Name: Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metody indukcji ostrego i podostrego niedokrwienia kończyn tylnych u myszy przy użyciu konstrikterów amerydowych. Techniki te umożliwiają kontrolowane modelowanie choroby niedokrwiennej kończyn w badaniach nad angiogenezą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez granty NIH R21HL118661, R56HL124444 i R01HL124444 dla CDK, oraz przez granty NIH R00HL103797 i R01HL125695 dla JMM.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Duke Institutional Animal Care and Use Committee. W badaniu wykorzystano samce myszy, choć do celów naukowych badania można zastosować osobniki obu płci.
1. Usuwanie owłosienia
<ol>
	<li>Przed indukcją znieczulenia przygotować obszar przygotowania przedoperacyjnego, składający się z przykrytej podgrzewanej maty ustawionej na 37 °C oraz portu z maską nosową podłączonego do ciągłego przepływu izofluranu.</li>
	<li>Umieścić mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia. Ustawić przepływomierz O2 na 1 L/min, a stężenie izofluranu na 1 - 3%. 
	UWAGA: Znieczulenie u myszy o masie 25 g indukuje się zazwyczaj przy użyciu 2% izofluranu.</li>
	<li>Sprawdzić reakcję myszy na bodźce, delikatnie kołysząc komorą i obserwując brak odruchu prostowania.</li>
	<li>Przed otwarciem przepłukać komorę O2, aby usunąć izofluran. Szybko przenieść mysz na podgrzewaną matę i podłączyć ją do izofluranu za pomocą maski nosowej.</li>
	<li>Ustawić stężenie izofluranu na 1,5%. Sprawdzić reakcję na bodźce za pomocą odruchu stopowego (uścisk palca).</li>
	<li>Obficie nałożyć smar oftalmiczny do obu oczu, aby zapobiec ich wysychaniu podczas operacji.</li>
	<li>Ogolone włosy z obu kończyn tylnych za pomocą małego trymera elektrycznego. Podczas golenia skórę należy naciągnąć, aby uniknąć jej skaleczenia.</li>
	<li>Nałożyć podgrzany krem do depilacji i pozostawić na 1 min. Delikatnie usunąć krem za pomocą zwilżonego gazika.</li>
	<li>W przypadku przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego w późniejszym czasie, wyłączyć izofluran i przenieść mysz do pustej klatki wybudzeniowej wyłożonej ręcznikiem papierowym, aby zapobiec aspiracji ściółki. Monitorować zwierzę do momentu, aż będzie w stanie utrzymać pozycję grzbietową. W przeciwnym razie przenieść mysz na stół operacyjny. 
	UWAGA: Proces usuwania włosów może podrażnić skórę i wpłynąć na pomiary perfuzji. Zaleca się odczekanie 1 - 2 dni po usunięciu włosów przed wykonaniem przedoperacyjnego skanu perfuzji lub zabiegu chirurgicznego.</li>
</ol>
2. Przygotowanie przedoperacyjne
<ol>
	<li>Podczas tej procedury należy użyć następujących narzędzi: małych prostych nożyczek chirurgicznych, 2 pęset kątowych z cienkimi końcówkami, małej pęsety Graefe'a, igłotrzymacza, 3 haków, małych nożyczek sprężynowych oraz cienkich patyczków bawełnianych.</li>
	<li>Wszystkie narzędzia należy wysterylizować w autoklawie przed rozpoczęciem operacji. Przed każdą procedurą chirurgiczną oraz pomiędzy kolejnymi zabiegami (do 5 zwierząt) należy stosować sterylizator koralikowy. W przypadku grup większych niż 5 zwierząt należy wysterylizować dodatkowe zestawy narzędzi chirurgicznych.</li>
	<li>Przygotować sterylne pole operacyjne składające się z przykrytej maty grzewczej i portu do izofluranu. Wszystkie prace należy wykonywać pod stereomikroskopem sekcyjnym 10x.</li>
	<li>Mysz należy znieczulić i przygotować zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.5.</li>
	<li>Sprawdzić, czy mysz jest w pełni oszołomiona, i ułożyć ją na stole operacyjnym w pozycji grzbietowej. Obie kończyny należy przymocować za pomocą taśmy chirurgicznej.</li>
	<li>W przypadku użycia maty grzewczej z kontrolą temperatury, należy podłączyć sondę temperatury i przymocować ją taśmą chirurgiczną do podstawy platformy operacyjnej, aby zapobiec jej przypadkowemu wyrwaniu podczas procedury.</li>
	<li>Miejsce nacięcia należy oczyścić, używając naprzemiennie 3 gazików nasączonych powidonem jodowym i alkoholem. Zwierzę należy przykryć sterylnym obłożeniem chirurgicznym i wyciąć otwór, aby odsłonić miejsce nacięcia.</li>
</ol>
3. Indukcja niedokrwienia kończyny
<ol>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj wstępne nacięcie wzdłuż środka przyśrodkowej części uda, prowadząc je od kolana w kierunku brzucha, a następnie poszerz nacięcie do około 1 cm za pomocą drobnych nożyczek (Rysunek 1A).</li>
</ol>
<img alt="Schemat anatomiczny przedstawiający rozgałęzienia tętnicze; oznaczone struktury obejmują FA, FV, SA, z zaznaczeniem miejsca sekcji." src="/files/ftp_upload/54166/54166fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Pole operacyjne i anatomiczne punkty orientacyjne naczyń krwionośnych w chirurgii niedokrwienia kończyny tylnej myszy. (A) Widok zewnętrzny kończyny tylnej myszy w pozycji na plecach. Linia kreskowana wskazuje miejsce nacięcia niezbędne do prawidłowego przeprowadzenia procedur niedokrwienia kończyny tylnej. (B) Widok proksymalnych naczyń krwionośnych kończyny tylnej myszy. Koniec proksymalny tętnicy udowej (FA) wywodzi się spod więzadła pachwinowego (IL). Koniec dystalny FA znajduje się w miejscu jego rozwidlenia na tętnicę podkolanową (PA) i tętnicę odbytniczą (SA). Głównymi tętnicami bocznymi odchodzącymi od FA są boczna tętnica obwodowa uda (LCFA), proksymalna tętnica udowa ogonowa (PCFA) oraz powierzchowna tętnica brzuszna ogonowa (SCEA). Żyła udowa (FV) biegnie obok FA, a gałęzie żylne są widoczne równolegle do głównych gałęzi tętniczych. Gwiazdki (*) oznaczają miejsca proksymalne i dystalne dla umieszczenia konstriktorów ameroidowych lub podwiązań, w zależności od tego, czy indukowane będzie niedokrwienie podostre czy ostre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Za pomocą pincety rozszerzyć nacięcie i odsłonić błonę pokrywającą tkankę tłuszczową pachwinową (IFT).</li>
	<li>Za pomocą zamkniętej pincety przebić błonę w miejscu oddzielenia IFT od jamy brzusznej. Delikatnie zwolnić nacisk pincety, aby oddzielić IFT od mięśni brzucha, odsłaniając znajdujący się pod nimi pęczek naczyniowo-nerwowy. Jako istotne punkty orientacyjne anatomiczne należy zidentyfikować proksymalne i powierzchowne gałęzie ogonowe (Rysunek 1B).</li>
	<li>Wprowadzić rozwierak i odsunąć tkankę brzuszną proksymalnie, aby odsłonić proksymalny konstriktor ameroidowy lub miejsce ligacji, znajdujące się tuż proksymalnie względem bocznej tętnicy obwodowej uda (Rysunek 1B). Tętnica obwodna boczna znajduje się około 5 mm proksymalnie względem proksymalnych i powierzchownych tętnic ogonowych.
	<ol>
		<li>Wprowadzić dwa kolejne rozwieraki do dystalnej części nacięcia, jeden przyśrodkowo i jeden bocznie, aby odsunąć IFT dystalnie od miejsca operacyjnego i poszerzyć pole operacyjne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając dwóch cienkich pęset, usunąć zewnętrzną błonę pokrywającą pęczek naczyniowo-nerwowy. Delikatnie wprowadzić połowę końcówki cienkiej pęsety między żyłę a tętnicę, przesuwając ją pod błoną, która je ze sobą wiąże. Zamknąć pęsetę i delikatnie oderwać błonę.</li>
	<li>Wprowadzić końcówkę zamkniętej pincety między żyłę a tętnicę i stworzyć między nimi przerwę, zwalniając nacisk pincety. Powtórzyć tę technikę, aby stworzyć przerwę między tętnicą a nerwem.</li>
	<li>W przypadku podostrej niedokrwienności kończyny, umieścić konstriktor ameroidowy na proksymalnej tętnicy udowej (Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Aby zainstalować proksymalny konstriktor ameroidowy, wsunąć końcówkę pincety pod tętnicę udową, aby odizolować ją od pęczka naczyniowo-nerwowego. Użyć drugiej pęsety kątowej, aby chwycić krawędź konstriktora i poprowadzić go pod tętnicę udową.</li>
		<li>Umieścić tętnicę udową w szczelinie konstriktora. Powtórzyć czynność dla konstriktora dystalnego, pozycjonując go bezpośrednio proksymalnie względem rozwidlenia tętnicy udowej na tętnicę podkolanową i tętnicę odżyłkową (Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Procedura chirurgiczna przedstawiająca tętnice szczura z mikroklipsami, opisane jako LCFA, PA, SA; eksperyment biologiczny." src="/files/ftp_upload/54166/54166fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Umiejscowienie konstriktorów ameroidowych i podwiązań. (A) Przykład dwóch konstriktorów ameroidowych umieszczonych na tętnicy udowej w celu wywołania podostrego niedokrwienia kończyny dolnej. Konstriktor proksymalny jest umieszczony tuż przed tętnicą obwodową boczną uda (LCFA). Konstriktor dystalny jest umieszczony tuż przed rozwidleniem tętnicy podkolanowej (PA) i tętnicy odpiszczelowej (SA). Konstriktory są instalowane szczeliną skierowaną do góry, aby zapewnić prawidłowe osadzenie tętnicy wewnątrz konstriktora. (B) Przykład podwiązań tętnicy udowej w celu wywołania ostrego niedokrwienia kończyny dolnej. Podwiązania (żółte strzałki) są rozmieszczone tak, aby flankować pozycję konstriktorów z panelu (B), a tętnica udowa jest przecinana pomiędzy każdą parą podwiązań (gwiazdki). Pasek skali, 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54166/54166fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="8">
	<li>W przypadku ostrego niedokrwienia kończyny, podwiąż i przetnij bliższy odcinek tętnicy udowej.
	<ol>
		<li>Aby przeciąć tętnicę udową, przełóż szew 7 - O pod tętnicą, tuż powyżej miejsca położenia bliższego konstriktora (patrz Krok 3.7) i zawiąż. Zawiąż drugą ligaturę około 1 mm powyżej pierwszej.</li>
		<li>Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć tętnicę pomiędzy dwiema ligaturami. W celu wykonania dalszego przecięcia tętnicy powtórz te kroki, umieszczając dwie ligatury w odstępach około 1 mm, tuż powyżej rozwidlenia tętnicy udowej na tętnicę podkolanową i tętnicę odpiszczelową, upewniając się jednocześnie, że znajdują się one poniżej tętnicy powierzchownej brzusznej ogonowej (patrz Rycina 1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij nacięcie, stosując przerywane szwy z nici vicryl 5 - O.</li>
</ol>
4. Obrazowanie perfuzyjne
<ol>
	<li>Przenieś mysz na podkładkę grzewczą o temperaturze 37 °C umieszczoną pod laserowym obrazownikiem perfuzji dopplerowskiej (LDPI) i podłącz ją za pomocą stożka nosowego do źródła izofluranu. Jeśli monitor temperatury nie jest dostępny, odczekaj 5 min, aż mysz rozgrzeje się do 37 °C.</li>
	<li>Włącz obrazownik i uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazów.</li>
	<li>Kliknij ikonę „New Single Image”, aby otworzyć okno „Scanner Setup”. Ustaw „Scan Size” na „Large”, a „Scan Speed” na „4 ms/pixel”. Wyznacz obszar skanowania, zmieniając wartości x i y w panelu „Scan Area (units)”.</li>
	<li>Kliknij kartę „Video and Distance”, aby wyświetlić podgląd wideo, i ustaw mysz tak, aby mieściła się w obszarze skanowania wskazanym przez czerwoną obwódkę. Kliknij „Auto Distance”, aby skalibrować odległość lasera od obiektu. Kliknij „Next”, aby otworzyć okno „Subject Details”.</li>
	<li>Wprowadź informacje o obiekcie oraz wszelkie istotne uwagi. Kliknij przycisk „Next”, aby przejść do okna skanowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk „Start Measurement”, aby otworzyć okno dialogowe „Confirm or Override Scan Distance”. Kliknij „OK”, aby potwierdzić odległość skanowania. Obserwuj rozpoczęcie procesu skanowania, który trwa od 4 do 8 min w zależności od wielkości obszaru skanowania.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania pojawi się okno „Save As”. Nadaj plikowi nazwę i zapisz go.</li>
	<li>Wyłącz dopływ izofluranu, przenieś mysz do pustej klatki regeneracyjnej i monitoruj ją, aż zwierzę będzie w stanie utrzymać pozycję sternalną. Nigdy nie umieszczaj myszy budzącej się z narkozy w klatce z innymi myszami.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu. Kliknij ikonę „Open”, przejdzij do pliku z obrazem i otwórz go w celu analizy. W oknie pliku obejrzyj obrazy przepływu (flux), zdjęcia oraz obrazy kolorowe myszy.</li>
	<li>Aby zaznaczyć obszar zainteresowania (ROI) na obrazie przepływu, kliknij ikonę „Show ROIs”. Następnie kliknij przycisk „Add Polygon” i przeciągnij kursor wokół kończyny nieoperowanej, aby narysować ROI. Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby zamknąć kształt. Wybierz ponownie „Add Polygon” i narysuj analogiczny ROI wokół kończyny operowanej.</li>
	<li>Kliknij ikonę „Statistics”, aby otworzyć okno „Image ROIs Statistic Results (PU)”. Odczytaj procentową różnicę w przepływie w kolumnie „Flux %”. 
	UWAGA: Pierwszy narysowany ROI będzie służył jako referencja. 
	UWAGA: Przed każdym kolejnym skanowaniem perfuzji należy wykonać czynności opisane w Sekcji 1 w celu znieczulenia myszy oraz kroki od 4.1 do 4.11 w celu obrazowania zwierzęcia.</li>
</ol>

<ol><li>Criqui, M. H., Aboyans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of peripheral artery disease.</a> Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).</li>
<li>Thukkani, A. K., Kinlay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endovascular+intervention+for+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Endovascular intervention for peripheral artery disease.</a> Circ. Res. 116, 1599-1613 (2015).</li>
<li>Vartanian, S. M., Conte, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+intervention+for+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Surgical intervention for peripheral arterial disease.</a> Circ. Res. 116, 1614-1628 (2015).</li>
<li>Bonaca, M. P., Creager, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+treatment+and+current+management+of+peripheral+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological treatment and current management of peripheral artery disease.</a> Circ. Res. 116, 1579-1598 (2015).</li>
<li>Conte, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+rationale+of+the+PREVENT+III+clinical+trial%3A+edifoligide+for+the+prevention+of+infrainguinal+vein+graft+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Endovascular+Surg%22%5BJournal%5D)">Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure.</a> Vasc Endovascular Surg. 39, 15-23 (2005).</li>
<li>Pomposelli, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+experience+with+dorsalis+pedis+artery+bypass%3A+analysis+of+outcome+in+more+than+1000+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">A decade of experience with dorsalis pedis artery bypass: analysis of outcome in more than 1000 cases.</a> J. Vasc. Surg. 37, 307-315 (2003).</li>
<li>Willigendael, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking+and+the+patency+of+lower+extremity+bypass+grafts%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Smoking and the patency of lower extremity bypass grafts: a meta-analysis.</a> J. Vasc. Surg. 42, 67-74 (2005).</li>
<li>Schillinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balloon+angioplasty+versus+implantation+of+nitinol+stents+in+the+superficial+femoral+artery%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Balloon angioplasty versus implantation of nitinol stents in the superficial femoral artery.</a> N. Engl. J. Med. 354, 1879-1888 (2006).</li>
<li>Marmagkiolis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((12-month+primary+patency+rates+of+contemporary+endovascular+device+therapy+for+femoro-popliteal+occlusive+disease+in+6%2C024+patients%3A+beyond+balloon+angioplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Catheter.+Cardiovasc.+Interv%22%5BJournal%5D)">12-month primary patency rates of contemporary endovascular device therapy for femoro-popliteal occlusive disease in 6,024 patients: beyond balloon angioplasty.</a> Catheter. Cardiovasc. Interv. 84, 555-564 (2014).</li>
<li>Rosenfield, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trial+of+a+Paclitaxel-Coated+Balloon+for+Femoropopliteal+Artery+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Trial of a Paclitaxel-Coated Balloon for Femoropopliteal Artery Disease.</a> N. Engl. J. Med. 373, 145-153 (2015).</li>
<li>Tepe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-coated+balloon+versus+standard+percutaneous+transluminal+angioplasty+for+the+treatment+of+superficial+femoral+and+popliteal+peripheral+artery+disease%3A+12-month+results+from+the+IN.PACT+SFA+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug-coated balloon versus standard percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of superficial femoral and popliteal peripheral artery disease: 12-month results from the IN.PACT SFA randomized trial.</a> Circulation. 131, 495-502 (2015).</li>
<li>Couffinhal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Mouse model of angiogenesis.</a> Am. J. Pathol. 152, 1667-1679 (1998).</li>
<li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>McClung, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-specific+genetic+determinants+contribute+to+the+differential+strain-dependent+effects+of+hindlimb+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice.</a> Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).</li>
<li>Dokun, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+trait+locus+%28LSq-1%29+on+mouse+chromosome+7+is+linked+to+the+absence+of+tissue+loss+after+surgical+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia.</a> Circulation. 117, 1207-1215 (2008).</li>
<li>Rivard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+impairment+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Age-dependent impairment of angiogenesis.</a> Circulation. 99, 111-120 (1999).</li>
<li>Hazarika, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+angiogenesis+after+hindlimb+ischemia+in+type+2+diabetes+mellitus%3A+differential+regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1+and+soluble+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired angiogenesis after hindlimb ischemia in type 2 diabetes mellitus: differential regulation of vascular endothelial growth factor receptor 1 and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1.</a> Circ. Res. 101, 948-956 (2007).</li>
<li>Couffinhal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+collateral+vessel+development+associated+with+reduced+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+ApoE-%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice.</a> Circulation. 99, 3188-3198 (1999).</li>
<li>Tang, G. L., Chang, D. S., Sarkar, R., Wang, R., Messina, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+gradual+or+acute+arterial+occlusion+on+skeletal+muscle+blood+flow%2C+arteriogenesis%2C+and+inflammation+in+rat+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">The effect of gradual or acute arterial occlusion on skeletal muscle blood flow, arteriogenesis, and inflammation in rat hindlimb ischemia.</a> J. Vasc. Surg. 41, 312-320 (2005).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+blood+flow+recovery+in+acute+versus+gradual+femoral+artery+occlusion+are+distinct+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse.</a> J. Vasc. Surg. 48, 1546-1558 (2008).</li>
<li>Litvak, J., Siderides, L. E., Vineberg, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+experimental+production+of+coronary+artery+insufficiency+and+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Heart+J%22%5BJournal%5D)">The experimental production of coronary artery insufficiency and occlusion.</a> Am. Heart J. 53, 505-518 (1957).</li>
<li>Bredee, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+ameroid+constrictor.+Preliminary+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">An improved ameroid constrictor. Preliminary communication.</a> J. Surg. Res. 9, 107-112 (1969).</li>
<li>McClung, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subacute+limb+ischemia+induces+skeletal+muscle+injury+in+genetically+susceptible+mice+independent+of+vascular+density%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Subacute limb ischemia induces skeletal muscle injury in genetically susceptible mice independent of vascular density.</a> J. Vasc. Surg. , (2015).</li>
<li>Hellingman, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+surgical+procedures+for+hind+limb+ischaemia+mouse+models+result+in+differences+in+collateral+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Vasc.+Endovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation.</a> Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 40, 796-803 (2010).</li>
<li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb%3A+functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PloS one. 8, e84047(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Być może najtrudniejszym krokiem w tej procedurze jest oddzielenie tętnicy udowej od żyły udowej. Większa średnica i cieńsze ścianki żyły udowej w porównaniu do ścian tętnicy zwiększają jej podatność na przebicie i rozerwanie podczas manipulacji chirurgicznej. Prawdopodobieństwo przerwania żyły można zmniejszyć, utrzymując ranę w wilgoci za pomocą sterylnego wacika zwilżonego PBS. Ważne jest również, aby upewnić się, że wszystkie kleszcze są naostrzone, wyrównane i wolne od pęknięć, aby umożliwić precyzyjną manipulację n...

Choroba tętnic obwodowych (PAD) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności z powodu chorób sercowo-naczyniowych w krajach rozwiniętych 1. PAD wynika z miażdżycowej niedrożności tętnic obwodowych, która prowadzi do niedokrwienia kończyn z wynikającym z tego bólem wysiłkowym lub spoczynkowym, a czasami niegojącymi się owrzodzeniami i gangreną, które wymagają amputacji kończyny. Terapie ukierunkowane na PAD są ukierunkowane przede wszystkim na endowaskularną 2 lub chirurgiczną rewaskularyzację 3, ponieważ zasadniczo nie istnieją skuteczne terapie medyczne 4.
Niestety, rewaskularyzacja często przynosi ograniczone korzyści, ponieważ przeszczepy bypassów mają wysoki wskaźnik niepowodzeń (do 50% w ciągu 5 lat) 5, który jest gorszy w niektórych populacjach (np. palacze, kobiety, przeszczepy żył odpiszczelowych) 6,7. Podejścia wewnątrznaczyniowe, takie jak angioplastyka i stentowanie, są również zagrożone przez wysokie wskaźniki restenozy (przekraczające 50% w ciągu 1 roku), szczególnie w chorobie udowo-podkolanowej 8, chociaż stosowanie balonów i stentów uwalniających leki poprawiło nieco wyniki 9-11. W celu opracowania nowych metod leczenia PAD konieczne jest opracowanie modeli zwierzęcych, które w wiarygodny sposób odtwarzają chorobę u ludzi.
Do tej pory najczęstszym modelem PAD jest model niedokrwienia kończyn tylnych (HLI), który najczęściej wykonywany jest u myszy 12,13. Najczęstszym przejawem modelu jest chirurgiczne podwiązanie bliższej i dalszej tętnicy udowej oraz jej pośrednich odgałęzień bocznych, a następnie wycięcie naczynia, co skutkuje niedrożnością przepływu krwi i indukcją ostrego niedokrwienia kończyny. HLI jest stosowany przede wszystkim do badania odpowiedzi angiogennych i tętniczych w tkance mięśniowej kończyn obwodowych oraz wpływu różnych terapii (np. leków, dostarczania genów, komórek macierzystych) na te odpowiedzi. Niedawno nasza grupa wykorzystała ten model do zbadania roli komórek mięśni szkieletowych w odpowiedzi na niedokrwienie kończyn oraz wpływu różnic genetycznych na wyniki 14.
Model HLI ułatwił nam zrozumienie, że reakcje naczyń krwionośnych i mięśni na niedokrwienie są zależne od genetyki (tj. szczepu wsobnego) 15, wieku 16 lat oraz obecności lub braku innych chorób lub stanów związanych z miażdżycą, w tym cukrzycy 17 i hipercholesterolemii 18. Istotną słabością tradycyjnego modelu HLI jest jednak to, że jest to model ostrego niedokrwienia kończyn 12,13, podczas gdy ludzki PAD powoduje przewlekłe niedokrwienie w wyniku stopniowego rozwoju zgryzowych zmian miażdżycowych w tętnicach obwodowych.
Próbując obejść tę słabość, Tang i współpracownicy początkowo opracowali szczurzy model stopniowego zamykania tętnicy udowej za pomocą zwężaczy ameroidów 19, a następnie ta sama grupa opracowała podobny model myszy 20. Zwężacze ameroidów zostały opisane po raz pierwszy w latach pięćdziesiątych XX wieku w psim modelu przewlekłego niedokrwienia mięśnia sercowego 21,22. Urządzenia te mają zewnętrzną metalową tuleję otaczającą wewnętrzną warstwę materiału higroskopijnego, zwykle kazeiny, a po umieszczeniu wokół tętnicy wywołują stopniową niedrożność naczyń, ponieważ pochłaniają wilgoć z otaczających tkanek. W swojej modyfikacji modelu, Yang i wsp. Umieszczono zwężacze zarówno na bliższej, jak i dalszej tętnicy udowej w miejscach analogicznych do miejsc podwiązania chirurgicznego, a także podwiązano boczne gałęzie tętnicy udowej, jak w tradycyjnym modelu. W porównaniu z ostrym HLI, niedokrwienie wywołane zwężaczem ameroidowym skutkowało niższą ekspresją genów zależnych od stanu zapalnego i stresu ścinającego, wolniejszym odzyskiwaniem przepływu krwi 4-5 tygodni po operacji i mniejszą martwicą mięśni 20. Na podstawie tych obserwacji uznano, że stopniowa niedrożność tętnic może dostarczyć modelu PAD bardziej odpowiedniego dla choroby ludzkiej.
Warto zauważyć, że w oryginalnym raporcie, efekty niedokrwienia wywołanego przez zwężaczy ameroidów były badane tylko u myszy C57BL/6 19, które są stosunkowo odporne na martwicę mięśni wywołaną niedokrwieniem 15. Niedawno zmodyfikowaliśmy model stopniowego niedokrwienia i zbadaliśmy jego efekty w bardziej podatnym na niedokrwienie szczepie myszy BALB/c 23. W pierwszej odsłonie modelu umieściliśmy zwężacze zarówno na bliższej, jak i dalszej tętnicy udowej, pozostawiając wszystkie boczne gałęzie nienaruszone. W drugiej, łagodniejszej modyfikacji, umieściliśmy pojedynczy zwężacz tylko na bliższej tętnicy udowej i ponownie pozostawiliśmy wszystkie boczne brache tętnicy nienaruszone. W obu modyfikacjach tego modelu stwierdziliśmy, że myszy BALB/c, ale nie myszy C57BL/6, wykazywały znaczną martwicę mięśni, mimo że miały podobny przepływ krwi i gęstość naczyń. Podobnie jak w naszym poprzednim badaniu 14, odkrycia te wykazały, że na uszkodzenie mięśni kończyn nie ma wpływu wyłącznie przepływ krwi, ale jest częściowo zależne od tła genetycznego. Co więcej, odkryliśmy, że przepływ krwi w kończynach spadł do nadiru w ciągu 3 dni, dlatego model wydaje się być bardziej "podostrym" niż stopniowym niedokrwieniem kończyny.
Na podstawie tych wcześniejszych badań, wydaje się jasne, że pojedyncza metoda wywoływania niedokrwienia kończyn tylnych może nie być odpowiednia we wszystkich przypadkach. Ponieważ różnorodność schorzeń (np. różnice genetyczne oraz obecność lub brak chorób współistniejących) wpływają zarówno na reakcje specyficzne dla mięśni naczyniowych, jak i szkieletowych, badacze mogą uznać za konieczne zmodyfikowanie przewlekłości i/lub nasilenia niedokrwienia kończyn tylnych, aby jak najlepiej odpowiadało ich celom. Co więcej, we wcześniejszych opisach modelu zazwyczaj brakowało odpowiednich anatomicznych punktów orientacyjnych, które ułatwiałyby wiarygodną odtwarzalność techniki między badaczami. W niniejszej pracy opisano metody wywoływania ostrego lub podostrego niedokrwienia kończyn tylnych u myszy oraz podano dokładne anatomiczne punkty orientacyjne.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5/45 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11251-35</td><td>Dumoxel</td></tr><tr><td>Dumont Style 5 Mini kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11200-14</td><td>Inox</td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>7 - 0 Jedwabny szew</td><td>Sharpoint</td><td>DA-2527N</td><td></td></tr><tr><td>5 - 0 Powlekany szew</td><td>Vicryl Ethicon</td><td>J463G</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe Vannas</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr>Maść do sztucznych<td>łez</td><td>Rugby Laboratories</td><td>0536-6550-91</td><td></td></tr><tr><td>Taśma chirurgiczna</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie waciki bawełniane</td><td>Contec</td><td>SC-4</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Physitemp</td><td>TCAT-2DF</td><td></td></tr><tr><td>Zwężacze ameroidów</td><td>Przyrządy badawcze SW</td><td>MMC-0,25 x 1,00-SS</td><td></td></tr><tr>Sterylizator <td></td><td></td><td></td><td>gorących koralików</td></tr><tr><td>Podkładka izotermiczna Deltaphase</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik igieł</td><td>Narzędzia</td><td></td><td></td>do nauki o soli</tr> fizjologicznej <tr><td>buforowanej fosforanem&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Moor LDPI</td><td>Moor Instruments</td><td>moorLDI2</td><td></td></tr><tr><td>moorLDI Oprogramowanie pomiarowe</td><td>Moor Instruments</td><td>v. 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Krem do depilacji</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia

Choroba tętnic obwodowych (PAD) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności sercowo-naczyniowej w krajach rozwiniętych, a modele zwierzęce, które wiarygodnie odtwarzają ludzką chorobę, są niezbędne do opracowania nowych terapii tej choroby. Model niedokrwienia kończyn tylnych myszy jest szeroko stosowany do tego celu, ale standardowa praktyka wywoływania ostrego niedokrwienia kończyn poprzez podwiązanie tętnicy udowej może powodować znaczną martwicę tkanek, zagrażając zdolności badaczy do badania odpowiedzi tkanki naczyniowej i mięśni szkieletowych na niedokrwienie. Alternatywnym podejściem do podwiązania tętnicy udowej jest indukcja stopniowego zamykania tętnicy udowej poprzez zastosowanie zwężaczy ameroidowych. Po umieszczeniu wokół tętnicy udowej w tych samych lub różnych miejscach, co miejsca podwiązania tętnicy udowej, urządzenia te zamykają tętnicę w ciągu 1-3 dni, co powoduje bardziej stopniowe, podostre niedokrwienie. Powoduje to mniej istotną martwicę tkanki mięśni szkieletowych, która może bardziej naśladować reakcje obserwowane w ludzkim PAD. Ponieważ tło genetyczne wpływa na wyniki zarówno w modelu ostrego, jak i podostrego niedokrwienia, rozważenie badanego szczepu myszy jest ważne przy wyborze najlepszego modelu. W niniejszej pracy opisano prawidłową procedurę i anatomiczne rozmieszczenie ligatur lub zwężaczy ameroidów na tętnicy udowej myszy w celu wywołania podostrego lub ostrego niedokrwienia kończyn tylnych u myszy.

Prawidłowa identyfikacja naczyń krwionośnych kończyny tylnej myszy jest kluczowa dla zapewnienia powtarzalności technik indukowania niedokrwienia kończyny tylnej w formie podostrej i ostrej, opisanych w niniejszym opracowaniu. Poza zmiennością właściwą dla badań na zwierzętach, inne czynniki mogą wprowadzać różnice w obrazowaniu perfuzji metodą laserowego Dopplera (LDPI), w tym rodzaj znieczulenia, pozycja zwierzęcia (na plecach vs. na brzuchu) oraz temperatura ciała (patrz <stro...

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Peripheral artery disease (PAD) is a leading cause of cardiovascular morbidity and mortality in developed countries, and animal models that reliably ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest modelowanie choroby tętnic obwodowych u ludzi poprzez nałożenie szwów lub implantację konstriktorów ameroidowych na tętnicę udową myszy w celu indukcji odpowiednio ostrego lub podostrego niedokrwienia kończyny dolnej. Choroba tętnic obwodowych stanowi istotny problem kliniczny, a opisane techniki z wykorzystaniem modeli zwierzęcych zostały opracowane, aby lepiej odzwierciedlać przebieg tej choroby u ludzi. Główną zaletą tych metod jest możliwość kontrolowania przez badacza stopnia nasilenia oraz czasu wystąpienia niedokrwienia kończyny.Procedurę zademonstruje Mike Padgett, technik z mojego laboratorium. Na jeden do dwóch dni przed procedurą należy potwierdzić, że mysz jest w pełni znieczulona poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi, a następnie nałożyć maść do oczu. Następnie należy użyć małego trymera elektrycznego, aby ogolić sierść z obu kończyn tylnych.Po przycięciu wszystkich włosów należy nałożyć uprzednio podgrzany krem do depilacji. Po jednej minucie delikatnie zetrzeć krem zwilżonym gazikiem. Następnie umieścić mysz w pustej klatce rekonwalescencyjnej wyścielonej ręcznikiem papierowym, aż zwierzę będzie w stanie utrzymać poz

methods-for-acute-and-subacute-murine-hindlimb-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Pokazujemy tutaj in-vivo wprowadzenie pompy osmotycznej do stałego miejscowego dostarczania leków i tworzenie niedokrwienia kończyn tylnych w modelu mysim. Ponadto unaczynienie kończyn tylnych jest perfundowane za pomocą Microfilu, silikonowego środka nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich, w celu przygotowania do obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT).

Osmotyczne podawanie leków do niedokrwionych kończyn tylnych i perfuzja naczyń krwionośnych za pomocą mikrofilu do obrazowania mikrotomografii komputerowej

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Tutaj opisujemy szczegółową procedurę niedokrwienia jelit u myszy, która prowadzi do powtarzalnego uszkodzenia bez śmiertelności, aby zachęcić do standaryzacji tej techniki w całej dziedzinie. Ten model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit może być wykorzystany do badania komórkowych i molekularnych mechanizmów uszkodzenia i regeneracji.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego jelit

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.

Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych

Tutaj prezentujemy protokół, który demonstruje technikę i niezbędne kontrole dla laserowego obrazowania perfuzjowego Dopplera do pomiaru przepływu krwi w tylnej kończynie myszy.

Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej w tylnej kończynie myszy

Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Poznaj metody indukcji ostrego i podostrego niedokrwienia kończyn tylnych u myszy przy użyciu konstrikterów amerydowych. Techniki te umożliwiają kontrolowane modelowanie choroby niedokrwiennej kończyn w badaniach nad angiogenezą.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Przeglądaj więcej filmów