Name: Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj izolowany model pracującego serca gryzoni do precyzyjnej kontroli warunków obciążenia komór. Ta metoda pozwala badać wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sprzęt i eksperymenty opisane tutaj zostały sfinansowane przez Oddział Kardiologii Szpitala Dziecięcego w Bostonie oraz przez filantropijne darowizny od rodziny Haseotes. Jesteśmy wdzięczni doktorom Frankowi McGowanemu i Huamei He za udostępnienie nam wczesnych doświadczeń z tym modelem, a także Lindsay Thomson za pomoc przy tworzeniu grafiki.

Ten protokół jest wykonywany zgodnie z aktualnym protokołem w ramach komitetu ds. opieki nad zwierzętami i użytkowania zwierząt.
1. Przygotowanie do badania
<ol>
	<li>Włączyć łaźnię wodną, aby podgrzać zbiornik buforowy Krebs-Henseleit (KHB) (ustawiony na 42 °C).</li>
	<li>Przygotować 16 l KHB zawierającego (w mM) 128 NaCl, 5,7 KCl, 1,3MgSO4, 25 NaHCO3, 2,7 CaCl2, 0,53 EDTA, 0,54 NaC,3H3O3 i 10,8 dekstrozy. 13 Masy substratu są następujące: 27,584 g NaCl, 1,58 g KCl, 0,578 gMgSO4, 8,401 gNaHCO3, 1,47 g CaCl2, 0,744 g EDTA, 0,22 g NaC3H3O3 i 7,208 g dekstrozy. 
	Uwaga: składniki te mogą być przechowywane w stożkowych probówkach w postaci sproszkowanej w celu ich roztworzenia w dniu eksperymentu.
	<ol>
		<li>Przefiltruj 4 l wody dejonizowanej przez filtr 0,22 mikrona.</li>
		<li>Dodaj 3,7 l tej wody do zlewki o pojemności 4 l. Dodać do wody wszystkie składniki z wyjątkiem CaCl2.</li>
		<li>Rozpuścić CaCl2 w pozostałych 300 ml wody, używając oddzielnej zlewki.</li>
		<li>Natleniać roztwór 95%O2 / 5% CO2 w stężeniu 1 l/min (l/min) przez 5 min. To koryguje pH do 7,40 i zwiększa rozpuszczanie CaCl2.</li>
		<li>Dodaj CaCl2 do pozostałej części KHB.</li>
		<li>Dodaj gotowy KHB do zbiornika i cyrkuluj przez wszystkie rurki przez 30 minut. Upewnij się, że system jest wolny od makroskopowych pęcherzyków. Natleniać 95%O2 / 5% CO2 przy 0,5 l/min. 
		UWAGA: KHB można przechowywać przez noc w lodówce nie dłużej niż 1 - 2 dni, przywrócić do temperatury pokojowej i ponownie przefiltrować do użycia. Nie używaj ponownie KHB między eksperymentami.</li>
		<li>Przygotuj 2 czyste zlewki o pojemności 50 ml z lodowatym KHB i umieść je w wiadrze z lodem w pobliżu stacji rozwarstwiania. Upewnij się, że KHB jest lodowato zimny (a nie schłodzony) przed wysadzeniem serca.</li>
		<li>Umieść cewnik mikrociśnieniowo-objętościowy (PV) w strzykawce o pojemności 10 ml wypełnionej przefiltrowanym KHB na 30 minut przed kalibracją, zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Temperatura KHB używana do namaczania cewnika PV powinna być jak najbardziej zbliżona do 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj stację anestezjologiczną i preparacyjną dla zwierzęcia.
	<ol>
		<li>Zapewnić odpowiednią ilość izofluranu w zbiorniku. Pobrać 500 j. heparyny do strzykawki o pojemności 1 ml; Umieścić igłę o rozmiarze 26 (1/2") na tej strzykawce. Przygotuj maskę do znieczulenia zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw ciśnienie perfuzji bloku aorty na 80 mmHg, a ciśnienie perfuzji bloku lewego przedsionka (LA) na 10 mmHg. Otwórz zarówno blok aorty, jak i blok LA, aby umożliwić wypłynięcie ciepłego KHB. Kiedy będziesz gotowy do sekcji zwierzęcia, otwórz blok aorty, aby umożliwić równomierne, powolne kapanie KHB.</li>
	<li>Skalibruj cewnik PV zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i sekcja zwierząt
UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, upewnij się, że waga zwierzęcia wynosi od 300 do 500 g; stwierdziliśmy, że waga zwierzęcia między 425 a 450 g jest idealna dla naszego systemu.
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę w komorze za pomocą izofluranu (1 - 2%) do momentu utraty przytomności. Przenieś zwierzę do stacji preparacyjnej i umieść na zwierzęciu maskę anestezjologiczną z izofluranem i tlenem. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby ocenić poziom sedacji. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Wstrzyknąć heparynę, 500 jednostek dootrzewnowo do jamy brzusznej. Odczekaj 10 minut, aby heparyna się wchłonęła. Zabezpiecz kończyny zwierzęcia taśmą, aby poprawić wizualizację klatki piersiowej.</li>
	<li>Rozwarstwienie serca.
	<ol>
		<li>Po upewnieniu się, że nie ma reakcji na uszczypnięcie palca u nogi, podnieś skórę od jamy brzusznej za pomocą kleszczy, a następnie użyj nożyczek, aby naciąć jamę otrzewnej, podążając za krzywizną przepony z powrotem do tylnego kąta żeber.</li>
		<li>Gdy przepona jest widoczna, za pomocą małych nożyczek przetnij wzdłuż przedniej powierzchni przepony zgodnie z kierunkiem wcześniejszych nacięć, aby umożliwić wejście do klatki piersiowej. Każde cięcie wzdłuż linii pachowej rozciągnąć obustronnie do pachy. 
		UWAGA: Kolejne kroki należy wykonywać wydajnie, ponieważ wentylacja będzie zakłócona po nacięciu membrany.</li>
		<li>Cofnij klatkę piersiową do przodu od wyrostka mieczykowatego za pomocą kleszczy. Naciąć osierdzie i opłucną.</li>
		<li>Zidentyfikuj żyłę główną dolną (IVC) i aortę tuż nad przeponą i cofnij je en bloc do przodu za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Używając dużych, zakrzywionych nożyczek, szybko wykonaj nacięcie w poprzek IVC i aorty, wyciągając serce i płuca z klatki piersiowej en bloc. Przeciąć przełyk, tchawicę, tętnice ramienno-głowowe i żyły głowowe, aby usunąć serce i płuca z klatki piersiowej. Wytnij tkankę grasicy za pomocą tego bloku tkanki. Uważaj, aby nie przeciąć bliższej części aorty wstępującej.</li>
		<li>Natychmiast zanurz serce i płuca w lodowatym KHB i przejdź do aparatu Langendorffa, wcześniej ustawionego zgodnie z opisem w kroku 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kaniulacja aorty
<ol style="margines po lewej: 40px;">
	<li>Umieść kompleks płuco-serce w płaskim naczyniu i ustaw serce tak, aby grasica i wielkie naczynia były skierowane w stronę eksperymentatora, a tylna część płuc była skierowana w stronę stołu. Rozsuń dwa płaty grasicy i zidentyfikuj start tętnic ramienno-głowowych z aorty.
	<ol>
		<li>Ułóż aortę na krawędzi naczynia i przeciąć aortę małymi nożyczkami około 5 mm powyżej zastawki aortalnej, tuż obok startu prawej tętnicy podobojczykowej. 
		UWAGA: Nacięcie powinno dać czysty okrągły okrąg — aorta w przekroju. Jeśli jest pod kątem (tj. szeroki owal) lub niekompletny, powtórz cięcie, aby osiągnąć pożądany efekt. Ułatwi to sprawną kaniulację aorty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając 2 par zakrzywionych kleszczyków po obu stronach aorty, poprowadź aortę nad kaniulą aorty (która powinna powoli ociekać KHB). Zastawka aortalna powinna znajdować się 1-2 mm poniżej końcówki kaniuli.
	<ol>
		<li>Po kanneulacji aorty ustaw kleszcze prostopadle w poprzek aorty, aby utrzymać aortę na miejscu. Alternatywnie, umieść mały zacisk w poprzek aorty, aby utrzymać kompleks płuco-serce na miejscu, umożliwiając jednemu eksperymentatorowi ukończenie tego modelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poproś asystenta, aby przesunął jedwabny szew 4-0 tuż pod kleszczami i zawiązał na miejscu, zapętlając się wokół kaniuli i zawiązując wiele razy zarówno przed, jak i za sercem. Całkowicie otwórz kaniulę, aby rozpocząć pełny wsteczny przepływ aorty. Obserwuj energiczne bicie serca. 
	UWAGA: Jeśli serce nie zaczyna bić szybko (~ 200 uderzeń na minutę) i energicznie, opaska lub kaniula może zamykać jedną lub obie tętnice wieńcowe. Jeśli istnieje podejrzenie, usuń opaskę i przenieś ją z dala od tętnic wieńcowych. Jeśli serce rozszerza się i nie bije, kaniula może znajdować się w poprzek zastawki aortalnej. Jeśli tętnica wieńcowa przecieka (KHB rozpyla się z korzenia aorty), przesuń kaniulę bliżej zastawki aortalnej (zjawisko to może wystąpić, jeśli tętnica ramienno-głowowa jest kanulatowana w miejscu aorty wstępującej).</li>
</ol>
4. Niedrożność żyły płucnej i przygotowanie tętnicy płucnej do kaniulacji
UWAGA: Celem tego kroku jest stworzenie zamkniętego systemu lewego przedsionka, aby zapewnić, że cała objętość i ciśnienie z bloku lewego przedsionka są przekazywane do struktur lewego serca. Brak całkowitego zamknięcia żył płucnych może spowodować niedobór napięcia wstępnego i może zafałszować wyniki lub spowodować niestabilną pracę preparatu serca.
<ol>
	<li>Usuń grasicę, aby poprawić odsłonięcie tętnicy płucnej (PA).</li>
	<li>Ręcznie obróć kaniulę aorty tak, aby tylna część serca była skierowana w stronę operatora. Wypreparuj naczynia prowadzące do prawego płuca. Zawieś prawą tkankę płucną za pomocą kleszczy, aby dokładniej wyznaczyć te naczynia. Za pomocą średnio-dużych klipsów chirurgicznych (lub szwów) zamknij prawą tętnicę płucną oraz żyłę i oskrzela za pomocą jednego klipsa. Wyciąć prawe płuco dystalnie do klipsa. 
	UWAGA: Ze względu na trudności w swobodnym wycięciu tętnicy płucnej, naszą praktyką jest zamykanie żył płucnych w celu rozciągnięcia tętnicy płucnej, co ułatwia nacinanie bez uszkadzania pobliskich struktur w modelu bijącego serca.</li>
	<li>Powtórz krok 4.2 na lewym płucu. 
	UWAGA: Potencjalne pułapki i rozwiązywanie problemów: Gdy obie tętnice płucne zostaną zamknięte, prawy przedsionek widocznie się rozszerzy, a serce może stać się bradykardią. Dzieje się tak, ponieważ prawa komora ulega ciśnieniu. Jeśli tak się nie stanie, prawdopodobnie żyły płucne nie są całkowicie zamknięte, a obciążenie wstępne będzie niewystarczające do pracy w trybie serca. Jeśli serce nie jest w stanie utrzymać rzutu serca po kaniulacji lewego przedsionka (LA) i próbie przejścia do pracy serca (patrz poniżej), rozważ umieszczenie dodatkowych klipsów lub opaski wokół kikutów żyły płucnej, aby zatkać wszelkie resztki wycieku. Jednak po zamknięciu PA należy natychmiast wykonać Krok 5, aby zminimalizować niedokrwienie mięśnia sercowego. Należy pamiętać, że niektórzy badacze nacinają tętnicę płucną przed podwiązaniem żył płucnych, aby uniknąć ucisku w prawej komorze.</li>
	<li>Nacięcie tętnicy płucnej
	<ol>
		<li>Obróć kaniulę aorty tak, aby przednia część serca była skierowana w stronę operatora. Zidentyfikuj tętnicę płucną. Ponownie, ta tętnica może być rozdęta. Za pomocą małych nożyczek wykonaj poprzeczne nacięcie około 3 mm powyżej zastawki płucnej. 
		UWAGA: Spowoduje to natychmiastowe zmniejszenie ciśnienia, a tętno może wzrosnąć. Ponieważ kaniula ta jest łatwa do usunięcia, kanniulacja tętnicy płucnej po zakończeniu kaniulacji lewego przedsionka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Kaniulacja lewego przedsionka
<ol>
	<li>Obróć kaniulę aorty tak, aby lewe przedsionki były skierowane w stronę operatora. Za pomocą małych nożyczek wykonaj 2-3 mm nacięcie w górnej części lewego przedsionka, około 3 mm powyżej rowka przedsionkowo-komorowego.
	<ol>
		<li>Ustaw lewą kaniulę przedsionkową prostopadle do płaszczyzny zastawki mitralnej i skierowaną w stronę przegrody przedsionkowej.</li>
		<li>Otwórz kaniulę LA, aż KHB zacznie płynąć. Upewnij się, że KHB jest ciepły w dotyku (szybko się ochładza, gdy siedzi się w dowolnym drenach bez osłony), aby uniknąć dysfunkcji mięśnia sercowego z powodu hipotermii po przejściu do trybu pracy. Przejście na szybkość kroplowania podczas kaniulacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając kleszczy do przytrzymania przeciwbieżności, włóż kaniulę przedsionkową do korpusu lewego przedsionka, uważając, aby nie używać nadmiernej siły, która może rozerwać przedsionek. 
	UWAGA: Kaniula LA powinna być umieszczona tak, aby znajdowała się na środku przedsionka bez żadnego napięcia na ścianie przedsionka.</li>
	<li>Przełóż jedwabny szew 4-0 wokół korpusu lewego przedsionka i zawiąż węzeł, aby stworzyć uszczelnienie przedsionka wokół kaniuli. Zwróć uwagę, aby upewnić się, że tylna strona lewego przedsionka jest objęta szwem. W razie potrzeby dodaj dodatkowe szwy. Po uszczelnieniu pociągnij kaniulę do tyłu o 1-2 mm, tak aby znajdowała się na środku przedsionka, a nie na przegrodzie międzyprzedsionkowej. 
	UWAGA: Najczęstszym powodem, dla którego serce ulega nieprawidłowemu uszkodzeniu po przejściu do trybu pracy serca, jest to, że kaniula LA przylega do przegrody przedsionkowej, która zasłania dopływ lewego przedsionka. Śledzenie LA często zmienia się, aby zademonstrować prawidłową falę A i falę V, gdy kaniula jest we właściwej pozycji (patrz rysunek 2E).</li>
	<li>Otwórz całkowicie zawór kaniuli LA, aby podać pełne obciążenie wstępne do lewego przedsionka. Monitoruj szybkość wycieku z serca (która pochodzi ze ścieków wieńcowych). Upewnij się, że szybkość kapania nie zmienia się, gdy kaniula LA jest otwarta. Jeśli tak się stanie, należy załatać przedsionek wokół kaniuli zgodnie z opisem w kroku 6.4, ponieważ oznacza to nieszczelność systemu.</li>
</ol>
6. Kanituacja tętnicy płucnej i przejście do trybu pracy serca
<ol>
	<li>W przypadku pomiaru zużycia tlenu przez mięsień sercowy (lub innych substancji w ściekach wieńcowych, takich jak poziomy leków lub cytokin), włóż elastyczną rurkę 1/32" do wcześniejszego nacięcia w tętnicy płucnej. 
	UWAGA: Zużycie tlenu mierzy się jako różnicę w zawartości tlenu między perfuzatem lewego przedsionka a ściekami z tętnicy płucnej. cyfra arabska
	<ol>
		<li>Do ciągłego pomiaru zużycia tlenu przez mięsień sercowy należy użyć elektrody tlenowej in-line, aby porównać ściek z lewego przedsionka i zatoki wieńcowej.</li>
		<li>Zbierz ściek z zatok wieńcowych (zarówno z tętnicy płucnej, jak i kapiący z serca) w cylindrze z podziałką w celu ilościowego określenia przepływu wieńcowego w czasie.</li>
		<li>Oblicz zużycie tlenu w mięśniu sercowym, jak opisano wcześniej. cyfra arabska</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejście do trybu pracy serca poprzez wyłączenie wstecznej pompy aortalnej. 
	UWAGA: Po wykonaniu tej czynności ciśnienie LA staje się ciśnieniem obciążenia wstępnego, a rezystor, który wcześniej zapewniał opór pompie wstecznej w trybie Langendorffa, teraz zapewnia opór rzutu serca, tworząc średnie ciśnienie tętnicze. Jeśli średnie ciśnienie tętnicze spadnie poniżej ~ 80 mmHg, przyczyna jest prawdopodobnie związana z obciążeniem wstępnym lub funkcją mięśnia sercowego. Najbardziej prawdopodobnym problemem jest kaniula lewego przedsionka, którą należy wyregulować po ponownym uruchomieniu pompy wstecznej.</li>
</ol>
7. Wprowadzenie cewnika objętościowego do lewej komory
UWAGA: Cewnik PV może być umieszczony albo wstecznie (przez zastawkę aortalną), albo przez nakłucie wierzchołkowe. Zaletą retrogradacji jest to, że pozycja jest bardziej spójna i eliminuje potrzebę nakłucia wierzchołkowego i towarzyszące mu ryzyko uszkodzenia naczyń wieńcowych lub utraty obciążenia wstępnego. Jednak umieszczenie wstecz może być czasami bardzo trudne, dlatego opisujemy tutaj obie techniki.
<ol>
	<li>Podłącz francuski cewnik ciśnieniowo-objętościowy 1,4 do systemu pętli objętości ciśnienia. Skalibruj system w ciepłym KHB zgodnie z instrukcjami producenta. Upewnij się, że przebieg jest widoczny w czasie rzeczywistym. Przyłóż cewnik i do powierzchni lewej komory napowietrznej, aby nie przesunąć jej po umieszczeniu.</li>
	<li>W celu umieszczenia wstecznego otwórz regulowany zawór i delikatnie przesuwaj cewnik PV przez zastawkę aortalną, aż zostanie zidentyfikowany stabilny przebieg ciśnienia i objętości. Unikaj nadmiernego użycia siły, która może uszkodzić zastawkę aortalną lub przebić wierzchołek komory. 
	UWAGA: Stwierdziliśmy, że ważne jest, aby zminimalizować długość rurki i liczbę zwojów, po których cewnik PV musi się poruszać, aby zbliżyć się do AV. Pomocne może być przecięcie przewodów dołączonych do systemu.</li>
	<li>W celu umieszczenia wierzchołkowego użyj angiocewnika 24 G, aby utworzyć nakłucie wierzchołkowe w LV. Upewnij się, że unikasz lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej. Skieruj igłę w kierunku zastawki aortalnej z wierzchołka komory. Wsuń cewnik ciśnieniowo-objętościowy do korpusu LV. Zatrzymaj przesuwanie cewnika, gdy tylko zostanie zidentyfikowany przebieg ciśnienia i objętości lewej komnaty.</li>
	<li>Po umieszczeniu cewnika ciśnieniowo-objętościowego przesuń płaszcz wodny na miejsce wokół serca. Przymocuj cewnik do ściany płaszcza wodnego za pomocą małego kawałka taśmy.</li>
	<li>Zapewnić co najmniej 30-minutowy okres stabilności przed rozpoczęciem jakichkolwiek pomiarów lub interwencji.</li>
</ol>
8. Napar leków
<ol>
	<li>(Opcjonalnie) Wlej leki (np. dopaminę) do bloku lewego przedsionka za pomocą standardowej pompy do leków. 
	UWAGA: Dozowaliśmy leki w zależności od masy ciała całego zwierzęcia, ponieważ przepływ równy całej pojemności minutowej serca przechodzi przez blok przedsionkowy; Tylko niewielka część z nich przechodzi przez krążenie wieńcowe, tak jak ma to miejsce in vivo. Alternatywnie, drugi zestaw perfuzatu może być utworzony z ustalonym stężeniem leku i użyty do perfuzji serca. 
	UWAGA: W naszym protokole podajemy leki w infuzji przez 12 minut, zbierając dane fizjologiczne podczas ostatnich 10 minut każdej infuzji i porównując je z bezpośrednio poprzedzającym 10-minutowym punktem odniesienia.</li>
</ol>
9. Manipulacje fizjologiczne
<ol>
	<li>tętno
	<ol>
		<li>(Opcjonalnie) zszyj dwa druty stymulacyjne na prawej ścianie przedsionka i przymocuj do tymczasowego urządzenia stymulacyjnego. 
		UWAGA: Pozwala to na precyzyjną kontrolę częstości akcji serca (powyżej natywnej częstości ssawek) i zrozumienie związku między częstością akcji serca a kurczliwością niezależnie od leku kardiotonicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obciążenie wstępne
	<ol>
		<li>Zmień obciążenie wstępne (zdefiniowane jako objętość rozkurczowa końca lewej komory) poprzez zmianę wysokości kolumny zasilającej lewy blok przedsionkowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ciśnienie krwi
	<ol>
		<li>Manipuluj ciśnieniem krwi (głównym wyznacznikiem obciążenia następczego w tym modelu) za pomocą zaworów ciśnieniowych w IH-51.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawartość tlenu w naczyniach wieńcowych
	<ol>
		<li>Osiągnij różne stopnie niedotlenienia mięśnia sercowego poprzez perfuzję serca za pomocą KHB nasyconego różnymi mieszaninami gazów. Należy to zrobić, używając oddzielnych zbiorników z płaszczem (każdy z własną mieszaniną gazów), aby zapewnić równowagę między gazem a KHB.</li>
		<li>Osiągnij niedokrwienie naczyń wieńcowych poprzez podwiązanie szwem dystalnej tętnicy wieńcowej. 
		UWAGA: Podwiązanie proksymalnych tętnic wieńcowych w trybie pracy serca może spowodować śmiertelną dysfunkcję mięśnia sercowego.</li>
		<li>Wywołanie globalnego niedokrwienia naczyń wieńcowych poprzez przerwanie lub opóźnienie perfuzji wstecznej na określony czas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Langendorff, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+am+uberlebenden+saugethierherzen+%5Binvestigations+on+the+surviving+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Ges+Physiol%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart.</a> Arch Ges Physiol. 61, 291-332 (1895).</li>
<li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pressure+development+on+oxygen+consumption+by+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart.</a> Am J Physiol. 212 (4), 804-814 (1967).</li>
<li>Friehs, I., Cao-Danh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+prevents+protein+kinase+C+activation+during+hypothermic+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circ%22%5BJournal%5D)">Adenosine prevents protein kinase C activation during hypothermic ischemia.</a> Circ. 96 (9 Suppl), 221-226 (1997).</li>
<li>Aoyagi, T., Higa, J. K., Aoyagi, H., Yorichika, N., Shimada, B. K., Matsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mTOR+rescues+the+detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+in+the+heart+after+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physio.+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac mTOR rescues the detrimental effects of diet-induced obesity in the heart after ischemia-reperfusion.</a> Am J Physio. Heart Circ Physiol. 308 (12), H1530-H1539 (2015).</li>
<li>Kitahori, K., He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+left+ventricular+diastolic+dysfunction+with+preservation+of+ejection+fraction+during+progression+of+infant+right+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Development of left ventricular diastolic dysfunction with preservation of ejection fraction during progression of infant right ventricular hypertrophy.</a> Circ Heart Fail. 2 (6), 599-607 (2009).</li>
<li>Cowan, D. B., Noria, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+internalization+activates+endotoxin-dependent+signal+transduction+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide internalization activates endotoxin-dependent signal transduction in cardiomyocytes.</a> Circ Res. 88 (5), 491-498 (2001).</li>
<li>Broadley, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+coronary+vascular+responses+to+catecholamines%2C+using+a+modified+Langendorff+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">An analysis of the coronary vascular responses to catecholamines, using a modified Langendorff heart preparation.</a> Br J Pharmacol. 40 (4), 617-629 (1970).</li>
<li>Schmidt, H. D., Hoppe, H., Heidenreich, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+effects+of+dopamine%2C+orciprenaline+and+norepinephrine+on+the+right+and+left+ventricle+of+isolated+canine+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiol%22%5BJournal%5D)">Direct effects of dopamine, orciprenaline and norepinephrine on the right and left ventricle of isolated canine hearts.</a> Cardiol. 64 (3), 133-148 (1979).</li>
<li>Fawaz, G., Tutunjini, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+adrenaline+and+noradrenaline+on+the+metabolism+and+performance+of+the+isolated+dog+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharm+Chemother%22%5BJournal%5D)">The effect of adrenaline and noradrenaline on the metabolism and performance of the isolated dog heart.</a> Br J Pharm Chemother. 15, 389-395 (1960).</li>
<li>Allen, L. A., Fonarow, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hospital+variation+in+intravenous+inotrope+use+for+patients+hospitalized+with+heart+failure%3A+insights+from+Get+With+The+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Heart+Fail%22%5BJournal%5D)">Hospital variation in intravenous inotrope use for patients hospitalized with heart failure: insights from Get With The Guidelines.</a> Circ Heart Fail. 7 (2), 251-260 (2014).</li>
<li>Furnival, C. M., Linden, R. J., Snow, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inotropic+and+chronotropic+effects+of+catecholamines+on+the+dog+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The inotropic and chronotropic effects of catecholamines on the dog heart.</a> J Physiol. 214 (1), 15-28 (1971).</li>
<li>Li, J., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+effects+of+dopamine+on+systemic+hemodynamic+status+and+oxygen+transport+in+neonates+after+the+Norwood+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Coll+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Adverse effects of dopamine on systemic hemodynamic status and oxygen transport in neonates after the Norwood procedure.</a> J Am Coll Cardiol. 48 (9), 1859-1864 (2006).</li>
<li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused%2C+isolated%2C+working+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am J Physiol. 271 (2 Pt 2), H784-H789 (1996).</li>
<li>Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+biventricular+working+rat+heart+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Thor+Surg%22%5BJournal%5D)">Isolated biventricular working rat heart preparation.</a> Ann Thor Surg. 54 (5), 915-920 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ten działający model serca umożliwia ocenę wydolności komór z pełną kontrolą obciążenia wstępnego i następczego komór, ciśnienia tlenu perfuzatu, a także częstości akcji serca. Pozwala między innymi na ocenę wewnętrznego wpływu leków inotropowych na mięśnia sercowego niezależnie od obciążenia następczego i obciążenia wstępnego, co nie jest możliwe przy użyciu modelu in vivo . Ponieważ model ten wykorzystuje perfuzat krystaloidowy, umożliwia ocenę mięśnia sercowego bez ingerencji hemoglobiny, upraszczając na przykład analizę spektroskopową stanów energetycznych mięśnia sercowego. 14 W tym modelu prawe przedsionek nie jest kaniulowany jako część naszego oprzyrządowania, chociaż jest to możliwe. Celowo zdecydowaliśmy się tego nie robić, aby ułatwić pobieranie próbek przepływu z zatok wieńcowych w celu oceny zużycia tlenu przez mięsień sercowy. Co jednak ważne, prawe serce nadal wykonuje pracę ciśnieniową i objętościową w tym modelu, pompując przepływ z zatoki wieńcowej do kaniuli tętnicy płucnej. Zapewnienie pewnego obciążenia wstępnego prawej komory poprawia ustawienie przegrody komorowej i poprawia wydajność lewej komory i jest ważnym elementem tego modelu. 15
Istnieje kilka eksperymentalnych pułapek, o których należy wspomnieć. Pierwszą z nich jest początkowa kaniulacja wsteczna, którą należy wykonać celowo (tj. w czasie krótszym niż 2 minuty), aby zminimalizować okres niedokrwienia. Najważniejszą umiejętnością, którą należy opanować, jest skuteczna izolacja, przygotowanie i obsługa aorty wstępującej. Ważne jest, aby kikut aorty nie był nadmiernie przycięty, pozostawiając niewystarczającą ilość miejsca na kaniulację powyżej zastawki aortalnej. Jednak ważne jest również, aby kikut aorty nie był zbyt długi, co może powodować moment obrotowy aorty wokół kaniuli. Ważne jest również, aby kaniula aorty i korzeń aorty były odpowiednio dopasowane pod względem wielkości. Zbyt duża aorta na małej kaniuli może również prowadzić do momentu dokręcenia korzenia aorty na kaniuli. Prawa tętnica podobojczykowa zazwyczaj startuje z aorty wstępującej około 7 mm powyżej zastawki aortalnej. Identyfikacja naczyń ramienno-głowowych (o średnicy około 1 mm) podczas preparowania i przycinania aorty służy jako ważne punkty orientacyjne dla poprzecznego nacięcia aorty. Wskazane jest przycinanie aorty tuż poniżej startu pierwszej tętnicy ramienno-głowowej. Włączenie tego naczynia do przyciętego korzenia aorty zwykle prowadzi do wycieku KHB i utraty ciśnienia w korzeniu aorty po przejściu w tryb pracy serca.
Innym technicznie trudnym aspektem kaniulacji jest kaniulacja lewego przedsionka. Chociaż możliwa jest kaniulacja uszka lewego przedsionka, stwierdziliśmy, że kaniula często utknęła w wyrostku i nie przechodzi łatwo do ciała lewego przedsionka. Dlatego wolimy wykonać nacięcie w ciele lewego przedsionka, około 2 mm powyżej rowka przedsionkowo-komorowego. Ważne jest, aby przed założeniem ułożyć kaniulę lewego przedsionka w odpowiedniej płaszczyźnie, aby uniknąć rozerwania cienkościennego przedsionka podczas mocowania kaniuli.
Stwierdziliśmy, że idealny rozmiar nacięcia lewego przedsionka wynosił około 3 mm. Wykonanie zbyt małego nacięcia może również utrudnić umiejscowienie kaniuli lewego przedsionka i może doprowadzić do rozerwania lewego przedsionka. Używamy prostego, 8 mm, skośnego odcinka rurki nieprzepuszczalnej dla tlenu (średnica wewnętrzna 2,9 mm) na lewym bloku przedsionkowym. Odkryliśmy, że użycie tego, zamiast kaniuli ze ściętą krawędzią, prowadzi do najbardziej spójnej kaniulacji przedsionków i ułatwia proces zabezpieczania bloku lewego przedsionka. Niezależnie od zastosowanego drenu, ważne jest, aby upewnić się, że koniec rurki nie jest zasłonięty przez przegrodę przedsionkową lub zastawkę mitralną (jak pokazano powyżej, stwierdziliśmy, że śledzenie ciśnienia w lewym przedsionku było pomocne w tym względzie), ponieważ nawet subtelny ruch kaniuli przedsionkowej może znacząco zmienić obciążenie wstępne lewej komory i wynikające z tego pomiary hemodynamiczne. Z tego samego powodu ważne jest, aby upewnić się, że lewy przedsionek nie przecieka po otwarciu bloku lewego przedsionka. Ważne jest, niezależnie od rodzaju użytego przewodu, aby zapewnić, że rurka w tym systemie jest nieprzepuszczalna dla tlenu, aby zapewnić odpowiednie dostarczanie tlenu do serca.
Kolejnym technicznie trudnym aspektem procedury było umieszczenie cewnika ciśnieniowo-objętościowego (PV). Początkowo opowiadaliśmy się za wstecznym umieszczeniem cewnika przez blok aorty. Chociaż jest to technicznie wykonalne, stwierdziliśmy, że znacznie prostsze i celowe jest umieszczenie cewnika PV poprzez przezwierzchołkowe nakłucie. Należy zachować ostrożność w celu monitorowania położenia cewnika przez cały czas trwania eksperymentu, ponieważ czasami cewnik może przesuwać się do lub na zewnątrz lewej komory. Można to zrobić, monitorując śledzenie ciśnienia i objętości w czasie.
Na koniec należy zadbać o to, aby roztwór KHB był tworzony na świeżo dla każdego eksperymentu. Możliwe jest odważenie składników KHB i przechowywanie ich z wyprzedzeniem w stożkowych probówkach w postaci sproszkowanej. W dniu eksperymentu można je zmieszać ze sterylną, przefiltrowaną wodą, dwutlenkiem węgla/tlenem, a następnie dodać do mieszaniny wapń. Ważne jest również, aby myć system aktywnym enzymatycznie detergentem w proszku, takim jak Tergazyme (lub podobnym) i regularnie wymieniać filtr perfuzyjny.
Należy zwrócić uwagę na kilka ograniczeń tego eksperymentalnego preparatu. Po pierwsze, podobnie jak wszystkie perfuzjonowane krystaloidami preparaty Langendorffa, KHB i inne perfuzaty asanguiniczne mają znacznie zmniejszoną zdolność przenoszenia tlenu w stosunku do krwi. Chociaż jest to częściowo kompensowane przez rozszerzenie naczyń wieńcowych i suprafizjologiczny przepływ wieńcowy, z tego powodu preparat nie jest całkowicie fizjologiczny. Po drugie, ze względu na prawie nieskończoną podatność komory Windkessel zastosowanej w tym instrumencie, ciśnienie skurczowe i rozkurczowe są oddzielone tylko w minimalnym stopniu (patrz rysunek 2A), a zatem ciśnienie perfuzji wieńcowej jest niefizjologiczne. Problem ten może zostać rozwiązany w przyszłych modelach poprzez włączenie komponentu elascyjności do bloku obciążenia następczego. Po trzecie, podobnie jak w przypadku wszystkich izolowanych preparatów nasercowych, serce przechodzi określony okres (2-3 min) ciepłego niedokrwienia, które może spowodować uszkodzenie lub dysfunkcję mięśnia sercowego. Zminimalizowanie tego urazu poprzez ćwiczenie techniki ma ogromne znaczenie dla reprezentatywnych wyników. Ponadto, chociaż jest to konieczne dla dobrostanu zwierząt, wziewne środki znieczulające mogą służyć jako środek tłumiący mięsień sercowy na wczesnym etapie procesu reperfuzji, chociaż oczekuje się, że efekt ten zostanie szybko zniesiony, gdy serce zostanie ponownie zinfekowane KHB.
Opisany działający układ serca pozwala na szeroką gamę badań fizjologicznych istotnych dla opieki nad pacjentem, badań i nauczania. Dzięki kilku dodatkowym modyfikacjom system może być również wykorzystywany do symulacji ważnych elementów fizjologicznych związanych z wrodzonymi wadami serca, w tym nadciśnienia płucnego i fizjologii pojedynczej komory. Ograniczenia obejmują to, że jest to preparat ex vivo , że serce jest perfundowane przez bufor, a nie przez krew o wyższej zawartości tlenu.

Badanie izolowanych narządów pozwala na kontrolę warunków fizjologicznych wykraczających poza to, co jest możliwe in vivo. Preparaty nasercowe ex vivo zostały po raz pierwszy opisane przez Otto Langendorffa, który opisał izolowany model z perfuzją wsteczną. Następnie inni opisali model "pracującego serca", w którym mięsień sercowy wykonuje zarówno pracę ciśnieniową, jak i objętościową. 2 Takie preparaty odegrały zasadniczą rolę w wyjaśnieniu mechanizmów działania mięśnia sercowego,3 metabolizmu mięśnia sercowego,4-6 i skutków leków kardiotonicznych. 7-9
Stosowanie leków zwiększających kurczliwość mięśnia sercowego jest powszechne u pacjentów w stanie krytycznym. Dostępnych jest jednak niewiele danych porównujących względny wpływ tych leków na kurczliwość i zużycie tlenu w mięśniu sercowym, dane, które mogą być przydatne w opiece nad pacjentami z klinicznymi objawami niewydolności serca lub w warunkach pooperacyjnych. 10 Ponieważ jednak większość leków kardiotonicznych wpływa nie tylko na mięsień sercowy, ale także na opór tętniczek, pojemność żylną11 i tempo metabolizmu pacjenta12, izolowane modele serca ex vivo pozostają optymalnym sposobem badania wpływu takich leków na właściwy mięsień sercowy.
Opisujemy użycie modelu ex vivo do niezależnego od obciążenia badania leków inotropowych na czynność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Serca szczurów Sprague Dawley kaniulowano przy użyciu modelu pracującego serca lewej komory i perfuzjono za pomocą zmodyfikowanego perfuzatu Krebs Henseleit. Ciśnienie w aorcie i lewym przedsionku było kontrolowane. Cewniki o impedancji ciśnieniowo-objętościowej umieszczono w lewej komorze poprzez nakłucie wierzchołkowe w celu ciągłego monitorowania funkcji skurczowej i rozkurczowej. Zużycie tlenu mierzono w sposób ciągły jako indeksowaną różnicę w zawartości tlenu między perfuzatem lewego przedsionka a ściekiem z tętnicy płucnej. Leki, które miały być testowane, podawano w infuzji do bloku lewego przedsionka, a zmiany w wydajności serca i metabolizmie tlenu mierzono i porównywano z bezpośrednio poprzedzającą wartością wyjściową.

<table><tbody><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>8.401 g/4 L</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>0.744 g/4 L</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>1.580 g/4 L</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>0.578 g/4 L</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>0,220 g/ 4 l</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>27,584 g/4 l</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9434</td><td>7,208 g/4 l</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>1,470 g/4 l</td></tr><tr><td>Dwukomorowy model pracy serca</td><td>Aparat Harvard</td><td>IH-51</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik objętościowy ciśnieniowy</td><td>Millar, Inc</td><td>SPR-944-1</td><td>Zastosowano cewnik o rozstawie 6 mm</td></tr><tr><td>LabChart Pro 8</td><td>AD Instruments</td><td>Wersja 8.1</td><td></td></tr></tbody></table>

model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption

Izolowane modele pracującego serca zostały wykorzystane do zrozumienia wpływu warunków obciążenia, częstości akcji serca i leków na wydajność mięśnia sercowego w sposób, który nie może być osiągnięty in vivo. Na przykład leki inotropowe często wpływają również na obciążenie wstępne i następcze, co wyklucza niezależną od obciążenia ocenę ich wpływu na mięśnia sercowego in vivo. Dodatkowo model ten pozwala na pobieranie próbek ścieków z zatok wieńcowych bez zanieczyszczenia z ogólnoustrojowego powrotu żylnego, co pozwala na ocenę zużycia tlenu przez mięsień sercowy. Co więcej, pojawienie się zminiaturyzowanych cewników ciśnieniowo-objętościowych pozwoliło na precyzyjne określenie ilościowe markerów zarówno skurczowej, jak i rozkurczowej wydajności. Opisujemy model, w którym lewa komora może być badana podczas wykonywania zarówno pracy objętościowej, jak i ciśnieniowej w kontrolowanych warunkach. 
W tej technice, serce i płuca szczura Sprague-Dawley (waga 300-500 g) są usuwane en bloc w znieczuleniu ogólnym. Aorta jest wycinana bez preparacji i kaniulowana w celu perfuzji wstecznej za pomocą natlenionego buforu Krebsa. Tętnice i żyły płucne są podwiązane, a płuca są usuwane z preparatu. Lewy przedsionek jest następnie nacinany i kaniulowany za pomocą oddzielnej kaniuli żylnej, przymocowanej do bloku obciążenia wstępnego. Po ustaleniu, że jest to wolne od wycieków, lewe serce jest obciążane, a perfuzja wsteczna zostaje zatrzymana, tworząc model pracującego serca. Tętnica płucna jest nacinana i kaniulowana w celu zebrania ścieków wieńcowych i określenia zużycia tlenu przez mięsień sercowy. Cewnik ciśnieniowo-objętościowy umieszcza się w lewej komorze wstecznie lub przez nakłucie wierzchołkowe. W razie potrzeby można umieścić przewody stymulujące przedsionki, aby uzyskać bardziej precyzyjną kontrolę tętna. Model ten pozwala na precyzyjną kontrolę napięcia wstępnego (za pomocą bloku ciśnienia w lewym przedsionku), obciążenia następczego (za pomocą bloku obciążenia następczego), tętna (za pomocą przewodów stymulacyjnych) oraz napięcia tlenu (za pomocą mieszanin tlenu w perfuzacie).

Schemat w pełni opomiarowanego serca w perfuzji wstecznej (Rysunek 1A) oraz w modelu pracującego serca w lewej komorze (Rysunek 1B). Typowe zapisy ciśnienia i objętości w aorcie, lewym przedsionku i lewej komorze przedstawiono na Rysunku 2A - D. Typowe ciśnienie koniec rozkurczowe w tym modelu wynosi około 3 - 5 mmHg, a szczytowe ciśnienie skurczowe około 100 mmHg. Rysunek 2E obrazuje zmianę zapisu w lewym przedsionku podczas odsuwania kaniuli LA od przegrody przedsionkowej w trakcie jej wprowadzania i pozycjonowania. W tych eksperymentach ciśnienie w aorcie ustawiono na 90 mmHg, a ciśnienie w LA na 10 mmHg.
Aby przetestować działanie katecholamin, każdy parametr fizjologiczny (wyznaczony głównie za pomocą cewnika ciśnieniowo-objętościowego i powiązanego oprogramowania) porównano z bezpośrednio poprzedzającym go okresem bazowym. W przedstawionym przykładzie dopaminę wlewano w dawce 15 μg/kg/min do bloku przedsionka lewego. Chociaż ciśnienie koniec rozkurczu jest identyczne w obu warunkach (ze względu na stałe ciśnienie w przedsionku w tym modelu), objętość koniec rozkurczu lewej komory zmniejsza się o 2,5%, a objętość koniec skurczu lewej komory zmniejsza się o 4,9%, co skutkuje zwiększeniem objętości wyrzutowej (Ryc. 3A). W porównaniu z infuzjami placebo, praca skurczowa lewej komory, zdefiniowana jako pole powierzchni wewnątrz krzywej ciśnieniowo-objętościowej, wzrosła o 32% podczas leczenia dopaminą (Ryc. 3B, P &lt; 0.001, test t, n = 10 na grupę). Wiązało się to z większym wzrostem zużycia tlenu przez mięsień sercowy w porównaniu z infuzjami placebo (Ryc. 3C). W ten sposób można porównać względną moc i koszty energetyczne różnych leków kardiotonicznych oraz ich dawek, niezależnie od ich wpływu na warunki obciążenia.
<img alt="Schemat przepływu w układzie sercowo-naczyniowym z blokadą aorty i cewnikiem ciśnienie-objętość; przedstawia dynamikę infuzji." src="/files/ftp_upload/54149/54149fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przepływu w w pełni opomiarowanym sercu w trybie perfuzji wstecznej i trybie pracującego serca. (Panel A: tryb Langendorffa; Panel B: tryb pracującego serca. W trybie retrogradnym KHB jest infundowany pod ustalonym ciśnieniem perfuzyjnym do pierścienia aorty. Tryb ten jest wykorzystywany w celu regeneracji mięśnia sercowego po czasie niedokrwienia oraz podczas instrumentacji. W trybie pracującego serca perfuzat przepływa przez lewą część serca przed perfuzją krążenia wieńcowego. W tym trybie mięsień sercowy musi sam generować ciśnienie perfuzyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>
<img alt="Krzywe ciśnienia i objętości serca; schemat ciśnienia w zatoce aorty, lewym przedsionku, LV oraz objętości w funkcji czasu." src="/files/ftp_upload/54149/54149fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne zapisy ciśnienia i objętości uzyskane podczas pomiarów bazowych. (A) Przedstawiono zapisy ciśnienia w zatoce aorty, (B) ciśnienia w lewym przedsionku, (C) ciśnienia w lewej komorze oraz (D) objętości lewej komory podczas pomiaru bazowego. Objętość wyrzutowa, praca wyrzutowa, rzut serca, tau oraz inne parametry mogą być automatycznie obliczane i wyświetlane w czasie rzeczywistym przez oprogramowanie. Spłaszczony zapis ciśnienia w lewym przedsionku (E) związany z niskim rzutem serca w trybie pracującego serca może być sygnałem, że kaniula jest nieprawidłowo umieszczona w lewym przedsionku. Należy zauważyć, że wyraźna fala v w prawidłowo umieszczonym zapisie ciśnienia w lewym przedsionku jest częstym zjawiskiem, prawdopodobnie wynikającym ze zmniejszonej podatności lewego przedsionka u w pełni instrumentowanego zwierzęcia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres funkcji serca; diagram ciśnienia komory względem objętości wraz z wykresami słupkowymi pracy skurczowej i zużycia tlenu." src="/files/ftp_upload/54149/54149fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Wpływ dopaminy na krzywą ciśnienie-objętość. Wlew dopaminy powoduje przesunięcie krzywej PV w lewo (A), w tym zwiększenie objętości wyrzutowej i zmniejszenie objętości końcowoskurczowej w porównaniu z pomiarami wyjściowymi. Należy zauważyć, że kształt niektórych komponentów tych krzywych PV różni się od tych typowo mierzonych in vivo (patrz Rycina 4) ze względu na brak elastancji tętniczej i żylnej. (B) W stosunku do bezpośrednio poprzedzającej linii bazowej, praca skurczowa wzrosła znacznie bardziej podczas wlewów dopaminy niż placebo (**, P = 0,0017, test t), podobnie jak zużycie tlenu przez mięsień sercowy (*, P = 0,013, test t, C). W tym modelu średnie zużycie tlenu przez mięsień sercowy w stanie wyjściowym wynosiło 0,22 ± 0,02 mmol O2/gram tkanki/minutę, przy szacowanej zawartości tlenu rozpuszczonego w soli fizjologicznej wynoszącej 165 µmol/L w temperaturze 40 °C. Takie pomiary mogą być wykorzystane do porównania zużycia tlenu przez mięsień sercowy pod wpływem różnych leków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zależność ciśnienie-objętość, schemat cyklu serca; ESPVR/EDPVR, elastyczność, inotropia, preload." src="/files/ftp_upload/54149/54149fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza pętli ciśnienie-objętość. Przedstawiona teoretyczna pętla ciśnienie-objętość opisuje prawidłowy cykl pracy serca. Po zamknięciu zastawki aorty (AV) (1) następuje skurcz izowolumetryczny (1 - 2), gdy ciśnienie w komorze spada poniżej ciśnienia w przedsionku. Czas trwania tej fazy reprezentuje Tau. Następnie zastawka mitralna (MV) otwiera się jednocześnie z skurczem przedsionka, wypełniając komorę (2 - 3). Systole rozpoczyna się następnie od skurczu izowolumetrycznego (3 - 4), aż ciśnienie w komorze przekroczy rozkurczowe ciśnienie tętnicze, w którym momencie otwiera się zastawka AV. Objętość wyrzutowa jest różnicą między liniami 1 - 2 a 3 - 4. Praca wyrzutowa to pole powierzchni wewnątrz krzywej 1 - 2 - 3 - 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54149/54149fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Izolowane modele pracującego serca mogą być używane do pomiaru wpływu warunków obciążenia, tętna i leków na wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu. Opisano metody przygotowania modelu pracy lewego serca gryzonia, który pozwala na badanie wydolności skurczowej i rozkurczowej oraz zużycia tlenu w różnych warunkach.

Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

Isolated working heart models have been used to understand the effects of loading conditions, heart rate and medications on myocardial performance in ways ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie izolowanego modelu pracującego lewego serca gryzoni, który umożliwia precyzyjną kontrolę warunków obciążenia komór. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fizjologii układu sercowo-naczyniowego, w tym dotyczące wpływu leków na kurczliwość mięśnia sercowego, wydajność tkanek oraz zużycie tlenu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość precyzyjnej kontroli warunków obciążenia serca.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ sekcja i izolacja aorty, granulacja lewego przedsionka oraz izolacja żył płucnych wymagają wprawy i praktyki w celu ich opanowania. Po zastosowaniu odpowiedniej sedacji, analgezji i przeciwkrzepliwości za pomocą heparyny, należy rozpocząć operację na szczurze dawcy. Najpierw odsunąć skórę od jamy brzusznej za pomocą pęsety i użyć nożyczek do nacięcia jamy otrzewnowej.Podążaj wzdłuż krzywizny przepony z powrotem do tylnego kąta żeber. Po odsłonięciu przepony użyj nożyczek, aby przeciąć jej powierzchnię przednią w linii z wcześniejszymi cięciami, aby uzyskać dostęp do klatki piersiowej. Przedłuż każde cięcie obustronnie wzdłuż linii pachowej aż do pachy.Następnie za pomocą pęsety odsunąć klatkę piersiową do przodu, zaczynając od wyrostka mieczykowatego. Następnie naciąć osierdzie i opłucną. Działać sprawnie, ponieważ po nacięciu przepony wentylacja zostaje upośledzona.Zidentyfikuj żyłę główną dolną i aortę tuż nad przeponą, a następnie za pomocą tępych pincetek odsunij je w kierunku przednim. Następnie, używając dużych zakrzywionych nożyczek, szybko przetnij żyłę główną dolną i aortę. Nie przecinając aorty wstępującej, przetnij przełyk, tchawicę, tętnice szyjne wspólne oraz żyły w kierunku głowowym.Następnie wyciąć tkankę grasicy wraz z sercem i płucami w jednym bloku. Bezzwłocznie zanurzyć serce i płuca w lodowatym roztworze KHB i przenieść do aparatu Langendorffa. Umieścić kompleks serca i płuc w płaskim naczyniu, orientując serce tak, aby grasica i duże naczynia były skierowane w stronę eksperymentatora.A tylna część płuc skierowana jest w stronę stołu. Następnie rozsunąć dwa płaty grasicy i zidentyfikować miejsce odchodzenia tętnic szyjno-obojczykowych od aorty. Teraz przerzucić aortę przez krawędź naczynia.Następnie, używając małych nożyczek, przetnij aortę około pięciu milimetrów powyżej zastawki aortalnej, bezpośrednio przed odgałęzieniem prawej tętnicy podobojczykowej. Wymagane jest uzyskanie okrągłego przekroju poprzecznego. Powtarzaj cięcie, aż zostanie ono prawidłowo wykonane.Poniższa mikroskopia wideo wyjaśnia kluczowy etap tej procedury: dysekcję i przecięcie aorty w ramach przygotowania do kaniulacji. Jak pokazano tutaj, grasicę należy przeciąć w połowie, po czym łatwo będzie ją rozdzielić. Należy używać delikatnych ruchów zakrzywioną pęsetą, aby rozciąć osierdzie i odsunąć tkanki otaczające aortę.Należy unikać stosowania nadmiernej siły. Kikut tętnicy beznazwisnej powinien zostać zidentyfikowany i chwycony jako punkt trakcji aorty. Następnie aortę należy naciąć poprzecznie za pomocą małych, ostrych nożyczek w połowie odległości między zastawką aorty a odejściem tętnicy podobojczykowej.Jeśli cięcie zostanie wykonane zbyt wysoko, aorta staje się nadmiarowa, co może prowadzić do skręcania serca wokół kaniuli. Alternatywnie, z kikuty tętnicy szyjnej głównej może wyciekać bufor przeciwskurczowy. Jeśli cięcie jest zbyt krótkie, końcówka kaniuli może przejść przez zastawkę aortalną.Następnie, używając dwóch par zakrzywionych pincet, nasuń aortę na kaniulę aortalną, z której powoli powinny kapać roztwór KHB. Zastawka aortalna powinna znajdować się jeden do dwóch milimetrów poniżej końcówki kaniuli. Następnie zmień położenie pincet tak, aby znajdowały się prostopadle do aorty, i unieruchom ją w tej pozycji.Można również użyć zacisku. Następnie asystent powinien za pomocą szwu jedwabnego 4-0 przymocować kaniulę, zawiązując kilka węzłów po obu stronach serca. Teraz całkowicie otwórz kaniulę, aby rozpocząć pełny wsteczny przepływ aortalny.Serce powinno bić energicznie. Jednym z potencjalnych błędów jest przesunięcie się końcówki kaniuli aortalnej przez zastawkę aortalną do lewej komory. Jak pokazano tutaj, w takim przypadku serce będzie wyglądać na blade, a lewy przedsionek będzie rozszerzony.Należy to natychmiast skorygować, krótko zatrzymując przepływ wieńcowy i przesuwając serce w dół na kaniuli aorty. Należy pamiętać, że tkanka aorty u gryzoni jest krucha i łatwo ulega przerwaniu. Inną potencjalną trudnością jest nieszczelność w obrębie korzenia aorty, wynikająca albo z przerwania tkanki, albo ze zbyt wysokiego cięcia aorty, co powoduje wyciek KHB przez tętnicę szyjno-głowową.Można to rozwiązać poprzez zatrzymanie przepływu wieńcowego, odłączenie serca od kaniuli aorty i zmianę jego położenia. Celem tego kroku jest stworzenie zamkniętego układu, w którym całe ciśnienie z bloku obciążenia wstępnego jest przekazywane do struktur lewej części serca. Niecałkowite zamknięcie żył płucnych może prowadzić do utraty obciążenia wstępnego, może spowodować niestabilność preparatu serca lub sfałszować wyniki.Ręcznie obróć kaniulę aortalną tak, aby tylna część serca była skierowana w stronę operatora. Następnie wypreparuj naczynia prowadzące do lewego płuca. Aby ułatwić dostęp do naczyń, użyj pęsety do odsunięcia tkanki lewego płuca.Następnie użyj pojedynczego chirurgicznego klipsa średniego, aby zamknąć lewą tętnicę płucną, żyłę płucną oraz oskrzele. Następnie wyresektuj lewe płuco dystalnie względem klipsa. Teraz powtórz tę procedurę na prawym płucu.W przypadku całkowitego zamknięcia obu tętnic płucnych, prawe przedsionek ulegnie rozszerzeniu, a u serca może wystąpić bradykardia. W razie potrzeby należy zastosować dodatkowe klipsy lub szwy w celu uszczelnienia wycieków i sprawnej pracy. Teraz należy wykonać nacięcie tętnicy płucnej.Obrócić kaniulę aortalną, aby uzyskać dostęp do przedniej ściany serca i zidentyfikować tętnicę płucną. Za pomocą małych nożyczek wykonać nacięcie poprzeczne około 3 mm powyżej zastawki płucnej. Tętnica płucna może zostać teraz zakaniulowana w późniejszym etapie.Następnie przeprowadź kaniulację lewego przedsionka. Patrząc na lewy przedsionek, użyj małych nożyczek, aby wykonać nacięcie o długości od dwóch do trzech milimetrów w górnej części lewego przedsionka, około trzech milimetrów powyżej bruzdy przedsionkowo-komorowej. Następnie umieść kaniulę lewego przedsionka prostopadle do płaszczyzny zastawki mitralnej, kierując ją w stronę przegrody przedsionków.Otwórz lewą kaniulę przednią, aż ciepły KHB zacznie widocznie przepływać. Upewnij się, że KHB jest ciepły w dotyku, w przeciwnym razie może wystąpić hipotermia. Podczas kaniulacji zmień przepływ KHB na tempo kroplowe.Teraz, używając pincety do utrzymania przeciwciągu, wprowadź kaniulę przedsionkową do wnętrza lewego przedsionka. Nie należy używać nadmiernej siły, ponieważ przedsionek jest delikatny. Ustaw kaniulę tak, aby znajdowała się w środku przedsionka, nie wywierając nacisku na jego ścianę.Następnie przymocuj kaniulę do przedsionka za pomocą szwu jedwabnego 4-0, prowadząc go wokół ciała lewego przedsionka, obejmując również jego tylną ścianę. W razie potrzeby dodaj kolejne szwy. Po uszczelnieniu wycofaj kaniulę o 1–2 mm, aby znajdowała się w środkowej części przedsionka, a nie opierała się o przegrodę przedsionkową.Można to sprawdzić, analizując przebieg fali w lewym przedsionku. Teraz całkowicie otwórz zawór kaniuli, aby podać pełny preload do lewego przedsionka. Kluczowe jest monitorowanie szybkości kapania z serca.Poziom powinien być stabilny podczas otwarcia kaniuli. Jeśli tak nie jest, należy ponownie zawiązać przedsionek wokół kaniuli, aby uszczelnić wyciek, który prawdopodobnie jest przyczyną problemu. Aby zmierzyć stężenie substancji w odpływie wieńcowym, takich jak gazy, leki lub cytokiny, należy wprowadzić elastyczną rurkę do nacięcia w tętnicy płucnej.Aby umożliwić ciągły pomiar ciśnienia i objętości, należy wprowadzić skalibrowany cewnik do pomiaru przewodnictwa ciśnienie-objętość (PVC) do lewej komory. Najlepiej wykonać to w sposób wsteczny, poprzez zastawkę aortalną. W przypadku trudności technicznych zabieg ten można przeprowadzić również poprzez punkcję koniuszkową komory.Wartość DPDT max powinna wynosić co najmniej 3500 do 4000, aby przygotowanie było odpowiednie. Zbieraj odciek z zatoki wieńcowej z tętnicy płucnej oraz z serca do cylindra mierowego w celu ilościowego określenia przepływu wieńcowego w czasie. Następnie oblicz zużycie tlenu przez mięsień sercowy.Na koniec wyłącz pompę aortową w trybie wstecznym, aby przejść w tryb pracy serca. Perfuzja wsteczna została przygotowana zgodnie z opisem. Podczas konfiguracji przepływ był początkowo wsteczny.Po wyłączeniu pompy wstecznej przepływ zmienił się na przedni, tworząc pracujące serce. Typowe ciśnienie końcoworozkurczowe w tym modelu wynosi od trzech do pięciu mm Hg. Natomiast szczytowe ciśnienie skurczowe wynosi około 100 mm Hg.Gdy kaniulę lewego przedsionka odsunięto od przegrody przedsionkowej, można było wykryć zmianę w zapisie lewego przedsionka. W tych eksperymentach ciśnienie aortalne ustawiono na 90 mmHg, a ciśnienie w lewym przedsionku na 10 mmHg. W jednym z eksperymentów do bloku lewego przedsionka infundowano dopaminę w dawce 15 µg/kg/min.Mimo że ciśnienie koniec rozkurczowe pozostało bez zmian, dopamina spowodowała zmniejszenie objętości końcoworozkurczowej lewej komory o 2,5% oraz zmniejszenie objętości końcowoskurczowej lewej komory o 4,9%, co doprowadziło do zwiększenia objętości wyrzutowej. W porównaniu z infuzjami placebo, praca skurczowa lewej komory, zdefiniowana jako pole pod krzywą ciśnienie-objętość, wzrosła o 32% podczas leczenia dopaminą. Wiązało się to również z większym wzrostem zużycia tlenu przez mięsień sercowy.Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w 15 minut, pod warunkiem że zostanie przeprowadzona prawidłowo.

rodent-working-heart-model-for-study-myocardial-performance-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Perfuzja izolowanego serca w trybie Langendorffa, w połączeniu ze spektroskopią NMR 31P, łączy dziedziny biochemii i fizjologii w jednym eksperymencie. Protokół ten umożliwia dynamiczny pomiar zawartości i obrotu fosforanów wysokoenergetycznych w sercu przy jednoczesnym monitorowaniu funkcji fizjologicznych. Prawidłowo wykonana, technika ta stanowi cenne narzędzie w ocenie energetyki serca.

Ocena funkcji i energetyki serca w izolowanych sercach myszy z wykorzystaniem spektroskopii 31P NMR

Celem jest monitorowanie stanu redoks mitochondriów w izolowanych sercach w kontekście fizjologicznych ciśnień obciążenia wstępnego i następczego. Przedstawiono biventrykularny model pracującego serca królika. Do monitorowania stanu redoks mitochondriów w tkance epikardialnej wykorzystano obrazowanie fluorescencyjne NADH o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.

Obrazowanie fluorescencyjne NADH w izolowanych, pracujących sercach królika z obiema komorami

Większość badań z udziałem aparatu Langendorffa wykorzystuje małe modele zwierzęce ze względu na zwiększoną złożoność systemów dla większych ssaków. Opisujemy system Langendorffa dla dużych modeli zwierzęcych, który pozwala na zastosowanie go u różnych gatunków, w tym ludzi, i stosunkowo łatwe pozyskiwanie danych.

Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie do ilościowego pomiaru szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego. Omówiono również metody stosowane do analizy próbek i interpretacji danych.

Metody oznaczania szybkości utleniania glukozy i kwasów tłuszczowych w izolowanym sercu szczura pracującego

Ten protokół pokazuje proste i elastyczne podejście do oceny nowych czynników kondycjonujących lub strategii zwiększających wykonalność dawstwa serca po śmierci krążeniowej.

Przedkliniczny model dawstwa serca po śmierci krążeniowej

Celem tego badania było ustalenie metody badania dynamiki serca za pomocą translacyjnego modelu zwierzęcego. Opisane podejście eksperymentalne obejmuje optokardiografię podwójnej emisji w połączeniu z badaniem elektrofizjologicznym w celu oceny aktywności elektrycznej w izolowanym, nienaruszonym modelu serca świni.

Badania optokardiograficzne i elektrofizjologiczne serca perfundowanego ex vivo Langendorffem

Opisujemy tworzenie szczurzego modelu umiarkowanego przemodelowania wywołanego przeciążeniem ciśnieniem i wczesnej dysfunkcji skurczowej, gdzie aktywowane są szlaki transdukcji sygnału zaangażowane w inicjację procesu przebudowy. Ten model zwierzęcy pomoże w identyfikacji celów molekularnych do zastosowania wczesnych strategii terapeutycznych zapobiegających przebudowie niewydolności serca.

Szczurzy model przeciążenia ciśnieniem wywołał umiarkowaną przebudowę i dysfunkcję skurczową, w przeciwieństwie do jawnej skurczowej niewydolności serca

Ten artykuł przedstawia skuteczną metodę przeprowadzenia niedokrwienia mięśnia sercowego i następującej po nim przewlekłej reperfuzji u szczurów przy użyciu minimalnie inwazyjnego podejścia. Ponadto funkcję hemodynamiczną lewej komory szczurów ocenia się za pomocą echokardiografii i izolowanych metod pracy serca.

Półminimalnie inwazyjna metoda indukcji zawału mięśnia sercowego u szczurów i ocena czynności serca przez izolowany działający układ serca

Model niedokrwienno-reperfuzyjny serca szczura został ulepszony dzięki zastosowaniu samodzielnie wykonanego retraktora, rurki z polichlorku winylu i unikalnej metody wiązania. Wyniki elektrokardiogramu, chlorku trifenylotetrazolu i barwienia histologicznego oraz analizy procentowej przeżycia wykazały, że ulepszona grupa modelowa ma wyższe wskaźniki sukcesu i przeżycia niż już istniejąca grupa modelowa.

Ulepszony model niedokrwienia mięśnia sercowego i uszkodzenia reperfuzyjnego u gryzoni

Opisujemy protokół ex vivo izolowanego działania na szczurzym sercu, aby przetestować strategie zachowania serca dawcy. W artykule opisano protokół stosowania w statycznym przechowywaniu serc dawców gryzoni w chłodniach; Jednak protokół może być również stosowany w przypadku serc dawców uzyskanych po dawstwie po śmierci krążeniowej i śmierci mózgu.

Wykorzystanie izolowanego modelu pracującego serca szczura do testowania strategii zachowania serca dawcy

Poznaj izolowany model pracującego serca gryzoni do precyzyjnej kontroli warunków obciążenia komór. Ta metoda pozwala badać wydajność mięśnia sercowego i zużycie tlenu w kontrolowanych warunkach.

Model pracującego serca gryzoni do badania wydajności mięśnia sercowego i zużycia tlenu

Przeglądaj więcej filmów