Jednoczesna rejestracja elektroretinografii i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów
July 1st, 2016
Ten protokół opisuje jednoczesny pomiar elektroretinogramu i wzrokowych potencjałów wywołanych u znieczulonych szczurów.
Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesny pomiar elektroretinogamu i wizualnego potencjału wywołanego u szczura. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki szczelinowej. Na przykład, czy efekt starzenia się lub chorób wpływa na niektóre elementy ścieżki wzrokowej.
Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia kompleksową ocenę funkcji siatkówki i jej wpływu na wzrokowo-wywołaną funkcję korową. Aby rozpocząć tę procedurę, wstępnie uformuj wykonane na zamówienie nieaktywne elektrody ERG, przecinając srebrny drut o długości 70 milimetrów i tworząc pętlę o średnicy ośmiu milimetrów, aby otoczyć oko szczura. Przygotuj jednolity okrąg i dostosuj rozmiar pętli, kształtując ją na jednomilimetrowej końcówce główki rury.
Jest to ważne, ponieważ zbyt mały pierścień może nieumyślnie podnieść ciśnienie śródstawowe, podczas gdy zbyt duży pierścień może zwiększyć zmienność sygnałów. Następnie wstępnie uformuj wykonaną na zamówienie nieaktywną elektrodę VEP, wycinając srebro o długości 70 milimetrów. I tworzy elipsę o średnicy ośmiu milimetrów, aby zaczepić się o siekacze szczurów.
Następnie wstępnie uformuj wykonane na zamówienie aktywne elektrody ERG, przecinając 30-milimetrowy drut srebrny i tworząc małą pętlę o średnicy około jednego do dwóch milimetrów, która służy do delikatnego kontaktu z rogówką szczura przy minimalnych otarciach rogówki. Następnie bezpiecznie przymocuj elektrody do przewodów elektrod, splatając srebro z odsłoniętym drutem wewnętrznym. Zaizoluj nadmiar odsłoniętego metalu taśmą maskującą, aby zmniejszyć artefakty fotowoltaiczne.
W przypadku elektrod aktywnych ERG można nałożyć więcej warstw taśmy maskującej, aby uzyskać grubsze i sztywniejsze owinięcie, dzięki czemu elektroda jest łatwiejsza do trzymania za pomocą mikromanipulatora. Na każdej nieaktywnej elektrodzie ERG przyklej mały kawałek zapięcia na rzep do taśmy maskującej, aby umożliwić stabilne przymocowanie do paska na szyję gryzonia. Następnie dla każdej aktywnej elektrody VEP przymocuj zacisk krokodylkowy do wewnętrznego przewodu elektrody.
Bezpośrednio przed nagraniami należy pokryć galwanicznie odsłonięte powierzchnie srebrnych drutów chlorkiem, aby poprawić przewodzenie sygnału. Aby to zrobić, podłącz katodę do ujemnego bieguna akumulatora i zanurz drugi koniec w soli fizjologicznej. Następnie zanurz srebrną końcówkę przewodu anodowego w zwykłej soli fizjologicznej i podłącz drugi koniec tego drutu elektrody do dodatniego zacisku dziewięciowoltowego akumulatora.
Odłącz je po 20 sekundach, a srebrna końcówka drutu elektrody powinna być równomiernie pokryta na biało. Powtórz procedurę chlorowania dla wszystkich srebrnych elektrod ERG i VEP. W tej procedurze należy trzykrotnie zdezynfekować ogolony obszar znieczulonego zwierzęcia 10% jodowidonem.
Wykonaj strzałkowe nacięcie wzdłuż linii środkowej głowy za pomocą skalpela i wytnij okrąg tkanki skórnej o średnicy 20 milimetrów, aby odsłonić kość czaszki. Następnie usuń leżącą poniżej okostną, zeskrobując i osuszając gazą, aby odsłonić szwy czaszkowe koronalne i strzałkowe. Wywierć dwa otwory w czaszce na obu półkulach.
Wkręć ze stali nierdzewnej w dwa wstępnie wykonane otwory na głębokość jednego milimetra, aby umożliwić mocne zakotwienie. Następnie przygotuj obszar operacyjny do amalgamatu dentystycznego, osuszając kość czaszki gazą i cofając skórę za pomocą dwóch szwów. Następnie rozprowadź amalgamat dentystyczny na odsłoniętej czaszce, aby zabezpieczyć elektrody śrubowe na miejscu i upewnić się, że około 1,5 milimetra jest odsłoniętych do nagrywania.
Następnie usuń szwy zwijające. W przypadku nagrań skotopowych wszystkie zabiegi wykonywane są w ciemnym pomieszczeniu. Dla celów ilustracyjnych, pozycjonowanie elektrod odbywa się tutaj przy normalnym oświetleniu pomieszczenia.
Zwierzę było przystosowane do ciemności przez 12 godzin i znieczulone ketaminą i ksylazyną. Po rozszerzeniu źrenicy i znieczuleniu miejscowym zaczepić nieaktywną elektrodę VEP o dolne siekacze. Następnie umieść zwierzę na platformie ERG przed miską Ganzfelda znajdującą się w klatce Faradaya.
Przymocuj zwierzę do platformy za pomocą paska zapięcia na rzep umieszczonego mocno, ale nie ciasno wokół karku. Następnie ustaw nieaktywne elektrody ERG, nieinwazyjnie otaczając pierścień skórny wokół równika oczu. Około trzy metry za rąbkiem.
Ustabilizuj to, mocując elektrodę do paska mocującego na rzep wokół karku. Powtórz procedurę dla oka przeciwległego. Teraz przymocuj aktywne elektrody VEP, przymocowując zaciski krokodylkowe do ze stali nierdzewnej, wstępnie wszczepionych w czaszkę.
Przed umieszczeniem aktywnej elektrody ERG umieść niewielką kroplę 1% karboksymetylocelulozy sodu na elektrodzie, aby poprawić jakość sygnału. Ustaw aktywne elektrody ERG tak, aby delikatnie dotykały środkowej powierzchni rogówki za pomocą mikromanipulatora przymocowanego do specjalnie zbudowanego ramienia stereotaktycznego. Upewnij się, że sól sodowa karboksymetylocelulozy styka się tylko z rogówką, a nie ze skórką, wycierając nadmiar płynu.
Następnie włóż od dwóch do pięciu milimetrów elektrody igłowej ze stali nierdzewnej podskórnie do ogona. Przesuń platformę bliżej misy Ganzfelda i upewnij się, że oczy zwierzęcia są wyrównane z otworem miski, aby umożliwić równomierne oświetlenie obu siatkówk. Następnie zamknij klatkę Faradaya, aby zredukować zewnętrzny hałas.
Korzystając z powyższego protokołu, można zarejestrować stos kształtów fal ERG w odpowiedzi na szereg bodźców, przy czym najciemniejszy błysk jest pokazany na dole, a najjaśniejszy na górze. Przy bardzo słabym oświetleniu można rejestrować skotopowe reakcje progowe. Wraz ze wzrostem jasności bodźca, formy fal zostają zdominowane przez falę B, a następnie ujemna fala A pojawia się przy najjaśniejszych bodźcach.
Funkcję fotoreceptora pręcika można oznaczyć za pomocą P3 do modelowania fali A. Rysunek ten pokazuje, że amplituda P2 rośnie wraz ze wzrostem energii bodźca. Funkcję komórek dwubiegunowych pręcików można oznaczyć, modelując teorie odpowiedzi intensywności pręcika P2 za pomocą funkcji naka rushtin.
Funkcja komórek zwojowych siatkówki jest oznaczana przy słabych energiach świetlnych i określana ilościowo za pomocą amplitudy i czasu piku pSTR. Funkcja dwubiegunowej komórki stożkowej jest wywoływana za pomocą sparowanego paradimu błysku i określana ilościowo przez amplitudę i czas piku stożka P2. Analiza amplitudy VEP jest traktowana jako amplitudy piku trofy i trofa do piku, co daje czas tych reakcji.
Amplituda form fali VEP wzrasta wraz ze wzrostem energii bodźca. Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu około 30 do 45 minut, nie licząc czasu na przygotowanie elektrody i umieszczenie elektrody oraz adakadaptację. Podczas wykonywania tej procedury szczególnie ważne jest, aby zwrócić uwagę na to, jak dokładnie umieszczasz elektrody i pozostawiasz wystarczająco dużo czasu na adaptację.
Po tej procedurze można wykonać inne procedury, takie jak modyfikacja choroby lub terapie, aby odpowiedzieć na konkretne pytania. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i umieścić elektrody, a także jak rejestrować i analizować kształty fal ERG i VEP.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje jednoczesne pomiary elektroretinogramu i wzrokowo wywołanych potencjałów w wyczulonych szczurach. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurologii szczelin, szczególnie dotyczących wpływu starzenia się lub chorób na ścieżkę wzrokową.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Przetwarzanie wzrokowe
Tło
- Elektroretinogram (ERG) mierzy funkcję siatkówki.
- Wzrokowo wywołane potencjały (VEP) oceniają kortykalne przetwarzanie wzrokowe.
- Rozumienie składowych ścieżki wzrokowej jest kluczowe dla badań neuronaukowych.
- Wiek i choroby mogą wpływać na funkcję wzrokową.
Cel badania
- Wykonanie jednoczesnych pomiarów ERG i VEP u szczurów.
- Ocena wpływu starzenia się i chorób na ścieżki wzrokowe.
- Dostarczenie kompleksowej oceny funkcji siatkówki i kory.
Stosowane metody
- Przygotowanie niestandardowych elektrod ERG za pomocą drutu srebrnego.
- Umieszczenie elektrod wokół oka szczura.
- Jednoczesne rejestrowanie sygnałów ERG i VEP.
- Analiza danych w celu oceny funkcji wzrokowej.
Główne wyniki
- Udane pomiary zarówno ERG, jak i VEP u wyczulonych szczurów.
- Identyfikacja zmian w składowych ścieżki wzrokowej z powodu starzenia się lub chorób.
- Demonstracja skuteczności metody w kompleksowej ocenie wzroku.
- Wgląd w interakcje między siatkówką a korą w przetwarzaniu wzrokowym.
Konkluzje
- Ta technika pozwala na szczegółowe badanie funkcji wzrokowej w modelach zwierzęcych.
- Może pomóc wyjaśnić wpływ różnych czynników na ścieżki wzrokowe.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć rozumienie przetwarzania wzrokowego w zdrowiu i chorobie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Simultaneous ERG and VEP recording enables comprehensive assessment of retinal-to-cortical visual pathway integrity in preclinical models. This dual-modality approach supports mechanistic de-risking by linking retinal dysfunction to upstream cortical effects, informing target validation in neurodegenerative and ophthalmic disease research. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, translatable electrophysiological readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating retinal electrophysiological changes with cortical visual processing deficits.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous measurement of retinal and visual pathway responses to light stimulation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate specific visual pathway components (e.g., rod bipolar, retinal ganglion cell function).
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline retinal and cortical electrophysiological profiles.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantitative outputs (e.g., P2 amplitude, pSTR peak) for reliable compound screening.
- Scalability: Facilitates platform reuse across disease models due to consistent electrode preparation and signal acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains translational continuity by assessing disease-relevant visual pathway alterations from retina to cortex.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through amplitude and timing analysis of ERG and VEP waveforms.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether retinal changes drive cortical dysfunction or occur independently, reducing false positives in target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, providing electrophysiological biomarkers of visual pathway integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological manipulations affect retinal neuronal and glial cell class responses.
- Screening: Enables assay readiness via stable, low-noise signal acquisition after electrode chloridation and proper dark adaptation.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (ERG A/B waves, VEP peak-to-peak amplitude) for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by modeling retinal ganglion and cone bipolar cell function using established intensity-response paradigms.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for chronic studies due to stable electrode implantation and standardized recording parameters.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by distinguishing retinal versus cortical contributions to visual deficits.
- Operational Value: Ensures standardization through detailed electrode preparation (silver wire chloridation, loop sizing) and placement protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target modulation to functional visual pathway outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on dose-responsive changes in scotopic threshold responses and VEP amplitude.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microsurgery, and electrode fabrication for stable signal acquisition.
- Depends on instrumentation including Ganzfeld stimulator, Faraday cage, micro-manipulator, and differential amplifiers.
- Necessitates cross-team standardization of dark adaptation protocols and stimulus intensity ranges for reproducible data.
- Involves adaptation considerations across rodent strains and anesthesia regimens affecting pupil dilation and corneal sensitivity.
- Practical limitations include signal variability from improper electrode sizing or inadequate chloridation, as noted in the protocol.
