Name: Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj metodę MSPP do podtypowania szczepów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu. Ta szybka i ekonomiczna technika spektrometrii masowej umożliwia analizę pokrewieństwa filoproteomicznego oraz przewidywanie fenotypów, takich jak oporność na leki i wirulencja, wspierając epidemiologiczne typowanie patogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Hannah Kleinschmidt za doskonałe wsparcie techniczne. Artykuł został sfinansowany przez program wsparcia otwartego dostępu Deutsche Forschungsgemeinschaft oraz fundusz wydawniczy Georg August Universität Göttingen.

<ol><li>Seng, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ongoing+revolution+in+bacteriology%3A+routine+identification+of+bacteria+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).</li>
<li>Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF-MS-based+species+identification+and+typing+approaches+in+medical+mycology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology.</a> Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).</li>
<li>Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI+TOF+MS+profiling+of+bacteria+at+the+strain+level%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review.</a> Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+of+multilocus+sequence+typing-based+Campylobacter+jejuni+subgroups+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> BMC Microbiol. 13, 247(2013).</li>
<li>Reil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Clostridium+difficile+PCR-ribotypes+001%2C+027+and+126%2F078+using+an+extended+MALDI-TOF+MS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).</li>
<li>Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+discrimination+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhi+from+other+serovars+by+MALDI-TOF+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry.</a> PLoS One. 7 (6), e40004(2012).</li>
<li>Wolters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+MS+fingerprinting+allows+for+discrimination+of+major+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages.</a> Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).</li>
<li>Josten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrum+of+Staphylococcus+aureus+identifies+mutations+that+allow+differentiation+of+the+main+clonal+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages.</a> J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).</li>
<li>Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+biomarker+discovery+for+identification+of+methicillin-resistant+and+vancomycin-intermediate+Staphylococcus+aureus+strains+by+MALDI-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF.</a> Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).</li>
<li>Novais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry+as+a+tool+for+the+discrimination+of+high-risk+Escherichia+coli+clones+from+phylogenetic+groups+B2+%28ST131%29+and+D+%28ST69%2C+ST405%2C+ST393%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393).</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).</li>
<li>Matsumura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+extended-spectrum-beta-lactamase-producing+Escherichia+coli+ST131+and+ST405+clonal+groups+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time+of+flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry.</a> J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).</li>
<li>Christner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry+Strain+Typing+during+a+Large+Outbreak+of+Shiga-Toxigenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli.</a> PLoS One. 9 (7), e101924(2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-based+PhyloProteomics+%28MSPP%29%3A+A+novel+microbial+typing+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method.</a> Scientific Reports. 5, (2015).</li>
<li>The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/">http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/</a> (2013).</li>
<li>Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+a+brief+overview+on+pathogenicity-associated+factors+and+disease-mediating+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms.</a> Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).</li>
<li>Zautner, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seroprevalence+of+campylobacteriosis+and+relevant+post-infectious+sequelae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).</li>
<li>Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni+-+The+Search+for+virulence-associated+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+Fur+Lebensmittelhygiene%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors.</a> Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+system+for+Campylobacter+jejuni%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni.</a> J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).</li>
<li>Dingle, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Campylobacter+jejuni+clones%3A+a+basis+for+epidemiologic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation.</a> Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).</li>
<li>Cody, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+genomic+epidemiological+evaluation+of+human+Campylobacter+isolates+by+use+of+whole-genome+multilocus+sequence+typing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing.</a> J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).</li>
<li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA6%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+version+6.0%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.</a> Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).</li>
<li>Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mlstdbNet+-+distributed+multi-locus+sequence+typing+%28MLST%29+databases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases.</a> BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).</li>
<li>Verroken, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Matrix-Assisted+Laser+Desorption+Ionization-Time+of+Flight+Mass+Spectrometry+for+Identification+of+Nocardia+Species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clinl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species.</a> J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).</li>
<li>El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-Assisted+Laser+Desorption%2FIonization+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry+Identification+of+Mycobacteria+in+Routine+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice.</a> PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).</li>
<li>Goujon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+bioinformatics+analysis+tools+framework+at+EMBL-EBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI.</a> Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).</li>
<li>Hall, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BioEdit%3A+a+user-friendly+biological+sequence+alignment+editor+and+analysis+program+for+Windows+95%2F98%2FNT%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT.</a> Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).</li>
<li>Jolley, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+multilocus+sequence+typing%3A+universal+characterization+of+bacteria+from+domain+to+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain.</a> Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).</li>
<li>Suarez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+proteins+as+biomarkers+for+bacterial+identification+by+mass+spectrometry+in+the+clinical+microbiology+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory.</a> J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).</li>
<li>Teramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+classification+of+Pseudomonas+putida+strains+by+MALDI-MS+using+ribosomal+subunit+proteins+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers.</a> Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).</li>
<li>Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+Rhodococcus+erythropolis+based+on+the+variation+of+ribosomal+proteins+as+observed+by+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-mass+spectrometry+without+using+genome+information%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information.</a> J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).</li>
<li>Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+on-target+lysis+%28YOTL%29%2C+a+procedure+for+making+auxiliary+mass+spectrum+data+sets+for+clinical+routine+identification+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts.</a> J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).</li>
<li>Stark, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+profiling+of+Bacillus+cereus+strains+and+quantitation+of+the+emetic+toxin+cereulide+by+means+of+stable+isotope+dilution+analysis+and+HEp-2+bioassay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay.</a> Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem na drodze do ustanowienia schematu MSPP jest jednoznaczne genetyczne określenie tożsamości jonów biomarkerowych. Jeżeli bez wątpienia nie jest możliwe zidentyfikowanie biomarkera, należy go wykluczyć ze schematu13.
Schemat C. jejuni ssp. doylei obejmuje 14 różnych jonów biomarkerowych. Są one o 5 mniej w porównaniu ze schematem MSPP C. jejuni ssp. jejuni 13. Najistotniejszą różnicą pomiędzy wykrywalnymi biomarkera...

W ciągu ostatniej dekady, spektrometria mas czasu przelotu wspomagana desorpcją laserową (MALDI-TOF MS) stała się wysoko cenioną standardową metodą identyfikacji rodzajów i gatunków drobnoustrojów w mikrobiologii klinicznej 1,2. Identyfikacja gatunków opiera się na rejestrowaniu małych odcisków palców białek z nienaruszonych komórek lub lizatów komórkowych. Typowy zakres mas dla spektrometru mas stosowanego w rutynowej mikrobiologii klinicznej wynosi 2-20 kDa. Dodatkowo, uzyskane widma mogą być wykorzystane do rozróżnienia szczepów na poziomie3 poniżej gatunku i poniżej podgatunku. Wczesne pionierskie badania zidentyfikowały specyficzne jony biomarkerowe dla określonej podgrupy szczepów Campylobacter jejuni4, Clostridium difficile5, Salmonella enterica ssp. enterica serowar Typhi6, Staphylococcus aureus 7-9 i Escherichia coli 10-12.
Kombinacja kilku zmiennych mas biomarkerów odpowiadających izoformom alleli daje możliwość głębszego podtypowania. Wcześniej z powodzeniem wdrożyliśmy metodę przekształcania tych zmian w profilach mas w znaczące i powtarzalne relacje filoproteomiczne zwane filoproteomiką opartą na spektrometrii mas (MSPP) na kolekcji izolatów C. jejuni ssp. jejuni 13. MSPP może być stosowany jako spektrometria mas równoważna technikom podtypowania opartym na sekwencjach DNA, takim jak typowanie sekwencji wielolocus (MLST).
Gatunki Campylobacter są główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie14,15. W wyniku następstwa poinfekcyjnego kampylobakteriozy, a mianowicie zespołu Guillaina-Barrégo, może dojść do reaktywnego zapalenia stawów i nieswoistego zapalenia jelit16. Głównymi źródłami zakażenia są skażone mięso zwierząt gospodarskich z kurczaków, indyków, trzody chlewnej, bydła, owiec i kaczek, mleko i wody powierzchniowe15,17. W związku z tym konieczne są regularne badania nadzoru epidemiologicznego w kontekście bezpieczeństwa żywności. MLST jest "złotym standardem" w typowaniu molekularnym dla gatunków Campylobacter 18. Ponieważ metoda MLST oparta na sekwencjonowaniu Sangera jest pracochłonna, czasochłonna i stosunkowo kosztowna, typowanie MLST jest ograniczone do stosunkowo małych kohort izolowanych. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na tańsze i szybsze metody podtypowania. Potrzeba ta może zostać zaspokojona za pomocą metod spektrometrii mas, takich jak MSPP.
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół typowania MSPP przy użyciu kolekcji izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei i porównanie jego potencjału z MLST.

<table><tbody><tr><td>acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>System Autoflex III TOF/TOF 200</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>GT02554 G201</td><td>Spektrometr</td></tr><tr><td>mas standard testu bakteryjnego BTS</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>604537</td><td></td></tr><tr><td>BioTools 3.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>263564</td><td>Pakiet oprogramowania</td></tr><tr><td>Standard testu bakteriologicznego Bruker IVD</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>8290190</td><td>5 probówek</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat&nbsp;</td><td>Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia</td><td>LMG8843</td><td>ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; szczep 093</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat&nbsp;</td><td>Belgia koordynowany zbiór mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia</td><td>LMG9143</td><td>Goossens Z90</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat&nbsp;</td><td>Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia</td><td>LMG7790</td><td>ATCC 49350; CCUG 18265; Kasper 71; LMG 8219; NCTC 11847</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat&nbsp;</td><td>Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia</td><td>LMG9243</td><td>Goossens N130</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat&nbsp;</td><td>Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia</td><td>LMG8871</td><td>NCTC A603/87</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat&nbsp;</td><td>Belgia koordynowany zbiór mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia</td><td>LMG9255</td><td>Goossens B538</td></tr><tr><td>Campylobacter jejuni subsp. doylei izolat&nbsp;</td><td>Belgia koordynowane zbieranie mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG Gandawa, Belgia</td><td>LMG8870</td><td>NCTC A613/87</td></tr><tr><td>Columbia baza agarowa&nbsp;</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.10455 .0500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kompas do FlexSeries 1.2 SR1</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>251419</td><td>Pakiet oprogramowania</td></tr><tr><td>defibrynowana krew owcza&nbsp;</td><td>Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, Niemcy</td><td>SR0051</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>02854 Kwas</td> mrówkowy Fluka <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>Matryca HCCA</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>604531</td><td></td></tr><tr><td>Bibułki papierowe</td><td>Kimtech Science przez Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td></td><td></td>Z188956</tr><tr><td>MALDI Biotyper 2.0</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>259935</td><td>Pakiet oprogramowania</td></tr><tr><td>Mast Cryobank Fiolki</td><td>Mast Diagnostica, Reinfeld, Niemcy</td><td>Tarcza ze stali polerowanej CRYO/B</td><td></td></tr><tr><td>MSP 96</td><td>Bruker Daltonics, Brema, Niemcy</td><td>224989</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAamp DNA Mini&nbsp;</td><td>Qiagen, Hilden, Niemcy</td><td>51304</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowana insulina ludzka</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>woda, klasa biologii molekularnej</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

podtypowanie izolatów campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (mspp)

Subtyping of Campylobacter jejuni ssp. doylei Isolates Using Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP)

MALDI-TOF MS oferuje możliwość różnicowania niektórych bakterii nie tylko na poziomie gatunku i podgatunku, ale nawet poniżej, na poziomie szczepu. Izoformy alleli wykrywalnych jonów biomarkerowych powodują przesunięcia masy specyficzne dla izolatu. Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) to nowatorska technika, która łączy wykrywalne masy biomarkerów za pomocą spektrometrii mas w schemacie, który umożliwia wnioskowanie relacji filoproteomicznych na podstawie specyficznych przesunięć masowych izolatu w porównaniu ze szczepem referencyjnym zsekwencjonowanym w genomie. Wydedukowane sekwencje aminokwasów są następnie wykorzystywane do obliczania dendrogramów opartych na MSPP.
Tutaj opisujemy przebieg pracy MSPP, wpisując kolekcję siedmiu szczepów izolatu Campylobacter jejuni ssp. doylei. Wszystkie siedem szczepów było pochodzenia ludzkiego, a typowanie sekwencji wielolocus (MLST) wykazało ich różnorodność genetyczną. Typowanie MSPP zaowocowało siedmioma różnymi typami sekwencji MSPP, wystarczająco odzwierciedlającymi ich filogenetyczne relacje.
Schemat MSPP C. jejuni ssp. doylei zawiera 14 różnych jonów biomarkerowych, głównie białka rybosomalne w zakresie mas od 2 do 11 kDa. MSPP można w zasadzie dostosować do innych platform spektrometrii mas o rozszerzonym zakresie mas. Dlatego technika ta ma potencjał, aby stać się użytecznym narzędziem do typowania drobnoustrojów na poziomie szczepu.

Wcześniej z sukcesem opracowaliśmy schemat MSPP dla C. jejuni ssp. jejuni13. W niniejszej pracy dążyliśmy do rozszerzenia tej metody na pokrewną podgatunek C. jejuni ssp. doylei. W tym konkretnym ustawieniu eksperymentalnym pozyskano siedem izolatów C. jejuni ssp. doylei z belgijskiej kolekcji mikroorganizmów/Laboratorium Mikrobiologii UGent BCCM/LMG w Gandawie, Belgia. Wszystkie siedem izolatów wykorzystanych w naszych anal...

Filoproteomika oparta na spektrometrii mas (MSPP) została użyta do typowania zbioru izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu w porównaniu do typowania sekwencji wielolocus (MLST).

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

MALDI-TOF MS offers the possibility to differentiate some bacteria not only at the species and subspecies level but even below, at the strain level. ...

Ogólnym celem tej procedury spektrometrycznej, nazywanej MSPP lub filoproteomiką opartą na spektrometrii mas (Mass Spectrometry-based PhyloProteomics), jest podtypownie bakterii na poziomie szczepu. Metoda ta może być wykorzystana do odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mikrobiologii, epidemiologii i higieny. Może być ona na przykład stosowana do analizy sytuacji epidemicznych poprzez wizualizację pokrewieństwa filoproteomicznego.W porównaniu do innych metod typowania, MSPP jest tanią w przeliczeniu na próbkę i bardzo szybką metodą. Zakażenia wewnątrzszpitalne stają się problemem o coraz większym znaczeniu i mamy nadzieję, że nasz schemat MSPP będzie mógł zostać rozszerzony na typowanie epidemiologiczne innych bakterii, a nawet grzybów. Nasz schemat MSPP dostarcza informacji o pokrewieństwie szczepów, zatem w celu przewidywania istotnych fenotypów, takich jak oporność na leki czy nawet wirulencja, zasadne jest jego stosowanie w przypadkach, gdy fenotypy te korelują z konkretnymi genotypami.Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj dwie probówki z roztworem matrycy, rozpuszczając 2,5 mg HCCA w 250 µL mieszaniny rozpuszczalników organicznych: 50% izonitrylu, 47,5% wody dwukrotnie destylowanej oraz 2,5% kwasu trifluorooctowego. Do jednej z probówek dodaj rekombinowaną ludzką insulinę jako kalibrator wewnętrzny. Następnie nanieś niewielką ilość kolonii szczepu referencyjnego (wielkości łebka szpilki) bezpośrednio na płytkę docelową MALDI.W celu oznaczenia dokładnej masy piku kalibracyjnego, nanieś jeden mikrolitr wzorca testowego w innym miejscu. Każdą plamkę bakterii oraz wzorca przykryj 1 mikrolitrem roztworu matrycy z dodatkiem HCCA i pozostaw do krystalizacji w temperaturze pokojowej. Powtórz przygotowanie rozmazu dla każdego analizowanego szczepu.Na każdą plamkę nanieś 1 µL roztworu matrycy HCCA z dodatkiem i pozostaw do skrystalizowania w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, białka można wyekstrahować z komórek trudnych do osadzenia. W tym celu pobierz około 5 kolonii z kultury na płytce agarowej za pomocą pętli do szczepienia.Zawiesić je w 300 µL wody dwukrotnie destylowanej w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 mL i wymieszać dokładnie poprzez wielokrotne pipetowanie, aż kolonie bakteryjne zostaną całkowicie zawieszone. Następnie dodać 900 µL bezwodnego etanolu i wymieszać. Próbkę wirować z prędkością 13 000 g przez 1 minutę.Po wysuszeniu osadu należy go zawiesić ponownie, pipetując w górę i w dół w 50 µL 70% kwasu mrówkowego. Następnie należy dodać 50 µL acetonitrylu i wymieszać. Zanieczyszczenia usuwa się poprzez wirowanie przy 13 000 g przez 2 minuty.Po zakończeniu przenieś 1 µL supernatantu na pozycję próbki na płytce docelowej MALDI. Po wyschnięciu próbki na każdą plamkę nanieś 1 µL roztworu matrycy HCCA i pozostaw do krystalizacji w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź analizę MALDI-TOF, zbierając 600 widm w krokach po 100 strzałów dla każdej plamki.Najpierw kliknij kartę auto execute w oprogramowaniu konfiguracyjnym spektrometru mas. Otwórz metodę, klikając lewym przyciskiem myszy przycisk method i wybierając odpowiednią metodę z menu rozwijanego. Następnie kliknij lewym przyciskiem myszy przycisk edit, aby otworzyć edytor metod auto execute.W zakładce akumulacji (accumulation) ustaw wartość satisfactory shot na 100, a wartość sum up na 600. Dla każdego widma wybierz z listy pik kalibratora, kliknij „automatic assign”, a następnie naciśnij OK. Po uzyskaniu widm mas z każdego punktu wyznacz doświadczalnie dokładną masę piku kalibracji, otwierając widmo w przeglądarce widm (spectrum browser) i odnajdując pik o oczekiwanej masie w porównaniu z widmem bez kalibratora. Sprawdź, czy pik kalibratora nie jest przesłonięty przez żaden inny biomarker badanego organizmu.Na podstawie danych z sekwencjonowania genomu szczepu referencyjnego oblicz teoretyczną monoizotopową masę cząsteczkową każdego z kodowanych białek, tłumacząc sekwencję DNA na odpowiadającą jej sekwencję aminokwasów. Prześlij plik lub wklej tę sekwencję białkową w pole wprowadzania odpowiedniego panelu zasobów bioinformatycznych, a następnie oblicz teoretyczny punkt izoelektryczny i masę cząsteczkową. Skopiuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego, w którym jedna kolumna będzie zawierać identyfikator genu, a druga masę cząsteczkową.Posortuj wiersze według obliczonej masy cząsteczkowej, aby ułatwić wyszukiwanie mas. Wstaw do arkusza dodatkową kolumnę dla masy cząsteczkowej formy zdemetioninowanej, odejmując 135 daltonów od monizotopowej masy cząsteczkowej. Przypisz każdą z głównych zmierzonych mas biomarkerów do mas obliczonych dla szczepu referencyjnego, wyszukując zmierzoną masę w tabeli genomu.W innym arkuszu obliczeniowym zapisz masę oraz identyfikator dla każdego jonu biomarkera. Następnie skalibruj widma masowe uzyskane z zebranych izolatów w taki sam sposób, jak zrobiono to dla szczepu referencyjnego. Dla jednego izolatu w każdym wierszu zidentyfikuj wariantowe biomarkery w widmach masowych, a w odpowiednich kolumnach zapisz zmierzoną masę każdego biomarkera oraz przewidywaną izoformę.Widmo masowe MALDI-TOF szczepu C-Jejuni Subspecies doylei ATCC 49349 zawiera 14 jednokrotnie naładowanych jonów biomarkerów, które zidentyfikowano poprzez porównanie obliczonych mas cząsteczkowych z widmem referencyjnym. W obrębie kolekcji wykryto różne izoformy dla białka L32 bez metioniny, L33 oraz białka hipotetycznego kodowanego przez gil152939117, a także S20 M i S15 M. Pozostałe masy przypisane jonom biomarkerów były niezmienne w badanych izolatach. Substytucja aminokwasowa odpowiadająca przesunięciu masy została zidentyfikowana za pomocą amplifikacji PCR i sekwencjonowania metodą Sangera konkretnego genu z wykorzystaniem wymienionych tutaj starterów.Sekwencje aminokwasowe wszystkich jonów biomarkerów uwzględnionych w schemacie MSPP, a także wykryte izoformy alleliczne, zostały wskazane tutaj. Dendrogram UPGMA oparty na MLST, skonstruowany z badanych izolatów C. jejuni podgatunku doylei, wykazuje, że każdy izolat należy do innego typu sekwencji MLST. Szczep LMG7790 charakteryzuje się najdłuższą dystansą filogenetyczną.Jak wykazano w analizie MLST, izolat LMG7790 wykazuje największą odległość filoproteomiczną w analizie MSPP spośród badanych izolatów C. jejuni podgatunku doylei. Po opanowaniu metody, technika ta może zostać wykonana w ciągu jednego dnia, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas stosowania niniejszego protokołu należy pamiętać o toksyczności niektórych substancji wykorzystywanych w trakcie eksperymentu.Na przykład acetonitryl może powodować podrażnienie skóry. Dodatkowo, obok MSPP, można zastosować inne metody, takie jak sekwencjonowanie DNA, aby przeanalizować dalsze parametry, na przykład obecność genów oporności. Opracowanie tej techniki otwiera badaczom z dziedziny mikrobiologii drogę do zgłębiania fotogenii.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak działa MSPP oraz w jaki sposób można go zastosować do konkretnych zagadnień. Należy pamiętać, że praca z gwałtownymi patogenami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie sprzętu laboratoryjnego klasy S2.

subtyping-campylobacter-jejuni-ssp-doylei-isolates-using-mass

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Chociaż posiewy kału dla Campylobacter są nieprecyzyjne, nadal są uważane za złoty standard identyfikacji. Opisano metody określania granicy wykrywalności i przeżycia C. jejuni w pożywkach transportowych w ludzkim stolcu i porównano je z nowym testem immunologicznym z większą dokładnością.

Metody hodowli w celu określenia granicy wykrywalności i przeżywalności w pożywkach transportowych Campylobacter jejuni w próbkach kału ludzkiego

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej identyfikacji białek wytwarzanych przez genomowo sekwencjonowane bakterie chorobotwórcze za pomocą tandemowej spektrometrii mas MALDI-TOF-TOF i odgórnej analizy proteomicznej za pomocą oprogramowania opracowanego przez nas. Metastabilne jony białkowe fragmentują się ze względu na działanie kwasu asparaginowego i ta specyficzność jest wykorzystywana do identyfikacji białek.

Identyfikacja białek odporności przeciwbakteryjnej w Escherichia coli za pomocą MALDI-TOF-TOF-MS/MS i odgórnej analizy proteomicznej

Wykonalność strategii sekwencjonowania całego genomu (WGS) przy użyciu narzędzi laboratoryjnych uprościła badanie genomu każdego mikroba istotnego dla zdrowia publicznego w warunkach laboratoryjnych. Opisano adaptację metodologiczną przepływu pracy dla bakteryjnych WGS, a także przedstawiono proces analizy bioinformatycznej.

Charakterystyka patogennego szczepu Escherichia coli pochodzącego z gospodarstw Oreochromis spp. przy użyciu sekwencjonowania całego genomu

Campylobacter jest główną przyczyną bakteryjnego zapalenia żołądka i jelit przenoszonego przez żywność na całym świecie. Pomimo tego, że zakłady wprowadzają środki mające na celu zmniejszenie rozpowszechnienia w swoich obiektach, skażone produkty konsekwentnie docierają do konsumentów. Technika opracowana w ciągu ostatnich dwunastu lat rozwiązuje problemy związane z ograniczeniami istniejących metod izolowania i wykrywania Campylobacter spp. z surowego mięsa.

Wykrywanie i izolacja Campylobacter spp. z surowego mięsa

Protokół ten umożliwia szybką i opłacalną ocenę składu mikroorganizmów w produktach mlecznych poprzez połączenie kulturologii z MALDI-TOF MS. Dostarcza wyniki taksonomiczne porównywalne z sekwencjonowaniem 16S rRNA, z krótszym czasem realizacji niż tradycyjne metody hodowla.

Ocena bezpieczeństwa mikroorganizmów w mleczarstwach za pomocą profilowania bakteryjnego proteomicznego za pomocą podejścia MALDI

Poznaj metodę MSPP do podtypowania szczepów Campylobacter jejuni ssp. doylei na poziomie szczepu. Ta szybka i ekonomiczna technika spektrometrii masowej umożliwia analizę pokrewieństwa filoproteomicznego oraz przewidywanie fenotypów, takich jak oporność na leki i wirulencja, wspierając epidemiologiczne typowanie patogenów.

Podtypowanie izolatów Campylobacter jejuni ssp. doylei przy użyciu filoproteomiki opartej na spektrometrii mas (MSPP)

Przeglądaj więcej filmów