Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

Ogólnym celem tej chirurgicznej procedury przeszczepiania komórek macierzystych jest stworzenie nowego chimerycznego modelu mysiego z funkcją wątroby ludzkiej z wykorzystaniem niedojrzałych ludzkich komórek progenitorowych macierzystych wątroby, które umożliwiają proliferację, dojrzewanie i różnicowanie komórek w celu nabycia zdolności do metabolizmu leków. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do stworzenia mikrośrodowiska wspierającego progenezę ludzkich komórek macierzystych wątroby dawcy w celu ich namnożenia, różnicowania i odbudowy uszkodzonej wątroby myszy biorcy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania dojrzałych, proliferujących komórek oraz fakt, że wątroba ulega niemal całkowitej repopulacji.

Na początek należy przygotować roztwór zapasowy toksyny błoniczej (DT) o stężeniu 1 mg/ml, dodając 1 ml fenolowanego 0,85% roztworu chlorku sodu do 1 mg DT. Wykonaj iniekcję doszpryetonalną DT: unieruchom mysz Albtrek SCID w pozycji grzbietowej i wprowadź igłę pod kątem 45 stopni do ciała, poniżej zgięcia kolan, po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Używając strzykawki insulinowej, wstrzyknij 100 µl świeżo przygotowanego roztworu DT o stężeniu 0,3 µg/ml na każde 20 g masy ciała myszy. Po 48 godzinach od iniekcji DT umieść mysz w stabilizatorze i ogrzewaj ogon w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez około 10 minut, aby rozszerzyć naczynia krwionośne.

Następnie dwa centymetry od końca ogona należy wykonać ostrym ostrzem skalpela nacięcie o długości jednego milimetra i za pomocą rurki kapilarnej pobrać krew. Probówkę mikrokapilarną zawierającą krew wiruje się przy 1500 ×g przez pięć minut, a następnie pobiera surowicę poprzez oddzielenie supernatantu od osadu komórkowego. 50 µL rozcieńczenia surowicy 1:20 należy nanieść pipetą na slajdy GOT ASTP3.

Następnie, korzystając z wielofunkcyjnego automatycznego analizatora chemii suchej zgodnie z protokołem producenta, zmierz absorbancję produktu reakcji przy 650 nanometrach. Za pomocą sortera komórek wyizoluj ludzkie komórki macierzyste wątroby z ludzkich pierwotnych komórek płodowej wątroby z antygenami komórkowymi CDCP1, CD90 i CD66, aby uzyskać subpopulację CDCP1 dodatnią, CD90 dodatnią i CD66 ujemną. Wysiej komórki na naczynia hodowlane pokryte kolagenem typu IV i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Gdy komórki osiągną 80 do 90% konfluencji, należy przemyć je raz za pomocą PBS. Następnie należy dodać 0,05% Trypsyny EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej. Gdy pod mikroskopem będzie widać, że komórki zaczynają pływać lub swobodnie się przemieszczać, należy zatrzymać trawienie enzymatyczne, dodając osiem mililitrów DMF12 zawierającego 10% FBS.

Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml powoli zresuspenduj komórki, a następnie przenieś je do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml. Wirowarkuj komórki z przyspieszeniem 100 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Używając 10 ml medium DMF12 z 10% FBS, ostrożnie zresuspenduj osad komórkowy i określ liczbę komórek za pomocą licznika komórek.

Podziel komórki na aliquoty zawierające 1×10⁶ komórek w 50 µL PBS dla każdej myszy i przechowuj na lodzie do momentu transplantacji. Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym sprawdź obecność odruchu, lekko ściskając opuszkę tylnej łapy. Następnie nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu.

Za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia ogolić miejsce operacyjne, a następnie odkazić je, nakładając 70% ethanol oraz povidone-iodine. Wykonać nacięcie skóry o długości jednego centymetra w lewym boku, tuż poniżej brzegu żebrowego. Następnie wykonać nacięcie na lewej ścianie brzucha, a po nim nacięcie otrzewnej.

Następnie ostrożnie odsłoń śledzionę. Po czym, pod kątem pięciu stopni, wprowadź strzykawkę do mikroiniekcji o pojemności 100 µL z igłą 32G o długości 1/2 cala na głębokość równą połowie grubości śledziony i wykonaj bezpośrednią iniekcję 1 × 10⁶ ludzkich komórek macierzystych wątroby w 50 µL PBS, przechodząc od jednego końca narządu do drugiego, a następnie wyjmij igłę. Aby zapobiec wyciekowi komórek po iniekcji, delikatnie uciskaj miejsce wkłucia palcem przez dwie minuty.

Umieść śledzionę z powrotem w jamie brzusznej myszy, a następnie użyj zwykłego szwu ciągłego do zszycia mięśni oraz skóry w celu zamknięcia otworu. Natychmiast przenieś mysz, kładąc ją na boku, do wcześniej ogrzanej do 37 °C klatki. Unikaj kontaktu ściółki w klatce z miejscem operacji i monitoruj zwierzę zgodnie z protokołem tekstowym.

W czwartym do szóstego tygodnia po transplantacji, po eutanazji myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć nożyczek chirurgicznych, aby otworzyć jamę brzuszną, przecinając jednocześnie skórę i powięź. Używając nożyczek jako rozwieracza, należy rozciąć tkankę łączną nad otrzewną wzdłuż białej linii (linea alba), aby otworzyć jamę otrzewną. Za pomocą pęsety należy unieść mostek.

Następnie przekłuj przeponę i przetnij obie strony mostka aż do obręczy barkowej. Przetnij żyłę główną po klatkowej stronie wątroby i wyciągnij przełyk przez wątrobę w kierunku przednim. Usuń przeponę, a następnie, używając jej jako uchwytu, zacznij wyciągać wątrobę z jamy brzusznej.

Hollow vena cava (żyła główna dolna) będzie utrzymywać wątrobę na miejscu. Należy zatem przeciąć żyłę główną dolną, dbając o to, aby nie uwolnić przedwcześnie prawej nadnerki. Oddziel od siebie płaty wątroby w miejscach ich połączeń i zamieść je w OCT zgodnie z protokołem producenta.

Zamrozić OCT zawierający tkankę wątroby w metalowych kasetach w kriostacie. Za pomocą kriostatu wykonać przekroje próbek o grubości 5 µm w temperaturze -18 °C i przymocować je do szkiełek mikroskopowych w temperaturze pokojowej. Przechowywać zapas w temperaturze -80 °C.

Na koniec przygotować preparaty do barwienia H&E zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami oraz wykonać test ELISA zgodnie z protokołem tekstowym. Jak pokazano na tych sekcjach barwionych H&E, myszy traktowane DT wykazywały zdezorganizowaną architekturę wątroby oraz cechy przekrwienia z podwyższoną aktywnością AST w surowicy. Sześć tygodni po transplantacji komórki pochodzące z ludzkich macierzystych komórek wątroby zrekonstruowały strukturę wątroby, zastępując rezydentne hepatocyty mysie.

Makroskopowo, w czwartym dniu po transplantacji, stwierdzono obecność małych ludzkich skupisk wątrobowych, które były równomiernie rozmieszczone w całej wątrobie. W 45. dniu skupiska te przerodziły się w duże konglomeraty. Jak tutaj widać, obecność ludzkich hepatocytów w wątrobach myszy została po raz pierwszy potwierdzona w sześciu tygodniach po transplantacji poprzez barwienie przeciwciałami przeciwko ludzkim jądrom komórkowym oraz cytocheratynie 8/18.

Hepatocyty wykazujące pozytywną reakcję na ludzkie ALB i negatywną na CK19 przypominały funkcjonalne hepatocyty, natomiast komórki, które uległy pozytywnemu podwójnemu barwieniu na ludzkie ALB i CK19, wykazywały bipotencjalną zdolność do różnicowania się w hepatocyty i cholangiocyty. Wykryto obecność wielu okrągłych skupisk otaczających płaty wątroby z wyraźnymi ludzkimi jądrami i ekspresją CK8/18, co wykazało zdolność ludzkich komórek macierzystych wątroby do tworzenia kolonii w humanizowanych wątrobach. Ostatecznie poziom repopulacji osiągnął do 90% miesiąc po transplantacji, a w repopulowanych wątrobach myszy wykryto wydzielanie ludzkiej albuminy.

Po opanowaniu techniki, chirurgiczny przeszczep komórek może zostać wykonany w ciągu 10 minut, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tego zabiegu należy pamiętać, że uszkodzenia wątroby powinny ograniczać się do wątroby donora. W przypadku wycieku komórek należy zrezygnować z przeszczepu.

W połączeniu z tą procedurą można zastosować inne metody, takie jak transfekcja genów w celu bezpośredniego przeprogramowania in vitro komórek ludzkich, aby zbadać konwergencję komórek ludzkich z naszym obecnym modelem. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny hepatologii do badania metabolizmu leków u ludzi, interakcji lekowych, toksyczności wątrobowej oraz wirusa zapalenia wątroby w humanizowanym modelu wątroby. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak izolować i namnażać macierzyste komórki wątroby, indukować uszkodzenie wątroby oraz transplantować komórki drogą śledzionową w celu stworzenia chimerycznego modelu mysiego z ludzką funkcją wątroby.

Należy pamiętać, że toksyna błonica może być kontrolowana i jest istotna, a podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak unikanie martwicy serca i wątroby.