Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się

Ogólnym celem tego schematu testowego jest ustanowienie serii prostych testów, które mogą być wykorzystane jako początkowy potok fenotypowania w celu skierowania kolejnych szczegółowych badań nad fenotypami behawioralnymi oraz strukturą i funkcją tkanek. Czy behawioralne i komórkowe fenotypy chorób człowieka są rekapitulowane w modelu mysim. Główną zaletą tej techniki jest to, że testy mogą być wykonywane w laboratoriach bez wcześniejszego doświadczenia w takich eksperymentach bez znacznych inwestycji, ale nadal dostarczających dalszych szczegółowych badań.

Przeprowadzaj test kończyn tylnych codziennie od czwartego do 10 dnia po urodzeniu, aby ocenić siłę, osłabienie i zmęczenie mięśni bliższych kończyn tylnych. Na początek pozwól myszom zaaklimatyzować się w obszarze testowym przez 30 minut. W międzyczasie przygotuj nową stożkową rurkę o pojemności 500 mililitrów, myjąc ją 70% etanolem, a następnie wciskając jeden lub dwa waciki na dno tuby.

Zabezpiecz tę rurkę w pozycji pionowej na czas testu. Kiedy nie są testowane, trzymaj młode z matką, aby utrzymać ich temperaturę. Po półgodzinnej aklimatyzacji wyjmij szczeniaka z klatki i zapisz jego wagę.

Następnie delikatnie zawieś noworodka za tylne kończyny nad krawędzią rurki, tak aby szczenię było skierowane w stronę bawełny. Następnie policz liczbę prób ściągnięcia wykonanych przez szczenię i zmierz jego opóźnienie, aby spadło. Po odczekaniu 30 sekund powtórz test.

Po drugim teście oznacz szczeniaka markerem. Następnie delikatnie natrzyj szczeniaka ściółką z domowej klatki i zwróć go do tamy. Ponieważ starsze szczenięta P8 nie mogą być oznaczone, identyfikuj je za pomocą obcięcia palca.

Przed przejściem do następnego szczeniaka przetrzyj probówkę 70% etanolem. Wykonuj test obserwacji odsadzenia codziennie od P19 do P21, aby ocenić poziom ruchu i ogólnej aktywności. Zacznij od pozostawienia myszom aklimatyzacji w obszarze testowym przez 30 minut.

Podczas gdy szczenięta się aklimatyzują, przygotuj arenę. Zaznacz pudełko testowe z pleksiglasu siatką o wymiarach sześć na sześć składającą się z dwucalowych kwadratów. Przed użyciem pudełka wyczyść je 70% etanolem.

Następnie ustaw kamerę wideo tak, aby widok z boku całego pudełka wypełniał pole widzenia. Ujednolicaj wygląd otoczenia, aby uniknąć wprowadzania nowości. Przed badaniem przenieść odsadzenie do czystego kubka i zanotować jego wagę.

Następnie rozpoczęło się nagrywanie wideo. Najpierw sfilmuj testową kartę identyfikacyjną z numerem identyfikacyjnym myszy, jej wiekiem i aktualną datą. Następnie przenieś mysz z kubka trzymającego na środkowy kwadrat.

Przez trzy minuty policz liczbę linii przeciętych przez obie przednie łapy. Po trzech minutach umieść mysz z powrotem w czystej klatce i zakończ nagrywanie wideo. Pomiędzy każdym testem wyczyść pudełko 70% etanolem.

Na filmach policz wydarzenia związane z odchowywaniem, czyli sytuację, w której mysz stoi z obiema przednimi łapami z dala od podparcia. Policz również zdarzenia pielęgnacyjne, które mają miejsce, gdy obie przednie łapy są zaangażowane w czyszczenie. Przeprowadź test siły chwytu co drugi dzień między P22 i P26, aby ocenić siłę nerwowo-mięśniową.

Jak zwykle daj myszom 30 minut na przystosowanie się do obszaru testowego. Aparaturą badawczą jest pudełko z pleksi z siatką siatkową. Wyczyść oba za pomocą 70% etanolu.

Następnie wyłóż spód pudełka warstwą folii bąbelkowej do wyściółki i przykryj folię bąbelkową papierem, aby wchłonąć wydzieliny. Przystąp do oddzielenia myszy testowych i załaduj je do pojedynczych kubków. Teraz umieść pierwszą mysz na środku drucianej siatki i powoli odwróć siatkę na 10 do 20 centymetrów nad miękką powierzchnią pudełka.

Zmierz opóźnienie do upadku lub zakończ test po 60 sekundach, jeśli mysz nie upadnie. Następnie umieść pierwszą mysz z powrotem w miseczce. Pomiędzy testami przetrzyj siatkę 70% etanolem i umieść papier na folii bąbelkowej.

Następnie przeprowadź test na dwóch pozostałych myszach w grupie. Po jednokrotnym przetestowaniu każdej myszy powtórz proces jeszcze dwa razy dla trzech prób na mysz. Jeśli w grupie jest mniej niż trzy myszy, upewnij się, że czas rekonwalescencji między próbami wynosi co najmniej pięć minut.

W przypadku barwnika diaforazowego NADH połącz równe objętości świeżo przygotowanego roztworu NADH i świeżo przygotowanego roztworu NBT. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu barwiącego do każdego szkiełka i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. W przypadku barwienia hydrogenazą bursztynianową przygotuj roztwór 0,1 molowego bursztynianu sodu, 1,25 molowego NBT i 0,2 molowego buforu fosforanowego.

Następnie dodaj jeden mililitr do każdego szkiełka. Zapakuj szkiełka do nawilżonej komory i inkubuj szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji z jednym z barwników odessać roztwór barwiący i trzykrotnie przemyć szkiełka wodą destylowaną.

Następnie umyj szkiełka przez serię kąpieli acetonowych, które zwiększają i zmniejszają stężenie. Przy każdym stężeniu acetonu wykonaj trzy prania przez dwie minuty na pranie. Na koniec trzykrotnie opłucz szkiełka w wodzie destylowanej.

Następnie zamontuj szkiełka za pomocą medium wodnego. Myszy bez ekspresji HTRA2 badano przy użyciu opisanej baterii testów i porównywano z kontrolami z miotu. Nie zaobserwowano żadnych zmian w liczbie pociągnięć ani opóźnieniu do spadku między P4 a P6. Między P7 a P10 odnotowano zmniejszenie siły nerwowo-mięśniowej.

W teście aktywności stwierdzono zmniejszoną aktywność myszy z nokautem HTRA2. Myszy z nokautem HTRA2 wykazały również zmniejszenie wytrzymałości w teście uchwytu z siatki drucianej. Barwienie H i E pokazuje, że myszy z nokautem HTRA2 nie miały widocznych zmian w strukturze siatkówki w porównaniu z kontrolami w P35.

Na koniec wykorzystano barwienie histochemiczne pod kątem aktywności kompleksu łańcucha transportu elektronów w celu zidentyfikowania zmian w funkcjach enzymów oddechowych. U myszy z nokautem HTRA2 stwierdzono zmniejszone barwienie w porównaniu z grupą kontrolną. Odnotowano to w móżdżku i prążkowiu, ale nie w korze

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oceniać aktywność i siłę nerwowo-mięśniową genetycznie zmodyfikowanych myszy, a także jak połączyć te badania z osiami komórkowymi. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.