Name: Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj metodę generowania humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu leków i funkcji wątroby człowieka w modelu chimerycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Mammalian Genetics Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, za dostarczenie myszy. Dziękujemy również S. Aoyamie i Y. Adachi z Instytutu Badań nad Wchłanianiem, Dystrybucją, Metabolizmem, Wydalaniem i Toksykologią, Sekisui Medical Company Ltd., Japonia, a także K. Kozakai i Y. Yamada za pomoc w analizie LC-MS/MS. Prace te były częściowo wspierane przez dotacje z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) w Japonii dla Y-W.Z. (18591421, 20591531 i 23591872); w ramach innowacyjnego i przedsiębiorczego projektu Jiangsu mającego na celu wprowadzenie talentów wysokiego szczebla oraz projektu planowania nauki i technologii Jiangsu (BE2015669); oraz poprzez dotacje dla H.T. na rzecz Strategicznej Promocji Innowacyjnych Badań i Rozwoju (S-innovation, 62890004) z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii.

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi Ochrony Zwierząt Uniwersytetu Miejskiego w Yokohamie.
1. Generowanie mysiego modelu ostrego uszkodzenia wątroby
<ol>
	<li>Dodać 1 ml fenolizowanego 0,85% roztworu NaCl (0,6 g fenolu w 100 ml 0,85% roztworu NaCl) do 1 mg toksyny błoniczej (DT), aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml DT. Uwaga: DT w stężeniu 1 mg/ml może być przechowywany przez około 2 lata w temperaturze od 3 °C do 8 °C.</li>
	<li>Roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml DT należy rozcieńczyć do 0,3 μg/ml DT w fenolowanym 0,85% roztworze NaCl i przygotować podwielokrotność roztworu DT o stężeniu 0,3 μg/ml jako roztwór roboczy. Uwaga: Ten roztwór roboczy powinien być świeżo przygotowany.</li>
	<li>Aby przeprowadzić eksperymenty z użyciem dawki subletalnej (~ 50% śmiertelności), podaj 8-tygodniowym myszom dawkę 1,5 μg/kg DT.
	<ol>
		<li>Wykonaj dootrzewnowe wstrzyknięcie DT, trzymając mysz w pozycji grzbietowej i wbij igłę poniżej zgięcia kolan, po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Omijaj linię środkową, aby zapobiec penetracji pęcherza. Ustawić igłę pod kątem około 45° w stosunku do ciała.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknij myszom 100 μl świeżo przygotowanego 0,3 μg/ml DT na 20 g masy myszy. Na przykład mysz o wadze 18 g powinna otrzymać 90 μl roztworu DT o stężeniu 0,3 μg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 48 godzinach od wstrzyknięcia DT należy pobrać krew z żyły ogonowej, umieszczając mysz w unieruchomieniu i ogrzewając ogon myszy w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez około 10 minut, aby rozszerzyć naczynia krwionośne. Następnie wykonaj 1-milimetrowe nacięcie w ogonie w odległości 2 cm od czubka ostrym ostrzem skalpela i zbierz krew za pomocą rurki mikrokapilarnej.
	<ol>
		<li>Odwirować probówkę mikrokapilarną zawierającą krew o stężeniu 1 500 x g przez 5 minut i zebrać surowicę, oddzielając supernatant i osad komórkowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odpipetować 50 μl rozcieńczonej mysiej surowicy w stosunku 1:20 na szkiełka podstawowe GOT/AST-PIII. Zmierzyć absorbancję produktu reakcji (niebieskiego barwnika) przy długości fali 650 nm za pomocą wielofunkcyjnego automatycznego analizatora chemii suchej zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Odczyt aktywności aminotransferazy asparaginianowej (AspAT)/aminotransferazy szczawiooctowej glutaminowej (GOT) jest wyświetlany automatycznie. 2 dni po wstrzyknięciu DT około 60% myszy wykazywało wartości AspAT między 12 000 - 16 000 IU / L i uważano, że cierpią na ostre uszkodzenie wątroby. Myszy te przeniesiono do nowej klatki i wykorzystano jako biorców przeszczepu komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkich komórek macierzystych wątroby
<ol>
	<li>Wyizoluj ludzkie wątrobowe komórki macierzyste od ludzkich pierwotnych komórek wątroby płodu za pomocą sortera komórek przy użyciu antygenów komórkowych CDCP1, CD90 i CD66, aby uzyskać subpopulację CDCP1 + CD90 + CD66-, a następnie wysiewaj izolowaną populację komórek na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem IV, jak wcześniej zgłoszono15. Należy użyć ludzkich pierwotnych komórek wątroby płodu w wieku embrionalnym między 14. a 18. tygodniem.</li>
	<li>Zebrać ludzkie wątrobowe komórki macierzyste wyhodowane do 80% - 90% zbiegu na 100-milimetrowych szalkach hodowlanych, odessać pożywkę, umyć komórki 10 ml PBS, a następnie usunąć PBS. Trypsynizować komórki 2 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Uwaga: Komórki o konfluencji większej niż 90% nie nadają się do przeszczepu komórek, ponieważ różnicowanie komórek może wpływać na ich zdolność proliferacyjną u myszy.</li>
	<li>Monitoruj stan dyspersji komórek pod mikroskopem. Gdy komórki wydają się unosić lub swobodnie płynąć, zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 8 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS.</li>
	<li>Zawiesić komórki powoli za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirowywać komórki przez 5 minut w temperaturze 100 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DMEM/F12 zawierającym 10% FBS i określić liczbę komórek za pomocą mikroskopowej komory zliczającej.</li>
	<li>Podzielić komórki na 1,0 x 106 komórek na 50 μl podwielokrotności PBS dla każdej myszy z osobna i przechowywać na lodzie do czasu przeszczepu.</li>
</ol>
3. Wewnątrzśledzionowe przeszczepienie ludzkich komórek macierzystych wątroby
<ol>
	<li>Umieść czystą klatkę na elektrycznej poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Znieczulij mysz za pomocą inhalacji izofluranu (1 - 1,5% (vol/vol) w 2 l tlenu na minutę), umieszczając ją pod dyszą. Alternatywnie użyj probówek zawierających gazę nasączoną izofluranem.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że mysz jest znieczulona, lekko ściskając tylną podkładkę. Jeśli zostanie wywołany odruch, umieść mysz z powrotem w komorze. Używaj maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ogolić miejsce operowane za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia i zastosować 70% (obj./obj.) etanolu i jodu powidonu w celu sterylizacji. Następnie wykonaj 1-centymetrowe nacięcie skóry w lewym boku tuż poniżej żebrowej granicy żeber, a następnie nacięcie na ścianie brzucha, a także otrzewnej.</li>
	<li>Ostrożnie odsłoń śledzionę. Użyj strzykawki do mikroiniekcji o pojemności 100 μl z igłą 32 G 1/2 cala, aby bezpośrednio wstrzyknąć 1,0 x 106 ludzkich komórek macierzystych wątroby w 50 μl PBS do śledziony każdej myszy. Przechylić igłę pod kątem 5° w celu wstrzyknięcia.
	<ol>
		<li>Upewnij się, że głębokość wstrzyknięcia jest mniejsza niż połowa grubości śledziony. Igła powinna wejść do śledziony z jednej strony (głowa) i umieścić komórki na drugim końcu (ogonie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zapobiec wyciekaniu komórek po wstrzyknięciu, należy delikatnie uciskać palcem przez 2 minuty, a następnie wyjąć igłę.</li>
	<li>Umieść śledzionę z powrotem w ciele myszy i zamknij jamę normalnym szwem biegnącym dla mięśni i skóry.</li>
	<li>Natychmiast po przesadzeniu należy przenieść myszy do wstępnie ogrzanej klatki o temperaturze 37 °C. Aby upewnić się, że mysz może swobodnie oddychać, umieść ją na boku w klatce, unikając kontaktu między ściółką klatki a miejscem operacji.</li>
	<li>Monitoruj myszy, aż znieczulenie ustąpi, aby upewnić się, że szwy pozostaną zamknięte, a myszy powrócą do stanu sprzed operacji.</li>
	<li>Upewnij się, że myszy mają zapewnioną normalną wodę pitną i jedzenie. Po 1 godzinie zwróć klatkę do pokoju myszy w centrum dla zwierząt i codziennie monitoruj myszy.</li>
</ol>
4. Wykrywanie przeszczepionych ludzkich hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych wątroby w wątrobie myszy
Uwaga: W przypadku następujących procedur, należy poddać eutanazji wszystkie zwierzęta za pomocą przedawkowania ketaminy i ksylazyny, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.
<ol>
	<li>Po 4-6 tygodniach od przeszczepu należy poddać myszy eutanazji i otworzyć jamę brzuszną, jednocześnie przecinając skórę i powięź za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Wypreparuj tkankę łączną powyżej otrzewnej, używając nożyczek jako rozsiewacza, i przetnij otrzewną wzdłuż kresy białej, aby otworzyć jamę otrzewnej.</li>
	<li>Podnieś mostek kleszczami, przebij przeponę i przetnij z każdej strony mostka w górę przez obręcz szyjną.</li>
	<li>Przeciąć żyłę główną po piersiowej stronie wątroby i przeciągnąć przełyk przez wątrobę w kierunku przednim. Zdjąć membranę w celu usunięcia wątroby. 
	Uwaga: Uważaj, aby końcówki nożyczek były skierowane do góry, aby zapobiec uszkodzeniu narządów klatki piersiowej pod spodem. Grasica ma tendencję do okazjonalnego przylegania do grzbietowej strony mostka i należy tego ostrożnie unikać.</li>
	<li>Używając membrany jako uchwytu, zacznij wyciągać wątrobę z jamy brzusznej. Żyła główna wewnętrzna będzie utrzymywać wątrobę na miejscu. Przeciąć wewnętrzną żyłę główną; Uważaj, aby nie uwolnić przedwcześnie prawego nadnercza. 
	Uwaga: Myszy mają czteropłatową wątrobę składającą się z płata środkowego, lewego płata, prawego płata i płata ogoniastego. Pęcherzyk żółciowy jest zawieszony w małym rozwidleniu płata środkowego.</li>
	<li>Oddziel krzywki od siebie na skrzyżowaniach i zanurz je w związku o optymalnej temperaturze skrawania (OCT) zgodnie z protokołem producenta. Zamrozić OCT zawierający tkankę wątroby w metalowych siatkach kriostatu.</li>
	<li>Wyciąć skrawki próbki o grubości 5 μm za pomocą kriostatu w temperaturze -18 °C i zamontować je na szkiełkach mikroskopowych RT. Przechowywać wywar w temperaturze -80 °C. Przygotować szkiełka do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunofluorescencji zgodnie z wcześniej opisanymi procedurami16.</li>
</ol>
5. Wykrywanie wydzielania albuminy ludzkiej i obliczanie szybkości chimerycznej
<ol>
	<li>Aby zmierzyć rekonstytucję ludzkiej wątroby, należy wykonać test ELISA albuminy ludzkiej przy użyciu surowicy i zestawu ELISA z albuminą ludzką zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Oblicz wskaźnik chimerycznej humanizowanej wątroby za pomocą analizy PCR w czasie rzeczywistym poziomów ekspresji w całej humanizowanej wątrobie. Określ względny stosunek poziomu ekspresji aktyny specyficznej dla człowieka do aktyny krzyżowej człowiek-mysz (stosunek 1) oraz stosunek aktyny specyficznej dla myszy do aktyny krzyżowej człowiek-mysz (stosunek 2). Szybkość chimeryczną oblicza się jako stosunek 1/(stosunek 1 + stosunek 2).</li>
</ol>

<ol><li>Muruganandan, S., Sinal, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+as+clinically+relevant+models+for+the+study+of+cytochrome+P450-dependent+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).</li>
<li>Nishimura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+chimeric+mice+with+humanized+livers+to+predict+human+drug+metabolism+and+a+drug-drug+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).</li>
<li>Suemizu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+humanized+model+of+liver+using+NOD%2FShi-scid+IL2Rgnull+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).</li>
<li>Tateno, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+completely+humanized+liver+in+mice+shows+human-type+metabolic+responses+to+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs.</a> Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).</li>
<li>Hasegawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reconstituted+%27humanized+liver%27in+TK-NOG+mice+is+mature+and+functional%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).</li>
<li>Azuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+expansion+of+human+hepatocytes+in+Fah%E2%88%92%2F%E2%88%92%2FRag2%E2%88%92%2F%E2%88%92%2FIl2rg%E2%88%92%2F%E2%88%92+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice.</a> Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).</li>
<li>Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replacement+of+diseased+mouse+liver+by+hepatic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation.</a> Science. 263, 1149-1152 (1994).</li>
<li>Haridass, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+efficiencies+of+adult+hepatocytes%2C+fetal+liver+progenitor+cells%2C+and+embryonic+stem+cell-derived+hepatic+cells+in+albumin-promoter-enhancer+urokinase-type+plasminogen+activator+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice.</a> Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).</li>
<li>Sharma, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+embryonic+stem+cell-derived+hepatic+progenitor+cells+engraft+in+recipient+livers+with+limited+capacity+of+liver+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation.</a> Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).</li>
<li>Peltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+%27humanized%27+mice+improve+drug+development+in+the+21st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century.</a> Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+repopulation+with+hepatocytes+generated+from+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts.</a> Nature. 508, 93-97 (2014).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin+receptor-mediated+conditional+and+targeted+cell+ablation+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice.</a> Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).</li>
<li>Ishii, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+embryonic+stem+cell-derived+endodermal+cells+into+mice+with+induced+lethal+liver+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage.</a> Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).</li>
<li>Machimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+the+survival+rate+by+fetal+liver+cell+transplantation+in+a+mice+lethal+liver+failure+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model.</a> Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).</li>
<li>Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).</li>
<li>Zhang, R. -R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cells+transplanted+into+a+fulminant+hepatic+failure+Alb-TRECK%2FSCID+mouse+model+exhibit+liver+reconstitution+and+drug+metabolism+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities.</a> Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).</li>
<li>Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrom%2C+SC+%22Hepatocytes%22">Hepatocytes</a>. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).</li>
<li>Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+experimental+models+of+drug+metabolism+and+disposition+in+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm.+Sin.+B%22%5BJournal%5D)">Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development.</a> Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).</li>
<li>Nowak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+expandable+human+hepatic+progenitors+which+differentiate+into+mature+hepatic+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo.</a> Gut. 54, 972-979 (2005).</li>
<li>Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+a+diphtheria+toxin+receptor%3A+identity+with+a+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor.</a> Cell. 69, 1051-1061 (1992).</li>
<li>Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diphtheria+toxin+binds+to+the+epidermal+growth+factor+%28EGF%29-like+domain+of+human+heparin-binding+EGF-like+growth+factor%2Fdiphtheria+toxin+receptor+and+inhibits+specifically+its+mitogenic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity.</a> J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).</li>
<li>Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+organs+from+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regener%22%5BJournal%5D)">Generation of functional organs from stem cells.</a> Cell Regener. 2, 1(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Ostatnie badania wykazały, że wątroba myszy może być ponownie zasiedlona ludzkimi hepatocytami, w tym dorosłymi hepatocytami i proliferacyjnymi wątrobowymi komórkami macierzystymi17. Te ponownie zasiedlone wątroby zostały wykorzystane jako przedkliniczne modele eksperymentalne do testowania metabolizmu leków oraz odkrywania i opracowywania leków18; Ponadto stworzyli środowisko in vivo do dojrzewania i różnicowania komórek19. Głównym celem niniejszego badania było wygenerowanie no...

Myszy są powszechnie używane do testów farmaceutycznych, ponieważ badania biomedyczne na ludziach są ograniczone1; jednak te modele nie zawsze są użyteczne, ponieważ mogą niedokładnie symulować efekty obserwowane u ludzi. Większość leków w obecnym zastosowaniu medycznym są metabolizowane głównie w wątrobie. Jednak ten sam lek może być metabolizowany do różnych metabolitów w wątrobie myszy i człowieka ze względu na różnice międzygatunkowe. W związku z tym często trudno jest określić, czy potencjalny lek stanowi jakiekolwiek ryzyko dla zastosowań klinicznych2,3. 
Aby rozwiązać ten problem, "humanizowane" wątroby myszy zostały opracowane poprzez hodowanie ludzkich komórek wątroby wewnątrz myszy4-6; modele te wykazują reakcje na leki podobne do tych obserwowanych w ludzkiej wątrobie. Podstawowe modele mysie używane obecnie do humanizowanego generowania wątroby obejmują myszy z aktywatorem uroplazminogenu (uPA+/+)4,7, myszy z hydrolazą hydrolazy fumaryloacetooctanu (Fah−/−) myszy6 i niedawno zgłoszone myszy z kinazą tymidynową (TK-NOG). 
Jednakże, poprzednie raporty wykazały, że przeszczepione ludzkie niedojrzałe komórki lub komórki macierzyste są mniej konkurencyjne niż dorosłe ludzkie hepatocyty w wątrobach myszy Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. Co więcej, myszy Fah−/− zapewniają przewagę wzrostu tylko dla zróżnicowanych hepatocytów, a nie dla niedojrzałych komórek progenitorowych wątroby11. Przeszczepienie ludzkich wątrobowych komórek macierzystych (HpSC) myszom TK-NOG w laboratorium zakończyło się niepowodzeniem. W związku z tym nie istnieje obecnie żaden użyteczny model mysi do skutecznego wszczepiania ludzkich niedojrzałych komórek wątroby. 
Tak więc, opracowaliśmy nowy model myszy Alb-TRECK/SCID, który mógł być skutecznie ponownie zasiedlany ludzkimi niedojrzałymi hepatocytami. Ten transgeniczny model myszy wykazuje ekspresję receptorów ludzkiego czynnika wzrostu podobnego do EGF (HB-EGF) wiążących heparynę pod kontrolą promotora albuminy specyficznego dla komórek wątroby. Po podaniu toksyny błoniczej (DT) u myszy tych rozwija się piorunujące zapalenie wątroby z powodu warunkowej ablacji hepatocytów, umożliwiając rezydencję i proliferację komórek dawcy12. Chociaż hepatocyty myszy zostały z powodzeniem przeszczepione myszom Alb-TRECK/SCID w poprzednich badaniach13,14, generacja humanizowanej wątroby przy użyciu myszy Alb-TRECK/SCID nie została jeszcze zgłoszona. 
W tym badaniu, humanizowane wątroby zostały wygenerowane u myszy Alb-TRECK/SCID poprzez przeszczepienie HpSCs. Ta humanizowana wątroba zapewnia środowisko in vivo dla uniwersalnego różnicowania komórek macierzystych i zdolność do przewidywania wzorców metabolizmu leków u ludzi i interakcji między lekami.

<table><tbody><tr><td>Albumina ludzka</td><td>Sigma</td><td>A6684</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Ludzka CK19</td><td>Mysz Dako</td><td>M088801</td><td></td></tr><tr><td>Jądra ludzkie</td><td>Milipore</td><td>MAB1281</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Ludzki CK8/18</td><td>Progen</td><td>GP11</td><td>Świnka morska</td></tr><tr><td>CDCP1</td><td>Biolegend</td><td>324006</td><td>Mysz</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CD90 BD 559869Mysz 551479 CD66</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GOT/AST-PIII</td><td>Fujifilm</td><td>14A2X10004000009</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1520</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna błonicy</td><td>Sigma</td><td>D0564-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA albuminy ludzkiej</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E88-129</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml)</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>32G Igła 1/2"</td><td>TSK</td><td>PRE-32013</td><td></td></tr><tr><td>Związek OCT (118 ml)</td><td>Sakura Finetek Japonia</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Szybki sortownik komórkowy MoFlo</td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>DRI-CHEM 7000</td><td>Fujifilm</td><td>14B2X10002000046</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Nowatorski model zwierzęcy z udziałem chimerycznych myszy z humanizowaną wątrobą, stworzony poprzez przeszczep ludzkich hepatocytów, został opracowany. Te myszy, u których wątroba została ponownie zasiedlona funkcjonalnymi ludzkimi hepatocytami, mogą służyć jako użyteczne narzędzie do badania biologii ludzkich komórek wątroby, metabolizmu leków i innych zastosowań przedklinicznych. Jednym z kluczowych czynników niezbędnych do pomyślnego przeszczepienia ludzkich hepatocytów myszom jest eliminacja endogennych hepatocytów, aby zapobiec konkurencji z komórkami ludzkimi i zapewnić odpowiednią przestrzeń i mikrośrodowisko do promowania ekspansji i różnicowania ludzkich komórek dawcy. Do tej pory ustalono dwa główne modele myszy z uszkodzeniem wątroby wykorzystujące hydrolazę fumaryloacetooctanu (Fah) i aktywator uroplazminogenu (uPA). Jednak myszy Fah są używane głównie z dojrzałymi hepatocytami, a zastosowanie modelu uPA jest ograniczone przez zmniejszoną hodowlę. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, myszy z nokautem komórkowym za pośrednictwem receptora toksyny albowej (TRECK)/SCID zastosowano do różnicowania in vivo niedojrzałych ludzkich hepatocytów i humanizowanego wytwarzania wątroby. Ludzkie wątrobowe komórki macierzyste (HpSC) z powodzeniem ponownie zasiedliły wątroby myszy Alb-TRECK/SCID, u których rozwinęła się śmiertelna, piorunująca niewydolność wątroby po leczeniu toksyną błoniczą (DT). Ten model humanizowanej wątroby u myszy Alb-TRECK/SCID będzie miał funkcjonalne zastosowania w badaniach obejmujących metabolizm leków i interakcje lek-lek oraz będzie promował inne badania in vivo i in vitro.

Hepatocyty myszy Alb-TRECK/SCID wykazują ekspresję ludzkiego genu receptora DT HB-EGF pod kontrolą promotora albuminy i wykazują efekty cytotoksyczne po podaniu DT12. Aby ocenić wpływ leczenia DT na uszkodzenie wątroby, dawkę DT 1.5 μg/kg wstrzykiwano 8-tygodniowym myszom Alb-TRECK/SCID, a zmiany patologiczne w wątrobie 48 hr po podaniu DT oceniono histologicznie. W porównaniu z myszami kontrolnymi (nieleczonymi DT), myszy leczone DT wykazywały zdezorganizowaną architekturę wąt...

Tutaj prezentujemy nowy humanizowany model wątroby myszy wygenerowany u myszy z nokautem komórkowym za pośrednictwem receptora alb-toksyny (TRECK)/SCID po przeszczepie niedojrzałych i zdolnych do rozbudowy ludzkich komórek macierzystych wątroby.

Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Ogólnym celem tej chirurgicznej procedury przeszczepiania komórek macierzystych jest stworzenie nowego chimerycznego modelu mysiego z funkcją wątroby ludzkiej z wykorzystaniem niedojrzałych ludzkich komórek progenitorowych macierzystych wątroby, które umożliwiają proliferację, dojrzewanie i różnicowanie komórek w celu nabycia zdolności do metabolizmu leków. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do stworzenia mikrośrodowiska wspierającego progenezę ludzkich komórek macierzystych wątroby dawcy w celu ich namnożenia, różnicowania i odbudowy uszkodzonej wątroby myszy biorcy. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykorzystania dojrzałych, proliferujących komórek oraz fakt, że wątroba ulega niemal całkowitej repopulacji.Na początek należy przygotować roztwór zapasowy toksyny błoniczej (DT) o stężeniu 1 mg/ml, dodając 1 ml fenolowanego 0,85% roztworu chlorku sodu do 1 mg DT. Wykonaj iniekcję doszpryetonalną DT: unieruchom mysz Albtrek SCID w pozycji grzbietowej i wprowadź igłę pod kątem 45 stopni do ciała, poniżej zgięcia kolan, po lewej lub prawej stronie linii środkowej. Używając strzykawki insulinowej, wstrzyknij 100 µl świeżo przygotowanego roztworu DT o stężeniu 0,3 µg/ml na każde

generation-of-a-humanized-mouse-liver-using-human-hepatic-stem-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten artykuł skupi się na generowaniu ludzkiej endodermy wątrobowej z populacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Solidna generacja komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich embrionalnych populacji komórek macierzystych

W niniejszym opracowaniu opisano generowanie i charakterystykę limfocytów T specyficznych dla nowotworu z wykorzystaniem myszy humanizowanych. Tkanka grasicy człowieka oraz genetycznie zmodyfikowane ludzkie komórki macierzyste krwi są przeszczepiane myszom z niedoborem odporności. Prowadzi to do rekonstrukcji zmodyfikowanego ludzkiego układu odpornościowego, co umożliwia badanie odpowiedzi immunologicznej przeciwnowotworowej in vivo.

Wykorzystanie humanizowanych myszy BLT jako modelu nowotworowego w genoterapii opartej na komórkach macierzystych

Ten film demonstruje metodę generowania podwójnie humanizowanego modelu myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Polega na przeszczepieniu ludzkich komórek wątroby oraz hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych transgenicznej myszy z niedoborem odporności poprzez wstrzyknięcie dośledzionowe, co prowadzi do wszczepienia komórek wątroby i rozwoju ludzkich komórek odpornościowych.

Opracowanie humanizowanego modelu myszy z ludzkimi komórkami wątroby i komórkami odpornościowymi

Ksenografty ludzkich nowotworów u myszy z niedoborem odporności są cennymi narzędziami do badania biologii raka.  Opisano specyficzne protokoły generowania ksenoprzeszczepów podskórnych i wewnątrzwątrobowych z ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego lub fragmentów guza.  Regeneracja wątroby wywołana częściową hepatektomią u myszy biorców jest przedstawiana jako strategia ułatwiająca wszczepienie wewnątrzwątrobowe.

Wytwarzanie podskórnych i wewnątrzwątrobowych ksenoprzeszczepów ludzkiego raka wątrobowokomórkowego u myszy z niedoborem odporności

Ten protokół opisuje metody konstruowania humanizowanego modelu myszy szpiku kostnego/wątroby/grasicy z opartą na komórkach macierzystych odpornością na zakażenie wirusem HIV.

Zmodyfikowana odporność na zakażenie wirusem HIV oparta na komórkach macierzystych w humanizowanym modelu myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia niezawodną metodę tworzenia humanizowanych myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Podwójnie odtworzone myszy z niedoborem odporności uzyskane przez wstrzyknięcie dośledzionowe ludzkich hepatocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + są podatne na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 i rekapitulują uszkodzenie wątroby, jak obserwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Opracowanie podwójnego humanizowanego modelu myszy TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV

Ortotopowe modele myszy z przerzutowym czerniakiem błony naczyniowej oka ludzkiej wątroby zostały stworzone przy użyciu technik chirurgicznej implantacji ortotopowej z technikami wstrzykiwania kawałków guza pochodzących od pacjenta i igieł z hodowanymi ludzkimi liniami komórkowymi czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej.

Generowanie ortotopowej platformy ksenoprzeszczepu ludzkiego czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej wątroby u myszy z niedoborem odporności

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Tutaj prezentujemy niegenetyczną metodę generowania ludzkich autologicznych sferoid wątroby przy użyciu komórek jednojądrzastych wyizolowanych z krwi obwodowej w stanie ustalonym.

Sferoidy ludzkiej wątroby z krwi obwodowej w badaniach nad chorobami wątroby

Poznaj metodę generowania humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby. Technika ta umożliwia badanie metabolizmu leków i funkcji wątroby człowieka w modelu chimerycznym.

Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

Przeglądaj więcej filmów