Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych
21 czerwca 2016
Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.
Ogólnym celem tego protokołu jest modelowanie choroby tętnic obwodowych u ludzi poprzez umieszczanie szwów lub zwężaczy ameroidowych na tętnicy udowej myszy w celu indukcji odpowiednio ostrego lub podostrego niedokrwienia kończyn tylnych. Choroba tętnic obwodowych jest ważnym problemem klinicznym, a techniki wykorzystujące modele zwierzęce zostały opracowane, aby lepiej odwzorować chorobę człowieka. Podstawową zaletą tych technik jest to, że nasilenie i czas wystąpienia niedokrwienia kończyn mogą być kontrolowane przez badacza.
Procedurę zademonstruje Mike Padgett, technik z mojego laboratorium. Na jeden do dwóch dni przed zabiegiem upewnij się, że mysz jest w pełni uspokojona z powodu braku reakcji na szczypanie palca u nogi i nałóż maść do oczu. Następnie użyj małego trymera elektrycznego, aby zgolić włosy z obu tylnych kończyn.
Po przycięciu wszystkich włosów nałóż podgrzany krem do depilacji. Po minucie delikatnie zetrzyj krem zwilżonym gazikiem. Następnie umieść mysz w pustej klatce wyłożonej ręcznikiem papierowym, aż będzie w stanie utrzymać leżący mostek.
W dniu operacji umieść w pełni uspokojoną mysz pod mikroskopem stereoskopowym w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz obie nogi taśmą chirurgiczną. Jeśli używana jest poduszka grzewcza o kontrolowanej temperaturze, przymocuj sondę temperatury i przymocuj sondę do podstawy platformy chirurgicznej za pomocą taśmy chirurgicznej. Następnie użyj trzech naprzemiennych chusteczek z jodonem i alkoholem, aby oczyścić miejsce operacji i przykryj zwierzę sterylną serwetą chirurgiczną z otworem w miejscu nacięcia.
Za pomocą skalpela wykonaj wstępne nacięcie wzdłuż środka przyśrodkowego uda od kolana w kierunku brzucha. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby wydłużyć nacięcie do około jednego centymetra. Za pomocą kleszczy otwórz nacięcie, aby odsłonić błonę pokrywającą pachwinową tkankę tłuszczową.
Następnie za pomocą zamkniętych kleszczy przebij się przez błonę, do przestrzeni między tkanką tłuszczową a brzuchem. Delikatnie zwolnij nacisk na kleszcze, aby oddzielić tkankę tłuszczową od mięśni brzucha, odsłaniając pęczek nerwowo-naczyniowy. Bardzo ważne jest, aby główne naczynia krwionośne i ich gałęzie zostały prawidłowo zidentyfikowane przed wypreparowaniem pęczka nerwowo-naczyniowego.
Różnice w lokalizacji dusicieli lub miejsc podwiązania mogą znacząco zmienić nasilenie niedokrwienia i prowadzić do znacznej zmienności wyników. Włóż retraktor do nacięcia i pociągnij tkankę brzuszną w kierunku głowy zwierzęcia, aby odsłonić proksymalne miejsce zwężania ameroidu, które jest tuż proksymalne do bocznej tętnicy udowej obwodowej. Następnie należy wprowadzić jeden retraktor przyśrodkowy i jeden boczny do dystalnej części nacięcia, aby poszerzyć pole operacyjne, ciągnąc pachwinową tkankę tłuszczową w kierunku stopy i z dala od pola operacyjnego.
Proksymalne i powierzchowne gałęzie ogonowe tętnicy udowej powinny być łatwe do zaobserwowania. Boczna tętnica udowa obwodowa znajduje się około pięciu milimetrów proksymalnie do gałęzi ogonowych i może być zasłonięta błoną. Teraz delikatnie wsuń końcówkę jednego kleszcza pod membranę, która wiąże naczynia ze sobą, aby wprowadzić 1/2 końcówki między żyłę a tętnicę.
Następnie skryj kleszcze i delikatnie oderwij membranę. Po usunięciu całej błony włóż końcówkę zamkniętych kleszczy między żyłę a tętnicę i zwolnij nacisk na kleszcze, aby utworzyć szczelinę między naczyniami. W przypadku podostrego niedokrwienia kończyn wsuń końcówkę kleszczy pod tętnicę udową, aby odizolować naczynie od pęczka nerwowo-naczyniowego.
Użyj drugiego zestawu kleszczy pod kątem, aby chwycić krawędź zwężacza i poprowadź dusiciela pod tętnicą udową. Następnie umieść tętnicę w gnieździe zwężającego. Następnie umieść dystalny zwęźnik na tętnicy udowej bezpośrednio proksymalnie do miejsca, w którym tętnica rozdziela się na tętnice podkolanowe i odpiszczelowe, a następnie umieść tętnicę udową w gnieździe zwężającym.
W przypadku ostrego niedokrwienia kończyn należy nawlec szew 7-0 pod tętnicą w tej samej pozycji co bliższy zwężacz i podwiązać tętnicę. Następnie zawiąż drugą ligaturę około jednego milimetra dystalnie do pierwszej i użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć tętnicę między dwoma ligaturami. W przypadku dystalnego przecięcia tętnicy należy umieścić ligatury w odległości około jednego milimetra od siebie, tuż proksymalnie do miejsca, w którym tętnica udowa rozwidla się na tętnice podkolanowe i odpiszczelowe.
Następnie zamknij nacięcie przerwanymi szwami vicryl five-0 i przenieś mysz do poduszki grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza pod laserowym dopplerowskim obrazem perfuzyjnym. Teraz włącz imager i uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazu. Kliknij ikonę Nowy pojedynczy obraz, aby otworzyć okno konfiguracji skanera i ustaw rozmiar skanowania na duży, a szybkość skanowania na cztery milisekundy na piksel.
Zmień wartości X i Y w panelu Jednostki obszaru skanowania na odpowiednie wartości, a następnie kliknij kartę Wideo i odległość i rozmieść obie tylne kończyny w obszarze skanowania. Kliknij opcję Automatyczna odległość, a następnie kliknij przycisk Dalej, aby otworzyć okno Szczegóły tematu, a następnie wprowadź informacje o temacie. Kliknij Dalej, aby przejść do okna skanowania.
Następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiar, aby otworzyć okno dialogowe Potwierdź lub zastąp odległość skanowania, a następnie kliknij przycisk OK, aby rozpocząć proces skanowania. Po zakończeniu skanowania przenieś mysz do pustej klatki odzyskiwania z monitorowaniem, aż do całkowitego odzyskania. Oprócz różnic nieodłącznie związanych z badaniami na zwierzętach, inne czynniki mogą wprowadzać zmienność w obrazowaniu perfuzji laserowej dopplerowskiej, w tym temperatura ciała i pozycja zwierzęcia.
Model podostrego niedokrwienia kończyn tylnych zależy od jakości zwężaczy ameroidów, która może się znacznie różnić w obrębie danej partii. Laserowe obrazowanie perfuzji dopplerowskiej powinno być wykonane bezpośrednio po zabiegu, gdy zwierzę jest jeszcze znieczulone, aby zademonstrować efekty operacji i ustalić wyjściowy pooperacyjny poziom perfuzji. Całkowitą utratę perfuzji kończyn tylnych należy zaobserwować po indukcji ostrego niedokrwienia kończyn, podczas gdy zwykle obserwuje się tylko łagodny spadek perfuzji po umieszczeniu ameroidalnego zwężacza w modelu podostrym.
Procedury te pozwalają na zbadanie wpływu różnego stopnia niedokrwienia na przebudowę naczyń krwionośnych i regenerację mięśni szkieletowych u myszy jako modelu choroby tętnic obwodowych u człowieka. Po opanowaniu procedury te można wykonać w około 15 minut, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tych operacji należy pamiętać o ciągłym monitorowaniu temperatury ciała i adekwatności znieczulenia u zwierzęcia.
Dostosowując rozmieszczenie ligatur lub zwężaczy, można zmodyfikować nasilenie urazu niedokrwiennego, co może być ważną zmienną w zależności od tła genetycznego zwierzęcia lub obecności czynników ryzyka sercowo-naczyniowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zarówno ostre, jak i podostre niedokrwienie kończyn tylnych u myszy oraz zdefiniować anatomię naczyń krwionośnych, aby zapewnić prawidłowy wynik i powtarzalność zabiegu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metody chirurgicznego wywoływania niedokrwienia kończyny tylnej u myszy w celu badania angiogenezy oraz choroby tętnic obwodowych. Dzięki zastosowaniu konstriktorów ameroidowych badacze mogą uzyskać kontrolowane zamknięcie tętnicy, minimalizując martwicę tkanek u podatnych szczepów myszy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyniowa
- Modele zwierzęce
Wprowadzenie
- Choroba tętnic obwodowych stanowi istotny problem kliniczny.
- Modele mysie są niezbędne do badania chorób ludzkich.
- Kontrolowane wywoływanie niedokrwienia pozwala na uzyskanie lepszych wyników eksperymentalnych.
- Niektóre linie wchłonne mogą wykazywać działania niepożądane w wyniku niedokrwienia.
Cel badania
- W celu modelowania choroby tętnic obwodowych u ludzi na modelach mysich.
- W celu opracowania technik, które wiernie odzwierciedlają stan chorobowy u ludzi.
- W celu kontrolowania stopnia nasilenia oraz czasu wystąpienia niedokrwienia kończyny.
Zastosowane metody
- Umieszczenie szwów lub konstriktorów ameroidowych na tętnicy udowej.
- Indukcja ostrego lub podostrego niedokrwienia kończyny tylnej.
- Sedykacja przedzabiegowa i przygotowanie myszy.
- Użycie trymerek elektrycznych do usunięcia włosów z kończyn tylnych.
Główne wyniki
- Skuteczne indukowanie kontrolowanego niedokrwienia kończyny.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez technika laboratoryjnego.
- Głębsze zrozumienie angiogenezy w warunkach niedokrwiennych.
- Potencjał do dalszych badań nad chorobą tętnic obwodowych.
Wnioski
- Opisane metody stanowią wiarygodny model do badania niedokrwienia.
- Stopniowe zamykanie tętnicy zmniejsza martwicę tkanek u wrażliwych szczepów.
- Techniki te mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia chorób naczyniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodne mysie modele niedokrwienia kończyn dolnych są kluczowe dla badań translacyjnych nad chorobą tętnic obwodowych, umożliwiając kontrolowaną analizę przebudowy naczyniowej i regeneracji tkanek. Zdolność do indukowania niedokrwienia ostrego lub podostrego o precyzyjnie określonym stopniu nasilenia wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego oraz zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach poszukiwania nowych terapii. Modele te stanowią podstawę decyzji dotyczących portfela projektów, dostarczając powtarzalnych, relewantnych dla danej choroby systemów do walidacji celów terapeutycznych i oceny przedklinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia kontrolowane testowanie hipotez terapeutycznych w zakresie regeneracji naczyń i mięśni.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modulowanie stopnia nasilenia i czasu wystąpienia niedokrwienia.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki powtarzalnej indukcji urazu istotnego dla przebiegu choroby.
- Stanowi platformę do badań porównawczych w różnych liniach genetycznych i przy zastosowaniu różnych interwencji.
Przesiewy i opracowanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy in vivo do późniejszych testów skuteczności oraz analiz biomarkerów.
- Standaryzuje indukcję niedokrwienia w celu poprawy powtarzalności i ilościowych pomiarów perfuzji.
- Umożliwia rzetelne przesiewowe badanie związków kandydackich w zakresie regeneracji naczyń i tkanek.
- Wspiera skalowalność i porównywalność między badaniami dzięki spójności protokołu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uspójnia wyniki uzyskane u myszy z patofizjologią PAD u ludzi poprzez minimalizację nekrozy tkanki w modelach podostrych.
- Umożliwia prowadzenie badań podłużnych nad przebudową naczyniową i regeneracją mięśni w odniesieniu do punktów końcowych o znaczeniu klinicznym.
- Wspiera dostosowany do ryzyka rozwój kandydatów wykazujących skuteczność w modelach istotnych dla danej choroby.
- Ułatwia odkrywanie i walidację biomarkerów w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje proces od wczesnego etapu odkrywania po walidację przedkliniczną, wspierając testowanie hipotez, identyfikację wiodących związków oraz badania translacyjne w dziedzinie chorób naczyniowych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do weryfikacji hipotez dotyczących odpowiedzi naczyń i mięśni na niedokrwienie.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe odczyty perfuzji do oceny związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie perfuzji i wyników tkankowych w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z chorobami ludzkimi poprzez modelowanie klinicznie istotnych uszkodzeń niedokrwiennych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje ustandaryzowany, adaptowalny model dla różnorodnych programów badań nad naczyniami i regeneracją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i skalowalność badań nad niedokrwieniem in vivo.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie rzetelnej oceny przedklinicznej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów w obszarze naczyń i medycyny regeneracyjnej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie technik chirurgicznych u myszy oraz znajomości anatomii naczyniowej.
- Wymaga dostępu do obrazowania perfuzji metodą laserowego dopplerowskiego obrazowania przepływów oraz standaryzowanych protokołów znieczulenia.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zminimalizowania zmienności proceduralnej.
- Przy wyborze modelu należy uwzględnić tło genetyczne oraz odpowiedzi specyficzne dla danej linii myszy.
- Zależność od jakości i spójności konstriktorów ameroidowych w przypadku modeli podostrych.
