Name: Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę kolorymetryczną do wykrywania cukrów redukujących podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych Clostridium difficile. Protokół umożliwia ilościowe oznaczanie fragmentów kory mózgowej w badaniach mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opisany projekt jest wspierany przez Nagrodę Numer 5R01AI116895 od Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych lub Narodowych Instytutów Zdrowia.

1. Generowanie próbek 
<ol>
	<li>Podgrzewać aktywować zarodniki C. difficile w temperaturze 65 °C przez 30 minut i przechowywać na lodzie. 
	Uwaga: Zarodniki C. difficile mogą być wytwarzane i oczyszczane w sposób opisany wcześniej7,9,10.</li>
	<li>Przygotować roztwór do kiełkowania w temperaturze X + 1 ml, gdzie X jest liczbą próbek, które należy pobrać podczas oznaczania. 
	Uwaga: Roztwór do kiełkowania jest specyficzny dla badanych gatunków zarodników bakterii. Do oznaczania kiełkowania zarodników C. difficile użyliśmy roztworu 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 100 mM glicyny i 10 mM kwasu taurocholowego w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem testu należy pobrać 1,0 ml próbki roztworu do kiełkowania bez zarodników, która posłuży jako ślepa próba do wykrywania fragmentów kory</li>.
	<li>Dodaj zarodniki do OD600 ~3,0 do roztworu do kiełkowania i szybko wiruj. 
	Uwaga: Do naszych badań kiełkowania B. subtilis użyliśmy tych samych zarodników OD600, co w przypadku C. difficile. 
	Uwaga: Ta ilość zarodników dobrze sprawdzała się w monitorowaniu uwalniania fragmentów kory podczas kiełkowania zarodników C. difficile. Ilość zarodników użytych w tym teście powinna być określona doświadczalnie dla każdej bakterii lub szczepu.</li>
	<li>Natychmiast po dodaniu zarodników usunąć próbkę o objętości 1,2 ml i odwirować w temperaturze pokojowej przez 1 minutę w temperaturze 14 000 × g. To jest zerowy punkt czasowy.</li>
	<li>Przenieść 1,0 ml supernatantu z odwirowanej próbki do świeżej probówki w celu późniejszej analizy fragmentów kory. 
	Uwaga: Jeżeli DPA wymaga monitorowania, należy pobrać oddzielną próbkę o objętości 100 μl w celu wykrycia DPA w roztworze przy użyciu testu opartego na fluorescencji terbu9,18,19.</li>
	<li>Pobraną próbkę zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 1.4 i 1.5 w regularnych odstępach czasu, aż wszystkie punkty czasu zostaną ukończone. 
	Uwaga: Ze względu na czas potrzebny na odwirowanie i pobranie próbek, punkty czasowe oddalone od siebie o mniej niż 2 minuty nie były możliwe podczas naszej procedury, więc nasze odstępy między próbkami były raz na 2 minuty przez 14 minut.</li>
	<li>Jako kontrolę pozytywną w celu zmniejszenia wykrywania i oznaczania ilościowego cukrów, należy uwzględnić następujące ilości N-acetyloglukozaminy (nmol): 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 i 5 000. Przygotuj te próbki w tym samym czasie, co próbki kory mózgowej i biegnij razem z próbkami kory mózgowej, tak aby krzywa standardowa była istotna dla danych generowanych przez kiełkujące zarodniki.</li>
	<li>Po pobraniu wszystkich próbek w punktach czasowych liofilizuj próbki. 
	Uwaga: Nasze próbki poddaliśmy liofilizacji w probówkach z nakrętką o pojemności 2 ml.</li>
</ol>
2. Pomiar fragmentów kory mózgowej
<ol>
	<li>Zawiesić liofilizowane próbki w 120 μl 3 N HCl uzupełnionego 1% fenolem i 0,5% β-merkaptoetanolem.</li>
	<li>Przenieść zawieszone próbki do probówek z nakrętką o pojemności 2 ml. 
	Uwaga: Aby zapewnić powtarzalność, upewnij się, że cała liofilizowana próbka została ponownie zawieszona i przeniesiona.</li>
	<li>Próbki inkubować w recyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 95 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Po inkubacji umieścić próbki na lodzie, aż ostygną.</li>
	<li>Zneutralizować próbki za pomocą 120 μl 3 M NaOH.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 80 μl nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i 80 μl 5% roztworu bezwodnika octowego i odwirować.</li>
	<li>Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Przenieść próbki z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 95 °C na DOKŁADNIE 3 minuty 
	Uwaga: Ten krok jest wrażliwy na czas, a dłuższe czasy mogą mieć wpływ na rozwój sygnału podrzędnego.</li>
	<li>Wyjąć próbki z łaźni wodnej i schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Dodać 400 μl 6,54% K2B4O7·4H2O do każdej probówki i wirować.</li>
	<li>Próbki inkubować w recyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 95 °C DOKŁADNIE przez 7 minut 
	Uwaga: Ten krok jest wrażliwy na czas, a dłuższe czasy mogą mieć wpływ na rozwój sygnału podrzędnego.</li>
	<li>Usuń próbki i umieść je na lodzie na 5 minut.</li>
</ol>
3. Odczynnik barwny
<ol>
	<li>Gdy próbki znajdują się na lodzie (krok 2.12), przygotuj odczynnik barwiący. Rozpuścić 0,320 g p-dimetyloaminobenzaldehydu (DMAB; Odczynnik Ehrlicha) w 1,9 ml lodowatego kwasu octowego. 
	Uwaga: Odczynnik jest wrażliwy na czas, temperaturę i światło i nie powinien być wykonywany z wyprzedzeniem.</li>
	<li>Po całkowitym rozpuszczeniu DMAB dodać 100 μl 10 N HCl i odwirować.</li>
	<li>Dodać 5 ml lodowatego kwasu octowego i odwirować.</li>
</ol>
4. Reakcja kolorymetryczna
<ol>
	<li>Przenieś 100 μl każdej schłodzonej próbki kory do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 700 μl świeżo przygotowanego roztworu barwnego.</li>
	<li>Natychmiast przenieść próbki do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować DOKŁADNIE przez 20 minut.</li>
	<li>Przenieść 200 μl każdej próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę.</li>
	<li>Oznacz ilościowo próbki przy długości fali 585 nm na czytniku płytek. Próbki powinny zaczynać się od żółtego koloru, a pozytywna reakcja zmieni się w fioletową. Im więcej kory mózgowej, tym głębszy fioletowy kolor.</li>
</ol>

<ol><li>Al-Hinai, M. A., Jones, S. W., Papoutsakis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+sporulation+programs%3A+diversity+and+preservation+of+endospore+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The Clostridium sporulation programs: diversity and preservation of endospore differentiation.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 79, 19-37 (2015).</li>
<li>Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germination+of+spores+of+Bacillus+species%3A+what+we+know+and+do+not+know%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know.</a> J Bacteriol. 196, 1297-1305 (2014).</li>
<li>Tan, I. S., Ramamurthi, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+formation+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Spore formation in Bacillus subtilis.</a> Environ Microbiol Rep. 6, 212-225 (2014).</li>
<li>Fimlaid, K. A., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+mechanisms+regulate+sporulation+sigma+factor+activity+in+the+Firmicutes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diverse mechanisms regulate sporulation sigma factor activity in the Firmicutes.</a> Curr Opin Microbiol. 24, 88-95 (2015).</li>
<li>Popham, D. L., Helin, J., Costello, C. E., Setlow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+peptidoglycan+structure+of+Bacillus+subtilis+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores.</a> J Bacteriol. 178, 6451-6458 (1996).</li>
<li>Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Foster, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+168+endospore+peptidoglycan+and+its+role+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation.</a> J Bacteriol. 178, 6173-6183 (1996).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salts+and+glycine+as+cogerminants+for+Clostridium+difficile+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Bile salts and glycine as cogerminants for Clostridium difficile spores.</a> J. Bacteriol. 190, 2505-2512 (2008).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Shen, A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+spore+biology%3A+sporulation%2C+germination%2C+and+spore+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile spore biology: sporulation, germination, and spore structural proteins.</a> Trends Microbiol. 22 (7), (2014).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spore+cortex+hydrolysis+precedes+DPA+release+during+Clostridium+difficile+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Spore cortex hydrolysis precedes DPA release during Clostridium difficile spore germination.</a> J Bacteriol. 197 (14), (2015).</li>
<li>Francis, M. B., Allen, C. A., Shrestha, R., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+recognition+by+the+Clostridium+difficile+Germinant+Receptor%2C+CspC%2C+is+important+for+establishing+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Bile acid recognition by the Clostridium difficile Germinant Receptor, CspC, is important for establishing infection.</a> PLoS Pathog. 9, e1003356(2013).</li>
<li>Moir, A., Smith, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+bacterial+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Genetics of bacterial spore germination.</a> Annu. Rev. Microbiol. 44, 531-553 (1990).</li>
<li>Zhang, P., Kong, L., Wang, G., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Raman+tweezers+and+quantitative+differential+interference+contrast+microscopy+for+measurement+of+dynamics+and+heterogeneity+during+the+germination+of+individual+bacterial+spores%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Combination of Raman tweezers and quantitative differential interference contrast microscopy for measurement of dynamics and heterogeneity during the germination of individual bacterial spores.</a> Journal of biomedical optics. 15, 056010(2010).</li>
<li>Ghuysen, J. -M., Tipper, D. J., Strominger, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+that+degrade+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymes that degrade bacterial cell walls.</a> Methods Enzymol. 8, 685-699 (1966).</li>
<li>Park, J. T., Johnson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+submicrodetermination+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A submicrodetermination of glucose.</a> J Biol Chem. 181, 149-151 (1949).</li>
<li>Thompson, J. S., Shockman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modification+of+the+Park+and+Johnson+reducing+sugar+determination+suitable+for+the+assay+of+insoluble+materials%3A+its+application+to+bacterial+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modification of the Park and Johnson reducing sugar determination suitable for the assay of insoluble materials: its application to bacterial cell walls.</a> Anal Biochem. 22, 260-268 (1968).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Setlow, P., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SleC+is+essential+for+cortex+peptidoglycan+hydrolysis+during+germination+of+spores+of+the+pathogenic+bacterium+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SleC is essential for cortex peptidoglycan hydrolysis during germination of spores of the pathogenic bacterium Clostridium perfringens.</a> J Bacteriol. 191, 2711-2720 (2009).</li>
<li>Paredes-Sabja, D., Sarker, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cortex-lytic+enzyme+SleC+from+non-food-borne+Clostridium+perfringens+on+the+germination+properties+of+SleC-lacking+spores+of+a+food+poisoning+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Effect of the cortex-lytic enzyme SleC from non-food-borne Clostridium perfringens on the germination properties of SleC-lacking spores of a food poisoning isolate.</a> Can J Microbiol. 56, 952-958 (2010).</li>
<li>Hindle, A. A., Hall, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipicolinic+acid+%28DPA%29+assay+revisited+and+appraised+for+spore+detection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Dipicolinic acid (DPA) assay revisited and appraised for spore detection.</a> The Analyst. 124, 1599-1604 (1999).</li>
<li>Kort, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+heat+resistance+of+bacterial+spores+from+food+product+isolates+by+fluorescence+monitoring+of+dipicolinic+acid+release%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of heat resistance of bacterial spores from food product isolates by fluorescence monitoring of dipicolinic acid release.</a> Appl Environ Microbiol. 71, 3556-3564 (2005).</li>
<li>Elson, L. A., Morgan, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+glucosamine+and+chondrosamine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine.</a> The Biochemical journal. 27, 1824-1828 (1933).</li>
<li>Ramirez, N., Abel-Santos, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+germination+of+Clostridium+sordellii+spores+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Requirements for germination of Clostridium sordellii spores in vitro.</a> J. Bacteriol. 192, 418-425 (2010).</li>
<li>Akoachere, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+an+in+vivo+inhibitor+of+Bacillus+anthracis+spore+germination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Indentification of an in vivo inhibitor of Bacillus anthracis spore germination.</a> J. Biol. Chem. 282, 12112-12118 (2007).</li>
<li>Duncan, C. L., Strong, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+medium+for+sporulation+of+Clostridium+perfringens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Improved medium for sporulation of Clostridium perfringens.</a> Appl Microbiol. 16, 82-89 (1968).</li>
<li>Heffron, J. D., Lambert, E. A., Sherry, N., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+four+cortex+lytic+enzymes+to+germination+of+Bacillus+anthracis+spores%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Contributions of four cortex lytic enzymes to germination of Bacillus anthracis spores.</a> J Bacteriol. 192, 763-770 (2010).</li>
<li>Meador-Parton, J., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+Bacillus+subtilis+spore+peptidoglycan+during+sporulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of Bacillus subtilis spore peptidoglycan during sporulation.</a> J Bacteriol. 182, 4491-4499 (2000).</li>
<li>Lambert, E. A., Popham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bacillus+anthracis+SleL+%28YaaH%29+protein+is+an+N-acetylglucosaminidase+involved+in+spore+cortex+depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Bacillus anthracis SleL (YaaH) protein is an N-acetylglucosaminidase involved in spore cortex depolymerization.</a> J Bacteriol. 190, 7601-7607 (2008).</li>
<li>Wang, S., Shen, A., Setlow, P., Li, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Dynamic+Germination+of+Individual+Clostridium+difficile+Spores+Using+Raman+Spectroscopy+and+Differential+Interference+Contrast+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Dynamic Germination of Individual Clostridium difficile Spores Using Raman Spectroscopy and Differential Interference Contrast Microscopy.</a> J Bacteriol. 197, 2361-2373 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Po stymulacji zarodniki poddawane procesowi kiełkowania tracą swoje właściwości odpornościowe bez konieczności syntezy makromolekularnej. Kiedy wyzwalane jest kiełkowanie zarodników, rdzeń zarodnika uwalnia DPA w zamian za wodę2. Ze względu na wysoką zawartość DPA w uśpionym zarodniku, rdzeń zarodnika znajduje się pod intensywnym ciśnieniem osmotycznym, a wyspecjalizowany peptydoglikan, kora, pomaga zapobiegać pęcznieniu rdzenia, działając, przypuszczalnie, jako bariera dla ekspansji2.
<p class=...

Endospory to metabolicznie uśpione formy bakterii, które pozwalają bakteriom przetrwać w niekorzystnym środowisku. U wielu bakterii przetrwalnikowych tworzenie się przetrwalników jest indukowane przez brak składników odżywczych, ale proces ten może być kontrolowany przez zmiany pH, ekspozycję na tlen lub inne stresy1. W metabolicznie uśpionej formie przetrwalników bakterie są odporne na promieniowanie UV, wysuszenie, wyższe temperatury i zamrażanie2. Większość wiedzy na temat procesu zarodnikowania pochodzi z badań na organizmie modelowym, Bacillus subtilis. Proces zarodnikowania rozpoczyna się od replikacji DNA i utworzenia włókna osiowego3,4. Asymetryczna przegroda dzieli następnie komórkę na dwa przedziały o nierównej wielkości. Większy przedział, komórka macierzysta, pochłania mniejszy przedział, przedspornik. Zarówno komórka macierzysta, jak i przedzarodnik koordynują ekspresję genów, aby dojrzeć zarodnik, a komórka macierzysta ostatecznie ulega lizie, uwalniając uśpiony zarodnik do otaczającego środowiska1.
Struktura i skład zarodników jest zachowana u wielu gatunków bakterii. Rdzeń zarodnika ma niższą zawartość wody niż komórka wegetatywna i jest bogaty w kwas dipikolinowy (DPA)1,2. Podczas tworzenia zarodników DPA jest pompowany do rdzenia zarodników w zamian za wodę. Wokół rdzenia znajduje się wewnętrzna błona zarodników, w której u większości bakterii tworzących przetrwalniki znajdują się receptory rozpoznające małe cząsteczki stymulujące kiełkowanie (kiełkowniki)2. Tuż za wewnętrzną błoną zarodnika znajduje się warstwa peptydoglikanu ściany komórkowej. Wyspecjalizowana warstwa peptydoglikanu (kora) otacza peptydoglikan ściany komórkowej i składa się z wielu tych samych składników, co peptydoglikan ściany komórkowej [naprzemiennie N-acetyloglukozamina (NAG) i kwas N-acetylomuraminowy (NAM)]. Jednak około 50% reszt NAM w korze zostało przekształconych wδ-laktam-5,6 muramino-laktamowy. Podczas kiełkowania zarodników te reszty muraminowo-δ-laktamowe są rozpoznawane przez enzymy lityczne kory przetrwalników (SCLE), umożliwiając w ten sposób degradację kory (proces niezbędny do całkowitego kiełkowania), ale nie ściany komórkowej. Wokół kory znajduje się błona zewnętrzna i kilka warstw białek płaszcza 2.
Kontrolowanie procesu kiełkowania jest niezwykle ważne dla bakterii tworzących przetrwalniki. Kiełkowanie jest inicjowane, gdy receptory zarodkowe wchodzą w interakcję z odpowiednimi germinentami2. W wielu bakteriach przetrwalnikowych tymi kiełkownikami są aminokwasy, cukry, nukleotydy, jony lub ich kombinacje2. Kiełkowanie przetrwalników C. difficile jest inicjowane przez połączenie niektórych kwasów żółciowych [np. kwasu taurocholowego (TA)] i aminokwasów (np. glicyny)7-10. Chociaż istnieją różnice między szlakiem kiełkowania C. difficile a szlakami badanymi u innych bakterii przetrwalnikowych, takich jak B. subtilis, wspólnym dla wszystkich jest bezwzględny wymóg degradacji kory zarodników, aby umożliwić wzrost komórki wegetatywnej z kiełkującego zarodnika2,8. Degradacja kory mózgowej może być dokonana przez SCLE CwlJ/SleB (jak w B. subtilis) lub SleC (jak w wielu Clostridia). Hydroliza kory mózgowej zmniejsza ograniczenie ściany komórkowej i zarodników. Pozwala to na pełne nawodnienie rdzenia, co jest niezbędnym krokiem w reaktywacji wielu białek niezbędnych do metabolizmu komórkowego 2.
Gdy zarodniki kiełkują, uśpione zarodniki przechodzą ze stanu jasnego fazowo na stan ciemny fazowo, a proces ten może być mierzony przez zmianę gęstości optycznej (OD) przy 600 nm11. Poprzedni raport sugeruje, że duża część tej zmiany w OD jest spowodowana uwolnieniem DPA z zarodnika12. Podczas naszego ostatniego badania staraliśmy się porównać czas kiełkowania zarodników C. difficile i monitorowaliśmy uwalnianie DPA i fragmentów kory9. W tym badaniu kluczowe znaczenie miało monitorowanie uwalniania fragmentów kory mózgowej, gdy zaczęły one być uwalniane przez kiełkujące zarodniki.
Test kolorymetryczny użyty tutaj opierał się na metodzie wykrywania cukrów z końcami redukującymi, opracowanej przez Ghuysena i wsp. 13. Ze względu na to, że inni opisali protokoły wykrywania cukrów redukujących14 lub zmodyfikowali te protokoły15, literatura na ten temat może być myląca. W tym miejscu szczegółowo opisujemy krok po kroku metodę kolorymetrycznego wykrywania cukrów redukujących uwolnionych z kiełkujących zarodników C. difficile. Chociaż w tym badaniu wykorzystano zarodniki C. difficile, cukry redukujące uwalniane podczas kiełkowania zarodników innych bakterii tworzących przetrwalniki można wykryć za pomocą tego protokołu9,16,17.

<table><tbody><tr><td>Rurka z nakrętką 2,0 ml</td><td>USA scientific</td><td>1420-3700</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Eppendorf pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,250 &#956; l końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>89079-486</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &#956; Końcówki do pipet VWR</td><td></td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylo-D-glukozamina</td><td>Sigma</td><td>A3286-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny - 10 N</td><td>BDH-Aristar</td><td>BDH3032-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>L04295</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>BDH</td><td>BDH0280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboran potasu Tetrahydrat</td><td>Alfa Aesar</td><td>39435</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>BDH</td><td>BDH8019-500G</td><td></td></tr><tr><td>4-(dimetyloamino)benzaldehyd</td><td>Sigma</td><td>156477-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nasycony fenol</td><td>Fisher</td><td>BP1750-400</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M3</td><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy, lodowaty</td><td>BDH</td><td>BDH3098-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewana, obiegowa kąpiel wodna</td><td>VWR Scientific</td><td>Model 1136</td><td></td></tr><tr><td>Microtest 96</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td>96 dobrze przezroczyste płytki do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Probówki hodowlane</td><td>VWR</td><td>89000-506</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloki</td><td></td><td></td><td></td>ciepła</tr><tr><td>Maszyna</td> <td>wirowa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

Proces kiełkowania endospor u Clostridium difficile i innych Clostridii coraz częściej różni się od modelowej bakterii tworzącej przetrwalniki, Bacillus subtilis. Kiełkowanie jest wywoływane przez drobnocząsteczkowe kiełkowniki i zachodzi bez potrzeby syntezy makromolekularnej. Chociaż istnieją różnice między mechanizmami kiełkowania zarodników u gatunków Bacillus i Clostridium, powszechnym wymogiem jest hydroliza kory podobnej do peptydoglikanu, która umożliwia pęcznienie i ponowne nawodnienie rdzenia zarodników. Po nawodnieniu może rozpocząć się metabolizm, co ostatecznie prowadzi do wzrostu komórki wegetatywnej. Wykrycie zhydrolizowanych fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania zarodników może być trudne, a modyfikacje wcześniej opisanych testów mogą być mylące lub trudne do odtworzenia. W związku z tym, opierając się na naszym ostatnim raporcie wykorzystującym ten test, szczegółowo opisujemy krok po kroku protokół kolorymetrycznego wykrywania fragmentów kory podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Tabela 1 przedstawia typowe wyniki uzyskane przy użyciu standardów NAG. Dane te są wykorzystywane do wygenerowania krzywej wzorcowej. Tabela 2 przedstawia typowe wyniki testu kiełkowania w buforze do kiełkowania uzupełnionym o 10 mM glicyny i 10 mM TA (warunki sprzyjające kiełkowaniu) lub o 100 mM glicyny (warunki niesprzyjające kiełkowaniu). Wobec braku TA przetrwalniki C. difficile nie kiełkują i obecność fragmentów kory w roztworze ulega niewi...

Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu krok po kroku jest ilościowe określenie zawartości fragmentów kory lub cukrów redukujących podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych. Metoda ta szczegółowo opisuje etapy niezbędne do wykrycia obecności fragmentów kory lub cukrów redukujących w trakcie kiełkowania przetrwalników. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że większość laboratoriów dysponuje odczynnikami i sprzętem niezbędnym do pomyślnego przeprowadzenia protokołu.Procedurę należy rozpocząć od umieszczenia probówki z zarodnikami Clostridium difficile w bloku grzewczym i inkubowania jej w temperaturze 65 °C przez 30 minut. Po inkubacji probówkę należy umieścić w lodzie. Roztwór do kiełkowania jest specyficzny dla badanego gatunku zarodników bakterii.Do badania kiełkowania zarodników C.difficile stosujemy roztwór 10 mM Tris o pH 7,5 z dodatkiem 150 mM chlorku sodu, 100 mM glicyny oraz 10 mM kwasu taurocholowego w wodzie dejonizowanej. Należy przygotować jeden mililitr roztworu do kiełkowania na każdą próbkę oraz dodatkowy jeden mililitr. Przed rozpoczęciem badania należy przenieść jeden mililitr roztworu do kiełkowania do probówki do mikrocentryfugi i odstawić go na bok.Służy to jako ślepa próba dla detekcji fragmentów kory. Następnie do roztworu do kiełkowania należy dodać zarodniki do uzyskania OD600 na poziomie około 3,0 i krótko wymieszać w wortexie. Taka ilość zarodników pozwala na odpowiednie umiarkowanie uwalniania fragmentów kory podczas kiełkowania zarodników C.difficile.Bezpośrednio po dodaniu zarodników, przenieś próbkę o objętości 1,2 ml do nowej probówki do mikrocentryfugi i umieść ją w wirówce. Następnie wiruj w temperaturze pokojowej przez jedną minutę przy 14 000 ×g. Jest to punkt czasowy zero. Po wirowaniu przenieś 1 ml supernatantu do nowej probówki z nakrętką o pojemności 2 ml i zamroź w temperaturze -80 °C.Powtarzaj proces pobierania alikwotów, wirowania i zamrażania w regularnych odstępach czasu, aż do momentu zgromadzenia próbek dla każdego punktu czasowego. Ze względu na czas wymagany na wirowanie i pobieranie próbek, w tej procedurze niemożliwe jest wyznaczenie punktów czasowych krótszych niż dwie minuty, dlatego próbki te pobiera się co dwie minuty przez 14 minut. Podczas przygotowywania próbek kory, jeśli wymagane jest monitorowanie kwasu dipikolinowego, należy pobrać oddzielną próbkę o objętości 100 µL i przenieść ją do probówki do mikrowirówki umieszczonej w lodzie.Przygotuj również próbki do wyznaczenia krzywej wzorcowej z następującymi ilościami N-acetyloglukozaminy: 0, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 oraz 5 000 nanomoli w roztworze do kiełkowania. Po pobraniu próbek dla każdego punktu czasowego, wyjmij je z zamrażarki i poddaj liofilizacji wraz z próbką ślepą oraz próbkami do krzywej wzorcowej.Następnie wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. W dniu przeprowadzenia analizy liofilizowane próbki, w tym kontrole i próbki do krzywej standardowej, należy resuspender w 120 µL kwasu solnego z fenolem i beta-merkaptoetanolem. Następnie wszystkie resuspenderowane próbki należy przenieść do nowych probówek z nakrętką o pojemności 2 mL.Następnie inkubuj je w cyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 95 °C przez cztery godziny. Po inkubacji umieść próbki na lodzie, aż ostygną. Następnie dodaj 120 µL 3 M wodorotlenku sodu, aby je zneutralizować.Następnie do każdej próbki dodaj 80 µL nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu oraz 80 µL 5% roztworu bezwodnika octowego i wymieszaj na wirówce typu vortex. Następnie inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji przenieś próbki z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 95 °C dokładnie na trzy minuty.Należy pamiętać, że ten etap jest ograniczony czasowo, a dłuższy czas oczekiwania może wpłynąć na późniejszy rozwój sygnału. Wyjąć próbki z kąpieli wodnej i schłodzić je na lodzie. Do każdej probówki dodać 400 µL 6,54% tetraboranu potasu tetrahydratu i wymieszać w wortexie.Inkubuj próbki w łaźni wodnej z cyrkulacją w temperaturze 95 °C przez dokładnie siedem minut. Ten etap jest również wrażliwy na czas. Wyjmij próbki i umieść je w lodzie na pięć minut.Podczas chłodzenia próbek w lodzie, należy przygotować odczynnik barwiący. Rozpuścić 0,320 g DMAB w 1,9 ml lodowatego kwasu octowego. Należy pamiętać, że odczynnik ten jest wrażliwy na czas, temperaturę oraz światło i nie powinien być przygotowywany z wyprzedzeniem.Po całkowitym rozpuszczeniu DMAB należy dodać 100 µL 10 N kwasu solnego i wymieszać próbkę na wirówce typu vortex. Następnie dodać 5 mL octanu lodowatego i ponownie wymieszać na vortexie. W celu przeprowadzenia reakcji kolorymetrycznej należy przenieść 100 µL każdej schłodzonej próbki kory lub próbki kontrolnej do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.Do każdej próbki należy dodać 700 µL świeżo przygotowanego roztworu barwiącego. Próbki należy niezwłocznie przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez dokładnie 20 minut. Po inkubacji należy przenieść 200 µL każdej próbki do przezroczystej płytki 96-dołkowej.Próbki na początku powinny mieć żółty kolor, który zmieni się na fioletowy w przypadku obecności cukrów redukujących, co wskazuje na obecność kory. W tym przypadku wiele próbek nie wykazuje widocznego fioletowego zabarwienia. Niemniej jednak próbki 250, 500 i 5 000 nanomole wyglądają wizualnie inaczej niż kontrola negatywna zero nanomole.Za pomocą czytnika płytek należy wyznaczyć absorbancję przy 585 nanometrach. Przy pomiarze OD przy 585 nanometrach sygnał generowany przez próbki wzorcowe najlepiej pasuje do regresji liniowej. Niniejsza tabela przedstawia typowe wyniki z zastosowaniem wzorców N-acetyloglukozaminy.Dane te zostały następnie wykorzystane do wygenerowania przedstawionej tutaj krzywej wzorcowej. Test kiełkowania przeprowadzono w warunkach sprzyjających kiełkowaniu, stosując bufor do kiełkowania uzupełniony o 100 mM glicyny i 10 mM kwasu taurocholowego. W warunkach hamujących kiełkowanie zastosowano wyłącznie 100 mM glicyny.Wobec braku kwasu taurocholowego zarodniki C.Difficile nie kiełkują, a obecność fragmentów kory w roztworze ulega niewielkiej zmianie. Jednak w obecności zarówno kwasu taurocholowego, jak i glicyny, zarodniki C.difficile kiełkują i uwalniają fragmenty kory do roztworu. Jest to rejestrowane jako wzrost OD585 w czasie w próbkach poddanych reakcji.Ilość uwolnionych fragmentów kory podczas tego testu obliczono przy użyciu krzywej wzorcowej. Jak widać w tym badaniu, większość kory uległa hydrolizie lub została uwolniona w ciągu 15 minut po ekspozycji na czynnik indukujący kiełkowanie. Sugeruje to, że większość zarodników wykiełkowała w tym przedziale czasowym.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykrywać fragmenty kory lub cukry redukujące w roztworze do kiełkowania podczas kiełkowania przetrwalników bakterii. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest ścisłe przestrzeganie czasu reakcji, aby analiza przebiegła prawidłowo.

detecting-cortex-fragments-during-bacterial-spore-germination

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Franciszek, M. B., et al. Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania zarodników bakterii. J. Vis. Exp. (2016).Ten film przedstawia kolorymetryczną metodę wykrywania degradacji kory podczas kiełkowania przetrwalników bakterii poprzez pomiar uwalniania cukrów redukujących w czasie. Wykorzystując wzorce N-acetyloglukozaminy i próbki punktów czasowych, test określa ilościowo stężenie cukru w wyniku fioletowej reakcji chromogennej, wskazując zakres hydrolizy kory.

Kolorymetryczne wykrywanie degradacji kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Źródło: Wen, J., Pasman, et al., Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis . J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii oświetlenia strukturalnego do uzyskania trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych, które ujawniają organizację białek kiełkujących w zarodnikach bakterii.

Wizualizacja białek kiełkujących w błonie wewnętrznej zarodników bakterii

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

Metoda wyodrębniania endospor bakteryjnych ze złożonych społeczności mikrobiologicznych została opracowana w celu przeprowadzenia dostosowanych kultur lub badań molekularnych tej grupy bakterii.

Fizyczna izolacja przetrwalników z próbek środowiskowych poprzez celowaną lizę komórek wegetatywnych

Ten protokół ilustruje ważne kolejne kroki wymagane do oceny znaczenia monitorowania parametrów żywotności i procesów naprawy DNA w ożywianiu zarodników Bacillus subtilis po leczeniu osoczem niskociśnieniowym poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie białek naprawczych DNA za pomocą czasowo-rozdzielczej mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Badanie szkodliwego wpływu niskociśnieniowej sterylizacji plazmowej na przeżywalność zarodników Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii żywych komórek

Tutaj prezentujemy protokoły dla początkujących badaczy, które rozpoczynają fenotypowanie dla farmakologicznie ważnego rodzaju bakterii Streptomyces.

Wizualna i mikroskopowa ocena mutantów rozwojowych Streptomyces

Grzyby smutku powodują wiele niszczycielskich chorób rolniczych. Są rozproszone jako uśpione teliospory, które kiełkują w odpowiedzi na sygnały środowiskowe. Przedstawiamy dwie metody badania zmian molekularnych podczas kiełkowania: pomiar wzrostu oddychania w celu wykrycia aktywacji metabolicznej i ocenę zmieniających się zdarzeń molekularnych poprzez izolację teliospory na różnych etapach morfologicznych.

Badanie kiełkowania teliosporu za pomocą analizy mikrooddychania i mikrodysekcji

Białka receptora germinantu skupiają się w 'germinosomach' w wewnętrznej błonie zarodników Bacillus subtilis. Opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię super rozdzielczości i fluorescencyjne białka reporterowe do wizualizacji germinosomów. Protokół identyfikuje również wewnętrzne domeny błony zarodnikowej, które są preferencyjnie barwione barwnikiem błonowym FM4-64.

Wizualizacja germinosomów i błony wewnętrznej w zarodnikach Bacillus subtilis

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Ten protokół skupia się na wykorzystaniu cytometrii przepływowej i liczenia koralików do ilościowego oznaczania zarodników bakterii znakowanych bromkiem etydyny. Metoda ta jest również skuteczna w analizie kowalencyjnego sprzężenia białek na powierzchni nienaruszonych zarodników.

Poprawa liczenia zarodników Bacillus subtilis i analizy znaczników w cytometrii przepływowej

Poznaj metodę kolorymetryczną do wykrywania cukrów redukujących podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych Clostridium difficile. Protokół umożliwia ilościowe oznaczanie fragmentów kory mózgowej w badaniach mikrobiologicznych.

Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych

Przeglądaj więcej filmów