Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych
13 lipca 2016
Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.
Ogólnym celem tej techniki jest efektywne przetwarzanie długich odcinków tkanki jelitowej myszy w celu uzyskania jednolitego barwienia histologicznego na całej jej długości. Aby uzyskać odcinki jelita, mogą występować różnice w barwieniu na całej długości jelita. Próbowałem użyć standardowej szwajcarskiej techniki walcowania, ale okazało się, że daje ona tkankę jelitową, która jest bardzo sztywna i niełatwa do otwarcia.
Po kilku eksperymentach wymyśliłem metodę szybkiego utrwalania, która wykorzystuje mniej toksycznych chemikaliów i pozwala na znacznie lepsze szwajcarskie zwijanie tkanki jelitowej. Zmodyfikowany utrwalacz może być używany do szybkiego mocowania innych grubych tkanek. W ramach przygotowań poddać zwierzę testowe eutanazji zgodnie z protokołem tekstowym i przygotować ustawienie chirurgiczne.
Na początek użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby wykonać boczne nacięcie w środku brzucha około jednego do dwóch centymetrów poniżej klatki piersiowej, w zależności od wielkości myszy. Następnie delikatnie rozsuń i odetnij skórę, aby odsłonić mięśnie brzucha. Następnie chwyć i podciągnij mięśnie, nie trzymając ani nie ciągnąc za jelita.
Następnie ostrożnie wykonaj wstępne nacięcie w mięśniach brzucha i ostrożnie je przetnij, aby odsłonić jelita. Teraz zidentyfikuj okrężnicę i prześledź ją do dystalnego końca, gdzie łączy się z odbytnicą. Następnie za pomocą nożyczek przeciąć okrężnicę jak najbliżej otworu odbytu.
Następnie znajdź miejsce, w którym żołądek łączy się z jelitem cienkim i za pomocą nożyczek odetnij jelita około jednego centymetra od żołądka. Teraz przenieś całą długość wolnego jelita cienkiego i okrężnicy na czystą szalkę Petriego zawierającą PBS. Następnie zabezpiecz dystalny koniec jelita grubego i delikatnie rozplątaj całą długość jelita grubego, usuwając wszelkie przyczepione tkanki krezkowe.
Następnie zidentyfikuj jelito ślepe i przeciąć jelito, w którym jelito ślepe łączy się z okrężnicą, izolując w ten sposób okrężnicę. Podobnie rozplątać resztę jelita cienkiego z przyczepionej krezki, tkanki łącznej i tłuszczowej. Następnie przeciąć jelito cienkie w miejscu, w którym łączy się z jelitem ślepym.
Jelito ślepe można następnie usunąć i wyrzucić. Teraz napełnij 10-mililitrową strzykawkę zmodyfikowanym utrwalaczem Bouina i przymocuj igłębnik do wbijania. Włóż igłę na około pół centymetra do przedniego otworu odcinka jelita.
Mocno mocując igłębnik wewnątrz segmentu, powoli przepłucz zawartość tkanki utrwalaczem. Bądź ostrożny, ponieważ zbyt duże ciśnienie spowoduje pęknięcie segmentu. Jeśli jelito cienkie wygląda na zbyt długie, aby sobie z nim poradzić, możesz najpierw pokroić je na trzy równe segmenty i przepłukać każdy segment osobno.
Utrwalenie spowoduje, że kolor odcinka jelita stanie się nieprzezroczysty. Następnie za pomocą nożyczek przetnij segment wzdłuż linii krezki, a następnie krótko opłucz segment w naczyniu z PBS, przytrzymując go otwartymi kleszczami. Teraz przetnij jelito cienkie na trzy równe segmenty, proksymalny, środkowy i dystalny, które odpowiadają mniej więcej dwunastnicy, jelitu czczemu i jelitu krętemu.
Makroskopowo nie ma żadnych dostrzegalnych cech w każdej sekcji. Pamiętaj, aby zrobić znak, aby zidentyfikować proksymalny od dystalnego końca na każdym segmencie. Następnie umieść segment stroną świetlną skierowaną do góry na pokrywie szalki Petriego.
Na segmencie okrężnicy zidentyfikuj stronę świetlną za pomocą grzbietów biegnących w poprzek jej szerokości na bliższym końcu. Regiony środkowe i dystalne mają pewne odmiany, które biegną podłużnie. Na jelicie cienkim zidentyfikuj stronę świetlną po bardziej szorstkiej powierzchni, która oznacza kosmki.
Badanie mikroskopowe pokazuje, że kosmki są najdłuższe w obszarach proksymalnych każdego segmentu, podczas gdy krypty okrężnicy są najkrótsze w obszarach proksymalnych i najwyższe w części środkowej. Kontynuuj szwajcarskie zwijanie okrężnicy. Mając okrężnicę płasko otwartą i świetlistą stroną do góry, pociągnij ją kleszczami od bliższego końca w kierunku krawędzi szalki Petriego.
Trzymając stronę świetlną do góry, przytrzymaj bliższy koniec kleszczami i owiń krawędź bliższego końca wokół wykałaczki i mocno dociśnij owiniętą krawędź do wykałaczki. Następnie delikatnie i powoli zwiń okrężnicę wokół wykałaczki, aby uformować szwajcarską bułkę. Po zwinięciu całej długości okrężnicy użyj kolejnej pary kleszczy, aby ostrożnie wsunąć rolkę do kasety do przetwarzania tkanek.
Następnie przenieś kasetę do 10-procentowo buforowanej formaliny i pozostaw do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Aby szwajcarsko zwinąć odcinek jelita cienkiego, otwórz go świetlistą stroną do góry i pociągnij kleszczami od bliższego końca w kierunku krawędzi naczynia. Następnie użyj tej samej techniki, jak pokazano w przypadku dwukropka, aby zrobić szwajcarską bułkę i utrwalić ją w formalinie.
Korzystając z opisanych metod, barwienie HND jelita grubego myszy C57 black 6 ujawniło wszystkie części okrężnicy w celu kompleksowej oceny histologicznej. Następnie preparat zastosowano u myszy wykazujących ekspresję EGFP napędzaną przez promotor LGR5, który jest aktywny tylko w peryferyjnych kryptach jelitowych. Ten transgen EGFP ma tylko około 5 do 10 procent penetracji, ale regiony zainteresowania można łatwo znaleźć.
Używając tych samych myszy z ekspresją EGFP LGR5, KLF5 i KI67 zostały wybarwione. Najpierw badano myszy kontrolne z normalną ekspresją LGR5. Komórki dodatnie EGFP są oznaczone niebieskimi strzałkami, a komórki ujemne EGFP są oznaczone białymi strzałkami.
Następnie te same transgeny uległy ekspresji u myszy z nokautem KLF5. Współbarwienie KLF5 i KI67 nie występuje w komórkach macierzystych EGFP dodatnich, ale pozostaje obecne w kryptach ujemnych EGFP. Wyraźnie widać, że jakość preparatu do barwienia metodą multi fluoro force jest bardzo dobra.
Po opanowaniu tej techniki można wykonać w około 15 minut na mysz, jeśli zbierasz zarówno jelito cienkie, jak i okrężnicę. Nie zapominaj, że praca z utrwalaczem Bouina może być niezwykle niebezpieczna dla oczu. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak odpowiednia ochrona oczu.
Dziękuję za oglądanie i dobre spojrzenie na swoje eksperymenty.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca koncentruje się na efektywnym przetwarzaniu tkanki jelitowej myszy w celu uzyskania jednorodnego barwienia histologicznego. Podkreślono w niej znaczenie właściwych metod utrwalania w celu poprawy jakości próbek tkanek do obrazowania i analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Histologia
- Obróbka tkanek
Wstęp
- Dokładna identyfikacja komórek nabłonkowych jest kluczowa dla określenia linii komórkowych.
- Obrazowanie tkanek jelitowych wymaga optymalnych metod przetwarzania.
- Wzdłuż jelita mogą występować różnice w barwieniu.
- Standardowe techniki mogą prowadzić do usztywnienia tkanki, co utrudnia analizę.
Cel badania
- Określenie optymalnych metod przetwarzania tkanek jelitowych myszy.
- Poprawa jednorodności barwienia histologicznego.
- Opracowanie metody utrwalania z wykorzystaniem mniej toksycznych substancji chemicznych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie zmodyfikowanej techniki zwijania typu „Swiss roll”.
- Eksperymentowanie z metodą szybkiej fiksacji.
- Przygotowanie warunków chirurgicznych do pobrania tkanek.
- Zastosowanie zmodyfikowanego utrwalacza w przypadku grubych tkanek.
Główne wyniki
- Zmodyfikowana metoda utrwalania umożliwia lepsze zwijanie tkanki jelitowej metodą swiss roll.
- Zastosowanie mniej toksycznych odczynników zwiększa bezpieczeństwo procesu utrwalania.
- Dzięki nowej metodzie można uzyskać jednorodne barwienie histologiczne.
- Technikę tę można zaadaptować do innych grubych tkanek.
Wnioski
- Udoskonalone techniki utrwalania poprawiają obróbkę tkanek do badań histologicznych.
- Wydajne metody są niezbędne do dokładnego obrazowania i analizy.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zastosowanie tych technik.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywne przetwarzanie tkanki jelita umożliwia spójną ocenę histologiczną na całej długości narządu, co wspiera ilościową analizę stanu zapalnego i tumorigenzy. Udoskonalona technika zwijania w rulon (tzw. Swiss-rolling) poprawia zachowanie morfologii tkanki, ułatwiając wiarygodną detekcję immunohistochemiczną i immunofluorescencyjną. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez zmniejszenie zmienności w przygotowaniu próbek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie homeostazy nabłonka jelitowego oraz odpowiedzi na uszkodzenia i regenerację.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez ulepszoną ocenę histologiczną pełnych przekrojów jelit.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów analizy, zapewniając nienaruszone cechy strukturalne jelit po sekcjonowaniu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność testów dzięki jednolitemu barwieniu histologicznemu wzdłuż całej długości tkanki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera badania nad układami istotnymi dla chorób, umożliwiając różnicowanie cech strukturalnych jelit, które są kluczowe dla pomiarów ilościowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia spójność translacyjnych biomarkerów dzięki rygorystycznemu przetwarzaniu z wykorzystaniem metod detekcji immunohistochemicznej i immunofluorescencyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Technika ta integruje się z procesami biologii odkrywczej poprzez usprawnienie obróbki tkanek do analizy histologicznej, wspierając identyfikację związków wiodących dzięki wiarygodnej ocenie substancji w modelach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez umożliwienie oceny morfologii nabłonka jelitowego.
- Przesiewanie: Określa gotowość testu poprzez ilościowe wyniki analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych.
- Analityka: Podkreśla pomiary stanu zapalnego jelit i tumorigenzy wzdłuż całej długości tkanki.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez systemy istotne dla choroby i dopasowanie biomarkerów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako możliwość ponownego wykorzystania w przetwarzaniu grubych tkanek poza próbkami jelitowymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej dzięki redukcji niejednoznaczności mechanistycznej w analizie tkanki jelita.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność procesów przetwarzania tkanek.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki usprawnionej walidacji celów i zmniejszeniu biologicznego ryzyka na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki zwiększonej niezawodności modeli przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza naukowa z zakresu histologii oraz technik przetwarzania tkanek.
- Zapotrzebowanie na instrumentarium i infrastrukturę analityczną do utrwalania, zatapiania i krojenia.
- Wymagania dotyczące standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia spójności wykonywania techniki Swiss-roll.
- Kwestie adaptacyjne w różnych systemach modelowych z wykorzystaniem zmodyfikowanego utrwalacza Bouina.
- Ograniczenia praktyczne obejmują pracę z substancjami niebezpiecznymi, co wymaga stosowania odpowiedniej ochrony oczu.
