Name: Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną technikę walcowania szwajcarskiego do przetwarzania tkanki jelitowej myszy, zapewniającą jednolite barwienie histologiczne. Ta metoda umożliwia dokładną analizę immunofluorescencyjną i immunohistochemiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Ainara Ruiz de Sabando za dostarczenie zdjęć H&E. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health (DK052230, DK093680 i CA172113) przyznane dr Vincentowi W. Yangowi.

1. Myszy
<ol>
	<li>Wszystkie badania z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Stony Brook University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Myszy utrzymywano w cyklu jasno-ciemnym trwającym 12:12 godziny.
	<ol>
		<li>Komercyjnie pozyskać myszy C57BL/6. Uzyskaj myszy C57BL / 6 z allelami Klf5 otoczonymi miejscami loxP (Klf5fl / fl). Myszy te zostały wcześniej opisanejako 21 i łaskawie dostarczone przez dr Ryozo Nagai.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakup myszy C57BL / 6 z indukowalnym genem rekombinazy Cre pod regulacją promotora Lgr5 (myszy Lgr5-EGFP / CreERT2).</li>
	<li>Aby ustalić myszy Lgr5-EGFP / CreERT2 / Klf5fl / fl, skrzyżuj myszy Klf5fl / fl z myszami Lgr5-EGFP / CreERT2, a następnie krzyżuj wstecznie potomstwo z myszamiKlf5fl / fl.</li>
	<li>Leczyć myszy tamoksyfenem zgodnie z wcześniej opisanym protokołem22. Wstrzyknąć 8-tygodniowym myszom eksperymentalnym i kontrolnym dootrzewnowo (I.P.) 1 mg tamoksyfenu (10 mg / ml), rozpuszczonego w sterylnym oleju kukurydzianym, przez 5 kolejnych dni.</li>
	<li>W 14 dniu po pierwszym wstrzyknięciu tamoksyfenu należy złożyć ofiary myszy za pomocą uduszenia CO2 poprzez umieszczenie ich w komorze podłączonej do źródła gazu CO2 . Pozwól, aby gaz wpłynął do komory, aż myszy stracą przytomność i ustanie wszelki ruch. Aby zapewnić eutanazję, należy przeprowadzić zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
2. Przygotowanie tkanek i walcowanie szwajcarskie
<ol>
	<li>Za pomocą kleszczy i nożyczek preparacyjnych wytnij nacięcie w skórze od strony brzucha. Za pomocą kleszczy przytrzymaj skórę w miejscu nacięcia i delikatnie odciągnij od tkanki mięśniowej brzucha. Użyj nożyczek, aby przeciąć skórę brzucha i odsłonić mięśnie brzucha.</li>
	<li>Przytrzymaj i podciągnij otrzewną kleszczami. Upewnij się, że nie trzymasz i nie ciągniesz za jelita. Ostrożnie wykonaj nacięcie w tkance otrzewnej i kontynuuj odcinanie skóry, aby odsłonić mięśnie brzucha. Ostrożnie wykonaj nacięcie w mięśniach brzucha i kontynuuj ich wycinanie, aby odsłonić jelita.</li>
	<li>Zidentyfikuj okrężnicę i prześledź do dystalnego końca, gdzie łączy się z odbytnicą/odbytem. Za pomocą nożyczek przytnij jak najbliżej otworu odbytu.</li>
	<li>Zidentyfikuj żołądek i prześledź, gdzie łączy się z jelitem cienkim. Nożyczkami odetnij jelito w odległości około 1 cm od żołądka. Przenieść całą długość uwolnionego jelita cienkiego i okrężnicy na czystą szalkę Petriego zawierającą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
	<li>Jedną ręką lub parą kleszczy przytrzymaj dystalny koniec okrężnicy, a drugą ręką delikatnie rozplątaj całą długość okrężnicy z tkanki łącznej i/lub tłuszczowej krezki.</li>
	<li>Zidentyfikuj jelito ślepe (małą torebkę między jelitem cienkim a grubym) i przeciąć miejsce, w którym jelito ślepe i okrężnica łączą się (bliższy koniec okrężnicy), aby uwolnić okrężnicę.</li>
	<li>Jedną ręką lub parą kleszczy przytrzymaj jelito cienkie, a drugą ręką delikatnie rozplątaj całą długość jelita cienkiego z tkanki łącznej i/lub tłuszczowej krezki. Odetnij jelito ślepe i wyrzuć, jeśli nie ma takiej potrzeby. 
	Uwaga: Proces można zatrzymać tutaj, inkubując wycięte jelita w zmodyfikowanym utrwalaczu Bouina (50% etanolu/5% kwasu octowego wdH2O) przez noc i kontynuując procedurę następnego dnia.</li>
	<li>Dotykając jednego odcinka jelita (jelita cienkiego lub okrężnicy), napełnij 10-mililitrową strzykawkę zmodyfikowanym utrwalaczem Bouina i przymocuj do niej igłębkę. Włóż igłę na około pół centymetra w przedni otwór odcinka jelitowego.</li>
	<li>Przytrzymaj igłębkę do wnętrza odcinka jelita, wywierając silny nacisk instrumentem na segment jelita. Drugą ręką trzymając strzykawkę, delikatnie ale konsekwentnie uciskać, aby wypłukać zawartość odcinka jelita za pomocą zmodyfikowanego utrwalacza Bouina. Ten krok umożliwia jednoczesne oczyszczenie odcinka jelita i natychmiastowe unieruchomienie. Użyj szalki Petriego, aby zebrać przepływające odpady. Utrwalenie można zaobserwować poprzez zmętnienie koloru jelita grubego. 
	Uwaga: Upewnij się, że nie wywierasz zbyt dużego nacisku podczas płukania, ponieważ może to spowodować pęknięcie odcinka jelita.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek rozetnij odcinek jelita wzdłuż linii krezki. Przytrzymaj go kleszczami i krótko opłucz na szalce Petriego zawierającej PBS.
	<ol>
		<li>Przetnij jelito cienkie na 3 równe segmenty: proksymalny, środkowy i dystalny. Segment proksymalny to ten, który znajduje się bezpośrednio po żołądku, a segment dystalny to ten bezpośrednio przed okrężnicą. Segment proksymalny jest odpowiednikiem dwunastnicy, środkowy – jelita czczego, a dystalny – jelita krętego.</li>
		<li>Dla każdego segmentu zaznacz bliższy i dalszy koniec. Bliższy koniec to ten, który pierwotnie był skierowany w stronę żołądka, a dystalny był skierowany w stronę okrężnicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj górnej części szalki Petriego, aby umieścić oczyszczony i otwarty segment jelita. Umieść segment jelita stroną ze światłem skierowanym do góry.
	<ol>
		<li>W przypadku okrężnicy zidentyfikuj stronę luminalną za pomocą różnorodnych grzbietów biegnących na całej jej szerokości i obecnych na bliższym końcu. Regiony środkowe i dystalne mają pewne odmiany, które biegną podłużnie. W przypadku jelita cienkiego zidentyfikuj stronę luminalną po szorstkiej powierzchni, która oznacza kosmki. 
		Uwaga: W przypadku jelita cienkiego nie ma zewnętrznego makroskopowego anatomicznego rozgraniczenia obszarów proksymalnych, środkowych i dystalnych. Jednak obszary te można zidentyfikować w sekcjach pod mikroskopem. Kosmki są najdłuższe w okolicy proksymalnej i stają się stopniowo krótsze dystalnie, gdzie są najkrótsze. Mikroskopowo krypty okrężnicy są najkrótsze w obszarze proksymalnym, który można również zidentyfikować po obecności grzbietów. Krypty okrężnicy są najwyższe w części środkowej i krótsze w okolicy dystalnej, ale nadal wyższe niż w okolicy proksymalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj szwajcarskie toczenie dwukropka:
	<ol>
		<li>Utrzymuj okrężnicę płasko otwartą i pociągnij ją kleszczami od bliższego końca w kierunku krawędzi szalki Petriego.</li>
		<li>Trzymaj świecącą stronę skierowaną do góry i jedną ręką przytrzymaj proksymalny koniec kleszczami, a drugą ręką trzymaj wykałaczkę.</li>
		<li>Owiń krawędź bliższego końca wokół wykałaczki za pomocą kleszczy i lekko ściśnij owiniętą krawędź do wykałaczki, aby utrzymać ją na miejscu.</li>
		<li>Delikatnie i powoli zacznij toczyć wykałaczkę palcami, aby zwinąć okrężnicę wokół wykałaczki, aby uformować szwajcarską bułkę.</li>
		<li>Gdy cała długość okrężnicy zostanie zwinięta, użyj kleszczy, aby ostrożnie zsunąć szwajcarską rolkę okrężnicy z wykałaczki do kasety do przetwarzania / osadzania tkanek. Umieść kasetę w 10% buforowanej formalinie na noc w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj szwajcarskie zwijanie jelita cienkiego:
	<ol>
		<li>Dotykając jednego segmentu na raz, utrzymuj segment płasko otwarty, świetlaną stroną do góry i pociągnij go kleszczami od bliższego końca w kierunku krawędzi szalki Petriego.</li>
		<li>Kontynuuj zwijanie szwajcarskie zgodnie z opisem dla okrężnicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj przetwarzanie tkanek utrwalonych w formalinie do zatapiania parafiny. Postępuj w następujący sposób: 
	UWAGA: Użyj automatycznego procesora (szczegółowe informacje można znaleźć w materiałach i sprzęcie).
	<ol>
		<li>Gdy tkanka znajduje się w kasecie, spłucz tkankę PBS, aż utrwalacz zostanie całkowicie usunięty.</li>
		<li>Odwodnić tkankę za pomocą etanolu w następującej kolejności: 50% etanolu przez 10 min, 70% etanolu przez 10 min, 80% etanolu przez 10 min, 95% etanolu przez 10 min, 100% etanolu przez 10 min, 100% etanolu przez 10 min i 100% etanolu przez 10 min.</li>
		<li>Wymiana etanolu z ksylenem w następującej kolejności: etanol 2:1 : ksylen przez 10 - 15 min, etanol 1:1 : ksylen przez 10 - 15 min, etanol 1:2 : ksylen przez 10 - 15 min, 100% ksylen przez 10 - 15 min, 100% ksylen przez 10 - 15 min i 100% ksylen przez 10 - 15 min. UWAGA: Ksylen stanowi zagrożenie dla zdrowia, dlatego miejsce pracy powinno być wyposażone w miejscową wentylację wyciągową z odpowiednim okapem oraz odpowiedni sprzęt ochronny być noszone przez personel.</li>
		<li>Zamień ksylen na parafinę. W piecu próżniowym ustawionym na 54 - 58 °C wykonaj następujące czynności: ksylen 2:1 : parafina przez 30 min, ksylen 1:1 : parafina przez 30 min, ksylen 1:2 : parafina przez 30 min, 100% parafina przez 1 - 2 godz. i 100% parafina przez 1 - 2 godz. lub na noc. 
		Uwaga: Nie pozwól, aby parafina przekroczyła 60 °C przez dłuższy czas, ponieważ spowoduje to degradację polimerów parafinowych i uczynienie ich twardymi i kruchymi.</li>
		<li>Zanurz w świeżej nowej parafinie i zorientuj tkankę zgodnie z życzeniem, zanim parafina stwardnieje. W przypadku bułek szwajcarskich, po zaparafinowaniu tkankowym, ważne jest, aby podczas zatapiania parafiny przestawić każdą rolkę na bok. Gwarantuje to, że podczas cięcia zostaną wyprodukowane odcinki na całej długości każdej rolki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do barwienia należy ciąć odcinki o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu. Zebrać skrawki na naładowanych szkiełkach i wysuszyć (upiec) w piekarniku o temperaturze 65 °C przez noc; Pozostaw do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie użyj ich do barwienia. 
	Uwaga: Czas pieczenia można skrócić do 1 - 2 godzin w zależności od tego, jak świeżo pokrojone są szkiełka. Jeśli od podziału minął mniej niż miesiąc, zaleca się pieczenie przez noc. Jeśli minął więcej niż miesiąc, wystarczy 1-2 godziny pieczenia, aby zaoszczędzić czas. Jeśli skończy się czas, zawsze można użyć podkładu nocnego.</li>
</ol>
3. Analiza histologiczna i barwienie immunofluorescencyjne
Wykonaj analizę histologiczną i barwienie immunofluorescencyjne zgodnie z wcześniejszym opisem23,24, z modyfikacjami. W celu uzyskania wzmocnionej immunofluorescencji białka zielonej fluorescencji (EGFP):
<ol>
	<li>Piecz szkiełka w piekarniku o temperaturze 65 °C przez 1 godzinę w celu dezaktywacji endogennej fosfatazy alkalicznej, a następnie odparafinowania w ksylenie.</li>
	<li>Inkubować skrawki w kąpieli z 3% nadtlenkiem wodoru w metanolu w celu zablokowania endogennych peroksydaz tkankowych; następnie ponownie nawodnić przez inkubację w malejącej serii kąpieli alkoholowych (100%, 95%, 70%), a następnie pobrać antygen w roztworze buforowym cytrynianu (10 mM cytrynian sodu, 0,05% Tween-20, pH 6,0) w temperaturze 125 °C przez 10 minut przy użyciu komory demaskatorskiej.</li>
	<li>Narysuj okrąg wokół skrawków tkanek za pomocą pisaka do znakowania, który zapewnia barierę hydrofobową i inkubuj skrawki z buforem blokującym (2,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] w TBS-Tween) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, a następnie z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko EGFP (rozcieńczenie 1:500) w temperaturze 4 °C przez noc w wilgotnej komorze, delikatnie wstrząsając.</li>
	<li>Przemyć skrawki i inkubować z przeciwciałem drugorzędowym znakowanym fluorescencyjnie w odpowiednim stężeniu przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przemyć szkiełka po wtórnym leczeniu przeciwciałami i wybarwieć jądra za pomocą Hoechst i zamocować za pomocą pożywki montażowej.
	<ol>
		<li>W przypadku jednoczesnego barwienia Klf5/EGFP/Ki-67 należy przetworzyć szkiełka podstawowe zgodnie z opisem w krokach 3.1 - 3.3 i przeprowadzić barwienie Klf5 przez inkubację z przeciwciałem Klf5 (rozcieńczenie 1:150) przez noc.</li>
		<li>Zastosuj wykrywanie polimeru AP królika do szkiełek zgodnie z protokołem.</li>
		<li>Ujawnij barwienie Klf4 za pomocą chromogenowego barwienia immunohistochemicznego zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przeprowadzić elucję przeciwciał przy użyciu wcześniej opisanego protokołu25. Inkubować szkiełka podstawowe w temperaturze 50 °C w roztworze Glycine-SDS (pH 2,0) z mieszaniem przez 1 godzinę.</li>
		<li>Dokładnie umyć szkiełka wodą destylowaną i inkubować z buforem blokującym (2,5% BSA w TBS-Tween) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dodać jednocześnie przeciwciała Ki-67 (rozcieńczenie 1:500) i EGFP (rozcieńczenie 1:500) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Przeprowadzić detekcję fluorescencyjną z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przed barwieniem Hoechst (dane nie pokazane) i zamontować za pomocą pożywki montażowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj morfologię histologiczną tkanek na wycinkach 5 μm barwieniem hematoksyliną i eozyną (H&E)26. W przypadku obrazów fluorescencyjnych użyj długości fal emisyjnych 535, 646 i 700, aby uwidocznić barwienie odpowiednio EGFP, Klf5 i Ki-67.</li>
</ol>

<ol><li>van der Flier, L. G., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+self-renewal%2C+and+differentiation+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium.</a> Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).</li>
<li>Bjerknes, M., Cheng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+isolation+of+intact+epithelium+from+the+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine.</a> Anat Rec. 199, 565-574 (1981).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).</li>
<li>van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OLFM4+is+a+robust+marker+for+stem+cells+in+human+intestine+and+marks+a+subset+of+colorectal+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells.</a> Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).</li>
<li>van der Flier, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+achaete+scute-like+2+controls+intestinal+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate.</a> Cell. 136 (5), 903-912 (2009).</li>
<li>Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+is+expressed+in+vivo+in+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells.</a> Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).</li>
<li>Montgomery, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+telomerase+reverse+transcriptase+%28mTert%29+expression+marks+slowly+cycling+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).</li>
<li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interconversion+between+intestinal+stem+cell+populations+in+distinct+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches.</a> Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).</li>
<li>May, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+putative+gastrointestinal+stem+cell+and+adenoma+stem+cell+marker%2C+doublecortin+and+CaM+kinase-like-1%2C+following+radiation+injury+and+in+adenomatous+polyposis+coli%2Fmultiple+intestinal+neoplasia+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice.</a> Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).</li>
<li>Powell, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pan-ErbB+negative+regulator+Lrig1+is+an+intestinal+stem+cell+marker+that+functions+as+a+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor.</a> Cell. 149 (1), 146-158 (2012).</li>
<li>Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+transcription+factors%3A+a+functional+family%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like transcription factors: a functional family.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).</li>
<li>McConnell, B. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Kruppel-like+factors+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases.</a> Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).</li>
<li>McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+Kruppel-like+factors+4+and+5+in+epithelial+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology.</a> Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).</li>
<li>Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+5+is+essential+for+proliferation+and+survival+of+mouse+intestinal+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells.</a> Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).</li>
<li>Gelberg, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+disease+production+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine.</a> Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).</li>
<li>De Robertis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AOM%2FDSS+murine+model+for+the+study+of+colon+carcinogenesis%3A+From+pathways+to+diagnosis+and+therapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Carcinog%22%5BJournal%5D)">The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies.</a> J Carcinog. 10 (9), (2011).</li>
<li>Magnus, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+presence+of+intestinal+epithelium+in+the+gastric+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).</li>
<li>Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22Swiss+roll%22%3A+a+simple+technique+for+histological+studies+of+the+rodent+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine.</a> Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).</li>
<li>Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+practical+%27swiss+roll%27+method+of+preparing+tissues+for+paraffin+or+methacrylate+embedding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding.</a> J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).</li>
<li>Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+and+chromogenic+in+situ+hybridization+to+detect+genetic+aberrations+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+material%2C+including+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays.</a> Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).</li>
<li>Takeda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+fibroblasts+are+essential+for+the+adaptive+response+of+the+murine+heart+to+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload.</a> J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).</li>
<li>el Marjou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+inducible+Cre-mediated+recombination+in+the+gut+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium.</a> Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).</li>
<li>McConnell, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+5+is+important+for+maintenance+of+crypt+architecture+and+barrier+function+in+mouse+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).</li>
<li>Nandan, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kruppel-like+factor+5+is+a+crucial+mediator+of+intestinal+tumorigenesis+in+mice+harboring+combined+ApcMin+and+KRASV12+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations.</a> Mol Cancer. 9 (63), (2010).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Szwajcarska technika walcowania jest potężną metodą przygotowania tkanki jelitowej do oceny histologicznej i morfologicznej na dużą skalę. W przeciwieństwie do wcześniej opisanej techniki walcowania szwajcarskiego, która została pierwotnie opracowana do przygotowania zamrożonych skrawków18,19, przedstawiona tutaj procedura umożliwia szybkie przygotowanie i utrwalenie tkanki jelitowej do utrwalenia formaliny i zatopienia w parafinie (FFPE). W porównaniu z tkanką zamrożoną, tkanka FFPE ma znacznie dłuższy okres ...

Nabłonek jelitowy ssaków składa się z pojedynczej warstwy komórek kolumnowych. W jelicie cienkim komórki proliferacyjne są zamknięte w kryptach, podczas gdy zróżnicowane komórki zajmują obszar kosmków. Ponieważ jednak w jelicie grubym nie ma kosmków, komórki proliferacyjne są zlokalizowane na dnie krypt, a zróżnicowane komórki zajmują górną część krypt. Nabłonek jelitowy ulega szybkiemu uzupełnieniu (około 3 - 5 dni), co jest napędzane ciągłym podziałem komórek proliferacyjnych w kryptach. Komórki proliferacyjne krypt nie są jednorodną populacją i są dalej dzielone na komórki macierzyste i komórki amplifikujące tranzyt (TA)1. Komórki macierzyste znajdują się na dnie krypty, w obrębie pierwszych 4 - 5 komórek od samych2 dna. Obecny model potwierdza istnienie dwóch typów komórek macierzystych: komórek macierzystych o podstawie krypty (CBC) i rezerwowych komórek macierzystych w stanie spoczynku. Komórki macierzyste CBC aktywnie się namnażają i są oznaczone przez bogaty w leucynę receptor sprzężony z białkiem G 5 (Lgr5)3, olfaktomedynę 4 (Olfm4)4 i Achaete scute-like 2 (Ascl2)5. Z drugiej strony, rezerwowe spoczynkowe komórki macierzyste są znakowane przez specyficzne dla komórek B miejsce integracji wirusa mysiej białaczki Moloneya 1 (Bmi1)6, odwrotną transkryptazę telomerazy myszy (mTert)7, HOP Homeobox (Hopx)8, kinazę podobną do podwójnej kortyny i CAM 1 (Dclk1)9 oraz powtórzenia bogate w leucynę i domeny podobne do immunoglobuliny 1 (Lrig1)10. Aktywnie proliferujące komórki macierzyste dają początek komórkom TA, a następnie ulegają dalszemu różnicowaniu w komórki absorpcyjne (enterocyty) i komórki wydzielnicze (komórki enteroendokrynne, kubkowe, Paneth i kępki). Ciągły podział komórek w strefie proliferacyjnej powoduje ruch komórek nabłonka w górę wzdłuż osi krypta-kosmki, aż dotrą do szczytu kosmków, gdzie ulegają apoptozie i są złuszczane z powierzchni nabłonka. Różne typy komórek nabłonka jelitowego charakteryzują się ekspresją odrębnych białek (np. komórki kubkowe jelita można rozpoznać przez barwienie przeciwciałem przeciwko Muc2, a komórki Panetha przez przeciwciało przeciwko lizozymowi). Badamy rolę czynników Krüppela (KLF) w homeostazie i patobiologii nabłonka jelitowego11-13. Przedstawione tu wyniki potwierdzające wykonalność zmodyfikowanej techniki walcowania szwajcarskiego opierają się na wcześniejszych badaniach nad rolą czynnika podobnego do Krüppela 5 (KLF5) w utrzymaniu aktywnie proliferujących komórek macierzystych nabłonka jelitowego14. KLF5 jest czynnikiem transkrypcyjnym palca cynkowego, który ulega silnej ekspresji w aktywnych jelitowych komórkach macierzystych i komórkach TA12. Wcześniejsze badania wykazały, że KLF5 ulega koekspresji z Ki-67, znanym markerem proliferacyjnym w kryptach jelitowych.
Przewód pokarmowy nie jest strukturalnie ani funkcjonalnie jednorodną tkanką. Jelito cienkie jest podzielone na dwunastnicę, jelito czcze i jelito kręte, a jelito grube na jelito ślepe i okrężnicę, przy czym ta ostatnia jest dalej podzielona na część proksymalną, środkową i dystalną. Każda z tych sekcji ma unikalne cechy histologiczne i odgrywa odrębne role15. W związku z tym skutki urazów i stopień odpowiedzi nabłonka jelitowego mogą zależeć od regionu badanej tkanki16. Ponadto różne szczepy myszy wykazują różnorodność odpowiedzi na poziomie histologicznym w zależności od rodzaju zniewagi zastosowanej w badaniach16. W związku z tym konieczne jest odpowiednie przygotowanie tkanek, aby umożliwić odpowiednią analizę histologiczną i molekularną tkanek jelitowych. W związku z tym technika Swiss-roll umożliwia analizę całej długości nabłonka jelitowego za jednym razem, a tym samym pozwala na wyciągnięcie świadomych wniosków na podstawie wyczerpujących informacji.
Technika szwajcarskiej bułki została po raz pierwszy wspomniana przez Magnusa17, a szczegółowo opisana przez Moolenbecka i Ruitenberga oraz Park i in. jako metoda przygotowania tkanek i przeprowadzania analiz histologicznych jelita gryzoniodpowiednio 18,19. Protokół opisany w niniejszej publikacji przedstawia ulepszoną wersję oryginalnej metody, która pozwala na terminowe i wiarygodne przygotowanie tkanek do celów diagnostycznych. Ta zmodyfikowana technika pozwala na sprawne pobieranie i przygotowanie nabłonka jelitowego do powszechnie stosowanych technik, takich jak immunohistochemia, immunofluorescencja, a także hybrydyzacja in situ (fluorescencyjna i chromogenna20). Co więcej, zmodyfikowana metoda przygotowania próbek tkanek wykorzystuje łatwo dostępne i stosunkowo niedrogie odczynniki, oferując jednocześnie metodę szybkiego utrwalania tkanek i pozwala na odzyskanie białka, DNA i RNA w celu dodatkowej oceny. Podsumowując, technika ta doskonale nadaje się do kompleksowej oceny histopatologicznych, patologicznych i molekularnych cech nabłonka jelitowego.

<table><tbody><tr><td>Zestawy preparacyjne ze stali nierdzewnej</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Komora demonstracyjna</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>VWR</td><td>89215-218</td><td></td></tr><tr><td>Swingsette Kaseta do zatapiania/przetwarzania tkanek z pokrywką</td><td>Simport</td><td>M515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Slides [rozmiar: 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Ręczny zestaw do barwienia szkiełek</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia Green</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia Białe</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>24-suwakowy uchwyt na suwaki z odłączanym uchwytem</td><td>Tissue-Tek/Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>Thermo Scientific</td><td>6243</td><td>do pieczenia szkiełków w temperaturze 65 stopni</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000C</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 90i</td><td>Jasne i fluescencyjne światło, z obiektywami: 10X, 20X</td></tr><tr><td>PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 proof</td><td>AAPR</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>AAPR</td><td>281000ACS</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 25% roztwór w wodzie</td><td>ACROS</td><td>202465000</td><td></td></tr><tr><td>10% formalina buferowana</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca frakcja V, szok termiczny</td><td>Roche</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279</td><td></td></tr><tr><td>Igła do zgłębnika</td><td>VWR</td><td>20068-624</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty Klf5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-22797</td><td>Rozcieńczenie 1:150</td></tr><tr><td>Kurczak przeciwciało anty EGFP</td><td>Milipore</td><td>AB16901</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało</td> <td>anty Ki67Biocare Medical</td><td>CRM325B</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania polimerów AP królika Mach3</td><td>Biocare Medical</td><td>M3R533L</td><td></td></tr><tr><td>Warp czerwony zestaw chromogenów</td><td>Biocare Medical</td><td>WR806 H</td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP/CreERT2&nbsp;</td><td>Laboratoria Jacksona</td><td>008875&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny procesor</td><td>Leica</td><td>Leica TP1020</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Zrozumienie roli czynników regulujących homeostazę nabłonka jelitowego oraz reakcję na urazy i regenerację jest ważne. W obecnej literaturze opisano kilka różnych podejść metodologicznych do uzyskiwania obrazów tkanek jelitowych w celu walidacji danych. W tym artykule nakreślamy wspólny protokół związany z pozyskiwaniem i przetwarzaniem tkanek jelitowych myszy. Omówiono prawidłowe utrwalanie tkanek jelitowych oraz techniki szwajcarskie poprawiające morfologię nabłonka jelitowego. Przetwarzanie po resekcji i reorientacja osadzonych tkanek jelitowych mają kluczowe znaczenie dla uzyskania bloków zatopionych w parafinie, które po przekroju wykazują nienaruszone cechy strukturalne jelita. Technika zwijania szwajcarskiego pomaga w ocenie histologicznej badanych całych odcinków jelita grubego lub okrężnicy. Zdolność do różnicowania cech strukturalnych jelit może być kluczowa w pomiarach ilościowych zapalenia jelit i nowotworzenia na całej długości. Wreszcie, skrawki zatopione w parafinie są idealne do solidnego przetwarzania przy użyciu metod wykrywania zarówno immunohistochemicznego, jak i immunofluorescencyjnego. Niefluorescencyjne sekcje immunohistochemiczne zapewniają żywy obraz tkanki z wyszczególnieniem różnych cech strukturalnych komórki, ale nie zapewniają elastyczności w eksperymentach kolokalizacji wewnątrzkomórkowej. Wiele kanałów fluorescencyjnych może być odpowiednio wykorzystanych z detekcją immunofluorescencyjną do eksperymentów kolokalizacyjnych, co stanowi wsparcie dla badań mechanistycznych.

Technika „Swiss roll” (rolowania) w połączeniu z barwieniem immunohistochemicznym umożliwia kompleksową analizę tkanek jelita cienkiego lub grubego. Przykład barwienia H&amp;E jelita grubego myszy C57BL/6 (Rycina 1) ilustruje wykonalność i skuteczność tej techniki. Jak pokazano na Rycynie 1, obraz pozwala uchwycić wszystkie odcinki okrężnicy: proksymalny, środkowy i dystalny. Umożliwia to tym samym pełną ocenę histologiczną. Metoda Swiss roll oraz możliwo...

Dokładna identyfikacja i lokalizacja komórek nabłonkowych wzdłuż błony śluzowej jelit są niezbędne do zdefiniowania różnych linii komórkowych. Prawidłowe obrazowanie tkanek jelitowych ma kluczowe znaczenie dla identyfikacji wzorców ekspresji białek z maksymalną rozdzielczością. Badanie to ma na celu nakreślenie optymalnych metod i warunków przetwarzania tkanek jelitowych myszy.

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

Ogólnym celem tej techniki jest efektywne przetwarzanie długich fragmentów tkanki jelita myszy w celu uzyskania jednorodnego barwienia histologicznego na całej ich długości. W przypadku pozyskiwania przekrojów jelita mogą wystąpić różnice w intensywności barwienia wzdłuż całego odcinka jelita. Próbowano zastosować standardową technikę swiss-rolling, jednak okazało się, że prowadzi ona do powstania bardzo sztywnej tkanki jelitowej, którą trudno rozwinąć.Dzięki serii eksperymentów opracowałem szybką metodę fiksacji, która wykorzystuje mniej toksyczne odczynniki i pozwala na znacznie lepsze zwijanie tkanki jelitowej w tzw. swiss roll. Zmodyfikowany utrwalacz może być stosowany do szybkiej fiksacji innych grubych tkanek. W ramach przygotowania należy poddać zwierzę testowe eutanazji zgodnie z protokołem tekstowym i przygotować zestaw chirurgiczny.Na początek, używając pęsety i nożyczek do sekcji, wykonaj nacięcie boczne w środkowej części brzucha, około jednego do dwóch centymetrów poniżej klatki piersiowej, w zależności od wielkości myszy. Następnie delikatnie rozsuń i odetnij skórę, aby odsłonić mięśnie brzucha. W kolejnym kroku chwyć i odciągnij mięśnie do góry, uważając, aby nie trzymać ani nie ciągnąć jelit.Następnie należy ostrożnie wykonać pierwsze nacięcie mięśni brzucha i uważnie je rozciąć, aby odsłonić jelita. Teraz należy zidentyfikować okrężnicę i śledzić ją aż do jej końca dystalnego, gdzie łączy się ona z odbytnicą. Następnie, używając nożyczek, należy przeciąć okrężnicę jak najbliżej otworu odbytu.Następnie zlokalizuj miejsce połączenia żołądka z jelitami cienkimi i za pomocą nożyczek odetnij jelita około jednego centymetra od żołądka. Teraz przenieś cały odcinek uwolnionego jelita cienkiego i okrężnicy do czystej płytki Petriego zawierającej PBS. Następnie zabezpiecz dystalny koniec okrężnicy i delikatnie rozwiń cały odcinek okrężnicy, usuwając wszelkie przytwierdzone tkanki krezkowe.Następnie zlokalizuj kątnicę i przetnij jelito w miejscu, w którym kątnica łączy się z jelitem grubym, izolując w ten sposób jelito grube. W podobny sposób oddziel resztę jelita cienkiego od przylegającej tkanki łącznej krezowej i tkanki tłuszczowej. Następnie przetnij jelito cienkie w miejscu jego połączenia z kątnicą.Następnie można usunąć i odrzucić kątnicę. Teraz należy napełnić strzykawkę o pojemności 10 ml zmodyfikowanym utrwalaczem Bouina i przymocować igłę do zgłębnika. Wprowadzić igłę na około pół centymetra do przedniego otworu segmentu jelita.Podczas mocnego zabezpieczenia igły do zgłębnikowania wewnątrz odcinka, powoli wypłucz zawartość tkanki utrwalaczem. Należy zachować ostrożność, ponieważ zbyt duże ciśnienie spowoduje pęknięcie odcinka. Jeśli jelito cienkie wydaje się zbyt długie do manipulacji, można je najpierw pociąć na trzy równe odcinki i wypłukać każdy z nich osobno.Fiksacja spowoduje, że kolor odcinka jelita stanie się matowy. Następnie za pomocą nożyczek przetnij odcinek wzdłuż linii błony krezowej, a następnie krótko opłucz go w naczyniu z PBS, trzymając go rozwartym za pomocą pęsety. Teraz podziel jelito cienkie na trzy równe segmenty: proksymalny, środkowy i dystalny, które odpowiadają mniej więcej dwunastnicy, jelitu czczemu i jelitu krętniczemu.Makroskopowo każda sekcja nie wykazuje charakterystycznych cech. Należy pamiętać o wykonaniu oznaczenia pozwalającego odróżnić koniec proksymalny od dystalnego na każdym segmencie. Następnie należy położyć segment stroną światła skierowaną do góry na pokrywce szalki Petriego.Na segmencie okrężnicy zidentyfikuj stronę światłową po prążkach przebiegających w poprzek jego szerokości w części proksymalnej. Regiony środkowy i dystalny wykazują pewne zróżnicowania przebiegające podłużnie. W przypadku jelita cienkiego zidentyfikuj stronę światłową po chropowatej powierzchni, która odpowiada kosmkom jelitowym.Badanie mikroskopowe wykazuje, że kosmki są najdłuższe w obszarach proksymalnych każdego segmentu, podczas gdy krypty okrężnicy są najkrótsze w obszarach proksymalnych i osiągają największą wysokość w części środkowej. Przejdź do techniki „szwajcarskiego rolowania” (Swiss rolling) okrężnicy. Rozpostrzyj okrężnicę płasko stroną światową do góry, a następnie za pomocą pęsety przeciągnij ją od końca proksymalnego w stronę krawędzi szalki Petriego.Trzymając stronę światła do góry, uchwyć koniec proksymalny pęsetą i owiń jego krawędź wokół wykałaczki, mocno dociskając owiniętą krawędź do wykałaczki. Następnie delikatnie i powoli zroluj jelito grube wokół wykałaczki, formując tzw. szwajcarski roletkę. Po zrolowaniu całej długości jelita grubego, użyj drugiej pęsety, aby ostrożnie wsunąć zwiniętą tkankę do kasety do przetwarzania tkanek.Następnie przenieś kasetkę do 10% buforowanego formaliny i pozostaw do inkubacji przez noc w temperaturze pokojowej. Aby wykonać tzw. Swiss roll (rolkę szwajcarską) z odcinka jelita cienkiego, otwórz go stroną światła do góry i przeciągnij pęsetą od końca proksymalnego w stronę krawędzi naczynia. Następnie zastosuj tę samą technikę, która została zaprezentowana dla jelita grubego, aby utworzyć Swiss roll i utrwalić go w formalinie.Zastosowanie opisanych metod barwienia HND w przypadku jelita grubego myszy C57 black 6 pozwoliło na uwidocznienie wszystkich odcinków okrężnicy w celu przeprowadzenia kompleksowej oceny histologicznej. Następnie preparat ten wykorzystano u myszy wykazujących ekspresję EGFP sterowaną przez promotor LGR5, który jest aktywny wyłącznie w obwodowych kryptach jelitowych. Transgen EGFP wykazuje penetrację na poziomie zaledwie około 5 do 10 procent, jednak obszary zainteresowania można było łatwo zlokalizować.W tych samych myszach z ekspresją EGFP LGR5 przeprowadzono barwienie KLF5 oraz KI67. W pierwszej kolejności zbadano myszy kontrolne z prawidłową ekspresją LGR5. Komórki dodatnie pod kątem EGFP zaznaczono niebieskimi strzałkami, a komórki ujemne pod kątem EGFP – białymi strzałkami.Następnie te same transgeny wyeksponowano w myszy z nokautem KLF5. Współbarwienie KLF5 i KI67 nie występuje w komórkach macierzystych dodatnich dla EGFP, lecz pozostaje obecne w kryptach ujemnych dla EGFP. Wyraźnie widać, że jakość preparacji do wielokrotnego barwienia fluorescencyjnego jest bardzo dobra.Po opanowaniu techniki, procedura ta zajmuje około 15 minut na jedną mysz w przypadku pobierania zarówno jelita cienkiego, jak i okrężnicy. Należy pamiętać, że praca z fiksatywem Bouina może być niezwykle niebezpieczna dla oczu. Podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiedniej ochrony oczu.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w badaniach.

improved-swiss-rolling-technique-for-intestinal-tissue-preparation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dekstran siarczan sodu (DSS) podawany w wodzie pitnej jest uznanym mysim modelem uszkodzenia zapalnego w przebiegu ostrego colitis. Niniejszy protokół opisuje metodę podawania DSS oraz przygotowania tkanek.

Modelowanie zapalenia jelita grubego u myszy z użyciem dekstranu siarczanu sodu (DSS)

W tym filmie pokazujemy przygotowanie całego wierzchowca jelita myszy za pomocą prostego urządzenia do nacinania jelit. Powstałe w ten sposób mocowania charakteryzują się najwyższą i jednolitą jakością i mogą być wykorzystywane do analiz histologicznych.

Przygotowanie całego mocowania jelita myszy: Użycie prostego urządzenia do nacinania jelit w celu przygotowania całego wierzchowca

Opisano użycie prostego urządzenia do cięcia i 'zwijania' mysich jelit w celu szybkiego przygotowania całych przygotowań do montażu.

Proste urządzenie do szybkiego przygotowania całych wierzchowców jelita myszy

Komórki macierzyste nabłonka jelitowego (ISC) są zmieszane z komórkami Panetha. Komórki te są zróżnicowanym potomstwem ISC, które wspiera ISC i zapewnia ochronę przeciwbakteryjną. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób wykorzystaliśmy transgeniczne warunkowe modele myszy, aby ustalić, że komórki Panetha odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu nabłonka jelitowego.

Protokoły analizy roli komórek Panetha w regeneracji jelita mysiego przy użyciu warunkowych modeli myszy Cre-lox

Systematyczne ocenianie stanu zapalnego jelit za pomocą darmowego systemu wspomaganego komputerowo jest potężnym narzędziem do ilościowego porównywania zmian histopatologicznych w modelach zapalenia jelita grubego charakteryzujących się obecnością wrzodów i zmian zapalnych. Ocena wyniku histologicznego zapalenia jelita grubego wzmacnia obserwacje kliniczne i ułatwia interpretację danych.

Systematyczna analiza punktacji zapalenia jelit w modelu zapalenia jelita grubego wywołanego mysim dekstranem sodu

Jelito jest niezbędne do trawienia i wchłaniania. Każdy region - dwunastnica, jelito czcze, jelito kręte, okrężnica - pełni różne funkcje dzięki unikalnym strukturom komórkowym. Studiowanie fizjologii jelit wymaga skrupulatnej analizy tkanek. Protokół ten określa utrwalanie i przetwarzanie tkanek przy użyciu szwajcarskiej techniki walcowania, zapewniając dokładne barwienie immunologiczne poprzez odpowiednie zachowanie i orientację tkanki.

Zoptymalizowany protokół dla jelitowych szwajcarskich bułeczek i barwienia immunofluorescencyjnego tkanek zatopionych w parafinie

Protokół ten określa metodę immunobarwienia całego żołądka, zmodyfikowaną na podstawie techniki "Swiss roll" pierwotnie opracowanej dla jelita myszy.

Ulepszone mapowanie przestrzenne warstw mięśni żołądka myszy z wykorzystaniem zmodyfikowanej techniki Swiss Roll

Niniejszy przewodnik opisuje metodę modyfikacji kształtu szklanych mikropipet. W szczególności, poprzez zastosowanie ciepła i ciśnienia powietrza, poszerza się zwężenie pipety bez zwiększania otworu końcówki, co prowadzi do obniżenia oporu pipety. Jest to kluczowe dla uzyskania pomiarów o niskim poziomie szumów w małych komórkach, lecz znajduje zastosowanie w wielu innych obszarach.

Polerowanie pipet pod ciśnieniem w celu poprawy jakości rejestracji metodą patch-clamp

Opracowaliśmy strategię wykrywania sekwencyjnego wbudowywania analogów tymydyny (CldU i IdU) w tkanki dorosłych myszy w celu ilościowego określenia dwóch następujących po sobie cykli podziałów komórkowych. Strategia ta jest przydatna do wykrywania wymiany komórkowej w tkankach długożyjących, transformacji onkogennej lub komórek wzmacniających przejście.

Immunofluorescencyjna detekcja dwóch analogów tymidyny (CldU i IdU) w tkance pierwotnej

Technika sekcji ilustruje proces usuwania ciała szklistego, siatkówki oraz soczewki z oka myszy, ich rozdzielenie za pomocą wirowania oraz charakterystykę z wykorzystaniem analiz białkowych.

Ewisceracja ciała szklistego i siatkówki myszy do analiz proteomicznych

Poznaj zmodyfikowaną technikę walcowania szwajcarskiego do przetwarzania tkanki jelitowej myszy, zapewniającą jednolite barwienie histologiczne. Ta metoda umożliwia dokładną analizę immunofluorescencyjną i immunohistochemiczną.

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszona technika walcowania szwajcarskiego do przygotowania tkanki jelitowej do analiz immunohistochemicznych i immunofluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów