21 czerwca 2016
Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.
Ogólnym celem tego protokołu jest modelowanie choroby tętnic obwodowych u ludzi poprzez umieszczanie szwów lub zwężaczy ameroidowych na tętnicy udowej myszy w celu indukcji odpowiednio ostrego lub podostrego niedokrwienia kończyn tylnych. Choroba tętnic obwodowych jest ważnym problemem klinicznym, a techniki wykorzystujące modele zwierzęce zostały opracowane, aby lepiej odwzorować chorobę człowieka. Podstawową zaletą tych technik jest to, że nasilenie i czas wystąpienia niedokrwienia kończyn mogą być kontrolowane przez badacza.
Procedurę zademonstruje Mike Padgett, technik z mojego laboratorium. Na jeden do dwóch dni przed zabiegiem upewnij się, że mysz jest w pełni uspokojona z powodu braku reakcji na szczypanie palca u nogi i nałóż maść do oczu. Następnie użyj małego trymera elektrycznego, aby zgolić włosy z obu tylnych kończyn.
Po przycięciu wszystkich włosów nałóż podgrzany krem do depilacji. Po minucie delikatnie zetrzyj krem zwilżonym gazikiem. Następnie umieść mysz w pustej klatce wyłożonej ręcznikiem papierowym, aż będzie w stanie utrzymać leżący mostek.
W dniu operacji umieść w pełni uspokojoną mysz pod mikroskopem stereoskopowym w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz obie nogi taśmą chirurgiczną. Jeśli używana jest poduszka grzewcza o kontrolowanej temperaturze, przymocuj sondę temperatury i przymocuj sondę do podstawy platformy chirurgicznej za pomocą taśmy chirurgicznej. Następnie użyj trzech naprzemiennych chusteczek z jodonem i alkoholem, aby oczyścić miejsce operacji i przykryj zwierzę sterylną serwetą chirurgiczną z otworem w miejscu nacięcia.
Za pomocą skalpela wykonaj wstępne nacięcie wzdłuż środka przyśrodkowego uda od kolana w kierunku brzucha. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby wydłużyć nacięcie do około jednego centymetra. Za pomocą kleszczy otwórz nacięcie, aby odsłonić błonę pokrywającą pachwinową tkankę tłuszczową.
Następnie za pomocą zamkniętych kleszczy przebij się przez błonę, do przestrzeni między tkanką tłuszczową a brzuchem. Delikatnie zwolnij nacisk na kleszcze, aby oddzielić tkankę tłuszczową od mięśni brzucha, odsłaniając pęczek nerwowo-naczyniowy. Bardzo ważne jest, aby główne naczynia krwionośne i ich gałęzie zostały prawidłowo zidentyfikowane przed wypreparowaniem pęczka nerwowo-naczyniowego.
Różnice w lokalizacji dusicieli lub miejsc podwiązania mogą znacząco zmienić nasilenie niedokrwienia i prowadzić do znacznej zmienności wyników. Włóż retraktor do nacięcia i pociągnij tkankę brzuszną w kierunku głowy zwierzęcia, aby odsłonić proksymalne miejsce zwężania ameroidu, które jest tuż proksymalne do bocznej tętnicy udowej obwodowej. Następnie należy wprowadzić jeden retraktor przyśrodkowy i jeden boczny do dystalnej części nacięcia, aby poszerzyć pole operacyjne, ciągnąc pachwinową tkankę tłuszczową w kierunku stopy i z dala od pola operacyjnego.
Proksymalne i powierzchowne gałęzie ogonowe tętnicy udowej powinny być łatwe do zaobserwowania. Boczna tętnica udowa obwodowa znajduje się około pięciu milimetrów proksymalnie do gałęzi ogonowych i może być zasłonięta błoną. Teraz delikatnie wsuń końcówkę jednego kleszcza pod membranę, która wiąże naczynia ze sobą, aby wprowadzić 1/2 końcówki między żyłę a tętnicę.
Następnie skryj kleszcze i delikatnie oderwij membranę. Po usunięciu całej błony włóż końcówkę zamkniętych kleszczy między żyłę a tętnicę i zwolnij nacisk na kleszcze, aby utworzyć szczelinę między naczyniami. W przypadku podostrego niedokrwienia kończyn wsuń końcówkę kleszczy pod tętnicę udową, aby odizolować naczynie od pęczka nerwowo-naczyniowego.
Użyj drugiego zestawu kleszczy pod kątem, aby chwycić krawędź zwężacza i poprowadź dusiciela pod tętnicą udową. Następnie umieść tętnicę w gnieździe zwężającego. Następnie umieść dystalny zwęźnik na tętnicy udowej bezpośrednio proksymalnie do miejsca, w którym tętnica rozdziela się na tętnice podkolanowe i odpiszczelowe, a następnie umieść tętnicę udową w gnieździe zwężającym.
W przypadku ostrego niedokrwienia kończyn należy nawlec szew 7-0 pod tętnicą w tej samej pozycji co bliższy zwężacz i podwiązać tętnicę. Następnie zawiąż drugą ligaturę około jednego milimetra dystalnie do pierwszej i użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć tętnicę między dwoma ligaturami. W przypadku dystalnego przecięcia tętnicy należy umieścić ligatury w odległości około jednego milimetra od siebie, tuż proksymalnie do miejsca, w którym tętnica udowa rozwidla się na tętnice podkolanowe i odpiszczelowe.
Następnie zamknij nacięcie przerwanymi szwami vicryl five-0 i przenieś mysz do poduszki grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza pod laserowym dopplerowskim obrazem perfuzyjnym. Teraz włącz imager i uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Kliknij ikonę Nowy pojedynczy obraz, aby otworzyć okno konfiguracji skanera i ustaw rozmiar skanowania na duży, a szybkość skanowania na cztery milisekundy na piksel.
Zmień wartości X i Y w panelu Jednostki obszaru skanowania na odpowiednie wartości, a następnie kliknij kartę Wideo i odległość i rozmieść obie tylne kończyny w obszarze skanowania. Kliknij opcję Automatyczna odległość, a następnie kliknij przycisk Dalej, aby otworzyć okno Szczegóły tematu, a następnie wprowadź informacje o temacie. Kliknij Dalej, aby przejść do okna skanowania.
Następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiar, aby otworzyć okno dialogowe Potwierdź lub zastąp odległość skanowania, a następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć proces skanowania. Po zakończeniu skanowania przenieś mysz do pustej klatki odzyskiwania z monitorowaniem, aż do całkowitego odzyskania. Oprócz różnic nieodłącznie związanych z badaniami na zwierzętach, inne czynniki mogą wprowadzać zmienność w obrazowaniu perfuzji laserowej dopplerowskiej, w tym temperatura ciała i pozycja zwierzęcia.
Model podostrego niedokrwienia kończyn tylnych zależy od jakości zwężaczy ameroidów, która może się znacznie różnić w obrębie danej partii. Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej powinno być wykonane bezpośrednio po zabiegu, gdy zwierzę jest jeszcze znieczulone, aby zademonstrować efekty operacji i ustalić wyjściowy pooperacyjny poziom perfuzji. Całkowitą utratę perfuzji kończyn tylnych należy zaobserwować po indukcji ostrego niedokrwienia kończyn, podczas gdy zwykle obserwuje się tylko łagodny spadek perfuzji po umieszczeniu ameroidalnego zwężacza w modelu podostrym.
Procedury te pozwalają na zbadanie wpływu różnego stopnia niedokrwienia na przebudowę naczyń krwionośnych i regenerację mięśni szkieletowych u myszy jako modelu choroby tętnic obwodowych u człowieka. Po opanowaniu procedury te można wykonać w około 15 minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tych operacji należy pamiętać o ciągłym monitorowaniu temperatury ciała i adekwatności znieczulenia u zwierzęcia.
Dostosowując rozmieszczenie ligatur lub zwężaczy, można zmodyfikować nasilenie urazu niedokrwiennego, co może być ważną zmienną w zależności od tła genetycznego zwierzęcia lub obecności czynników ryzyka sercowo-naczyniowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zarówno ostre, jak i podostre niedokrwienie kończyn tylnych u myszy oraz zdefiniować anatomię naczyń krwionośnych, aby zapewnić prawidłowy wynik i powtarzalność zabiegu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Niniejszy protokół opisuje metody chirurgicznego wywoływania niedokrwienia kończyny tylnej u myszy w celu badania angiogenezy oraz choroby tętnic obwodowych. Dzięki zastosowaniu konstriktorów ameroidowych badacze mogą uzyskać kontrolowane zamknięcie tętnicy, minimalizując martwicę tkanek u podatnych szczepów myszy.
Niezawodne mysie modele niedokrwienia kończyn dolnych są kluczowe dla badań translacyjnych nad chorobą tętnic obwodowych, umożliwiając kontrolowaną analizę przebudowy naczyniowej i regeneracji tkanek. Zdolność do indukowania niedokrwienia ostrego lub podostrego o precyzyjnie określonym stopniu nasilenia wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach poszukiwania nowych terapii. Modele te stanowią podstawę decyzji dotyczących portfela projektów, dostarczając powtarzalnych, relewantnych dla danej choroby systemów do walidacji celów terapeutycznych i oceny przedklinicznej.
Metoda ta integruje proces od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, wspierając testowanie hipotez, identyfikację wiodących związków oraz badania translacyjne w dziedzinie chorób naczyniowych.