Wykrywanie fragmentów kory mózgowej podczas kiełkowania przetrwalników bakteryjnych
25 czerwca 2016
Tutaj opisujemy test kolorymetryczny do wykrywania obecności cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii.
Ogólnym celem tego protokołu krok po kroku jest ilościowe określenie obfitości fragmentów kory mózgowej lub cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakterii. Ta metoda szczegółowo opisze kroki wymagane do wykrycia obecności fragmentów kory lub cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników. Główną zaletą tej techniki jest to, że większość laboratoriów posiada odczynniki i sprzęt niezbędny do pomyślnego wykonania protokołu.
Rozpocznij tę procedurę od umieszczenia probówki z zarodnikami Clostridium difficile w bloku grzewczym i inkubacji w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po inkubacji umieścić probówkę na lodzie. Roztwór do kiełkowania jest specyficzny dla badanego gatunku zarodników bakterii.
Do oznaczania kiełkowania zarodników C.difficile używamy roztworu 10 milimolowych Tris o pH 7,5 ze 150 milimolami chlorku sodu, 100-milimolową glicyną i 10-milimolowym kwasem taurocholowym w wodzie dejonizowanej. Przygotuj jeden mililitr roztworu do kiełkowania na próbkę plus dodatkowy jeden mililitr. Przed rozpoczęciem testu przenieś jeden mililitr roztworu do kiełkowania do probówki mikrowirówkowej i odłóż ją na bok.
Będzie to służyć jako puste miejsce do wykrywania fragmentów kory mózgowej. Następnie do roztworu do kiełkowania dodaj zarodniki do OD600 o wartości około 3,0 i krótko wiruj. Ta ilość zarodników działa dobrze w łagodzeniu uwalniania fragmentów kory podczas kiełkowania zarodników C.difficile.
Natychmiast po dodaniu zarodników wyjmij 1,2 mililitra próbki do nowej probówki mikrowirówki i włóż ją do wirówki. Następnie wirować w temperaturze pokojowej przez jedną minutę w temperaturze 14 000 razy G. Jest to punkt czasu zerowego. Po odwirowaniu przenieś jeden mililitr supernatantu do świeżej dwumililitrowej probówki z nakrętką i zamroź ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Powtarzać proces pobierania podwielokrotności, wirowania i zamrażania w regularnych odstępach czasu, aż próbka zostanie pobrana dla każdego punktu czasowego. Ze względu na czas potrzebny na odwirowanie i pobranie próbek, podczas tej procedury nie jest możliwe uzyskanie punktów czasowych krótszych niż dwie minuty, dlatego próbki te pobiera się raz na dwie minuty przez 14 minut. Podczas przygotowywania próbek kory mózgowej, jeśli konieczne jest monitorowanie kwasu dipikolinowego, należy usunąć oddzielną próbkę o pojemności 100 mikrolitrów i dozować do probówki mikrowirówkowej na lodzie.
Przygotuj również próbki do wygenerowania krzywej wzorcowej z następującymi ilościami N-acetyloglukozaminy. Zero, 12,5, 25, 50, 100, 250, 500 i 5 000 nanomoli w roztworze do kiełkowania. Po pobraniu próbki dla każdego punktu czasowego należy wyjąć próbki z zamrażarki i poddać je liofilizacji wraz z próbkami ślepej próby i próbkami z krzywej wzorcowej.
Następnie przechowuj wszystkie próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia. W dniu testu zawiesić liofilizowane próbki, w tym próbki kontrolne i próbki krzywej wzorcowej, w 120 mikrolitrach kwasu solnego z fenolem i beta-merkaptoetanolem. Następnie przenieś wszystkie zawieszone próbki do świeżych dwumililitrowych probówek z nakrętką.
Następnie inkubuj je w recyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po inkubacji umieścić próbki na lodzie, aż ostygną. Następnie dodaj 120 mikrolitrów trzech molowych wodorotlenków sodu, aby je zneutralizować.
Następnie dodaj 80 mikrolitrów nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i 80 mikrolitrów 5% roztworu bezwodnika octowego do każdej próbki i zwiruj ją. Następnie inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji przenieść próbki z powrotem do łaźni wodnej o temperaturze 95 stopni Celsjusza na dokładnie trzy minuty.
Należy pamiętać, że ten krok jest wrażliwy na czas, a dłuższe czasy mogą mieć wpływ na rozwój sygnału podrzędnego. Wyjąć próbki z łaźni wodnej i schłodzić je na lodzie. Dodaj 400 mikrolitrów 6,54% tetraboranu potasu do każdej probówki i odwiruj.
Próbki należy inkubować w recyrkulacyjnej łaźni wodnej w temperaturze 95 stopni Celsjusza dokładnie przez siedem minut. Ten krok jest również wrażliwy na czas. Usunąć próbki i umieścić je na lodzie na pięć minut.
Gdy próbki znajdują się na lodzie, przygotuj odczynnik barwiący. Rozpuść 0,320 grama DMAB w 1,9 mililitra lodowatego kwasu octowego. Należy pamiętać, że ten odczynnik jest wrażliwy na czas, temperaturę i światło i nie powinien być wykonywany z wyprzedzeniem.
Po całkowitym rozpuszczeniu DMAB dodać 100 mikrolitrów 10 normalnych kwasów solnych i odwirować próbkę. Następnie dodaj pięć mililitrów lodowatego kwasu octowego i ponownie wiruj. W przypadku reakcji kolorymetrycznej przenieś 100 mikrolitrów każdej schłodzonej kory lub próbki kontrolnej do nowej 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.
Do każdej próbki dodać 700 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu barwnego. Natychmiast przenieść próbki do łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubować próbki dokładnie przez 20 minut. Po inkubacji przenieść 200 mikrolitrów każdej próbki na przezroczystą 96-dołkową płytkę.
Próbki powinny być początkowo koloru żółtego, ale zmienią kolor na fioletowy, jeśli obecny jest cukier redukujący, który wskazuje na obecność kory. W tym przypadku wiele próbek nie ma widocznego fioletowego koloru. Jednak próbki 250, 500 i 5 000 nanomoli wydają się wizualnie różnić od nanomoli zero kontroli negatywnej.
Za pomocą czytnika płytek określ absorbancję przy 585 nanometrach. Przy pomiarze w średnicy zewnętrznej 585 nanometrów, sygnał generowany z próbek wzorcowych najlepiej pasuje do regresji liniowej. Poniższa tabela przedstawia typowe wyniki przy użyciu wzorców N-acetyloglukozaminy.
Dane te zostały następnie wykorzystane do wygenerowania krzywej standardowej pokazanej tutaj. Test kiełkowania przeprowadzono w warunkach sprzyjających kiełkowaniu z buforem do kiełkowania uzupełnionym 100-milimolową glicyną i 10-milimolowym kwasem taurocholowym. W warunkach niekiełkujących tylko glicyna 100 milimolowa.
Przy braku kwasu taurocholowego zarodniki C.Difficile nie kiełkują, a obecność fragmentów kory w roztworze powoduje niewielkie zmiany. Jednak w obecności zarówno kwasu taurocholowego, jak i glicyny, zarodniki C.difficile kiełkują i uwalniają fragmenty kory do roztworu. Jest on absorbowany jako wzrost OD585 w czasie przereagowanych próbek.
Ilość fragmentów kory mózgowej uwolnionych podczas tego testu została obliczona przy użyciu krzywej standardowej. Jak widać w tym teście, większość kory została zhydrolizowana lub uwolniona przez 15 minut po ekspozycji na kiełkowanie. Sugeruje to, że większość zarodników wykiełkowała w tym czasie.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać fragmenty kory lub cukry redukujące w roztworze do kiełkowania podczas kiełkowania zarodników bakterii. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na czas reakcji, aby test rozwijał się prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje test kolorymetryczny zaprojektowany w celu wykrywania cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników bakteryjnych. Protokół opisuje kroki niezbędne do ilościowego określenia obecności fragmentów kory lub cukrów redukujących, które są niezwykle ważne dla zrozumienia kiełkowania zarodników.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biochemia
- Biologia komórki
Tło
- Zarodniki bakteryjne przechodzą kiełkowanie, krytyczny proces w ich cyklu życia.
- Cukry redukujące odgrywają znaczącą rolę w tym procesie.
- Zrozumienie dynamiki kiełkowania zarodników może pomóc w badaniach mikrobiologicznych.
- Standardowe odczynniki laboratoryjne mogą być wykorzystane do tego testu.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę wykrywania cukrów redukujących podczas kiełkowania zarodników.
- Aby ilościowo określić obfitość fragmentów kory związanych z kiełkowaniem.
- Aby ułatwić badania nad biologią zarodników bakteryjnych.
Stosowane metody
- Inkubacja zarodników Clostridium difficile w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 30 minut.
- Chłodzenie próbek na lodzie po inkubacji.
- Wykorzystanie specyficznego dla gatunku bakteryjnego roztworu kiełkowania.
- Kolorymetryczne wykrywanie cukrów redukujących.
Główne wyniki
- Test z powodzeniem wykrywa cukry redukujące podczas kiełkowania zarodników.
- Udało się ilościowo określić fragmenty kory.
- Metoda jest dostępna dla większości laboratoriów.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia dynamiki zarodników bakteryjnych.
Wnioski
- Ten test kolorymetryczny jest skuteczny w badaniu kiełkowania zarodników.
- Daje wgląd w procesy metaboliczne podczas kiełkowania.
- Protokół można dostosować do różnych gatunków bakterii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Detecting cortex fragment hydrolysis provides a quantitative readout for spore germination kinetics, enabling mechanistic de-risking of antimicrobial strategies targeting Clostridioides difficile. This assay supports target validation by linking germinant receptor activation to downstream peptidoglycan remodeling, a conserved virulence-relevant process. The colorimetric readout offers a scalable, reagent-accessible method for early-stage screening of germination inhibitors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures cortex fragment release as a direct proxy for germinant-induced spore activation, enabling interrogation of germination receptor function.
- Operational Value: Uses standard laboratory reagents (e.g., HCl, phenol, DMAB) and common equipment (centrifuge, water bath, plate reader) for broad accessibility.
- Predictive Confidence: Quantifies hydrolysis kinetics to prioritize compounds that block cortex hydrolysis, a critical step in C. difficile pathogenesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a standard curve using N-acetylglucosamine to convert absorbance at 585 nm into nanomoles of reducing sugars, enabling absolute quantification.
- Operational Value: Includes blank controls and time-point sampling to distinguish germination-dependent signal from background hydrolysis.
- Scalability: Protocol processes multiple time points and conditions in parallel, supporting medium-throughput screening of germinant libraries or inhibitor candidates.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Focuses on C. difficile spores, a persistent clinical threat where germination precedes toxin production and relapse.
- Translational Continuity: Cortex fragment detection bridges spore activation (germination) to vegetative outgrowth, informing stages where antimicrobials may intervene.
- Mechanistic De-risking: Confirms that taurocholic acid plus glycine is required for significant cortex hydrolysis, validating the germinant dependence of the assay readout.
Pipeline & Workflow Integration
This assay fits between germinant screening and phenotypic outgrowth assays, providing a biochemical checkpoint for spore commitment to germination before metabolic activation or toxin production.
- Discovery Biology: Tests whether specific germinants or inhibitors modulate cortex hydrolysis, clarifying pathway-specific effects on spore activation.
- Screening: Delivers quantitative, time-resolved data on reducing sugar release, enabling rank-ordering of germination efficacy across compound libraries.
- Analytics: Outputs absorbance at 585 nm after DMAB derivatization, which correlates linearly with reducing sugar concentration via standard curve.
- Translational Research: Links germination efficiency to downstream phenotypes like outgrowth, supporting go/no-go decisions for anti-infective candidates.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other Clostridia or Bacillus species by modifying the germination solution, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into spore germination by quantifying a key biochemical event (cortex hydrolysis) that precedes metabolic reactivation.
- Operational Value: Avoids need for specialized kits or instruments; relies on heat blocks, centrifuges, and plate readers standard in microbiology labs.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of germination inhibitors, reducing investment in targets unlikely to block spore reactivation in vivo.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-infective programs by confirming target engagement at the germination step.
Implementation Considerations
- Requires expertise in anaerobic spore handling and safe lyophilization procedures.
- Depends on access to a recirculating water bath, centrifuge, and plate reader capable of 585 nm absorbance measurements.
- Necessitates standardization of spore stocks (OD600 normalization) and germination solution composition across users.
- Time-sensitive steps (e.g., acetylation, borate incubation, color development) must be tightly controlled to ensure assay reproducibility.
- Limited to detecting reducing sugars; does not distinguish between cortex-specific fragments and other reducing sugars without orthogonal validation.
