Name: Wizualizacja dużych cząsteczek DNA na uwięzi powierzchniowej z peptydem wiążącym DNA z białkiem fluorescencyjnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji dużych cząsteczek DNA na powierzchniach szkła modyfikowanych PEG i awidyną przy użyciu peptydu wiążącego DNA z białkiem fluorescencyjnym. Technika ta umożliwia obserwację rozciągania DNA w strumieniach mikrofluidycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Sogang University Research Grant z 201410036.

1. Biotynylacja DNA
<ol>
	<li>Biotynylacja tępo zakończonego DNA za pomocą transferazy końcowej (TdT) 
	Uwaga: Użyj DNA T4 (166 kbp), które jest DNA o końcu.
	<ol>
		<li>Do mieszaniny reakcyjnej dodać 5 μl 2,5 mM CoCl2, 5 μl 10× buforu reakcyjnego, 0,5 μl 10 mM biotyny-11-dUTP, 0,5 μl transferazy końcowej (10 jednostek) i 0,5 μl DNA T4 (0,5 μg/μl). Uzupełnić do końcowej objętości 50 μl przez dodanie 38,5 μl wody.</li>
		<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godz. 
		Uwaga: Wydłużony czas reakcji może prowadzić do powstania podwójnie uwiązanego DNA, tj. możliwe jest, że biotyny są znakowane na obu końcach.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 5 μl 0,5 M EDTA, pH 8.</li>
		<li>Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Biotynylacja lepkiego zakończonego DNA za pomocą ligazy DNA 
	Uwaga: Użyj λ DNA (48,5 kbp), które jest DNA o lepkim końcu.
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl ligazy DNA T4, 5 μl 10× buforu ligacyjnego, 1 μl 25 ng/μl λ DNA fagowego i dodać 43 μl wody, aby uzyskać końcową objętość 50 μl.</li>
		<li>Przechowywać probówkę w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Funkcjonalizowana derywatyzacja powierzchni
Uwaga: Aby przywiązać koniec cząsteczki DNA do powierzchni szkła, na szkiełku nakrywkowym silanizuje się pierwszorzędową grupę aminową, po której następuje powłoka biotynowo-PEG, jak pokazano na rysunku 1. Ten proces pegylacji jest ważny dla obrazowania pojedynczej cząsteczki DNA, ponieważ może znacznie zmniejszyć losowy szum tworzony przez przyczepienie się niepożądanych cząsteczek do powierzchni.
<ol>
	<li>Piranha Cleaning 
	Uwaga: Roztwory Piranha energicznie reagują z materiałami organicznymi, dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie, przestrzegając odpowiednich wytycznych dotyczących bezpieczeństwa.
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe na stojaku z politetrafluoroetylenu (PTFE) i przytrzymaj je za pomocą taśmy uszczelniającej z gwintem PTFE wzdłuż, połowę na krawędzi powierzchni, a połowę na stojaku. Po owinięciu pozostaw długi kawałek (~ 5 cm) taśmy do przenoszenia stojaka podczas procedury czyszczenia.</li>
		<li>Napełnić szklaną zlewkę o pojemności 1 l 350 mlH2SO4 i 150 mlH2O2w celu przygotowania roztworu piranii w dygestorium. Umieść stojak w roztworze piranii na 2 godziny.</li>
		<li>Opróżnij roztwór piranii ze zlewki i dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe wodą dejonizowaną, aż pH wody w zlewce osiągnie wartość neutralną. Użyj pasków papieru pH.</li>
		<li>Sonikować stojaki szkiełek nakrywkowych w zlewce zawierającej wodę przez 30 minut. Opróżnij wodę ze zlewki tuż przed silanizacją aminokwasów. Użyj 75 W mocy sonikacji do czyszczenia i derywatyzacji szklanych podłoży.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aminozylanizacja na powierzchni szkła
	<ol>
		<li>Dodać 2 ml N-[3-(trimetoksysililo)propylo]etylenodiaminy i 10 ml lodowatego kwasu octowego do 200 ml alkoholu metylowego w czystym pojemniku polipropylenowym w celu przygotowania roztworu aminozylanizacji.</li>
		<li>Oczyszczone szkiełka nakrywkowe umieścić w pojemniku z polipropylenu. Potrząsaj nimi z prędkością 100 obr./min i temperaturą pokojową przez 30 min.</li>
		<li>Sonikować zlewkę z derywatyzowanymi szkiełkami nakrywkowymi przez 15 minut przy 75 W. Potrząsać nimi z prędkością 100 obr./min i w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut.</li>
		<li>Opróżnij roztwór ze zlewki i dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe, raz alkoholem metylowym, a dwa razy alkoholem etylowym. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w alkoholu etylowym i zużyć w ciągu dwóch tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PEGylacja szkiełka nakrywkowego
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml 0,1 M wodorowęglanu sodu (NaHCO3). Przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.</li>
		<li>Rozpuścić 2 mg węglanu biotyny-PEG-sukcynimidylu (biotyna-PEG-SC) i 80 mg walerianianu PEG-sukcynimidylu (mPEG-SVG) w 350 μl NaHCO3. Użyj rurki chroniącej przed światłem.</li>
		<li>Energicznie wirować probówkę przez 10 sekund i odwirowywać ją w temperaturze 10 000 × g przez 1 minutę, aby usunąć pęcherzyki.</li>
		<li>Opłucz szkiełko szklane acetonem, a następnie spłucz alkoholem etylowym. Pozostaw szkiełko do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Umieść kroplę (50 μl) roztworu PEG na czystym szkiełku podstawowym. Delikatnie przykryj kroplę amino silanizowanym szkiełkiem nakrywkowym, nie wytwarzając żadnych pęcherzyków.</li>
		<li>Umieść szkiełka na 3 godziny do nocy w ciemnej, dobrze wypoziomowanej, wilgotnej komorze o temperaturze pokojowej. Użyj pustego uchwytu końcówki pipety jako komory, z wodą na dnie. Zamknąć resztki roztworu PEG w probówce i utrzymywać go w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dokładnie spłucz pegylowane szkiełko nakrywkowe wodą dejonizowaną. Przechowuj go w ciemnym i suchym miejscu do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Montaż komory przepływowej
<ol>
	<li>Wykonaj dziurkowany uchwyt akrylowy, jak na rysunku 2. Upewnij się, że średnica wkładki rurki wynosi 0.762 mm i oznacz jeden otwór jako wlot, a drugi jako wylot (Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść dwustronne paski taśmy klejącej (szerokość 5-6 mm) na akrylowym uchwycie (Rysunek 2), wyrównując prostopadle do otworu wlotowego i wylotowego, nie naruszając żadnych otworów kanałowych. Użyj tych pasków taśmy jako ścian wielokanałowych do wykonania komór. Wyszoruj taśmę za pomocą końcówki do pipety.</li>
	<li>Umieść PEGylowane szkiełko nakrywkowe na górze, aby utworzyć komory przepływowe, stroną PEGylowaną skierowaną w dół.</li>
	<li>Aby zapobiec wyciekaniu roztworu, dociśnij górną część szkiełka nakrywkowego do obszaru, w którym umieszczane są taśmy dwustronne. Dodaj szybkoschnący klej epoksydowy, aby zamknąć krawędzie komory u góry i u dołu (żółty kolor na rysunku 2).</li>
	<li>Podłącz krótki kawałek (2,5 cm) rurki (średnica zewnętrzna, OD, 0,042") do gazoszczelnej strzykawki i uszczelnij złącze klejem epoksydowym.</li>
	<li>Podłącz długą elastyczną rurkę (OD: 0,03") do rurki połączonej ze strzykawką i uszczelnij złącze klejem epoksydowym.</li>
	<li>Napełnij rurkę połączoną ze strzykawką wodą demineralizowaną. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Włóż rurkę do otworu w komorze przepływowej uszczelnionego klejem epoksydowym.</li>
	<li>Umieść żółtą końcówkę (końcówkę 200 μl) na drugim otworze jako zbiornik.</li>
</ol>
4. Ładowanie próbki do komory przepływowej
Uwaga: Neutrawidyna może być zastąpiona innymi białkami awidyny, takimi jak streptawidyna. Wszystkie reakcje można przeprowadzić w temperaturze pokojowej, chyba że jest to wymienione. Pobrać próbkę roztworu w żółtej końcówce i zainstalować końcówkę z roztworem w otworze akrylowego uchwytu (Rysunek 2b).
<ol>
	<li>Ustawić natężenie przepływu pompy strzykawkowej na 50 μl/min. Załadować 20 μl białka awidyny (25 μg/ml w roztworze T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8) i utrzymywać przez 10 minut.</li>
	<li>Załaduj 20 μl biotynylowanych oligodeoksynukleotydów (100 μM w 1× TE) i trzymaj przez 10 minut. Jeśli używana jest transferaza końcowa, pomiń ładowanie oligodeoksynukleotydów.</li>
	<li>Załadować 20 μl roztworu DNA z etapu 1 do komory przepływowej z prędkością przepływu 10 μl/min i przechowywać przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć komorę przepływową 1× TE i załadować 40 μl FP-DBP10 (~80 nM).</li>
	<li>Obserwuj DNA pod mikroskopem fluorescencyjnym z ciągłym przepływem cząsteczek barwiących w 1× TE na soczewce obiektywowej 60X. Użyj lasera półprzewodnikowego 488 nm do wzbudzenia FP(eGFP)-DBP. Aby uzyskać pełną rozciągliwość cząsteczek DNA, zastosuj różne prędkości przepływu w zależności od użytych długości DNA. Na przykład zastosuj 50 μl/min dla 48,5 kbp λ DNA i 100 μl/min dla 166 kb DNA T4.
	<ol>
		<li>W celu recyklingu akrylowego uchwytu namocz zmontowane komory przepływowe w roztworze detergentu do użytku domowego12. Usuń taśmy i żywicę epoksydową żyletką i przetrzyj rękami, aby całkowicie je zdjąć. Odblokuj otwory za pomocą igieł strzykawkowych. Trzymaj uchwyty w wodzie dejonizowanej do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Mechanical+Measurements+of+the+Elasticity+of+Single+DNA-Molecules+by+Using+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads.</a> Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).</li>
<li>Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+imaging+reveals+mechanisms+of+protein+disruption+by+a+DNA+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase.</a> Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).</li>
<li>Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+a+tethered+polymer+in+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamics of a tethered polymer in shear flow.</a> Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).</li>
<li>Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+a+Single+DNA+Molecule+Observed+by+Optical+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy.</a> Science. 264 (5160), 822-826 (1994).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ordered+restriction+endonuclease+maps+of+yeast+artificial+chromosomes+created+by+optical+mapping+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).</li>
<li>Kim, Y., Jo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutravidin+coated+surfaces+for+single+DNA+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis.</a> Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Glazer, A. N., Rye, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+dye-DNA+intercalation+complexes+as+reagents+for+high-sensitivity+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection.</a> Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+binding+fluorescent+proteins+for+the+direct+visualization+of+large+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li>
<li>Roy, R., Hohng, S., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-molecule FRET.</a> Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Prezentujemy tutaj platformę do wizualizacji długich cząsteczek DNA biotynylowanych w celu zakotwiczenia na powierzchniach. Opisaliśmy podejście do cząsteczek DNA uwiązanych na powierzchni pokrytej białkiem awidyny biotynylowaną albuminą surowicy bydlęcej. 6 We wcześniejszym podejściu znaleźliśmy kluczowy problem fotorozszczepienia DNA spowodowany przez barwniki bis-interkalacji, które barwią cząsteczki DNA uwięzione na powierzchni. Ponieważ te stale wzbudzane fluorofory mają wysokie prawdopodobieństwo zaatako...

Wizualizacja dużych cząsteczek DNA uwiązanych na powierzchni szkła lub koralików została wykorzystana do badania interakcji DNA-białko, dynamiki białek na podłożu DNA,1,2 i fizyki polimerów. 3,4 Platforma dla dużych cząsteczek DNA na uwięzi ma kilka wyraźnych zalet w porównaniu z innymi metodami immobilizacji DNA. 5 Po pierwsze, duża cząsteczka DNA uwiązana na powierzchni ma naturalną konformację losowej cewki bez przepływu ścinającego, co jest niezwykle ważne, aby białko wiążące DNA rozpoznało swoje miejsce wiązania. Po drugie, bardzo łatwo jest zmienić środowisko chemiczne wokół cząsteczek DNA, aby wywołać szereg reakcji enzymatycznych w komorze przepływowej. Po trzecie, mikroprzepływowy przepływ ścinający indukuje rozciąganie molekularne DNA do 100% pełnej długości konturu, co jest bardzo trudne do osiągnięcia przy użyciu alternatywnych metod wydłużania DNA, takich jak unieruchomienie powierzchni6 i uwięzienie w nanokanałach. 7 W pełni rozciągnięta cząsteczka DNA dostarcza również informacji o położeniu, które mogą być przydatne do monitorowania ruchów enzymatycznych na mapie genomowej.
Niemniej jednak, podejście do wiązania DNA ma krytyczną wadę polegającą na tym, że barwnik interkalacyjny, taki jak YOYO-1, zazwyczaj powoduje, że cząsteczki DNA na uwięzi są łatwo rozbijane przez światło wzbudzające fluorescencję. Ogólnie rzecz biorąc, duże cząsteczki DNA muszą być barwione barwnikiem fluorescencyjnym w celu wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym. W tym celu stosuje się przede wszystkim barwniki z serii YOYO-1 lub inne TOTO, ponieważ barwniki te fluoryzują tylko wtedy, gdy interkalują dwuniciowe DNA. 8 Wiadomo jednak, że barwnik interkalacyjny bis-powoduje fotorozszczepienie DNA wywołane światłem z powodu interkalacji fluoroforów. 9 Co więcej, fluorescencyjnie barwione cząsteczki DNA uwiązane na powierzchni są bardziej kruche, ponieważ przepływy ścinające mogą wywierać siły niszczące na swobodnie poruszające się cząsteczki DNA. W związku z tym opracowaliśmy FP-DBP jako nowatorski barwnik białkowy barwiący DNA do obrazowania dużych cząsteczek DNA uwięzionych na powierzchni. Zaletą stosowania FP-DBP jest to, że nie powoduje fotorozszczepienia cząsteczek DNA, z którymi się wiąże. 10 Ponadto FP-DBP nie zwiększa długości konturu DNA, podczas gdy barwniki bi-interkalacyjne zwiększają długość konturu o około 33%.
Ta metoda wideo wprowadza eksperymentalne podejście do wiązania dużych cząsteczek DNA z powierzchnią PEG-biotyny. Rysunek 1 ilustruje różne podejścia do wiązania DNA na uwięzi za pomocą i lepkich końców. Tak więc ta metoda barwienia może być stosowana do każdego rodzaju cząsteczki DNA. Rysunek 2 przedstawia schematyczne przedstawienie zespołu komory przepływowej, która może być sterowana przez pompę strzykawkową w celu generowania przepływów ścinających w celu rozciągnięcia cząsteczek DNA, a także załadowania roztworów chemicznych i enzymatycznych. Rysunek 3 przedstawia mikrofotografie w pełni rozciągniętych cząsteczek DNA uwiązanych na powierzchni PEGylowanej11 i wybarwionych FP-DBP.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>1. Biotynylacja DNA</td></tr><tr><td colspan="4">1.1) Biotynylacja końca DNA przy użyciu transferazy końcowej (TdT)</td></tr><tr><td>Terminal Transferaza</td><td>New England Biolabs</td><td>M0315S</td><td>Wyposażony w 10-krotny bufor reakcyjny, 2,5 mM chlorek kobaltu</td></tr><tr><td>Biotin-11-dUTP</td><td>Invitrogen</td><td>R0081</td><td>Biotin-ddNTP jest również dostępny</td></tr><tr><td>T4GT7 Phage DNA</td><td>Nippon Gene</td><td>318-03971</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>EDTA</td></tr><tr><td colspan="4">1.2) Biotynylacja lepkiego końca DNA za pomocą DNA Ligaza</td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S Dostarczany</td><td>z 10x buforem reakcyjnym</td></tr><tr><td>Lambda Phage DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Dostępne również w New England Biolabs</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>2. Funkcjonalizowana derywatyzacja powierzchniowa</td></tr><tr><td colspan="4">2.1) Piranha Cleaning</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0101050</td><td>22 mm x 22 mm, nr 1 Grubość</td></tr><tr><td>stojaka teflonowego</td><td></td><td></td><td>Produkcja na zamówienie</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca gwint PTFE</td><td>Han Yang Chemical Co., Ltd.</td><td>3032292</td><td>Teflon i taśma handlowa</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>S280823</td><td>H2SO4, 95% czystości</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Jin Chemical Co. Ltd.</td><td>H290423</td><td>H2O2, 35% w wodzie</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Daihan Scientific Co. Ltd.</td><td>WUC-A02H</td><td>Stołowa myjka</td></tr><tr> ultradźwiękowa<td colspan="4">2.2) Aminosilanizacja na powierzchni szkła</td></tr><tr><td>N-[3-(Trimethoxysililo)propyl] etylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>104884</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Duksan Chemicals</td><td>414</td><td>99% czystości</td></tr><tr><td>Alkohol metylowy</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>M300318</td> Pojemnik polipropylenowy o <td>czystości 99,9%</td></tr><tr><td>Qorpak</td><td>PLC-04907</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300202</td><td>99,9% czystości</td></tr><tr><td colspan="4">2.3) PEGylacja szkiełka nakrywkowego</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy</td><td>Sartorius</td><td>16534----------K</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SC</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotin-PEG-SC-5000</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-SVG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Jin Chemical Co., Ltd.</td><td>A300129</td> Szkiełka mikroskopowe <td>o czystości 99%</td></tr><tr><td></td><td>Marienfeld-Superior</td><td>1000612</td> <td>~ 76 mm x 26 mm x 1&nbsp; mm</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>3. Montaż komory przepływowej< / mocnego></td></tr><tr><td>akrylowego wspornika</td><td></td><td></td><td>Produkcja na zamówienie</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>3M</td><td></td><td>Przezroczysty typ</td></tr><tr><td>Szybkoschnące</td> rurki polietylenowe <td>epoksydowe 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole-Parmer</td><td>06417-11, 06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Gazoszczelne 250 &micro; l Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>81165</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Pump Systems Inc.</td><td>NE-1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><silny>4. Ładowanie próbki do komory przepływowej</td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-5KG</td><td>Trizma base</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX70</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Camera</td><td>Q Imaging Rolera</td><td>EM-C2</td><td></td></tr><tr><td>Laser na ciele stałym (488&nbsp; nm)</td><td>Oxxius</td><td>LBX488</td><td></td></tr><tr><td>Alconox Alconox</td><td>Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja dużych cząsteczek dna na uwięzi powierzchniowej z peptydem wiążącym dna z białkiem fluorescencyjnym

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Duże cząsteczki DNA uwiązane na funkcjonalizowanej powierzchni szkła zostały wykorzystane w fizyce polimerów i biochemii, szczególnie do badania interakcji między DNA a białkami wiążącymi. W tym miejscu przedstawiamy metodę, która wykorzystuje mikroskopię fluorescencyjną do wizualizacji dużych cząsteczek DNA uwięzionych na powierzchni. Po pierwsze, szkiełka nakrywkowe są biotynylowane i pasywowane przez powlekanie biotynylowanym glikolem polietylenowym, który specyficznie wiąże biotynylowane DNA za pośrednictwem łączników białka awidyny i znacznie zmniejsza niepożądane wiązanie z niespecyficznych interakcji białek lub cząsteczek DNA na powierzchni. Po drugie, cząsteczki DNA są biotynylowane dwiema różnymi metodami, w zależności od ich zakończeń. Tępo zakończone DNA jest znakowane biotynylowanym dUTP na jego końcu hydroksylowym 3' przez końcową transferazę, podczas gdy lepki zakończony DNA jest hybrydyzowany z biotynylowanymi komplementarnymi oligonukleotydami przez ligazę DNA. Wreszcie, mikroprzepływowy przepływ ścinający sprawia, że pojedyncze cząsteczki DNA rozciągają się do pełnej długości konturu po zabarwieniu fluorescencyjnym peptydem wiążącym białko-DNA (FP-DBP).

Rysunek 1 przedstawia dwie różne metody przyłączania DNA w zależności od struktur końcowych cząsteczki DNA. Rysunek 1a ilustruje, w jaki sposób cząsteczki DNA z lepkimi końcami są hibrydyzowane z komplementarnymi oligonukleotydami biotynilowanymi, które są immobilizowane na powierzchni PEG pokrytej awidyną. Rysunek 1b pokazuje dodanie biotynylowanego ddNTP lub dNTP do grupy hydroksylowej 3' DNA z końcem tępym za pomocą transferazy termina...

Prezentujemy podejście do wizualizacji dużych cząsteczek DNA wybarwionych peptydem wiążącym fluorescencyjne białko (FP-DBP) na uwięzi na powierzchni glikolu polietylenowego (PEG) i szkła pokrytego awidyną i rozciąganych za pomocą mikroprzepływowych przepływów ścinających.

Wizualizacja dużych cząsteczek DNA na uwięzi powierzchniowej z peptydem wiążącym DNA z białkiem fluorescencyjnym

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie wygodnego systemu analizy DNA dla mikroskopu epifluorescencyjnego, umożliwiającego manipulowanie pojedynczymi cząsteczkami DNA na zmodyfikowanych powierzchniach szklanych. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wizualizacji DNA, zarówno podczas badania samego DNA, jak i białek wiążących DNA oraz innych małych cząsteczek.Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwej obserwacji i analizy przemieszczającego się DNA. W celu rozpoczęcia należy umieścić szkiełka nakrywki na statywie z PTFE i zabezpieczyć je w miejscu, używając kawałka PTFE taśmy uszczelniającej do gwintów. Po owinięciu szkiełek nakrywek należy pozostawić pięciocentymetrowy odcinek taśmy, który będzie służył do manipulowania statywem podczas procedury czyszczenia.W dygestorium połącz 350 ml kwasu siarkowego i 150 ml nadtlenku wodoru w jednolitrowym zlewce szklanej, aby przygotować roztwór trawiący typu piranha. Następnie umieść statyw z szkiełkami nakrywkowymi w roztworze. Po dwóch godzinach opróżnij zlewkę i dokładnie wypłucz szkiełka wodą dejonizowaną.Kontynuuj płukanie szkiełek podstawowych, aż pH wody w zlewce osiągnie wartość neutralną. Następnie poddaj statiwy ze szkiełkami działaniu ultradźwięków w zlewce z wodą przez 30 minut, aby oczyścić i zfunkcjonalizować podłoża szklane. Tuż przed aminosilanizacją wylej wodę ze zlewki. W celu rozpoczęcia procesu przygotuj roztwór do aminosilanizacji, dodając 2 mL alkoksysilanu oraz 10 mL octu lodowatego do 200 mL alkoholu metylowego w czystym pojemniku z polipropylenu.Następnie umieść czyste szkiełka nakrywkowe w roztworze. Włóż oczyszczone szkiełka do przygotowanego roztworu i wstrząsaj nimi w temperaturze pokojowej przy 100 rpm przez 30 minut. Następnie poddaj naczynie z zderatywowanymi szkiełkami działaniu kąpieli ultradźwiękowej przez 15 minut przy mocy 75 watów.Następnie ponownie wstrząśnij je w temperaturze pokojowej przy 100 rpm przez co najmniej 30 minut. Po zakończeniu wylej roztwór z zlewki i ostrożnie wypłucz szkiełka nakrywki trzy razy: raz metanolem i dwukrotnie etanolem.Po końcowym płukaniu przechowywać szkiełka podstawowe w alkoholu etylowym i wykorzystać je w ciągu dwóch tygodni. Najpierw przygotować 10 mililitrów 0,1 molarno roztworu wodorowęglanu sodu i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy o porach 0,22 mikrona. Następnie rozpuścić dwa miligramy biotyniowanego PEG-karbonianu succinimidylowego oraz 80 miligramów PEG-walerianianu succinimidylowego w 350 mikrolitrach przefiltrowanego roztworu wodorowęglanu sodu.Chronić roztwór przed światłem, używając probówki chroniącej przed światłem. Energicznie mieszać zawartość probówki w wstrząsarze typu vortex przez 10 sekund, a następnie wirować ją przy 10 000 x g przez jedną minutę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Następnie wypłukać szkiełko przedmiotowe acetonem, a potem etanolem.Po wypłukaniu należy pozostawić preparat do całkowitego wyschnięcia na powietrzu. Na czyste szkiełko przedmiotowe nanieść kroplę 50 µL roztworu PEG. Powoli opuścić zaminosilone szkiełko cover-slip na kroplę pod niewielkim kątem, aby nie powstały pęcherzyki powietrza pod szkiełkiem.Następnie umieścić preparaty w poziomowej, ciemnej i nawilżonej komorze na co najmniej trzy godziny lub na noc, w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu procesu pozostały roztwór PEG szczelnie zamknąć w probówce chroniącej przed światłem i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji dokładnie wypłukać pegylowane szkiełka nakrywki wodą dejonizowaną, a następnie przechowywać je w ciemnym i suchym miejscu do momentu użycia.Aby stworzyć komorę przepływową, naklej paski dwustronnej taśmy klejącej na uchwyt akrylowy w taki sposób, aby były one ustawione prostopadle do otworów wlotowych i wylotowych i nie zasłaniały żadnego z otworów kanałów. Następnie, używając końcówki do pipety, dociśnij taśmę, aby uszczelnić kanały. Następnie umieść na górze taśmy pokrywkę z PEG-ylacją, stroną z PEG-ylacją skierowaną w dół, aby utworzyć komory przepływowe.Aby zapobiec wyciekom roztworu, dociśnij górną część szkiełka nakrywki do obszaru, w którym umieszczono taśmę dwustronną. Następnie na krawędziach komór nanieś szybko schnący klej epoksydowy, aby unieruchomić szkiełko. W kolejnym kroku podłącz odcinek rurki o długości 2,5 centymetra do szczelnej strzykawki i uszczelnij połączenie klejem epoksydowym.Następnie podłącz długą, elastyczną rurkę do przewodu wychodzącego ze strzykawki. Ponownie uszczelnij połączenie klejem epoksydowym. Napełnij rurkę połączoną ze strzykawką wodą dejonizowaną, upewniając się, że nie ma w niej pęcherzyków powietrza.Następnie włożyć rurkę do otworu w komorze przepływowej, który jest uszczelniony klejem epoksydowym. W drugi otwór włożyć końcówkę pipety o pojemności 200 µL, która będzie pełnić funkcję zbiornika. Ustawić prędkość przepływu pompy strzykawkowej na 50 µL/min.Następnie wprowadź do komory 20 µL roztworu białka awidyny i pozostaw go tam na 10 minut. Dalej, nabierz do strzykawki 20 µL biotynylowanych oligodeoksynukleotydów. Wprowadź je do komory i pozostaw tam na 10 minut.W przypadku użycia transferazy terminalnej należy pominąć etap ładowania oligodeoksynukleotydów. Następnie należy wprowadzić 20 µL roztworu DNA do strzykawki, przepuścić go przez komorę z prędkością 10 µL/min i pozostawić na 30 minut. Po 30-minutowej inkubacji należy przemyć komorę przepływową 40 µL buforu 1X TE z prędkością 50 µL/min.Po przemyciu należy wprowadzić do komory 40 µL tego samego FP-DBP o stężeniu 80 nM w 1X TE. Aby zaobserwować pełny zakres rozciągania cząsteczek DNA, należy zastosować różne prędkości przepływu, zależnie od długości wykorzystanego DNA. DNA obserwuje się pod obiektywem 60X przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Poniżej znajduje się film z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawiający cząsteczki DNA bakteriofaga lambda, przytwierdzone do powierzchni i rozciągane przez przepływ po ligacji z biotynilowanymi komplementarnymi oligonukleotydami.W warunkach przepływu w pełni wydłużone cząsteczki DNA osiągają długość 16,5 mikrona. W przeciwieństwie do nich, cząsteczki DNA bakteriofaga T4 pod wpływem przepływu ulegają wydłużeniu do 56,4 mikrona. Proces ten jest odwracalny, a DNA może być wielokrotnie rozciągane i rozluźniane.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat wykorzystania FP-DBP w analizie większych fragmentów DNA, a także umiejętność zademonstrowania rozciągania i relaksacji polimeru DNA.

visualization-surface-tethered-large-dna-molecules-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

W niniejszym materiale prezentujemy protokoły przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek na żywych komórkach bakteryjnych, co umożliwia wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych.

Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film opisuje metodę wizualizacji montażu kondensatów białek fuzyjnych na cząsteczkach DNA w określonych loci za pomocą obrazowania pojedynczych cząsteczek. Kondensaty te powstają w wyniku oddziaływań LCD-LCD i LCD-DBD, które pozwalają na rekrutację polimerazy RNA II i zwiększoną transkrypcję genów.

Obrazowanie pojedynczych cząsteczek w celu wizualizacji łączenia kondensatów białek fuzyjnych na zasłonach DNA

Mikroskopia lokalizacyjna aktywowana fotoaktywem (PALM) w połączeniu ze śledzeniem pojedynczych cząsteczek umożliwia bezpośrednią obserwację i kwantyfikację interakcji białko-DNA w żywych komórkach Escherichia coli.

Wizualizacja interakcji białko-DNA w żywych komórkach bakteryjnych za pomocą fotoaktywowanego śledzenia pojedynczych cząsteczek

Tutaj opisujemy oprzyrządowanie i metody wykrywania pojedynczych fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek białka oddziałujących z pojedynczą cząsteczką DNA zawieszoną pomiędzy dwiema optycznie uwięzionymi mikrosferami.

Połączenie manipulacji pojedynczymi cząsteczkami i obrazowania w celu badania interakcji białko-DNA

Zgłoszono platformę jednocząsteczkowych pęsety magnetycznej do manipulowania G-quadruplexami, która pozwala na badanie stabilności i regulacji G4 przez różne białka.

Manipulacja pojedynczymi cząsteczkami G-kwadrupleksów za pomocą pęsety magnetycznej

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Protokół ten demonstruje wykonanie testu pojedyncząłego w celu wizualizacji na żywo rozwijania DNA za pomocą helikazy CMG. Opisuje (1) przygotowanie substratu DNA, (2) oczyszczanie fluorescencyjnie znakowanej helikazy Drosophila melanogaster CMG, (3) przygotowanie komórki przepływowej mikrofluidycznej do mikroskopii całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz (4) test odwijania DNA pojedyncząłą.

Wizualizacja rozwijania DNA w czasie rzeczywistym pojedyncząłą cząsteczką przez helikazę CMG

Poznaj metodę wizualizacji dużych cząsteczek DNA na powierzchniach szkła modyfikowanych PEG i awidyną przy użyciu peptydu wiążącego DNA z białkiem fluorescencyjnym. Technika ta umożliwia obserwację rozciągania DNA w strumieniach mikrofluidycznych.

Wizualizacja dużych cząsteczek DNA na uwięzi powierzchniowej z peptydem wiążącym DNA z białkiem fluorescencyjnym

Przeglądaj więcej filmów