Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu
16 sierpnia 2016
Izolowane modele pracującego serca mogą być używane do pomiaru wpływu warunków obciążenia, tętna i leków na wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Opisano metody przygotowania modelu pracy lewego serca gryzonia, który pozwala na badanie wydolności skurczowej i rozkurczowej oraz zużycia tlenu w różnych warunkach.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie izolowanego modelu lewego pracującego serca, który pozwoli na precyzyjną kontrolę warunków obciążenia komór przez gryzonie. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii układu sercowo-naczyniowego, w tym wpływ leków na kurczliwość mięśnia sercowego, wydajność tekstyliów i zużycie tlenu. Główną zaletą tej techniki jest to, że warunki obciążenia serca mogą być precyzyjnie kontrolowane.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ rozwarstwienie i izolacja aorty, ziarninacja lewego przedsionka i izolacja żył płucnych wymaga umiejętności i praktyki. Po odpowiedniej sedacji, znieczuleniu i przeciwzakrzepnięciu heparyną należy rozpocząć operację na szczurze dawcy. Najpierw odciągnij skórę od jamy brzusznej za pomocą kleszczy i nożyczkami nacinaj jamę otrzewnej.
Podążając za krzywizną przepony z powrotem do tylnego kąta żeber. Gdy przepona jest widoczna, użyj nożyczek, aby przeciąć wzdłuż przedniej powierzchni przepony zgodnie z wcześniejszymi cięciami, aby uzyskać dostęp do klatki piersiowej. Przedłuż każde cięcie wzdłuż linii pachowej obustronnie do pachy.
Następnie cofnij klatkę piersiową do przodu od wyrostka ksylifoidalnego za pomocą kleszczy. Następnie naciąć osierdzie i opłucną. Postępuj wydajnie, ponieważ wentylacja jest zagrożona po nacięciu membrany.
Zidentyfikuj żyłę główną dolną i aortę tuż nad przeponą i użyj kleszczy, aby cofnąć je do przodu. Następnie, używając dużych zakrzywionych nożyczek, szybko przetnij żyłę główną dolną i aortę. Nie przecinając aorty wstępującej, przetnij przełyk, tchawicę, tętnice ramienno-głowowe i żyły głowowy.
Następnie wytnij te tkanki grasicy wraz z sercem i płucami w bloku. Natychmiast zanurz słuch i płuca w lodowatym KHB i przejdź do aparatu Langendorffa. Umieść kompleks płuc serca w płaskim naczyniu i ustaw serce tak, aby grasica i wielkie naczynia były skierowane w stronę eksperymentatora.
I tylna część płuc zwrócona w stronę stołu. Następnie rozsuń dwa płaty grasicy i zidentyfikuj start tętnic ramienno-głowowych z aorty. Teraz ułóż aortę na krawędzi naczynia.
Następnie za pomocą małych nożyczek przeciąć aortę około pięciu milimetrów powyżej zastawki aortalnej, tuż proksymalnie do startu prawej tętnicy podobojczykowej. Wymagany jest okrągły przekrój poprzeczny. Powtarzaj cięcie, aż zostanie wykonane.
Poniższa mikroskopia wideo zapewnia jasność co do krytycznej części tej procedury, rozwarstwienia i przecięcia aorty w ramach przygotowań do kaniulacji. Jak pokazano tutaj, grasica powinna być podzielona na środku i łatwo się rozdzieli. Używaj delikatnych pociągnięć zakrzywionymi kleszczami, aby podzielić osierdzie i przesiać tkanki otaczające aortę.
Unikaj używania nadmiernej siły. Kikut tętnicy nienazwanej należy zidentyfikować i uchwycić jako punkt trakcji na aorcie. Następnie aortę należy naciąć poprzecznie małymi ostrymi nożyczkami w punkcie środkowym między zastawką aortalną a startem tętnicy podobojczykowej.
Jeśli nacięcie zostanie wykonane zbyt wysoko, aorta staje się zbędna i może powodować skręcanie serca wokół kaniuli. Alternatywnie, bufor skurczowy może wyciekać z kikuta ramienno-głowowego. Jeśli jest zbyt krótka, końcówka kaniuli może przecinać zastawkę aortalną.
Następnie, za pomocą dwóch par zakrzywionych kleszczy, poprowadź aortę przez kaniulę aorty, która powinna powoli kapać KHB. Zastawka aortalna powinna znajdować się od jednego do dwóch milimetrów poniżej końcówki kaniuli. Następnie ustaw kleszcze prostopadle w poprzek aorty, aby utrzymać aortę na miejscu.
Można również użyć zacisku. Następnie poproś asystenta, aby użył jedwabnego szwu czterostopniowego, aby zabezpieczyć kaniulę wieloma węzłami po obu stronach serca. Teraz całkowicie otwórz kaniulę, aby rozpocząć pełny wsteczny przepływ aorty.
Serce powinno bić energicznie. Jedną z potencjalnych pułapek jest to, że końcówka kaniuli aortalnej przechodzi przez zastawkę aortalną do lewej komory. Jak pokazano tutaj, jeśli tak się stanie, serce będzie wyglądało na blade, a lewe przedsionek będzie rozdęte.
Należy to natychmiast skorygować poprzez krótkie zatrzymanie przepływu wieńcowego i ponowne ustawienie serca w dół na kaniuli aortalnej. Nie chodzi o to, że tkanki aorty są delikatne u gryzoni i łatwo się rozrywają. Inną potencjalną pułapką jest nieszczelność w korzeniu aorty, albo z powodu rozdarcia, albo z powodu zbyt wysokiego nacięcia aorty, tak że z tętnicy ramienno-głowowej przecieka KHB.
Można temu zaradzić, zatrzymując przepływ wieńcowy, usuwając serce z kaniuli aortalnej i zmieniając pozycję. Celem tego etapu jest stworzenie zamkniętego systemu, w którym całe ciśnienie z bloku napięcia wstępnego jest przenoszone na struktury lewego serca. Niemożność całkowitego zamknięcia żył płucnych może prowadzić do utraty obciążenia wstępnego i może powodować niestabilny preparat serca lub może zafałszować wyniki.
Ręcznie obróć kaniulę aorty tak, aby tylna część serca była skierowana w stronę operatora. Teraz wypreparuj naczynia prowadzące do lewego płuca. Aby ułatwić dostęp do naczyń, użyj kleszczy, aby zawiesić lewą tkankę płucną.
Następnie użyj pojedynczego średniego klipsa chirurgicznego, aby zamknąć lewą tętnicę płucną i żyłę oraz oskrzela. Następnie wytnij lewą płuco dystalnie do klipsa. Teraz powtórz ten proces na prawym płucu.
Kiedy obie tętnice płucne są całkowicie niedrożne, prawy przedsionek rozszerzy się, a serce może stać się bradykardią. W razie potrzeby dodaj dodatkowe klipsy lub szwy, aby zatkać nieszczelności i pracować wydajnie. Teraz wykonaj nacięcie tętnicy płucnej.
Obróć kaniulę aortalną, aby uzyskać dostęp do przedniej części serca i zidentyfikować tętnicę płucną. Za pomocą małych nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie około trzech milimetrów nad zastawką płucną. Tętnica płucna może być teraz kaniulowana w późniejszym etapie.
Następnie kanuuluj lewe przedsionek. Patrząc na lewy przedsionek, użyj małych nożyczek, aby wykonać dwu- lub trzymilimetrowe nacięcie w górnej części lewego przedsionka około trzech milimetrów powyżej rowka przedsionkowo-komorowego. Następnie ustaw lewą kaniulę przedsionkową prostopadle do płaszczyzny zastawki mitralnej, skierowaną w stronę przegrody przedsionkowej.
Otwórz lewą przednią kaniulę, aż zacznie widocznie płynąć ciepły KHB. Upewnij się, że KHB jest ciepły w dotyku, w przeciwnym razie może pojawić się hipotermia. Podczas kaniulacji przekształć przepływ KHB do szybkości kroplowania.
Teraz, używając kleszczy do przytrzymania przeciwstawnej trakcji, włóż kaniulę przedsionkową do korpusu lewego przedsionka. Nie używaj nadmiernej siły, ponieważ przedsionek jest delikatny. Ustaw kaniulę tak, aby znajdowała się na środku przedsionka bez żadnego napięcia na ścianie przedsionka.
Teraz przymocuj kaniulę do przedsionka za pomocą jedwabnego szwu z czterema oh umieszczonymi wokół korpusu lewego przedsionka, w tym tylnej części lewego przedsionka. W razie potrzeby dodaj dodatkowe szwy. Po uszczelnieniu pociągnij kaniulę do tyłu o jeden do dwóch milimetrów, tak aby znajdowała się na środku przedsionka, a nie na przegrodzie przedsionkowej.
Można to sprawdzić, patrząc na przebieg lewego przedsionka. Teraz całkowicie otwórz zawór kaniuli, aby podać pełne obciążenie wstępne do lewego przedsionka. Bardzo ważne jest monitorowanie szybkości kapania z serca.
Powinien być stabilny, gdy kaniula jest otwarta. Jeśli nie, zamocuj przedsionek wokół kaniuli, aby uszczelnić przeciek, który prawdopodobnie powoduje problem. Aby zmierzyć substancje w ściekach wieńcowych, takie jak gazy, leki lub cytokiny, należy wprowadzić elastyczną rurkę do nacięcia w tętnicy płucnej.
Aby umożliwić ciągły pomiar ciśnienia i objętości, należy wprowadzić do lewej komory skalibrowany cewnik konduktujący objętość ciśnienia. Najlepiej zrobić to wstecz przez zastawkę aortalną. Chociaż jest to technicznie trudne, można to również wykonać poprzez nakłucie komory wierzchołkowej.
Maksymalny DPDT powinien wynosić co najmniej 3500 do 4000 dla odpowiedniego przygotowania. Zbierz ściek z zatok wieńcowych z tętnicy płucnej i serca w cylindrze z podziałką w celu ilościowego określenia przepływu wieńcowego w czasie. Teraz oblicz zużycie tlenu w mięśniu sercowym.
Ostatecznie wyłącz wsteczną pompę aortalną, aby przejść do trybu pracy serca. Perfuzję wsteczną przygotowano zgodnie z opisem. Przepływ był początkowo wsteczny podczas konfiguracji.
Kiedy pompa wsteczna została wyłączona, przepływ przełączył się na antygrade, tworząc pracujące serce. Typowe końcowe ciśnienie rozkurczowe wynosi w tym modelu około trzech do pięciu milimetrów słupa rtęci. A szczytowe ciśnienie skurczowe wynosi około 100 milimetrów słupa rtęci.
Gdy kaniula lewego przedsionka została odsunięta od przegrody przedsionkowej, można wykryć zmianę w śladzie lewego przedsionka. W tych eksperymentach ciśnienie w aorcie ustawiono na 90 milimetrów słupa rtęci, a ciśnienie w lewym przedsionku ustawiono na 10 milimetrów słupa rtęci. W eksperymencie dopaminę podawano w dawce 15 mikrogramów na miligram na minutę do bloku lewego przedsionka.
Chociaż końcowe ciśnienie rozkurczowe pozostało niezmienione, dopamina spowodowała zmniejszenie końcowej objętości rozkurczowej lewej komory o 2,5%, a objętości skurczowej końca lewej komory o 4,9%, co spowodowało zwiększenie objętości wyrzutowej. W porównaniu z wlewami placebo, udar lewej komory mózgu zidentyfikowany jako obszar w obrębie krzywej objętości ciśnienia zwiększył się o 32% podczas leczenia dopaminą. Wiązało się to również z większym wzrostem zużycia tlenu w mięśniu sercowym.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje przygotowanie modelu izolowanego pracującego lewego serca gryzoni, który umożliwia precyzyjną kontrolę warunków obciążenia komór. Model ten jest niezbędny do badania wpływu różnych czynników na wydajność mięśnia sercowego oraz zużycie tlenu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia układu sercowo-naczyniowego
- Wydolność mięśnia sercowego
- Zużycie tlenu
Wprowadzenie
- Modele izolowanego serca są kluczowe dla zrozumienia funkcji kardiologicznych.
- Warunki obciążenia i częstotliwość skurczów serca znacząco wpływają na kurczliwość mięśnia sercowego.
- Leki mogą zmieniać wydajność serca oraz zużycie tlenu.
- Demonstracja wizualna jest istotna dla opanowania technik chirurgicznych.
Cel badania
- Stworzenie modelu do badania wydolności lewej komory serca w kontrolowanych warunkach.
- Zbadanie wpływu leków na funkcję serca.
- Pogłębienie wiedzy na temat funkcji skurczowej i rozkurczowej.
Zastosowane metody
- Przygotowanie szczura dawcy z zastosowaniem odpowiedniej sedacji i przeciwkrzepliwości.
- Disekcja oraz izolacja serca i powiązanych z nim naczyń.
- Kaniulacja aorty i tętnic płucnych.
- Ustanowienie układu zamkniętego w celu dokładnego pomiaru ciśnienia.
Główne wyniki
- Model umożliwia precyzyjne manipulowanie warunkami obciążenia.
- Pomyślna kanulacja prowadzi do stabilnej pracy serca.
- Potencjalne problemy obejmują niewłaściwe umiejscowienie kaniuli oraz nieszczelności.
- Wydajne techniki chirurgiczne są kluczowe dla osiągnięcia pomyślnych rezultatów.
Wnioski
- Model izolowanego pracującego serca lewego jest skuteczny w badaniach układu sercowo-naczyniowego.
- Kontrolowane warunki ułatwiają badanie funkcji mięśnia sercowego.
- Zrozumienie technik chirurgicznych jest niezbędne dla zapewnienia powtarzalności wyników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model izolowanego pracującego serca gryzonia umożliwia precyzyjną kontrolę obciążenia wstępnego, obciążenia nastawczego, częstotliwości akcji serca oraz napięcia tlenowego, stanowiąc system redukcjonistyczny służący do mechanistycznego ograniczania ryzyka w badaniach nad celami terapeutycznymi w układzie sercowo-naczyniowym. Dzięki możliwości oceny agentów inotropowych niezależnie od obciążenia oraz bezpośredniego pomiaru zużycia tlenu przez mięsień sercowy, model ten wspiera walidację celów i zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków. System ten stanowi pomost między przesiewem fenotypowym a oceną przedkliniczną, dostarczając ilościowych i powtarzalnych odczytów hemodynamicznych oraz metabolicznych w określonych warunkach fizjologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez oddzielenie kurczliwości mięśnia sercowego od zakłócających zmian obciążenia.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez analizę pętli ciśnienie-objętość oraz ilościowe oznaczenie dP/dt max.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do związków wiodących poprzez wykazanie zależnych od dawki efektów w zakresie pracy rzutu serca i zużycia tlenu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje ustandaryzowane, mierzalne wyniki, w tym pobieranie próbek z odpływu zatoki wieńcowej w celu pomiaru zużycia tlenu.
- Powtarzalność: Wymaga stabilnych preparatów z maksymalną wartością dP/dt max w zakresie 3500–4000 mmHg/s oraz określonymi zakresami ciśnień końca rozkurczu i skurczu.
- Skalowalność: Kompatybilne ze stymulacją przedsionków w celu kontroli częstości akcji serca oraz perfuzją natlenionym buforem Krebsa do badań metabolicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje wydajność lewej komory u gryzoni przy kontrolowanym obciążeniu, co umożliwia ekstrapolację do patofizjologii człowieka.
- Ciągłość translacyjna: Ułatwia przejście od identyfikacji celu terapeutycznego do walidacji przedklinicznej, dostarczając wglądu w mechanizmy zmian objętościowych i ciśnieniowych wywołanych przez lek.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Identyfikuje związki zwiększające zapotrzebowanie mięśnia sercowego na tlen bez proporcjonalnego wzrostu wydajności, co wspiera tworzenie profilu bezpieczeństwa.
Integracja potoku i procesu roboczego
Funkcjonalny model serca wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu, poprzez optymalizację wiodącego związku, aż po ocenę przedkliniczną, stanowiąc platformę do iteracyjnych badań nad relacją struktura-aktywność.
- Biologia odkrywcza: Pozwala na testowanie hipotez mechanistycznych dotyczących kurczliwości i energetyki serca niezależnie od sprzężeń neurohormonalnych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów ciśnienia-objętości oraz metabolicznych, odpowiednich do rankingu związków.
- Analityka: Umożliwia obliczenie pracy uderzeniowej, końcowoskurczowej elastancji oraz myocardialnego zużycia tlenu na podstawie pętli ciśnienie-objętość i odpływu wieńcowego.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z fizjologią całego narządu poprzez zachowanie architektury miocytów i perfuzji wieńcowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalną platformę hemodynamiczną do oceny wielu chemotypów w ramach projektów sercowo-naczyniowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w farmakologii sercowo-naczyniowej, umożliwiając ocenę kurczliwości niezależną od obciążenia.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki obciążenia komór poprzez blokowanie obciążenia wstępnego i następczego, co poprawia spójność między eksperymentami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez wczesną identyfikację związków o korzystnej wydajności tlenowej na etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, wskazując obciążenia w energetyce mięśnia sercowego przed rozpoczęciem prac wymagających dużych nakładów zasobów.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie chirurgii układu sercowo-naczyniowego gryzoni oraz technik kaniulacji.
- Zależne od systemów cewników ciśnienie-objętość oraz aparatury perfuzyjnej Langendorffa.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji składu perfuzatu, temperatury i napięcia tlenowego.
- Należy uwzględnić zmienność międzyosobniczą wielkości komór oraz funkcji bazowej.
- Ograniczone do badań ostrych; nieprzydatne do oceny przewlekłego dawkowania lub przebudowy.
Najczęściej zadawane pytania dot. biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Isolating the Heart and Lungs
2:26
Aortic Cannulation
6:07
Pulmonary Vein Occlusion, Preparation of the Pulmonary Artery for Cannulation, and Left Atrial Cannulation
9:37
Pulmonary Artery Cannulation and Working Heart Mode Experimentation
10:45
Results: The Effects of Dopamine on the Working Heart
12:23
Conclusion
