiększoną odpowiedź sygnalizacyjną cyklicznego AMP po dodaniu forskoliny. Procedura ta może być stosowana z innymi technikami mikroskopowymi, takimi jak FRAP, FLIM-FRET oraz pomiary FRET i anizotropii, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące np. różnic w przepuszczalności i sygnalizacji komórkowej pomiędzy różnymi typami mikrotkanek.

Ponieważ sieciowanie jest hamowane w pobliżu PDMS, należy pamiętać o zaprojektowaniu form do hydrożeli sieciowanych fotochemicznie o średnicy nieco większej niż same hydrożele.