Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest modelowanie choroby tętnic obwodowych u ludzi poprzez nałożenie szwów lub implantację konstriktorów ameroidowych na tętnicę udową myszy w celu indukcji odpowiednio ostrego lub podostrego niedokrwienia kończyny dolnej. Choroba tętnic obwodowych stanowi istotny problem kliniczny, a opisane techniki z wykorzystaniem modeli zwierzęcych zostały opracowane, aby lepiej odzwierciedlać przebieg tej choroby u ludzi. Główną zaletą tych metod jest możliwość kontrolowania przez badacza stopnia nasilenia oraz czasu wystąpienia niedokrwienia kończyny.

Procedurę zademonstruje Mike Padgett, technik z mojego laboratorium. Na jeden do dwóch dni przed procedurą należy potwierdzić, że mysz jest w pełni znieczulona poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u nogi, a następnie nałożyć maść do oczu. Następnie należy użyć małego trymera elektrycznego, aby ogolić sierść z obu kończyn tylnych.

Po przycięciu wszystkich włosów należy nałożyć uprzednio podgrzany krem do depilacji. Po jednej minucie delikatnie zetrzeć krem zwilżonym gazikiem. Następnie umieścić mysz w pustej klatce rekonwalescencyjnej wyścielonej ręcznikiem papierowym, aż zwierzę będzie w stanie utrzymać pozycję sternalną.

W dniu operacji w pełni zsedowanego mysza umieść pod stereomikroskopem sekcyjnym Technic w pozycji grzbietowej i unieruchom obie kończyny za pomocą taśmy chirurgicznej. W przypadku użycia podgrzewania z kontrolą temperatury, podłącz sondę temperatury i przymocuj ją taśmą chirurgiczną do podstawy platformy operacyjnej. Następnie oczyść miejsce operacji, używając naprzemiennie trzech gazików z jodkiem powidonu i alkoholem, a zwierzę przykryj jałowym obłożeniem chirurgicznym z otworem w miejscu nacięcia.

Za pomocą skalpela wykonaj początkowe nacięcie wzdłuż środkowej części przyśrodkowej strony uda, od kolana w kierunku brzucha. Następnie za pomocą cienkich nożyczek wydłuż nacięcie do około jednego centymetra. Używając pincety, rozszerz nacięcie, aby odsłonić błonę pokrywającą tkankę tłuszczową pachwinową.

Następnie użyj zamkniętej pęsety, aby przebić błonę i dostać się do przestrzeni między tkanką tłuszczową a brzuchem. Delikatnie zmniejsz nacisk pęsety, aby oddzielić tkankę tłuszczową od mięśni brzucha, odsłaniając pęczek naczyniowo-nerwowy. Kluczowe jest, aby przed preparowaniem pęczka naczyniowo-nerwowego prawidłowo zidentyfikować główne naczynia krwionośne oraz ich odgałęzienia.

Zróżnicowanie położenia konstriktorów lub miejsc podwiązania może znacząco wpłynąć na stopień niedokrwienia i doprowadzić do znacznej zmienności wyników. Wprowadź retraktor do nacięcia i odciągnij tkankę brzuszną w stronę głowy zwierzęcia, aby odsłonić proksymalne miejsce położenia konstriktora ameroidowego, znajdujące się tuż proksymalnie od bocznej tętnicy obwodowej uda. Następnie wprowadź jeden retraktor przyśrodkowy i jeden boczny do dystalnej części nacięcia w celu poszerzenia pola operacyjnego, odciągając tkankę tłuszczową pachwiny w stronę stopy i z dala od miejsca operacji.

Proksymalne i powierzchowne gałęzie ogonowe tętnicy udowej powinny być łatwo widoczne. Boczna tętnica krążąca uda znajduje się około pięciu milimetrów proksymalnie od gałęzi ogonowych i może być przesłonięta przez błonę. Teraz delikatnie wsuń końcówkę jednej pęsety pod błonę wiążącą naczynia, aby wprowadzić 1/2 końcówki pomiędzy żyłę a tętnicę.

Następnie zaciśnij pęsetę i delikatnie oderwij błonę. Po usunięciu całej błony wsuń końcówkę zamkniętej pęsety pomiędzy żyłę a tętnicę, a następnie zwolnij nacisk na pęsetę, aby stworzyć przerwę między naczyniami. W przypadku podostrej niedokrwienności kończyny wsuń końcówkę pęsety pod tętnicę udową, aby odizolować naczynie od pęczka naczyniowo-nerwowego.

Użyj drugiej pary pęsety kątowej, aby chwycić krawędź zacisku i poprowadzić go pod tętnicę udową. Następnie ułóż tętnicę w szczelinie zacisku. Potem umieść dystalny zacisk na tętnicy udowej bezpośrednio proksymalnie od miejsca, w którym tętnica rozwidla się na tętnicę podkolanową i żyłę odpływową, a następnie wprowadź tętnicę udową do szczeliny zacisku.

W przypadku ostrego niedokrwienia kończyny należy przeprowadzić szew 7-0 pod tętnicą w tym samym miejscu, co proksymalny zacisk, a następnie podwiązać tętnicę. Następnie należy zawiązać drugą ligaturę około jednego milimetra dystalnie od pierwszej i za pomocą nożyczek sprężynowych przeciąć tętnicę pomiędzy obiema ligaturami. W przypadku dystalnego przecięcia tętnicy należy umieścić ligatury w odległości około jednego milimetra od siebie, tuż proksymalnie od miejsca, w którym tętnica udowa rozgałęzia się na tętnicę podkolanową i tętnicę odpiszczową.

Następnie zamknij nacięcie za pomocą przerywanych szwów z nici Vicryl 5-0 i przenieś mysz na podkładkę grzewczą o temperaturze 37 °C pod laserowym obrazownikiem perfuzji dopplerowskiej. Włącz teraz obrazownik i uruchom oprogramowanie do przechwytywania obrazów. Kliknij ikonę New Single Image, aby otworzyć okno konfiguracji skanera, ustaw rozmiar skanowania na large (duży) oraz prędkość skanowania na 4 ms per pixel.

Zmień wartości X i Y w panelu jednostek obszaru skanowania (Scan Area) na odpowiednie wartości, następnie kliknij zakładkę Wideo i Odległość (Video and Distance) i ustaw obie kończyny tylne w obrębie obszaru skanowania. Kliknij Automatyczna Odległość (Auto Distance), a następnie kliknij Dalej (Next), aby otworzyć okno Szczegóły Obiektu (Subject Details), i wprowadź informacje o badanym obiekcie. Kliknij Dalej (Next), aby przejść do okna skanowania.

Następnie kliknij przycisk Start Measurement, aby otworzyć okno dialogowe Confirm or Override Scan Distance, i kliknij OK, aby rozpocząć proces skanowania. Po zakończeniu skanowania przesuń mysz na pustą klatkę regeneracyjną z monitorowaniem, aż zwierzę w pełni powróci do stanu równowagi. Oprócz zmienności immanentnej dla badań na zwierzętach, inne czynniki mogą wprowadzać zmienność w obrazowaniu laserowej przepływności dopplerowskiej, w tym temperatura ciała oraz pozycja zwierzęcia.

Model podostrej niedokrwienności kończyny tylnej zależy od jakości konstriktorów ameroidowych, która może się znacznie różnić w obrębie danej partii. Obrazowanie perfuzji metodą laserowego dopplera powinno być wykonane bezpośrednio po zabiegu, gdy zwierzę nadal znajduje się pod wpływem znieczulenia, aby wykazać efekty operacji oraz ustalić pooperacyjny poziom perfuzji wyjściowej. Po wywołaniu ostrego niedokrwienia kończyny powinno zaobserwować się całkowity brak perfuzji w kończynie tylnej, podczas gdy w modelu podostrym po umieszczeniu konstriktora ameroidowego zazwyczaj obserwuje się jedynie niewielki spadek perfuzji.

Procedury te umożliwiają badanie wpływu różnego stopnia niedokrwienia na przebudowę naczyniową i regenerację mięśni szkieletowych u myszy jako modelu choroby tętnic obwodowych u ludzi. Po opanowaniu techniki, prawidłowo wykonane procedury można zrealizować w około 15 minut. Podczas przeprowadzania tych operacji ważne jest, aby stale monitorować temperaturę ciała oraz stopień znieczulenia zwierzęcia.

Poprzez dostosowanie rozmieszczenia ligatur lub konstriktorów można modyfikować stopień nasilenia niedokrwienia, co może być istotną zmienną w zależności od tła genetycznego zwierzęcia lub obecności czynników ryzyka sercowo-naczyniowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać biegłą wiedzę na temat indukcji ostrego i podostrego niedokrwienia kończyny dolnej u myszy oraz definiowania anatomii naczyniowej w celu zapewnienia prawidłowego wyniku i powtarzalności procedury.