Name: Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Poznaj schemat fenotypowania genetycznie zmodyfikowanych myszy do badania genów związanych z chorobami człowieka. Metoda obejmuje test siły mięśniowej i ocenę aktywności behawioralnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze na te badania pochodziły z Fundacji Medycznej Rosebay oraz Funduszu Badawczego Dziekana Szkoły Medycznej Yale (JH). Dziękujemy dr Claire Koenig za pomoc w eksperymentach behawioralnych. Genetycznie zmodyfikowane linie myszy zostały stworzone w Ozgene (Perth, Australia).

Oświadczenie etyczne: Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami National Institutes of Health zawartymi w Przewodniku po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych oraz Instytucjonalnym Komitecie ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Yale.
1. Testy behawioralne genetycznie zmodyfikowanych myszy
Uwaga: Wszystkie myszy powinny być poddawane temu samemu schematowi testowania, aby ograniczyć różnice w przyzwyczajeniu do obsługi. Badania powinny być wykonywane za każdym razem o tej samej porze dnia.
<ol>
	Test na <li>kończynach tylnych noworodka 
	Uwaga: Test kończyn tylnych jest przeprowadzany codziennie od dnia po urodzeniu (P) 4 do P10 w celu oceny siły, osłabienia i zmęczenia mięśni bliższych kończyn tylnych.
	<ol>
		<li>Przenieś myszy do obszaru testowego i pozwól im odpocząć przez 30 minut przed badaniem.</li>
		<li>Przygotować aparaturę badawczą, czyszcząc stożkową probówkę o pojemności 50 ml z 70% etanolem, dociskając dwa (P4-P8) lub jeden (P9-P10) waciki do dna probówki i zabezpieczając w pozycji pionowej.</li>
		<li>Wyjmij jedno szczenię z klatki i zapisz wagę. Trzymaj szczeniaka w tacce na poduszce grzewczej, gdy nie testujesz.</li>
		<li>Delikatnie zawieś tylne kończyny noworodka nad krawędzią stożkowej rurki, tak aby była skierowana w dół w kierunku wacików. Policz liczbę wykonanych prób ściągnięcia i zmierz opóźnienie, aby spaść za pomocą stopera.</li>
		<li>Powtórz jeszcze raz, a następnie oznacz szczeniaka markerem. Następnie zidentyfikuj szczenięta P6 przez obcinanie palców. Przed wymianą delikatnie przetrzyj szczenięta pościelą z domowej klatki.</li>
		<li>Przetrzyj stożkową rurkę 70% etanolem.</li>
		<li>Powtarzaj testy na następnym szczenięciu, aż cały miot zostanie przetestowany.</li>
		<li>Wyrzuć wacik i stożkową rurkę. Wyczyść wszystkie urządzenia 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test obserwacji odsadzenia 
	Uwaga: Test obserwacji odsadzenia jest przeprowadzany codziennie od P19 do P21 w celu oceny poziomu ruchu i ogólnej aktywności.
	<ol>
		<li>Przenieś myszy do obszaru testowego i pozwól im odpocząć przez 30 minut przed badaniem.</li>
		<li>Przygotuj pudełko testowe z pleksiglasu oznaczone siatką 6x6 składającą się z 2-calowych kwadratów na podstawie, czyszcząc 70% etanolem. Ustaw sprzęt wideo z boku tak, aby całe pudełko znajdowało się w polu view. Utrzymuj konfigurację i otoczenie takie same każdego dnia, aby uniknąć wprowadzania nowości.</li>
		<li>Wyjmij jedno odsadzone od klatki i umieść w czystym kubku. Rekordowa waga.</li>
		<li>Rozpocznij nagrywanie wideo, nagrywając kartę identyfikacyjną testu z numerem identyfikacyjnym myszy, wiekiem i datą testu. Przenieś mysz z kubka trzymającego na środkowy kwadrat. Czas na trzy minuty, licząc liczbę linii przebytych przez obie przednie łapy myszy podczas testu.</li>
		<li>Umieść mysz z powrotem w czystej klatce i zakończ nagrywanie wideo.</li>
		<li>Wyczyść aparaturę testową 70% etanolem.</li>
		<li>Powtarzaj, aż cały miot zostanie przetestowany, a następnie zwróć wszystkie szczenięta do klatki domowej.</li>
		<li>Wyczyść wszystkie urządzenia testujące 70% etanolem.</li>
		<li>Korzystając z filmów, określ ilościowo liczbę zdarzeń odchowowych, zliczając po obserwacji wizualnej, w której mysz stoi z obiema przednimi łapami z dala od podparcia, oraz zdarzeniach pielęgnacyjnych, w których obie przednie łapy są zaangażowane w czyszczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test wytrzymałości na trzymanie siatki drucianej 
	Uwaga: Test siły chwytu jest przeprowadzany co drugi dzień między P22 i P26, w celu oceny siły nerwowo-mięśniowej.
	<ol>
		<li>Przenieś myszy do obszaru testowego i pozwól im odpocząć w klatce domowej przez 30 minut przed badaniem.</li>
		<li>Przygotuj aparaturę, czyszcząc pudełko z pleksi i siatkę siatkową 70% etanolem. Umieść folię bąbelkową na dnie pudełka i przykryj papierem.</li>
		<li>Podziel myszy na grupy po trzy, umieszczając je w indywidualnych kubkach.</li>
		<li>Umieść pierwszą mysz na środku siatki drucianej i powoli odwróć 10-20 cm nad miękką powierzchnią na dnie pudełka z pleksi. Zmierz opóźnienie do spadku za pomocą stopera. Zakończ testowanie po upływie 60 sekund, jeśli mysz nie upadnie.</li>
		<li>Umieść mysz z powrotem w kubku, przetrzyj siatkę 70% etanolem i połóż papier na folii bąbelkowej. Przeprowadź test na pozostałych dwóch myszach w grupie, zanim powrócisz do pierwszej. Powtarzaj tę czynność, aż każda mysz zostanie przetestowana łącznie trzy razy.</li>
		<li>Przywróć grupę do czystej klatki i kontynuuj z pozostałymi grupami. Jeśli w dowolnej grupie jest mniej niż trzy myszy, upewnij się, że dozwolony jest 5-minutowy interwał odzyskiwania między próbami.</li>
		<li>Umieść wszystkie myszy z powrotem w klatce domowej, wyrzuć papier i wyczyść sprzęt testowy z 70% etanolem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Badanie struktury siatkówki
<ol>
	<li>Znieczulenie zwierząt w temperaturze P30-35 przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia, ściskając opuszkę stopy i kontynuuj tylko w przypadku braku odpowiedzi, zgodnie z wytycznymi IACUC. Perfuzja z 4% PFA/PBS48.</li>
	<li>Aby usunąć oczy, oczyść skórę w miejscu nacięcia 70% etanolem, a następnie przetnij skórę u podstawy czaszki. Zdejmij skórę, aby odsłonić czaszkę i oczyść ją 70% etanolem. Używając czystych narzędzi, ostrożnie przetnij czaszkę, aby dotrzeć do oczodołów i odsłonić oczy. Przeciąć nerw wzrokowy, delikatnie wyjąć oko z oczodołu i spłukać w PBS.</li>
	<li>Utrwal oczy w 4% PFA/PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść oczy na małej szalce Petriego zawierającej PBS. Wykonaj małe nacięcie na środku rogówki za pomocą nożyczek do usuwania ściegów. Usuń rogówkę, przecinając krawędź między rogówką a twardówką. Użyj kleszczy, aby usunąć tęczówkę. Na koniec zdejmij warstwy RPE, pozostawiając siatkówkę nienaruszoną, a soczewkę na miejscu. 
	Uwaga: Utrwalenie 4% PFA/PBS spowoduje odklejenie RPE, co pozwoli na łatwe oderwanie RPE od zewnętrznej strony siatkówki.</li>
	<li>Ponownie umieścić w 4% PFA/30% sacharozy/PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed ponownym umieszczeniem oka na szalce Petriego zawierającej PBS. Wyciągnij soczewkę za pomocą kleszczy, zabierając ze sobą ciało szkliste.</li>
	<li>Cryoprotect w 30% sacharozie przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Pokryj oczka związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i przenieś do formy do zatapiania zawierającej świeży OCT. Ustaw oko tak, aby płaszczyzna strzałkowa była równoległa do powierzchni tnącej, wykonując jak najmniej ruchów i unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Błyskawiczne zamrożenie poprzez zanurzenie formy w kąpieli z suchym lodem/etanolem. Przechowywać bloki w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Za pomocą kriostatu wytnij odcinki strzałkowe o grubości 20 μm i zbierz je na wstępnie oczyszczonych szkiełkach.</li>
	<li>Wybarwić skrawki hematoksyliną i eozyną zgodnie ze standardowymi protokołami49. Obraz za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w mikroskopię jasnego pola.</li>
</ol>
3. Barwienie histochemiczne
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji zwierzęta w wieku P30-35 za pomocą przedawkowania izofluranu (30% w glikolu propylenowym) poprzez inhalację z otwartą kroplą. Oceń eutanazję na podstawie ustania oddechu, bicia serca i braku reakcji na szczypanie opuszki stopy. Potwierdzić zgon w wyniku zwichnięcia szyjki macicy i usunięcia narządów, zgodnie z wytycznymi IACUC.</li>
		<li>Aby usunąć mózg, oczyść skórę w miejscu nacięcia 70% etanolem, a następnie przetnij skórę u podstawy czaszki. Zdejmij skórę, aby odsłonić czaszkę i oczyść ją 70% etanolem. Używając czystych narzędzi, ostrożnie przetnij czaszkę i usuń, aby odsłonić mózg. Usuń błony i delikatnie usuń mózg z jamy czaszki. Spłucz w PBS.</li>
		<li>Pokryj mózg w OCT i przenieś do formy do zatapiania zawierającej świeży OCT. Ustaw mózg tak, aby płaszczyzna strzałkowa była równoległa do powierzchni tnącej, wykonując jak najmniej ruchów i unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza. Błyskawiczne zamrożenie poprzez zanurzenie formy w kąpieli z suchym lodem/etanolem i przechowywanie w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Za pomocą kriostatu wytnij odcinki strzałkowe o grubości 10 μm i zbierz je na wstępnie oczyszczonych szkiełkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie diaforazy NADH
	<ol>
		<li>Przygotować 0,05 M bufor Tris o pH 7,6, rozpuszczając 5,72 g Tris-HCl i 1,66 g zasady Tris w 1 l dejonizowanej wodzie. Przechowywać w temperaturze 4 °C do sześciu tygodni.</li>
		<li>Przygotować roztwór NADH (2,25 mM NADH w 0,05 M buforze Tris). Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Przygotować roztwór NBT (2,5 mM Nitro-Blue Tetrazolium w 0,05 M buforze Tris). Przechowywać w temperaturze 4 °C do sześciu tygodni w szklanej butelce.</li>
		<li>Połączyć równe objętości roztworu NADH i roztworu NBT, aby uzyskać roztwór barwiący i dodać 1 ml do każdego szkiełka. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 30 minut.</li>
		<li>Odessać roztwór barwiący i przemyć trzykrotnie dH2O.</li>
		<li>Płukać po trzy razy w rosnących i malejących stężeniach acetonu/dH20 (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłukać trzykrotnie w dH2O i zamontować sekcje w roztworze wodnym. Obraz za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w mikroskopię jasnego pola. Niebieskie zabarwienie odpowiada aktywności enzymatycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dehydrogenaza bursztynianowa Barwienie histochemiczne
	<ol>
		<li>Przygotować 0,2 M sodu fosforanu jednozasadowego/dH2O i 0,2 M fosforanu dwuzasadowego sodu/dH2O.</li>
		<li>Przygotować 0,2 M bufor fosforanowy o pH 7,6, łącząc 3 części fosforanu jednozasadowego z 20 częściami fosforanu dwuzasadowego sodu.</li>
		<li>Przygotować roztwór barwiący (0,1 M bursztynian sodu, 1,25 M NBT w 0,2 M buforze fosforanowym) i dodać 1 ml do każdego szkiełka. Inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej komorze przez 60 minut.</li>
		<li>Odessać roztwór barwiący i przemyć trzykrotnie w dH2O.</li>
		<li>Prać trzykrotnie w rosnących i malejących stężeniach acetonu/dH2O (30%, 60%, 90%, 60%, 30%) przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłukać trzykrotnie w dH2O i zamontować sekcje w roztworze wodnym. Obraz za pomocą mikroskopu świetlnego wyposażonego w mikroskopię jasnego pola. Niebieskie zabarwienie odpowiada aktywności enzymatycznej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Potrzebne są solidne terapie, aby ograniczyć wpływ wyniszczających stanów związanych ze starzeniem się człowieka, ale pozostają one nieuchwytne w przypadku wielu schorzeń. Aby zidentyfikować potencjalne cele terapeutyczne i opracować strategie interwencji, należy najpierw zrozumieć przyczyny i patologię chorób związanych ze starzeniem się. Nie wszystkie genetycznie zmodyfikowane myszy od razu mają wyraźne fenotypy, które są związane z chorobą będącą przedmiotem zainteresowania, nawet jeśli te geny zostały wcześniej powią...

Choroby związane z wiekiem stają się coraz bardziej powszechne we współczesnym społeczeństwie. Wraz z postępem nauk medycznych i wzrostem średniej długości życia populacja nadal się starzeje, a obciążenie tymi chorobami rośnie. Skuteczne leczenie jest konieczne, aby zmniejszyć wpływ wyniszczających stanów, ale w wielu przypadkach pozostaje nieuchwytne. Tylko dzięki zrozumieniu przyczyn i patologii chorób związanych ze starzeniem się naukowcy mogą zacząć identyfikować potencjalne cele terapeutyczne i opracowywać strategie interwencji. Powszechne schorzenia związane z wiekiem obejmują zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona (PD) i zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD). PD jest najczęstszym zaburzeniem ruchowym spowodowanym neurodegeneracją u ludzi. Większość pacjentów z chorobą Parkinsona wykazuje objawy, takie jak drżenie spoczynkowe, bradykinezja i sztywność po 50 roku życia. Wczesny początek zaobserwowano również w około 10% przypadków.
AMD jest główną przyczyną ślepoty u osób starszych, stopniowo uszkadzając fotoreceptory i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) w oku. Widzenie centralne jest upośledzone, ale widzenie peryferyjne jest na ogół nienaruszone. Istnieją dwie formy AMD. W postaci "suchej" między RPE a błoną Brucha (BM) tworzą się zewnątrzkomórkowe złogi białkowe znane jako druzy, co prowadzi do atrofii geograficznej i rozmycia widzenia centralnego. Cięższa "mokra" postać wynika z neowaskularyzacji od naczyniówki przez BM do warstw RPE i fotoreceptorów i może prowadzić do krwotoku pod siatkówką, który powoduje trwałe uszkodzenie tkanki siatkówki. Badania asocjacyjne całego genomu wcześniej zidentyfikowały loci, które są związane ze zwiększoną podatnością na tę chorobę i zidentyfikowały dwa obszary zainteresowania: czynnik dopełniacza H (CFH) na chromosomie 1 i locus 10q26,gdzie zlokalizowane są geny podatności na makulopatię związaną z wiekiem 2 (ARMS2) i czynnik wymagający wysokiej temperatury A1 (HtrA1). Kombinacje tych alleli zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia AMD w sposób zależny od dawki, a określone SNP mogą być preferencyjnie związane z mokrymi lub suchymi postaciami AMD3-6.
CFH działa jako negatywny regulator alternatywnego szlaku (AP) układu dopełniacza, hamując aktywację C3. Polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) został powiązany ze zwiększonym ryzykiem AMD, powodując wymianę tyrozyny 402 w eksonie 9 z histydyną w wyniku podstawienia T do C1. W AMD uważa się, że AP jest nieprawidłowo regulowany z powodu utraty funkcji CFH, ale nie jest jasne, czy SNP odgrywa rolę przyczynową. Jedna z hipotez głosi, że dodatnio naładowana histydyna neguje zdolność CFH do wiązania się z oddziałującymi białkami, białkiem C-reaktywnym i siarczanemheparyny 1,7. Badania in vitro CFH Y402H dostarczają sprzecznych wyników dotyczących różnic funkcjonalnych między wariantami, a prace in vivo na myszach Cfh-/- wykazujących ekspresję humanizowanego CFH są w toku8. ARMS2 znajduje się przed HtrA1 w genomie naczelnych, chociaż gen ten jest nieobecny u myszy. HtrA1 jest proteazą serynową, ale ARMS2 jest słabo scharakteryzowany. Brak równowagi sprzężeń między SNP w locus związanym z AMD utrudnia określenie wkładu w ryzyko indywidualnych mutacji genów w tym regionie, ale ostatnie prace sugerują, że to nadekspresja HtrA1, a nie ARMS2, prowadzi do neowaskularyzacji i subsiatkówkowych złogów białkowych9-11. Jednak bliskie sąsiedztwo genów w tym locus może pozwolić na interakcje, których nie można zbadać przy użyciu losowo wstawionych transgenów.
Oprócz AMD, rodzina proteaz serynowych HtrA jest związana z wieloma chorobami ludzkimi. Wszystkie białka HtrA zawierają domenę proteazy seryny, po której następuje co najmniej jedna C-końcowa domena PDZ. HtrA1, HtrA3 i HtrA4 mają największą homologię, składającą się z peptydu sygnałowego, domeny wiążącej insulinopodobny czynnik wzrostu, domeny inhibitora proteazy Kazala, domeny proteazy serynowej i domeny PDZ. HtrA2 ma inny N-koniec, składający się z sekwencji lokalizacji mitochondrialnej, domeny transbłonowej i domeny wiążącej inhibitor apoptozy, a następnie domen proteazy i PDZ12-16. HtrA1 ssaków jest regulowany przez indukowaną substratem przebudowę w miejscu aktywnym domeny proteazy17-20, a HtrA2 może być również modulowany przez interakcję między proteazą serynową a domenami PDZ, która hamuje aktywność proteazy21. Co ciekawe, wydaje się, aby domena PDZ nie zapewniała podobnej regulacji do HtrA316. Proteazy HtrA mogą być również regulowane przez czynniki zewnętrzne: niedawno wykazano, że istnieje interakcja regulacyjna między HtrA1 a protoporfirynami22, a HtrA2 może być regulowana przez fosforylację po aktywacji szlaku kinazy p38 MAP w sposób zależny od PINK123. Delecja poszczególnych członków rodziny HtrA u myszy została udokumentowana, jednak efekty mechanistyczne są w większości niejasne, częściowo z powodu braku widocznych fenotypów.
HtrA1 odgrywa ważną rolę w kontroli jakości białek, a jego nieprawidłowa regulacja lub mutacja jest związana z wieloma różnymi chorobami ludzkimi, w tym zapaleniem stawów, rakiem i zwiększonym ryzykiem AMD3,4,24-32. Utrata funkcji HtrA2 w tkankach nerwowych jest związana z fenotypami PD u ludzi i myszy, podczas gdy jej utrata z tkanek nienerwowych powoduje przyspieszone starzeniesię 33-37. Rozregulowanie HtrA3 jest związane z chorobami, w tym stanem przedrzucawkowym i niektórymi typami raka38,39. Regulację w górę HtrA4 zaobserwowano w łożyskach pacjentów ze stanem przedrzucawkowym, ale myszy z nokautem nie wykazują jawnego fenotypu40,41. Postuluje się, że brak fenotypów obserwowany u niektórych myszy z nokautem jest wynikiem kompensacji między członkiem rodziny HtrA: uważa się, że zarówno HtrA4, jak i HtrA1 oddziałują z rodziną białek TGF-B, umożliwiając kompensację przez HtrA1 po delecji HtrA441. Podobnie, uważa się, że ponieważ HtrA1 i HtrA3 mają wysoki stopień homologii domenowej, mogą mieć funkcje komplementarne42. Zasugerowano jednak, że białka HtrA mogą odgrywać częściowo antagonistyczne role, konkurując o regulację wspólnych celów43.
Aby dokładniej zbadać te czynniki ryzyka, wygenerowano trzy humanizowane linie myszy knock-in. W Cfhtm1(CFH*9)jhoh i Cfhtm2(CFH*9)jhoh ekson 9 genu Cfh jest zastąpiony eksonem 9 homologu ludzkiego. Cfhtm1(CFH*9)jhoh koduje niezwiązaną z chorobą resztę tyrozyny w pozycji 402, podczas gdy Cfhtm2(CFH*9)jhoh przenosi Y402H, SNP związane z ryzykiem. W ARMS2tm1jhoh ludzka sekwencja ARMS2 została ukierunkowana na region powyżej HtrA1. Sekwencja STOP po bokach loxP umieszczona przed sekwencją genu, ale za dołączonym promotorem UbiC, została wycięta przez skrzyżowanie z myszami OzCre, które eksprymują rekombinazę Cre pod kontrolą promotora Rosa26, jak opisano wcześniej34. Oprócz tych linii knock-in wygenerowano allele warunkowego nokautu dla Cfh i HtrA1 (Cfhtm1jhoh i HtrA1tm1jhoh), a także innych znanych członków rodziny HtrA: HtrA2 (HtrA2tm1jhoh), HtrA3 (HtrA3tm1jhoh) i HtrA4 (HtrA4tm1jhoh). Nokaity linii zarodkowej powstały przez skrzyżowanie myszy OzCre ze zwierzętami zmodyfikowanymi do flankowania określonych eksonów miejscami loxP, tak że delecja powoduje przesunięcie ramki i / lub delecję domeny aktywnej (Cfh; ekson 3, HtrA1; eksony 2-3, HtrA2: eksony 2-4, HtrA3; ekson 3, HtrA4; eksony 4-6)34,41. Neuronalna delecja HtrA2, usunięta za pomocą rekombinazy Cre pod kontrolą promotora Nestin (HtrA2 flox; Tg(Nes-cre)1Kln/J), opisano również34. Tylko myszy pozbawione HtrA2, zarówno ogólnoustrojowo, jak i w tkankach nerwowych, wykazywały wyraźne fenotypy, prezentując fenotypy parkinsonowskie.
Ponieważ zakłada się, że niektóre z tych interesujących genów są zlokalizowane w mitochondriach11,44-47, a delecja fenotypów Parkinsona generowanych przez HtrA2, opisano tutaj schemat fenotypowania z mitochondrialnym i neurologicznym ogniskiem, a także przedstawiono reprezentatywne wyniki interesujących testów. W celu zbadania genetycznie zmodyfikowanych myszy wyprodukowanych w celu dokładnego i systematycznego zbadania ludzkich chorób związanych z wiekiem ustalono wstępny harmonogram fenotypowania, składający się z serii testów związanych z dwiema głównymi chorobami będącymi przedmiotem zainteresowania: AMD i chorobą Parkinsona.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Decon (Fisher Scientific)</td><td>435541</td><td></td></tr><tr><td>Rurka stożkowa 50 ml</td><td>Waciki Fisher Scientific</td><td>1443222</td><td></td></tr><tr><td>Mata grzewcza</td><td></td> Walmart Sunbeam <td></td> 0000756-500-000 <td></td></tr><tr><td>Tacka do przechowywania (tacka na kostki lodu)</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Elektroniczny stoper GOGO PC396 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pudełko z pleksi</td><td>zbudowane w warsztacie</td><td></td><td>12" na 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera Vixia HF R400</td><td>Canon</td><td>8155B004</td><td></td></tr><tr><td>9 uncji przezroczystych kubków</td><td>Walmart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/4 cala siatka druciana</td><td>Home Depot</td><td>204331884 (online) / 554219 (w sklepie)</td><td>12" na 12"&nbsp;</td></tr><tr><td>Folia bąbelkowa</td><td>VWR</td><td>470092-416</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki proste do próbek</td><td>VWR</td><td>82027-438</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne z cienką końcówką</td><td>VWR</td><td>82027-408</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu 16%</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami pH 7,4</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072-04000</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>JT Baker</td><td>4072-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwienia hematoksyliny</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>353016</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwników eozyny y</td><td>Fisher Scientific (Ricca)</td><td>2845-32</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02000-01000</td><td></td></tr><tr><td>Dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowej</td><td>Sigma</td><td>N8129</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazolium Niebieski chlorek</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>JT Baker</td><td>9006-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodu fosforan jednozasadowy</td><td>jednowodny Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny</td><td>Sigma</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount wodne podłoże montażowe</td><td>Vector Labs</td><td>H-5501-60</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-M</td><td>60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop AxioImager A1</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statyw do kamery wideo</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optymalna temperatura cięcia (OCT)</td><td>Fischer Scientific</td><td>23730571</td><td></td></tr><tr><td>Sekcja kriostatu&nbsp; Maszyna</td><td>Leica&nbsp;</td><td>CM1900</td><td>Wycofany z produkcji, ale od tego czasu zastąpiony przez CM1950</td></tr></tbody></table>

schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się

A Phenotyping Regimen for Genetically Modified Mice Used to Study Genes Implicated in Human Diseases of Aging

Choroby związane z wiekiem stają się coraz bardziej powszechne, a obciążenie rośnie wraz ze starzeniem się naszej populacji. Skuteczne leczenie jest konieczne, aby zmniejszyć wpływ wyniszczających stanów, ale w wielu przypadkach pozostaje nieuchwytne. Tylko dzięki zrozumieniu przyczyn i patologii chorób związanych ze starzeniem się, naukowcy mogą zacząć identyfikować potencjalne cele terapeutyczne i opracowywać strategie interwencji. Najczęstszymi schorzeniami związanymi z wiekiem są zaburzenia neurodegeneracyjne, takie jak choroba Parkinsona i ślepota. Zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD) jest główną przyczyną ślepoty u osób starszych. Badania asocjacyjne całego genomu wcześniej zidentyfikowały loci, które są związane ze zwiększoną podatnością na tę chorobę i zidentyfikowały dwa obszary zainteresowania: czynnik dopełniacza H (CFH) i locus 10q26, w którym znajdują się geny podatności na makulopatię związaną z wiekiem 2 (ARMS2) i czynnik wymagający wysokiej temperatury A1 (HtrA1). CFH działa jako ujemny regulator alternatywnego szlaku (AP) układu dopełniacza, podczas gdy HtrA1 jest zewnątrzkomórkową proteazą serynową. ARMS2 znajduje się przed HtrA1 w genomie naczelnych, chociaż gen ten jest nieobecny u myszy. Aby zbadać wpływ tych genów, wygenerowano humanizowane mysie linie knock-in Cfh i ARMS2, nokauty Cfh, HtrA1, HtrA2, HtrA3 i HtrA4, a także warunkową neuronalną delecję HtrA2. Spośród wszystkich genetycznie zmodyfikowanych myszy, tylko myszy pozbawione HtrA2, zarówno ogólnoustrojowo, jak i w tkankach nerwowych, wykazywały wyraźne fenotypy. W celu dokładnego i systematycznego zbadania tych myszy ustalono wstępny harmonogram fenotypowania, składający się z serii testów związanych z dwiema głównymi chorobami będącymi przedmiotem zainteresowania: AMD i chorobą Parkinsona. Genetycznie zmodyfikowane myszy można poddać odpowiednim eksperymentom w celu zidentyfikowania fenotypów, które mogą być związane z powiązanymi chorobami u ludzi. Przedstawiono tutaj schemat fenotypowania z naciskiem na mitochondria wraz z reprezentatywnymi wynikami z interesujących nas testów.

W tej sekcji opisano przykłady wyników możliwych do uzyskania przy użyciu tych metod. W teście kończyn tylnych liczba prób pociągnięcia oraz czas do upadku są sumowane z dwóch kolejnych testów dla każdego dnia. Test ten można wykorzystać do porównania grup różniących się genetycznie w celu wyłonienia myszy o obniżonej sile nerwowo-mięśniowej. Myszy HtrA2tm1jhoh (HTRA2 KO) na Rysunku 1A-B nie wykazują zmian w liczbie pociągnięć i czasie...

Przedstawiono podejście genetyki odwrotnej do zrozumienia rodzin genów związanych z chorobami ludzkimi, używając myszy jako systemu modelowego, a następnie opisano harmonogram fenotypowania myszy. Ponieważ myszy z wadami genu HtrA2 wykazywały objawy parkinsonowskie, schemat fenotypowania koncentruje się na identyfikacji wad neurologicznych.

Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się

Age-related diseases are becoming increasingly prevalent and the burden continues to grow as our population ages. Effective treatments are necessary to ...

Ogólnym celem tego schematu testowego jest ustanowienie serii prostych testów, które mogą służyć jako wstępny potok fenotypowania, kierujący późniejsze szczegółowe badania nad fenotypami behawioralnymi oraz strukturą i funkcją tkanek. Pozwala to ocenić, czy fenotypy behawioralne i komórkowe ludzkich chorób są odwzorowane w modelu mysim. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przeprowadzenia testów w laboratoriach bez wcześniejszego doświadczenia w tego typu eksperymentach, bez konieczności znaczących inwestycji, a jednocześnie z uzyskaniem informacji niezbędnych do dalszych, szczegółowych badań.Test kończyn tylnych przeprowadza się codziennie od czwartego do dziesiątego dnia po urodzeniu w celu oceny siły, osłabienia i zmęczenia proksymalnych mięśni kończyn tylnych. Na początku należy pozwolić myszom na aklimatyzację w obszarze testowym przez 30 minut. W tym czasie należy przygotować nową probówkę stożkową o pojemności 500 ml, płucząc ją 70% etanolem, a następnie wpychając jedną lub dwie kulki waty na dno probówki.Ustabilizuj tę probówkę w pozycji pionowej na czas testu. Poza czasem przeprowadzania testów trzymaj szczenięta przy matce, aby utrzymać ich temperaturę ciała. Po półgodzinnej aklimatyzacji wyjmij szczenię z klatki i zmierz jego masę ciała.Następnie delikatnie zawieś noworodka za tylne kończyny nad krawędzią probówki, tak aby szczenię było zwrócone w stronę waty. Następnie policz liczbę prób pociągnięcia wykonanych przez szczenię i zmierz czas do jego upadku. Po odczekaniu 30 sekund powtórz test.Po drugim teście oznacz szczenię markerem. Następnie delikatnie przetrzyj szczenię ściółką z klatki macierzystej i zwróć je matce. Ponieważ starsze szczenięta P8 nie mogą być oznakowane markerem, zidentyfikuj je poprzez przycięcie palca u stopy.Przed przejściem do następnego szczenięcia, przemyj probówkę 70% ethanol. Przeprowadzaj test obserwacyjny odsadzonych młodych (Weanling Observation Test) codziennie od P19 do P21, aby ocenić ruch i ogólny poziom aktywności. Rozpocznij od umożliwienia myszom aklimatyzacji w obszarze testowym przez 30 minut.Podczas gdy szczenięta aklimatyzują się, przygotuj arenę. Na pleksiglasowej skrzynce testowej wyznacz siatkę o wymiarach sześć na sześć kwadratów o boku dwóch cali. Przed użyciem skrzynkę należy oczyścić 70% etanolem.Następnie ustaw kamerę wideo tak, aby widok z boku całego pudełka wypełniał pole widzenia. Ujednolicenie wyglądu otoczenia pozwoli uniknąć wprowadzania nowych bodźców. Przed testem przenieś odsadzone zwierzę do czystego kubka przechowawczego i zmierz jego masę ciała.Następnie rozpoczęto nagrywanie wideo. Najpierw sfilmowano kartę identyfikacyjną z numerem identyfikacyjnym myszy, jej wiekiem i bieżącą datą. Następnie przeniesiono mysz z kubka transportowego do kwadratu centralnego.Przez trzy minuty licz liczbę linii przekroczonych przez obie przednie łapy. Po trzech minutach umieść mysz z powrotem w czystej klatce i zakończ nagrywanie wideo. Między każdym testem przemyj pudełko 70% ethanolem.Na podstawie nagrań wideo policz zdarzenia wznoszenia się (rearing), czyli sytuacje, w których mysz stoi na tylnych łapach, a obie przednie łapy nie mają kontaktu z podłożem. Policz również zdarzenia pielęgnacyjne (grooming), które występują, gdy obie przednie łapy są zaangażowane w czyszczenie ciała. W celu oceny siły nerwowo-mięśniowej przeprowadź test siły chwytu (Grip Strength Test) w dniach naprzemiennych między P22 a P26.Jak zwykle, należy dać myszom 30 minut na adaptację do obszaru testowego. Aparatura testowa składa się z pleksiglasowej skrzynki z siatką. Oba elementy należy oczyścić 70% ethanol.Następnie wyłóż dno pudełka warstwą folii bąbelkowej w celu amortyzacji, a folię bąbelkową przykryj papierem, aby absorbował wydzieliny. Przystąp do rozdzielenia myszy testowych i umieść je w oddzielnych kubkach. Teraz połóż pierwszą mysz na środku drucianej siatki i powoli odwróć siatkę na wysokość od 10 do 20 centymetrów nad miękką powierzchnią pudełka.Pomiar czasu do spadnięcia lub zakończenie testu po 60 sekundach, jeśli mysz nie spadnie. Następnie należy umieścić pierwszą mysz z powrotem w kubku z holdingiem. Pomiędzy testami należy przetrzeć siatkę 70% etanolem i wymienić papier na folii bąbelkowej.Następnie przeprowadź test na dwóch pozostałych myszach w grupie. Po przetestowaniu każdej myszy powtórz ten proces dwukrotnie, aby uzyskać trzy próby na mysz. Jeśli w grupie znajduje się mniej niż trzy myszy, należy zapewnić czas regeneracji między próbami wynoszący co najmniej pięć minut.W celu wykonania barwienia na dehydrogenazę NADH należy zmieszać równe objętości świeżo przygotowanego roztworu NADH oraz świeżo przygotowanego roztworu NBT. Następnie nanieść jeden mililitr roztworu barwiącego na każdy preparat i inkubować je w wilgotnej komorze w temperaturze 37°C przez 30 minut. Do barwienia na dehydrogenazę bursztynianową należy przygotować roztwór zawierający 0,1 M bursztynianu sodu, 1,25 M NBT oraz 0,2 M buforu fosforanowego.Następnie nanieś jeden mililitr na każdy preparat. Umieść preparaty w komorze wilgotnej i inkubuj w temperaturze 37 °C przez godzinę. Po inkubacji z odpowiednim barwnikiem odessaj roztwór barwiący i przemyj preparaty trzykrotnie wodą destylowaną.Następnie przemyj preparaty w serii kąpieli w acetonie o rosnącym i malejącym stężeniu. Dla każdego stężenia acetonu wykonaj trzy płukania, trwające po dwie minuty każde. Na koniec przepłucz preparaty trzykrotnie w wodzie destylowanej.Następnie preparaty na szkiełkach należy zamontować w medium wodnym. Myszy bez ekspresji HTRA2 zbadano przy użyciu opisanego zestawu testów i porównano z kontrolnymi myszami z tego samego miotu. Między P4 a P6 nie zaobserwowano zmian w liczbie pociągnięć ani w czasie do upadku. Między P7 a P10 odnotowano spadek siły nerwowo-mięśniowej.W teście aktywności odnotowano obniżoną aktywność u myszy z knockoutem HTRA2. Myszy z knockoutem HTRA2 wykazały również spadek siły w teście chwytu na siatce drucianej. Barwienie H&amp;E wykazało, że u myszy z knockoutem HTRA2 nie wystąpiły wyraźne zmiany w strukturze siatkówki w porównaniu z grupą kontrolną w dniu P35.Na koniec, w celu zidentyfikowania zmian w funkcjach enzymów oddechowych, zastosowano barwienie histochemiczne aktywności kompleksów łańcucha transportu elektronów. U myszy z nokautem HTRA2 odnotowano zmniejszenie intensywności barwienia w porównaniu z grupą kontrolną. Zjawisko to zaobserwowano w móżdżku i prążkowiu, ale nie w korze mózgowej.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak oceniać aktywność i siłę nerwowo-mięśniową u myszy modyfikowanych genetycznie, a także jak łączyć te badania z analizami na poziomie komórkowym. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-phenotyping-regimen-for-genetically-modified-mice-used-to-study

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten manuskrypt opisuje protokół Morrisa wodnego labiryntu (MWM) dostosowany do użycia z powszechnie używanym mysim modelem choroby Alzheimera. MWM jest szeroko stosowany w transgenicznych modelach myszy. Implementacja procedury wrażliwej na odkształcenie tła modelu myszy jest niezbędna do wykrywania różnic grupowych.

Test labiryntu wodnego Morrisa: optymalizacja pod kątem obciążenia myszy i środowiska testowego

Odporność na stres jest jedną z cech charakterystycznych długowieczności i jest znana z tego, że jest genetycznie uwarunkowana. W tym miejscu opracowaliśmy bezstronną, wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych w poszukiwaniu mutacji, które nadają odporność na stres w komórkach ES, za pomocą której opracowaliśmy modele mysie do badań nad długowiecznością.

Zaawansowane podejście genetyczne do odkrycia genów odporności na stres u myszy — wysokoprzepustowe badanie przesiewowe w komórkach ES

Ten protokół wideo opisuje czułą, niezawodną i szybką metodę oceny deficytów nerwowo-mięśniowych w transgenicznym mysim modelu stwardnienia zanikowego bocznego.

Szybki fenotypowy system punktacji neurologicznej do oceny postępu choroby w mysim modelu SOD1-G93A ALS

Ten artykuł opisuje protokół oceny funkcji poznawczych dla modeli genetycznych choroby Alzheimera przy użyciu systemu IntelliCage, który jest wysokowydajnym zautomatyzowanym systemem monitorowania zachowań z warunkowaniem instrumentalnym.

Zautomatyzowany, długoterminowy test behawioralny funkcji poznawczych w wielu modelach genetycznych choroby Alzheimera z wykorzystaniem IntelliCage

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Protokół przedstawia proces obrazowania i obliczeniowy do wyodrębniania i weryfikacji chromatyny oraz epigenetycznego wieku (ImAge) opartego na obrazowaniu.

Pomiar starzenia pojedynczych komórek za pomocą biomarkera chromatyny i epigenetycznego starzenia się opartego na obrazowaniu

Procedura chirurgiczna stosowana w celu wywołania eksperymentalnego zawału mięśnia sercowego u myszy rozpoczyna się od lewej torakotomii między trzecim a czwartym żebrem, aby umożliwić wizualizację przedniej powierzchni serca i lewego płuca. Następnie podwiązuje się lewą tętnicę wieńcową, zamyka klatkę piersiową i pozostawia mysz do samoistnego powrotu do sprawności.

Zmodyfikowana technika ligacji tętnicy wieńcowej u myszy

Zespół słabości jest często obserwowany u osób starszych i odzwierciedla wieloukładowe zmiany fizjologiczne. Jednak przy zmniejszonej rezerwie funkcjonalnej i odporności wiadomo również, że słabość jest powszechna w populacji zakażonej wirusem HIV. W badaniu tym przedstawiono łatwy do przeprowadzenia test przesiewowy w celu identyfikacji pacjentów z HIV z zespołem słabości. Po zidentyfikowaniu istotnych składników zespołu słabości klinicyści będą mogli skupić się na poprawie problemu i promować...

Pomiar słabości u osób zakażonych wirusem HIV. Identyfikacja słabych pacjentów jest pierwszym krokiem do poprawy i odwrócenia słabości

Pokazujemy: (1) procedury pobierania próbek śliny u osób starszych z zaburzeniami poznawczymi przez opiekunów rodzinnych w warunkach domowych, (2) procedury pomiaru aktywności stresu za pomocą kortyzolu w ślinie i alfa-amylazy, oraz (3) profile reprezentatywne. Protokoły, które pozwalają naukowcom badać procesy związane ze stresem, pogłębiają naszą wiedzę na temat wrażliwości biologicznej i podatności.

Pobieranie śliny i pomiar kortyzolu i alfa-amylazy w ślinie u osób starszych mieszkających w słabych społecznościach za pośrednictwem opiekunów rodzinnych

Poznaj schemat fenotypowania genetycznie zmodyfikowanych myszy do badania genów związanych z chorobami człowieka. Metoda obejmuje test siły mięśniowej i ocenę aktywności behawioralnej.

Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się (Wideo) | JoVE Journal

Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się

Przeglądaj więcej filmów