Name: Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania cukrów w napojach za pomocą przenośnego analizatora FRET. Technika ta umożliwia szybką i czułą detekcję maltozy bez kosztownych fluorometrów laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty z Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944) oraz KRIBB Research Initiative Program.

1. Przygotowanie Biosensora
<ol>
	<li>Skonstruuj plazmid pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6, postępując zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem2.</li>
	<li>Zaszczepić 5 ml bulionu Luria (LB) pojedynczą kolonią szczepu Escherichia coli DE3 i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z wytrząsaniem.</li>
	<li>Przenieść 1 ml kultury O/N do kolby o pojemności 500 ml zawierającej 100 ml LB i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie 0,5 (około 3 godziny).</li>
	<li>Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml przez odwirowanie w temperaturze 1 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić szybko osad w każdej probówce z 50 ml lodowatej wody destylowanej (DW) i odwirować przy 1 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić osad w 50 μl lodowatego DW z 10% (v/v) glicerolem, delikatnie mieszając, aż roztwór (ogniwa elektrokompetentne) osiągnie OD600 100.</li>
	<li>Umieścić mieszaninę elektrokompetentnych ogniw (50 μl ogniw o średnicy zewnętrznej600 wynoszącej 100) i 10 ng plazmidu pET21a(+)-CFP-MBP-YFP-His6 w lodowatej kuwecie do elektroporacji w urządzeniu do elektroporacji i elektroporować mieszaninę (18 kV/cm, 25 μF).</li>
	<li>Szybko dodaj 1 ml pożywki SOC do kuwety i delikatnie ponownie zawieś ogniwa, a następnie odzyskuj w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z delikatnym wstrząsaniem w probówce o okrągłym dnie o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Rozprowadzić komórki na płytce LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin.</li>
	<li>Wyizolować pojedynczą kolonię za pomocą pętli i zaszczepić kolonię w 10 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez 12 godzin.</li>
	<li>Dodać 5 ml kultury nasiennej do 500 ml LB zawierającego 100 μg/ml ampicyliny i inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 0,5 mM izopropylu β-d-tiogalaktozydu (IPTG), gdy OD600 osiągnie 0,5 i inkubować kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Odwirować komórki w temperaturze 4 500 × g przez 20 minut (4 °C) i delikatnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu wiążącego (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM PMSF, 0,5 mM EDTA i 1 mM DTT).</li>
	<li>Sonikuj komórki na lodzie za pomocą sześciu 10-sekundowych impulsów o mocy 200-300 W, po każdym impulsie z 10-sekundowym chłodzeniem.</li>
	<li>Odwirować lizat w stężeniu 10 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórkowych. Przenieść supernatant (białko rozpuszczalne) do nowej probówki zbiorczej.</li>
	<li>Aby uzyskać oczyszczanie powinowactwa białek czujnika FRET, należy załadować 4 ml oczyszczonego lizatu komórkowego do kolumny powinowactwa Ni-NTA (objętość 5 ml) i przeprowadzić test chromatograficzny przy użyciu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)18.</li>
	<li>Przemyć kolumnę raz pięcioma objętościami buforu do przemywania I (50 mM buforu fosforanowego, 300 mM chlorku sodu, 10 mM imidazolu, pH 7,0).</li>
	<li>Powtórzyć etap płukania z pięcioma objętościami kolumny buforu do przemywania II (50 mM buforu fosforanowego, 300 mM chlorku sodu, 20 mM imidazolu, pH 7,0).</li>
	<li>Eluować białko czujnika za pomocą pięciu objętości buforu elucyjnego (50 mM buforu fosforanowego, 300 mM chlorku sodu, 500 mM imidazolu, pH 7,0).</li>
	<li>Aby zagęścić i odsolić eluowaną próbkę, należy napełnić koncentrator (wielkość membrany 10 000 MW) do 20 ml próbki i odwirować przez 10 minut przy 3 000 × g. Uzupełnij koncentrator 0,8% solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Powtórz ten krok dwukrotnie, najpierw napełniając koncentrator 20 ml próbki, a następnie ponownie napełniając PBS.</li>
	<li>Odzyskać skoncentrowane i odsolone białko czujnika i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Pomiar zawartości cukru za pomocą analizatora FRET
UWAGA: Szczegóły budowy analizatora FRET zostały opisane w naszej poprzedniej pracy7.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór detencyjny o stężeniu 0,8% PBS zawierający 0,2 μM białek czujnika.</li>
	<li>Włącz analizator FRET. Naciśnij przycisk "UP" przez 2 sekundy, aby skalibrować optymalną temperaturę. Ustaw temperaturę na 53 °C za pomocą przycisków "UP" i "DOWN" i naciśnij przycisk "SET".</li>
	<li>W celu kalibracji naciśnij i przytrzymaj jednocześnie przyciski "UP" i "DOWN" przez 2 sekundy. Upewnij się, że na panelu LED wyświetla się "CALIB" i naciśnij przycisk "SET".</li>
	<li>Umieścić prostokątne naczynie równoległościenne (kuwetę) o średnicy 12,5 × 12,5 × 45 mm (długość × szerokość × wysokość) zawierające tylko bufor PBS w uchwycie kuwety analizatora i nacisnąć przycisk "SET".</li>
	<li>Zastąp kuwetę taką, która zawiera tylko roztwór wykrywający (patrz 2.1) bez cukru (maltoza/sacharoza) i naciśnij przycisk "SET", aby skalibrować linię podstawową.</li>
	<li>Wymień kuwetę na taką, która zawiera roztwór detekcyjny z 10 mM cukru i naciśnij przycisk "SET".</li>
	<li>Aby określić zawartość cukru w próbce napoju, umieść 1 ml próbki napoju w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej i odwiruj przy 16 000 × g przez 1 min. 
	UWAGA: Pomiar fluorescencji oparty na czujniku FRET ma tę zaletę, że nie wymaga specjalnej obróbki wstępnej próbki, ponieważ tylko 1% (v/v) próbki jest uwzględniony w całkowitej objętości. Zalecamy jednak usunięcie wszelkich materiałów, które mogą mieć wpływ na pomiar fluorescencji (np. komórek, nierozpuszczalnych cząstek, lipidów, tłuszczów lub innych materiałów z autofluorescencją). Ponadto, jeśli mocny kwas, mocna zasada, środek czyszczący (detergent) lub środek emulgujący (emulgator) występuje w wysokim stężeniu i może wpływać na właściwości czujnika biologicznego FRET, należy go usunąć za pomocą rozpuszczalnika organicznego lub neutralizatora. Na przykład, gdy tłuszcz mleczny i emulgatory są eliminowane z mrożonych przekąsek, próbki są odwirowywane w probówce do mikrokrów o masie 16 000 × g przez 30 minut, a ciecz między osadem dennym a górną warstwą tłuszczu mlecznego jest ekstrahowana. Następnie dodaje się równą ilość heksanu, a następnie odwirowuje się w stężeniu 15 000 × g przez 30 minut w celu wyeliminowania lipidów.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy (wielkość porów 0,2 μm).</li>
	<li>Umieścić 0,1 ml przefiltrowanej próbki napoju w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej zawierającej 0,9 ml PBS i delikatnie przemieszać. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest prawidłowe rozcieńczenie próbki napoju. W tym przypadku przeprowadzono 1000-krotne rozcieńczenie, tak aby stężenie cukru mieściło się w zakresie dynamicznym urządzenia. Zalecamy wcześniejsze oszacowanie docelowego stężenia cukru poprzez odniesienie do zawartości cukru na etykiecie napoju.</li>
	<li>Dodać 5 μl rozcieńczonej próbki napoju (1%, v/v) do kuwety zawierającej 0,495 ml roztworu wykrywającego.</li>
	<li>Umieścić kuwetę w uchwycie na kuwetę analizatora FRET i podgrzać roztwór próbki do 53 °C.</li>
	<li>Naciśnij przycisk "SET", aby zmierzyć zawartość cukru. 
	Uwaga: Możliwa jest ocena pomiaru FRET za pomocą czytnika płytek z wieloma etykietami lub spektrofotometru fluorescencyjnego wyposażonego w urządzenie Peltiera do kontroli temperatury poprzez odczyt stosunku przy długości fali 488/535 nm7,8. W celu wykrycia sacharozy wykonaj czynności od 1.1 do 2.12 za pomocą czujnika CSY-LH2.</li>
</ol>

<ol><li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+highly+responsive+fluorescence+resonance+energy+transfer+biosensors+for+detection+of+sugar+in+living+Saccharomyces+cerevisiae+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).</li>
<li>Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanded+dynamic+range+of+fluorescent+indicators+for+Ca%282%2B%29+by+circularly+permuted+yellow+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).</li>
<li>Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+glutamate+release+from+neurons+by+genetically+encoded+surface-displayed+FRET+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).</li>
<li>Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+detection+of+protein+interactions+in+surface-supported+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers.</a> Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).</li>
<li>Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+new+fluorescent+probes+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Creating new fluorescent probes for cell biology.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).</li>
<li>Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portable+FRET+analyzer+for+rapid+detection+of+sugar+content%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content.</a> Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).</li>
<li>Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+analyses+at+critical+temperatures+can+magnify+the+signal+intensity+of+FRET-based+sugar+sensors+with+periplasmic+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins.</a> Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).</li>
<li>Hessels, A. M., Merkx, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically-encoded+FRET-based+sensors+for+monitoring+Zn2%2B+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells.</a> Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).</li>
<li>Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+FRET+sensor+for+intracellular+heme%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme.</a> ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).</li>
<li>Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/">https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/</a> (2015).</li>
<li>Rajendran, R., Rayman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+blood+glucose+testing+for+diabetes+care+in+hospitalized+patients%3A+an+evidence-based+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Diabetes+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).</li>
<li>American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf">http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf</a> (2015).</li>
<li>Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+and+signal-transducer+binding+sites+of+the+Escherichia+coli+galactose+chemoreceptor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein.</a> Science. 242, 1290-1295 (1988).</li>
<li>Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-containing+beverage+intake+in+toddlers+and+body+composition+up+to+age+6+years%3A+The+Generation+R+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study.</a> Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).</li>
<li>Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+food%2C+fat+and+sugar+sweetened+beverage+items+are+related+to+children%27s+dietary+energy+density%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density.</a> FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).</li>
<li>Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sweetened+beverage+consumption+is+associated+with+increased+risk+of+stroke+in+women+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men.</a> J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).</li>
<li>Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelkko%2C+S+%22E.+coli+Gene+Expression+Protocols%22">E. coli Gene Expression Protocols</a>. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten umożliwia szybkie i wydajne ilościowe oznaczanie zawartości cukru w próbkach napojów przy użyciu specjalnie zaprojektowanego analizatora FRET7 w temperaturze optymalnej dla czujników FRET. Analizator został zaprojektowany z niedawno opracowanym, niedrogim ultrafioletowym diodą LED o długości fali 405 nm jako źródłem światła oraz dwoma fotodetektorami z fotodiodą krzemową. To urządzenie jest bardziej opłacalne niż inne porównywalne fluorometry. Urządzenie wykazało się wysoką czułością detekcji, szc...

Förster resonance energy transfer (FRET) jest szeroko stosowany jako czujnik biometryczny do wykrywania małych cząsteczek, takich jak cukry, jony wapnia i aminokwasy1-4. Biosensory FRET zawierają białka fluorescencyjne, cyjanowe białka fluorescencyjne (CFP) i żółte białka fluorescencyjne (YFP), które są połączone z obydwoma końcami białek wiążących peryplazmatyczne (PBP). Cukry wiążą się z PBP znajdującymi się w środku czujnika FRET, powodując zmiany strukturalne czujnika, które następnie zmieniają odległość i orientację dipola przejściowego dwóch białek fluorescencyjnych na obu końcach PBP. Zmiana ta umożliwia ilościową analizę zawartości cukru poprzez pomiar stosunku długości fal emisji EYFP (530 nm) i ECFP (480 nm). Ze względu na wysoką czułość, swoistość, zdolność monitorowania w czasie rzeczywistym i szybki czas reakcji biosensorów FRET, czujniki te są szeroko stosowane w zastosowaniach środowiskowych, przemysłowych i medycznych5. Co więcej, pomiar ratiometryczny za pomocą biosensorów FRET ma ważne zalety praktyczne, ponieważ może być stosowany do pomiaru składników w złożonych próbkach biologicznych, w których stężenie czujnika nie może być łatwo kontrolowane, a fluorescencja tła jest zawsze obecna.
Pomimo tych zalet czujników opartych na FRET do wizualizacji ilościowej, małe zmiany strukturalne z niepełnym transferem ruchu domeny do białek fluorescencyjnych wytwarzają z natury słabą intensywność sygnału. Ten słaby sygnał ogranicza zastosowanie czujników opartych na FRET do analizy in vitro lub in vivo 6. W związku z tym większość biosensorów FRET wymaga użycia drogiego i bardzo czułego sprzętu. Wcześniej opracowaliśmy niedrogi i przenośny analizator FRET o możliwościach podobnych do istniejących analizatorów fluorescencji7. W tym urządzeniu jako źródło światła zastosowano niedrogą diodę elektroluminescencyjną ultrafioletową (LED) o długości fali 405 nm w celu wywołania wzbudzenia sygnału fluorescencji, zastępując drogą lampę lub laser. Układ detekcji analizatora skutecznie skupia rozpraszający sygnał fluorescencyjny na dwóch fotodetektorach z fotodiodą krzemową. W nowszym badaniu wykazaliśmy, że optymalizacja temperatury wykrywania przy 50 - 55 °C może znacznie zwiększyć ratiometryczny sygnał FRET8. To specyficzne dla temperatury wzmocnienie sygnału, wraz z wykonanym na zamówienie analizatorem FRET, umożliwia wykorzystanie czujników FRET w bardziej ogólnych zastosowaniach diagnostycznych z szybką i wysoką czułością.
W tym protokole wykazaliśmy ogólną przydatność analizatora FRET w optymalnych warunkach temperatury FRET, określając ilościowo zawartość cukru w dostępnych na rynku napojach. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat działania urządzenia FRET, a także krótki opis przygotowania czujnika i próbki. Przewidujemy, że raport ten przyczyni się do promowania potencjalnego zastosowania przenośnego analizatora w małych środowiskach laboratoryjnych i stworzy podstawę do dalszego rozwoju niedrogiego urządzenia diagnostycznego na miejscu z biosensorami opartymi na FRET.

<table><tbody><tr><td>LB</td><td>BD</td><td>#244620</td><td></td></tr><tr><td>izopropyl &beta;-D-tiogalaktozyd (IPTG)</td><td>Sigma</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Tri-HCl</td><td>Bioneer</td><td>C-9006-1</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bioneer</td><td>C-9007</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Junsei</td><td>19015-0350</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4</td></tr><tr><td>SOC</td><td></td><td></td><td>2% trypton, 0,5% ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Zasób glukozy</td></tr><tr><td>Q</td><td>Amersham Biosciences</td><td>17-1177-01</td><td>6 & razy; 30 mm kolumna chromatografii anionowej&nbsp;</td></tr><tr><td>HisTrap HP1</td><td>Amersham Biosciences</td><td>29-0510-21</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta kwarcowa</td><td>Sigma</td><td>Z802875</td><td></td></tr><tr><td>AK&Auml; KTAFPLC</td><td>Amersham Biosciences</td><td>18-1900-26</td><td>szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC)</td></tr><tr><td>Cary Eclipse</td><td>VarianInc</td><td></td><td>spektrofotometr fluorescencyjny</td></tr><tr><td>VICTOR&nbsp; &nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2030-0050</td><td>wieloetykietowy czytnik płyt<</td></tr><tr><td>i>E. coli JM109 (DE3)</td><td>Promega</td><td></td><td>Electrocompetence</td></tr><tr><td>cells A (napój)</td><td>Korea Yakult Co. (Korea)</td><td>Birak</td><td>Napoje fermentowane</td></tr><tr><td>B (napój)</td><td>Lotte Foods (Korea)</td><td>Epro</td><td>Napój bezalkoholowy</td></tr><tr><td>C (Napój)</td><td>Lotte Foods (Korea)</td><td>Getoray</td><td>Napój sportowy</td></tr></tbody></table>

bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora fret

Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer

Ostatnie ulepszenia w czujnikach transferu energii rezonansu (FRET) Förstera umożliwiły ich wykorzystanie do wykrywania różnych małych cząsteczek, w tym jonów i aminokwasów. Jednak wrodzona słaba intensywność sygnału czujników FRET jest poważnym wyzwaniem, które uniemożliwia ich zastosowanie w różnych dziedzinach i sprawia, że konieczne jest stosowanie drogich, wysokiej klasy fluorometrów. Wcześniej zbudowaliśmy ekonomiczny, wysokowydajny analizator FRET, który może mierzyć stosunek dwóch pasm długości fal emisji (530 i 480 nm) w celu uzyskania wysokiej czułości wykrywania. Niedawno odkryto, że czujniki FRET z bakteryjnymi białkami wiążącymi peryplazmatyczne wykrywają ligandy z maksymalną czułością w krytycznym zakresie temperatur 50 - 55 °C. Niniejszy raport opisuje protokół oceny zawartości cukru w dostępnych na rynku próbkach napojów przy użyciu naszego przenośnego analizatora FRET z czujnikiem FRET specyficznym dla temperatury. Nasze wyniki wykazały, że dodatkowy proces podgrzewania czujnika FRET znacznie zwiększa sygnał współczynnika FRET, aby umożliwić dokładniejszy pomiar zawartości cukru. Wykonany na zamówienie analizator i czujnik FRET zostały z powodzeniem zastosowane do ilościowego określenia zawartości cukru w trzech rodzajach napojów dostępnych na rynku. Przewidujemy, że dalsza redukcja rozmiarów i poprawa wydajności sprzętu ułatwi korzystanie z ręcznych analizatorów w środowiskach, w których nie jest dostępny wysokiej klasy sprzęt.

Aby przeprowadzić analizę ilościową zawartości cukru przy użyciu analizatora FRET, konieczne jest wyznaczenie krzywej dopasowania szacującej stężenie docelowego cukru na podstawie obserwowanego stosunku FRET. Niech r oznacza stosunek natężenia emisji CFP przy 480 nm do natężenia emisji YFP generowanego przy 530 nm (Eq. 1).
<img alt="Równanie dla stosunku intensywności fluorescencji r=I&lt;sub&gt;530nm&lt;/sub&gt;/I&lt;s...

Ten protokół opisuje szybką i bardzo czułą kwantyfikację danych z sensora rezonansu rezonansu (FRET) za pomocą przenośnego analizatora FRET wykonanego na zamówienie. Urządzenie zostało wykorzystane do wykrywania maltozy w krytycznym zakresie temperatur, który maksymalizuje czułość wykrywania, umożliwiając praktyczną i efektywną ocenę zawartości cukru.

Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Recent improvements in F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) sensors have enabled their use to detect various small molecules including ions and ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wykazanie ogólnej przydatności analizatora FRET w optymalnych warunkach poprzez ilościowe oznaczenie zawartości cukru w dostępnych w handlu napojach. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie detekcji i monitorowania małych cząsteczek, takich jak cukier. Główną zaletą tej techniki jest możliwość efektywnego monitorowania świeżego sygnału odpowiedzi na małe cząsteczki bez konieczności stosowania drogich, zaawansowanych fluorometrów.Procedurę zademonstruje dr Han z naszego laboratorium. Najpierw należy przygotować plazmid cyjanowego i żółtego fluorescencyjnego biosensora specyficznego dla maltozy lub sacharozy. Następnie 5 mL pożywki Luria broth należy zaszczepić pojedynczą kolonią E.Coli DE3 i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsowym przez 16 godzin.Następnie przenieś 1 mL hodowli do kolby zawierającej 100 mL LB. Inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsającym, aż gęstość optyczna przy 600 nm wyniesie około 0,5. Odwiruj hodowlę w wirówce przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Szybko resuspenduj osad w 50 mL lodowatej wody destylowanej i ponownie wiruj przez 20 minut.Resuspenduj osad w 50 µL roztworu glicerolu w stężeniu 10% objętościowo w lodowatej wodzie destylowanej. Delikatnie mieszaj zawiesinę aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 100. W lodowatej kuwecie do elektroporacji połącz mieszaninę z 10 ng plazmidu CMY.Przeprowadź elektroporację mieszaniny. W kuwecie resuspenduj komórki w 1 ml pożywki SOC, a następnie przenieś je do probówki o okrągłym dnie o pojemności 15 ml. Pozostaw komórki do regeneracji, delikatnie wstrząsając w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.Wysiać komórki na płytkę z agarem LB z dodatkiem 100 µg/mL ampicyliny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Za pomocą pętli przenieść pojedynczą kolonię do 10 mL LB zawierającego 100 µg/mL ampicyliny.Mieszaninę inkubować w temperaturze 37°C przy jednoczesnym wytrząsaniu przez 12 godzin w celu przygotowania kultury startowej. Przenieść 5 mL kultury startowej do 500 mL pożywki LB z ampicyliną i inkubować komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze wytrząsającym. Po osiągnięciu gęstości optycznej przy 600 nm wartości 0,5, dodać IPTG do uzyskania stężenia końcowego 0,5 mM.Po inkubacji hodowli przez 24 godziny, odwiruj komórki w wirówce przez 20 minut. Ostrożnie usuń nadsącz i resuspenduj osad w pięciu mililitrach buforu wiążącego. Poddaj komórki sonikacji na lodzie przez 10 sekund, a następnie schłodź je przez 10 sekund.Powtórz proces sonikacji i chłodzenia jeszcze pięć razy. Wirowarkuj lizat przez 30 minut. Przenieś nadsącz do drugiej probówki zbiorczej.Oczyść supernatant na kolumnie powinowactwa niklowego NTA. Napełnij koncentrator 10 000 milliwatt 20 mililitrami oczyszczonej próbki. Odwiruj próbkę przez 10 minut, a następnie ponownie napełnij koncentrator 0,8% roztworem soli fizjologicznej w buforze fosforanowym.Powtarzaj ten proces z pozostałą częścią próbki w ten sposób, po 20 mililitrów naraz, aż całe białko zostanie skoncentrowane i odsolone. Przechowuj oczyszczony biosensor FRET w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Przygotuj 0,2 mikromolarny roztwór białka biosensora CMY w 0,8% PBS jako roztwór detekcyjny.Włącz przenośny analizator FRET. Ustaw temperaturę analizy na 53 °C. Następnie przełącz urządzenie w tryb kalibracji.Napełnij kuwetę 0,8% PBS w celu wyznaczenia tła. Podgrzej próbkę do 53 °C w analizatorze, a następnie ustaw tło. Następnie napełnij kuwetę roztworem detekcyjnym.Umieść kuwetę w analizatorze i ustaw linię bazową. Wymień kuwetę na taką zawierającą roztwór detekcyjny i jeden milimol cukru. Ustaw intensywność przy nasyceniu, aby zakończyć kalibrację.Aby rozpocząć przygotowanie próbki napoju do analizy zawartości cukru, należy odwirować 1 ml napoju w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Usunąć nadsącz za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 0,2 µm. Połączyć 0,1 ml filtratu i 0,9 ml 0,8% PBS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml.Delikatnie wymieszaj mieszaninę w wirówce typu vortex, aby zapewnić całkowite rozcieńczenie. Przenieś 5 µL rozcieńczonej próbki napoju oraz 495 µL roztworu detekcyjnego do kuwety. Umieść kuwetę w analizatorze i podgrzej próbkę do 53 °C.Naciśnij przycisk set, aby zmierzyć zawartość cukru w próbce. W tej metodzie wydajność FRET jest mierzona jako stosunek intensywności emisji żółtego białka fluorescencyjnego do cyjanowego białka fluorescencyjnego w biosensorze. Optymalna temperatura pomiaru dla tych biosensorów CMY wynosi od 50 do 55 °C, ponieważ różnica w stosunku intensywności emisji między roztworem kontrolnym a nasyconym roztworem maltozy jest wtedy największa.Biosensor CMY-BII został wykorzystany do oceny zawartości maltozy w trzech napojach w temperaturze 53 stopni. Krzywa zależności odpowiedzi od dawki jest generowana poprzez wyznaczenie tego stosunku dla różnych stężeń maltozy w danej temperaturze. Stosunek emisji jest powiązany ze stężeniem maltozy przy użyciu wartości uzyskanych podczas kalibracji.Zmierzone zawartości maltozy przedstawiono wraz z całkowitą zawartością cukrów podaną przez producentów napojów. Napój A zawierał źródła maltozy, takie jak ryż i jęczmień. Odpowiednio, zaobserwowana ilość maltozy stanowi około połowy całkowitej zgłoszonej zawartości cukru.Napój C, napój sportowy, charakteryzował się bardzo niską zawartością maltozy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy urządzenia i czujników FRET w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat ilościowego oznaczania tak małych cząsteczek za pomocą niestandardowego, przenośnego analizatora FRET.

highly-sensitive-rapid-fluorescence-detection-with-portable-fret

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Mikrofluidyczne platformy kropelkowe są obiecującymi narzędziami do eksperymentów wysokoprzepustowych, ponieważ umożliwiają one niskokosztowe generowanie piko-litrowych, samoczynnie odseparowanych komór z częstotliwością rzędu kHz. Dzięki integracji z szybkimi, czułymi i wysokorozdzielczymi metodami spektroskopii fluorescencyjnej, duże ilości informacji generowanych w tych systemach mogą być efektywnie wydobywane, przetwarzane i wykorzystywane.

Metody detekcji fluorescencyjnej dla mikroprzepływowych platform kroplkowych

Prezentujemy zjawisko FRET pomiędzy sprzężonym polimerem polidiacetylenem (PDA) a fluorophorem przyczepionym do powierzchni liposomów PDA w celu detekcji biomolekuł. Liposomy PDA zawierały na swojej powierzchni cząsteczki receptorowe dla biomolekuł, które służyły jako sondy. Oddziaływania ligand-receptor prowadzą do zmian w efektywności FRET pomiędzy fluorophorem a PDA, co stanowi podstawę mechanizmu detekcji.

Monitorowanie w czasie rzeczywistym oddziaływań ligand-receptor z wykorzystaniem transferu energii rezonansowej fluorescencji

Mikroskopia oparta na transferze energii fluorescencji (FRET) jest potężną techniką monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach z wykorzystaniem różnych biosensorów jako reporterów. W niniejszej pracy opisujemy sposób budowy spersonalizowanego systemu obrazowania FRET w epifluorescencji z komponentów dostępnych w handlu oraz sposób jego wykorzystania w eksperymentach FRET.

Mikroskopia FRET do monitorowania w czasie rzeczywistym zdarzeń sygnalizacyjnych w żywych komórkach przy użyciu unimolekularnych biosensorów

Transfer agregatów białkowych, czyli nasion proteopatycznych z komórki do komórki, może leżeć u podstaw postępu patologii w chorobach neurodegeneracyjnych. W tym miejscu opisano nowatorski test cytometrii przepływowej FRET, który umożliwia specyficzne i czułe wykrywanie aktywności wysiewu z próbek rekombinowanych lub biologicznych.

Czułe wykrywanie proteopatycznej aktywności wysiewu za pomocą cytometrii przepływowej FRET

Wielokolorowa detekcja fluorescencji w mikrofluidyce kropelkowej zazwyczaj obejmuje nieporęczne i złożone systemy detekcji oparte na mikroskopie epifluorescencyjnym. Tutaj opisujemy kompaktowy i modułowy schemat detekcji wielokolorowej, który wykorzystuje szereg światłowodów do czasowego kodowania wielokolorowych danych zebranych przez pojedynczy fotodetektor.

Wielokolorowa detekcja fluorescencji dla mikrofluidyki kropelkowej z wykorzystaniem światłowodów

Czujnik fototermicznego kątowego rozpraszania światła (PT-AS) umożliwia szybkie i wolne od chemikaliów oznaczanie hemoglobiny w próbkach krwi w skali nanolitrów. Tutaj znajdują się szczegółowe informacje na temat konfiguracji PT-AS i protokołu pomiaru stężenia hemoglobiny we krwi. Przedstawiono również reprezentatywne wyniki dla próbek krwi z niedokrwistością.

Szybki i wolny od chemikaliów test hemoglobiny z fototermicznym rozpraszaniem kątowym światła

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Protokoły testów opartych na komórkach rezonansu rezonansu Förstera z rozdzielczością czasową są opisane dla prostej, specyficznej, czułej i solidnej kwantyfikacji endogennych fosforylowanych białek przetwornika sygnału i aktywatora transkrypcji (STAT) 1/3/4/5/6 w lizatach komórkowych w formacie 384-dołkowym.

Czasowo-rozdzielcze rezonansowe testy transferu energii Förstera do pomiaru endogennych fosforylowanych białek STAT w komórkach ludzkich

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Ten protokół opisuje unikalną metodę wykrywania wiązania między związkami a cząsteczkami białka, oferując korzyści w postaci minimalnej utraty próbki białka i wysokiej dokładności danych.

Wykrywanie interakcji białko-baldaszek CD40 za pomocą różnicowej fluorescencji skaningowej

W niniejszej pracy omawiano protokół projektowania i opracowania urządzenia E-Eye-Enable POCT do wykrywania Fe, Cr, As i F w próbkach środowiskowych, próbkach biologicznych oraz żywności i napojach. Przetestowano prawie 2000 próbek, a wyniki odpowiadają standardowej technice.

TD-DFT Guided Advanced E-Eye Sensing Technique do kwantyfikacji na miejscu Fe, Cr, F oraz As w próbkach środowiskowych, biologicznych i spożywczych

Poznaj metodę ilościowego oznaczania cukrów w napojach za pomocą przenośnego analizatora FRET. Technika ta umożliwia szybką i czułą detekcję maltozy bez kosztownych fluorometrów laboratoryjnych.

Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Przeglądaj więcej filmów