Wizualizacja dużych cząsteczek DNA na uwięzi powierzchniowej z peptydem wiążącym DNA z białkiem fluorescencyjnym
23 czerwca 2016
Prezentujemy podejście do wizualizacji dużych cząsteczek DNA wybarwionych peptydem wiążącym fluorescencyjne białko (FP-DBP) na uwięzi na powierzchni glikolu polietylenowego (PEG) i szkła pokrytego awidyną i rozciąganych za pomocą mikroprzepływowych przepływów ścinających.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie wygodnego systemu analizy DNA dla mikroskopu epifluorescencyjnego, do manipulowania pojedynczą cząsteczką DNA na zmodyfikowanych powierzchniach szklanych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wizualizacji DNA. Podczas badania samego DNA, a także białek wiążących DNA i innych małych cząsteczek.
Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwej obserwacji i analizy poruszającego się DNA. Na początek umieść szklane szkiełka nakrywkowe na stojaku z PTFE i zabezpiecz je na miejscu za pomocą kawałka taśmy uszczelniającej gwint PTFE. Po owinięciu szkiełek nakrywkowych pozostaw pięciocentymetrowy kawałek taśmy, który będzie używany do obsługi stojaka podczas procedury czyszczenia.
W dygestorium połącz 350 mililitrów kwasu siarkowego i 150 mililitrów nadtlenku wodoru w jednolitrowej szklanej zlewce, aby uzyskać roztwór do trawienia piranii. Następnie umieść stojak z szkiełkami nakrywkowymi w roztworze. Po dwóch godzinach opróżnij zlewkę i dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną.
Kontynuować płukanie szkiełek nakrywkowych, aż pH wody w zlewce osiągnie neutralne pH. Następnie poddaj sonikację stojaków szkiełek nakrywkowych w zlewce zatykającej wodę przez 30 minut, aby oczyścić i usunąć szklane podłoża. Opróżnij wodę ze zlewki, tuż przed aminozylanizacją. Na początek przygotuj roztwór aminozylanizacji, dodając dwa mililitry alkoksysilanu i 10 mililitrów lodowatego kwasu octowego do 200 mililitrów alkoholu metylowego w czystym, polipropylenowym pojemniku.
Następnie umieść czyste szkiełka nakrywkowe w roztworze. Następnie umieść oczyszczone szkiełka nakrywkowe w przygotowanym roztworze i potrząsaj nimi w temperaturze pokojowej i 100 obr./min przez 30 minut. Następnie sonikować pojemnik z derywatyzowanymi szkiełkami nakrywkowymi przez 15 minut przy mocy 75 watów.
Następnie potrząśnij nimi ponownie w temperaturze pokojowej i 100 obr./min przez co najmniej 30 minut. Po zakończeniu opróżnij roztwór ze zlewki i ostrożnie spłucz szkiełka nakrywkowe trzy razy. Raz alkoholem metylowym i dwa razy alkoholem etylowym.
Po ostatnim płukaniu przechowuj szkiełka nakrywkowe w alkoholu etylowym i zużyj je w ciągu dwóch tygodni. Najpierw przygotuj 10 mililitrów 0,1-molowego roztworu wodorowęglanu sodu i przefiltruj go przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona. Następnie rozpuść dwa miligramy węglanu sukcynimidylu biotyny PEG i 80 miligramów walerianianu sukcynimidylu PEG w 350 mikrolitrach przefiltrowanego roztworu wodorowęglanu sodu.
Chronić roztwór przed światłem za pomocą rurki chroniącej przed światłem. Energicznie wirować probówkę przez 10 sekund, a następnie odwirować ją przy 10 000 x g przez jedną minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Następnie przepłucz szkiełko podstawowe acetonem, a następnie alkoholem etylowym.
Po wypłukaniu pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. Umieść 50 mikrolitrów kropli roztworu PEG na czystym, szklanym szkiełku. Powoli opuść aminosilanizowane szkiełko nakrywkowe na kroplę pod niewielkim kątem, tak aby nie wytwarzać żadnych pęcherzyków powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym.
Następnie umieść szkiełka w równej, ciemnej i nawilżonej komorze na co najmniej trzy godziny do nocy, w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu zamknij resztki roztworu PEG w rurce chroniącej przed światłem i utrzymuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji dokładnie spłucz pegylowane szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną, a następnie przechowuj je w ciemnym i suchym miejscu do czasu ich użycia.
W celu stworzenia komory przepływowej należy umieścić dwustronne, samoprzylepne paski taśmy na akrylowym uchwycie, tak aby była ona ustawiona prostopadle do otworów wlotowych i wylotowych oraz nie zaburzała żadnego z otworów kanału. Następnie przetrzyj taśmę za pomocą końcówki pipety, aby uszczelnić kanały. Następnie umieść PEGylowane szkiełko nakrywkowe, stroną PEGylowaną skierowaną w dół, na górze taśmy, aby utworzyć komory przepływowe.
Aby zapobiec wyciekaniu roztworu, dociśnij górną część szkiełka nakrywkowego do obszaru, w którym umieszczona jest taśma dwustronna. Następnie dodaj szybkoschnący, epoksydowy klej do krawędzi komór, aby zabezpieczyć go na miejscu. Następnie podłącz kawałek rurki o długości 2,5 centymetra do gazoszczelnej strzykawki i uszczelnij złącze klejem epoksydowym.
Następnie podłącz długą, elastyczną rurkę do rurki wychodzącej ze strzykawki. I ponownie uszczelnij złącze klejem epoksydowym. Napełnij rurkę połączoną ze strzykawką wodą dejonizowaną, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
Następnie włóż rurkę do otworu w komorze przepływowej, który jest uszczelniony klejem epoksydowym. I umieść końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów na drugim otworze, który będzie używany jako zbiornik. Ustaw natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 50 mikrolitrów na minutę.
Następnie wlej 20 mikrolitrów roztworu białka awidyny do komory i trzymaj go tam przez 10 minut. Następnie załaduj 20 mikrolitrów biotynylowanych oligodeoksynukleotydów do strzykawki. Wlej go do komory i trzymaj tam przez 10 minut.
Jeśli używana jest transferaza końcowa, pomiń ładowanie oligodeoksynukleotydów. Następnie załaduj 20 mikrolitrów roztworu DNA do strzykawki, wlej go do komory z szybkością 10 mikrolitrów na minutę i trzymaj tam przez 30 minut. Po 30-minutowej inkubacji przemyć komorę przepływową 40 mikrolitrami buforu 1X TE o stężeniu 50 mikrolitrów na minutę.
Po umyciu załaduj komorę 40 mikrolitrami tego samego FP-DBP o stężeniu 80 nano-molowych, w 1X TE.To zobaczyć pełny zakres rozciągliwości cząsteczek DNA, zastosuj różne prędkości przepływu w zależności od użytych długości DNA. Obserwuj DNA pod soczewką obiektywową 60X, używając mikroskopu fluorescencyjnego. Oto film z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiający cząsteczki DNA bakteriofaga lambda, przywiązane do powierzchni, rozciągane przez przepływ po ligacji z biotynylowanymi komplementarnymi oligonukleotydami.
Pod przepływem w pełni wydłużone cząsteczki DNA mierzą 16,5 mikrona długości. Natomiast momkule DNA bakteriofaga T4, wydłużone do długości 56,4 mikrona, znajdują się pod przepływem. To wydłużenie jest odwracalne, a DNA może być wielokrotnie wydłużane i rozluźniane.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać FP-DBP w większej analizie DNA, a także zademonstrować rozciąganie i relaksację polimeru DNA.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę wizualizacji dużych cząsteczek DNA barwionych peptydem wiązania DNA białka fluorescencyjnego (FP-DBP). Technika polega na przymocowywaniu tych cząsteczek na powierzchni szkła pokrytej polietylenoglikolem (PEG) i awidyną oraz rozciąganiu ich za pomocą przepływów ścinających mikrofluidalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wizualizacja DNA
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami
Tło
- Badanie koncentruje się na analizie DNA i białek wiązających DNA.
- Ma na celu poprawę wygody systemów analizy DNA.
- Ta metoda umożliwia obserwację ruchomego DNA.
- Jest zaprojektowana do użycia z mikroskopiami epifluorescencyjnymi.
Cel badania
- Rozwój systemu do manipulacji pojedynczymi cząsteczkami DNA.
- Poprawa wizualizacji DNA i powiązanych białek.
- Ułatwienie analizy dynamiki DNA.
Stosowane metody
- Przygotowanie szkiełek pokrywowych na stojaku PTFE.
- Zabezpieczanie szkieł pokrywowych taśmą uszczelniającą z nici PTFE.
- Procedura czyszczenia zmodyfikowanych powierzchni szklanych.
- Wykorzystanie przepływów ścinających mikrofluidalnych do rozciągania DNA.
Główne wyniki
- Udane przymocowanie dużych cząsteczek DNA na zmodyfikowanych powierzchniach.
- Skuteczna wizualizacja dynamiki DNA przy użyciu barwienia FP-DBP.
- Ulepszona zdolność do analizy ruchomego DNA w czasie rzeczywistym.
- Demonstracja potencjału metody w badaniach DNA.
Wnioski
- Technika oferuje nowatorskie podejście do wizualizacji DNA.
- Dostarcza wglądu w interakcje DNA z białkami wiązającymi.
- Ta metoda może postępować w badaniach w dziedzinie biologii molekularnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct visualization of surface-tethered large DNA molecules using fluorescent protein DNA binding peptides (FP-DBP) enables precise interrogation of DNA-protein interactions at the single-molecule level. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma discovery pipelines. The method enhances predictive confidence for downstream assay development and screening workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of DNA-protein binding events for mechanistic clarification.
- Supports functional validation of DNA-binding targets in a controlled environment.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of molecular interactions relevant to disease pathways.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible platform for preparing validated DNA substrates for high-content assays.
- Enables quantitative measurement of DNA stretching and relaxation under defined conditions.
- Supports standardization and scalability for compound screening targeting DNA-protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling DNA-protein dynamics at the single-molecule level.
- Offers continuity from discovery through preclinical validation for DNA-targeting modalities.
- Reduces biological ambiguity in early-stage risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to assay development and preclinical research, supporting lead identification and target validation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification by visualizing DNA-protein interactions.
- Screening: Delivers assay-ready, surface-tethered DNA substrates with quantitative readouts.
- Analytics: Provides real-time measurement of DNA elongation and relaxation for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights to preclinical model validation when DNA-protein interactions are disease-relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse DNA-binding protein studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes DNA visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by clarifying early-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of DNA-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry, microfluidics, and fluorescence microscopy.
- Demands access to epifluorescent microscopes and microfluidic flow control systems.
- Necessitates cross-team standardization of surface preparation and DNA labeling protocols.
- Adaptation may be needed for different DNA lengths or binding protein classes.
- Surface passivation and non-specific binding reduction are critical for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Cleaning of the Coverslips
1:54
Aminosilanization of the Coverslips
3:01
PEGylation of the Coverslips
4:44
Assembly of the Flow Chamber
6:15
Loading Samples into the Flow Chamber
7:40
Results: Stretched DNA Molecules under Flow
8:22
Conclusion
