Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

Ogólnym celem tego protokołu jest wykazanie ogólnej możliwości zastosowania analizatora FRET w optymalnych warunkach poprzez ilościowe określenie zawartości cukru w dostępnych na rynku napojach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wykrywania i monitorowania małych cząsteczek, takich jak cukier. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona skutecznie monitorować świeży sygnał reagujący na małe cząsteczki bez drogich, wysokiej klasy fluorometrów.

Procedurę zademonstruje dr Han z naszego laboratorium. Najpierw przygotuj specyficzny dla maltozy lub sacharozy cyjan i żółty plazmid fluorescencyjny biosensora. Następnie zaintruj pięć mililitrów bulionu Luria pojedynczą kolonią DE3 E.Coli i inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze wstrząsającym przez 16 godzin.

Następnie umieść jeden milileter kultury w kolbie zawierającej 100 mililitrów LB. Inkubować kolbę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach wyniesie około 0,5. Odwiruj kulturę przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Szybko zawieś osad w 50 mililitrach lodowatej wody destylowanej i ponownie odwiruj przez 20 minut.

Zawiesić osad w 50 mikrolitrach 10-procentowego roztworu glicerolu i lodowatej wody destylowanej. Delikatnie mieszaj mieszaninę, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 100. W lodowatej kuwecie do elektroporacji połącz mieszaninę z 10 nanogramami plazmidu CMY.

Elektroporować mieszaninę. W kuwecie ponownie zawieś komórki w jednym mililecie pożywki SOC, a następnie przenieś je do 15-mililitrowej probówki z okrągłym dnem. Odzyskaj komórki, delikatnie potrząsając w temperaturze 37 stopni przez godzinę.

Rozłóż komórki na płytce agarowej LB ze 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni przez 12 godzin. Za pomocą pętli przenieś pojedynczą kolonię do 10 mililitrów LB zawierających 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny.

Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni, wstrząsając przez 12 godzin, aby stworzyć kulturę nasion. Przenieś pięć mililitrów kultury nasiennej do 500 mililitrów LB z ampicyliną i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni w inkubatorze z wytrząsaniem. Gdy gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,5, dodaj IPTG, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 milimola.

Po inkubacji kultury przez 24 godziny odwirować komórki przez 20 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu wiążącego. Sonikuj komórki na lodzie przez 10 sekund, a następnie schładzaj komórki przez 10 sekund.

Powtórz sonikację i chłodzenie jeszcze pięć razy. Odwirowywać lizat przez 30 minut. Przenieść supernatant do innej probówki zbiorczej.

Oczyść supernatant na kolumnie powinowactwa niklu do NTA. Napełnij koncentrator o mocy 10 000 miliwatów 20 mililitrami oczyszczonej próbki. Odwirować próbkę przez 10 minut, a następnie ponownie napełnić koncentrator 0,8% roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem.

Powtórz ten proces z resztą próbki w ten sposób, po 20 mililitrów na raz, aż całe białko zostanie zagęszczone i odsolone. Przechowuj oczyszczony biosensor FRET w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Przygotuj 0,2 mikromolowy roztwór białka biosensora CMY i 0,8% PBS jako roztwór wykrywający.

Włącz ręczny analizator FRET. Ustaw temperaturę analizy na 53 stopnie Celsjusza. Następnie ustaw przyrząd w tryb kalibracji.

Napełnij kuwetę 0,8% PBS jako tło. Podgrzej próbkę do 53 stopni Celsjusza w analizatorze, a następnie ustaw tło. Następnie napełnij kuwetę roztworem wykrywającym.

Umieść kuwetę w analizatorze i ustaw linię bazową. Zastąp kuwetę jedną zawierającą roztwór wykrywający i jeden cukier milimolowy. Ustaw intensywność przy nasyceniu, aby zakończyć kalibrację.

Aby rozpocząć przygotowywanie próbki napoju do analizy zawartości cukru, za pomocą 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej odwiruj jeden mililitr napoju. Usunąć supernatant za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra i przefiltrować supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mikrometra. Połącz 0,1 mililitra filtratu i 0,9 mililitra 0,8% PBS w 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Delikatnie zmieszaj mieszaninę, aby zapewnić całkowite rozcieńczenie. Umieścić pięć mikrolitrów rozcieńczonej próbki napoju i 495 mikrolitrów roztworu detekcyjnego w kuwecie. Umieść kuwetę w analizatorze i podgrzej próbkę do 53 stopni Celsjusza.

Naciśnij przycisk ustawiania, aby zmierzyć zawartość cukru w próbce. W tej metodzie wydajność FRET mierzy się stosunkiem intensywności emisji białka fluorescencyjnego żółtego do białka fluorescencyjnego cyjanu w biosensorze. Optymalna temperatura pomiaru dla tych biosensorów CMY wynosi od 50 do 55 stopni Celsjusza, ponieważ różnica we stosunku intensywności emisji między roztworem kontrolnym a nasyconym roztworem maltozy jest największa.

Biosensor CMY-BII został wykorzystany do oceny zawartości maltozy w trzech napojach w temperaturze 53 stopni. Krzywa dawka-odpowiedź jest generowana na podstawie uzyskania tego stosunku przy różnych stężeniach maltozy w danej temperaturze. Stosunek emisji jest powiązany ze stężeniem maltozy przy użyciu wartości uzyskanych podczas kalibracji.

Zmierzona zawartość maltozy jest pokazana wraz z całkowitą zawartością cukru podaną przez producentów napojów. Napój A zawierał źródła maltozy, takie jak ryż i jęczmień. Odpowiednio, obserwowana ilość maltozy stanowi około połowy całkowitej zgłoszonej zawartości cukru.

Napój C, napój sportowy, miał bardzo niską zawartość maltozy. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o obsłudze urządzenia i czujników FRET w temperaturze od 50 do 55 stopni Celsjusza. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak określić ilościowo tak małe cząsteczki za pomocą specjalnie wykonanego ręcznego analizatora FRET.