Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

Ogólnym celem tej procedury spektrometrii mas, zwanej MSPP lub filoproteomiką opartą na spektrometrii mas, jest podtyp bakterii na poziomie szczepu. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, epidemiologii i higieny. Na przykład można go użyć do analizy sytuacji epidemii poprzez wizualizację pokrewieństwa filoprotomicznego.

W porównaniu z innymi metodami typowania, MSPP jest tani w przeliczeniu na próbkę i bardzo szybki. Zakażenia szpitalne są zagadnieniem o rosnącym znaczeniu i mamy nadzieję, że nasz program MSPP zostanie rozszerzony o typowanie epidemiologiczne innych bakterii, a nawet grzybów. Nasz schemat MSPP zapewnia wgląd w pokrewieństwo szczepów, więc do przewidywania istotnych fenotypów, takich jak oporność na leki, a nawet zjadliwość, sensowne jest zastosowanie go tam, gdzie te fenotypy korelują z określonymi genotypami.

Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj dwie probówki roztworu matrycy, rozpuszczając 2,5 miligrama HCCA w 250 mikrolitrach mieszaniny rozpuszczalników organicznych, 50% izonitrylu. Dodaj rekombinowaną insulinę ludzką jako wewnętrzną kalibrację do jednego z nich, a następnie 47,5% podwójnie destylowaną wodę i 2,5% kwas trifluorooctowy. Następnie rozprowadź ilość kolonii wielkości główki od szpilki ze szczepu referencyjnego bezpośrednio na płytce docelowej maldi.

W celu określenia dokładnej masy piku kalibracyjnego umieścić na mikrolitrze wzorca testowego w innym miejscu. Na każde miejsce bakterii i wzorzec nałożyć 1 mikrolitr roztworu matrycy wzbogaconej HCCA i pozostawić do krystalizacji w temperaturze pokojowej. Dla każdego szczepu, który ma być analizowany, powtórzyć przygotowanie rozmazu.

Na każde miejsce nałożyć 1 mikrolitr wzbogaconego roztworu matrycy HCCA i pozostawić do krystalizacji w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, białka można wyekstrahować z trudnych do ułożenia komórek. W tym celu zbierz około 5 kolonii z kultury na płytce agarowej z pętlą inokulacyjną.

Zawieś je w 300 mikrolitrach podwójnie destylowanej wody w 1,5 mililitrowej probówce reakcyjnej i dokładnie wymieszaj, powtarzając pipetowanie, aż kolonie bakteryjne zostaną całkowicie zawieszone. Następnie dodaj 900 mikrolitrów absolutnego etanolu i wymieszaj. Odwirować próbkę o masie 13 000 g przez 1 minutę.

Po wysuszeniu granulatu należy go ponownie zawiesić, pipetując w górę iw dół w 50 mikrolitrach 70% kwasu mrówkowego. Następnie dodaj 50 mikrolitrów aceto-nitrylu i wymieszaj. Usuń zanieczyszczenia przez odwirowanie w ilości 13 000 g przez 2 minuty.

Po zakończeniu przenieś 1 mikrolitr nadnazwy na pozycję próbki na płytce docelowej maldi. Po pozostawieniu próbki do wyschnięcia, pokryj każde miejsce jednym mikrolitrem roztworu matrycy HCCA i pozostaw do krystalizacji w temperaturze pokojowej. W tym momencie przeprowadź analizę MALDI-TOF, zbierając 600 widm w 100 krokach dla każdego miejsca.

Najpierw kliknij zakładkę automatycznego wykonywania w oprogramowaniu konfiguracyjnym spektrometru mas. Otwórz metodę, klikając lewym przyciskiem myszy przycisk metody i wybierając metodę z menu rozwijanego. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy przycisk edycji, aby otworzyć edytor metod automatycznego wykonywania.

W zakładce akumulacji ustaw zadowalającą wartość strzału na 100, a wartość sumy na 600. Dla każdego widma wybierz pik kalibru z listy, kliknij automatyczne przypisanie" i naciśnij OK"Po uzyskaniu widm masowych z każdego miejsca, eksperymentalnie określ dokładną masę piku kalibracyjnego, otwierając widmo za pomocą przeglądarki widma i znajdując pik o oczekiwanej masie w porównaniu z widmem bez kalibru. Sprawdzić, czy pik kalibru nie jest przesłonięty przez żaden inny biomarker organizmu będącego przedmiotem zainteresowania.

Na podstawie danych sekwencjonowania genomu szczepu referencyjnego obliczyć teoretyczną monoizotopową masę cząsteczkową każdego z kodowanych białek, tłumacząc sekwencję DNA na odpowiednią sekwencję aminokwasów. Prześlij plik"lub skopiuj wklej" tę sekwencję białka do pola wejściowego odpowiedniego panelu zasobów bioinformatycznych i oblicz teoretyczny punkt izoelektryczny i masę cząsteczkową. Skopiuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego, w którym jedna kolumna zawiera identyfikator genu, a druga kolumnę masę cząsteczkową.

Posortuj wiersze według obliczonej masy cząsteczkowej, aby ułatwić wyszukiwanie mas. Wstaw dodatkową kolumnę do arkusza kalkulacyjnego dla masy cząsteczkowej formy dematianinowanej, odejmując 135 dautonów od monoizotopowej masy cząsteczkowej. Przypisz każdą główną zmierzoną masę biomarkera do mas obliczonych ze szczepu referencyjnego, wyszukując zmierzoną masę z tabeli genomu.

W innym arkuszu kalkulacyjnym zapisz masę i identyfikator dla każdego jonu biomarkera. Teraz należy skalibrować widma masowe uzyskane z izolatów pobranych tak, jak to zrobiono dla szczepu referencyjnego. Dla jednego izolatu w rzędzie należy zidentyfikować warianty biomarkerów w widmach masowych, zapisać zmierzoną masę dla każdego biomarkera i przewidywaną izoformę w odpowiednich kolumnach.

Widmo masowe MALDI-TOF C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 zawiera 14 pojedynczo naładowanych jonów biomarkerowych, które można zidentyfikować przez porównanie obliczonych mas cząsteczkowych z widmem referencyjnym. W obrębie kolekcji wykryto różne formy iso dla L32 bez metioniny, L33 i hipotetycznego białka kodowanego przez gil152939117, S20 M i S15 M. Pozostałe masy przypisane jonom biomarkerowym były niezmienne w badanych izolatach. Substytucja aminokwasów odpowiadająca przesunięciu masy została zidentyfikowana przez amplifikację PCR i sekwencjonowanie Sangera konkretnego genu przy użyciu wymienionych tutaj starterów.

Wskazano tutaj sekwencje aminokwasowe wszystkich jonów biomarkerowych zawartych w schemacie MSPP, a także wykryte izoformy aleliczne. Dendrogram UPGMA oparty na MLST, skonstruowany z badanych izolatów doylei podgatunku C jejuni, pokazuje, że każdy izolat należy do innego typu sekwencji MLST. A szczep LMG7790 ma najdłuższą odległość filogenetyczną.

Jak widać w przypadku alaysis MLST, izolat LMG7790 ma najdłuższą odległość filoprodeomiczną w analizie MSPP badanych izolatów doylei podgatunku C jejuni. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Postępując zgodnie z tą procedurą, należy pamiętać o toksyczności niektórych substancji użytych podczas eksperymentu.

Na przykład aceto-nitryl może powodować podrażnienie skóry. Dodatkowo, do MSPP można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie DNA, w celu analizy dalszych parametrów, takich jak obecność genów oporności. Rozwój tej techniki toruje drogę naukowcom w dziedzinie mikrobiologii do zbadania fotogenii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak działa MSPP i jak można go zastosować do konkretnych pytań. Nie zapominaj, że praca z agresywnymi patogenami może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak sprzęt laboratoryjny S2.