Generowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego poprzez chirurgiczne zespolenie rozwijających się blastuli

Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie parabiotycznych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do badania wewnętrznych i zewnętrznych funkcji komórek dla genów kandydujących na zainteresowanie. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące autonomii komórek. Na przykład w układzie hematopoetycznym istotne defekty w migracji HSC są nieodłącznie związane z HSC lub mikrośrodowiskiem niszowym.

Główną zaletą tego protokołu jest poprawa zdolności do skutecznego generowania parabiotycznych zarodków danio pręgowanego. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, będą miały trudności, ponieważ rozwijające się zarodki są niezwykle delikatne i łatwo je uszkodzić. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy szycia chirurgicznego mogą być trudne do nauczenia, ponieważ wymagają wysokiego stopnia dokładności i precyzji.

Tutaj podajemy instrukcje krok po kroku, jak wygenerować parabiotyczne zarodki danio pręgowanego poprzez chirurgiczną fuzję rozwijających się blastuli. Metoda ta pokazuje, w jaki sposób można zwiększyć efektywność fuzji parabiotycznych i zwiększyć przeżywalność zrośniętych zarodków. Po przygotowaniu odczynników i narzędzi zgodnie z protokołem tekstowym należy przygotować dwie lub trzy zmodyfikowane pipety Pasteura, krótko podgrzewając końcówkę pipety nad palnikiem Bunsena.

Następnie, za pomocą dużych kleszczy, gdy jest jeszcze gorący, zegnij koniec pipety o około 45 stopni. Aby upewnić się, że nie ma ostrych krawędzi, które mogłyby uszkodzić zarodki, trzymaj koniec pipety nad palnikiem Bunsena przez jedną do dwóch sekund. Używając DNA z osocza, mRNA lub morpholino, należy wstrzyknąć zarodki w ciągu godziny od pobrania i pozwolić im rozwinąć się do stadium 256 komórek.

Gdy zarodki zbliżają się do stadium 256 komórek, przenieś każde tło genetyczne do oddzielnych naczyń pokrytych agarozą, szklanych zlewek bez zarysowań lub szalek Petriego. Po dechorionacji zarodków zgodnie z protokołem tekstowym należy rozmrozić wcześniej przygotowaną metylocelulozę i użyć wirówki stołowej z maksymalną prędkością do osadzania nierozpuszczonych kryształów, które uszkodzą zarodki lub rozerwą żółtka. W międzyczasie, za pomocą markera, zaznacz od 12 do 15 wcześniej określonych miejsc na spodzie 100-mililitrowej szalki Petriego pokrytej agarozą.

Następnie, po odwirowaniu, używając wyraźnej górnej frakcji metylocelulozy, przenieś jedną do 1,5 centymetrowej kropli w zaznaczone miejsca na szalce Petriego. Następnie przygotuj jedną 40-mililitrową porcję wysokowapniowego roztworu dzwonka lub HCR na właśnie przygotowane naczynie pokryte agarozą. Do każdej podwielokrotności dodać antybiotyki, jak podano tutaj.

Gdy jesteś gotowy do przeprowadzenia fuzji blastuli, użyj porcji HCR z antybiotykami, aby ostrożnie wypełnić każde naczynie zawierające kropelki metylocelulozy, uważając, aby nie zakłócić kropelek. Podłącz zmodyfikowaną szklaną pipetę Pasteura przygotowaną wcześniej do 10-mililitrowej pompy do pipety. Następnie, pod stereoskopem, zbierz po jednym zdekorionowanym zarodku z każdego tła.

Przed wydaniem dwóch zarodków użyj pipety Pasteura, aby zrobić małe wgłębienie w środku kropli metylocelulozy. Następnie umieść dwa zarodki w zagłębieniu. Teraz, używając igły do drażnienia z końcówką do nakładania żelu na końcu, wykonuj delikatne ruchy zamiatające bez bezpośredniego dotykania zarodków, aby ostrożnie przestawić zarodki w metylocelulozie, tak aby ich bieguny zwierzęce stykały się bezpośrednio.

Właściwa orientacja rozwijających się zarodków decyduje o tym, w jaki sposób zarodki będą się zrastać i rozwijać. W przypadku fuzji head-to-head upewnij się, że każda fuzja jest wyrównana na biegunach zwierzęcych. Pozwól zarodkom siedzieć przez pięć minut, aby metyloceluloza osiadła wokół nich.

W tym czasie załaduj następną parę do kolejnej kropli. Aby wykonać operację, za pomocą szklanej igły ostrożnie nawiń każdy zarodek w miejscu ich kontaktu. Następnie, delikatnym ruchem szycia, wciągnij komórki z pierwszego zarodka do drugiego zarodka i z powrotem.

Pod koniec ruchu przytrzymaj igłę na miejscu przez dwie do trzech sekund, a następnie bardzo powoli ją odciągnij. Precyzja ze szklaną igłą ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia prawidłowego zszycia zarodków. Należy uważać, aby nie uszkodzić woreczków żółtkowych, zachowując jednocześnie wystarczające połączenie do pomyślnego połączenia.

Pozostaw zarodki na 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie zszyj dodatkowe pary zarodków. Po inkubacji należy ocenić, czy zarodki pozostały przyczepione i w razie potrzeby powtórzyć etap zranienia.

Inkubuj zarodki w tym samym naczyniu i podłożu w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka zarodki wyjdą z w większości rozpuszczonej metylocelulozy. Usuń wszystkie zarodki, które nie uległy fuzji.

Następnie zdekantuj pożywkę i użyj 25 mililitrów E3, aby ją zastąpić. Aby uzyskać obrazy zrośniętych zarodków, przygotuj 0,8% agarozę o niskiej temperaturze topnienia. Będąc jeszcze gorącym, podnieś 1 mililitr agarozy do 1,5 mililitrowych probówek do mikrofuzy ustawionych w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Znieczulić zarodki parabiotyczne, dodając jeden mililitr czterech miligramów na mililitr pH 7,0 tricainy do 25 mililitrów pożywki E3 zawierającej zarodki. Delikatnie zakręć naczyniem, aby zarodki zebrały się w środku. Następnie, za pomocą plastikowej pipety transferowej z szeroką końcówką, narysuj zarodki w jak najmniejszej ilości płynu.

Następnie obróć pipetę do góry pionowej i delikatnie odbij zarodki, aby osiadły na samym dnie pipety. Następnie przenieś zarodki do 1 mililitrowej porcji agarozy o niskiej temperaturze topnienia, lekko dotykając końcówką pipety o powierzchnię agarozy. Usuń nadmiar płynu z pipety i użyj pipety, aby delikatnie wymieszać zarodki w agarozie.

Następnie za pomocą pipety przenieś agarozę i zarodki do dołka na sześciodołkowej płytce ze szklanym dnem. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj końcówki ładującej żel przymocowanej do końca igły do drażnienia, aby umieścić zarodki blisko szkła nakrywkowego i w pożądanej orientacji do obrazowania. Po związaniu agarozy i dodaniu pożywki z tricainą do studzienek, użyj odwróconego szerokopolowego, epifluorescencyjnego, skaningowego, konfokalnego mikroskopu konfokalnego lub konfokalnego z wirującym dyskiem, aby uzyskać obrazy.

Aby uzyskać całe pole widzenia zarodka, użyj obiektywu 4X. Użyj obiektywu 20X, aby zobrazować określoną tkankę. Przetwarzaj obrazy zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak pokazano tutaj, po ustawieniu dwóch blastuli z ich zwierzęcymi biegunami skierowanymi do siebie, embriony zostały ostrożnie zranione w miejscu ich kontaktu. Większy stopień zranienia zwiększał prawdopodobieństwo utrzymania przez zarodki połączenia, które skutkowało udanym połączeniem bez dodatkowych wad morfologicznych lub opóźnionego rozwoju. Jak pokazano na tym rysunku, poprzez zorientowanie dwóch blastuli z ich biegunami zwierzęcymi ustawionymi bezpośrednio, wygenerowano niezawodne fuzje głowy w lub woreczka żółtkowego ze wspólnym krążeniem.

W większości przypadków zarodki miały dwa serca pompujące wspólne krążenie. Aby potwierdzić, że zarodki rzeczywiście dzieliły swoje krążenie, połączone transgeniczne zarodki, które miały erytrocyty GFP-dodatnie, zostały połączone z zarodkami, które miały mCherry-dodatnie komórki śródbłonka naczyniowego. Jak widać na tym filmie, po 48 godzinach od zapłodnienia zaobserwowano erytrocyty GFP-dodatnie krążące w zarodku partnera Flik 1 HRAS mCherry.

Wreszcie, aby zbadać czasową kontrolę ekspresji genów, jednemu z dwóch zarodków wstrzyknięto konstrukt DNA hsp70 EGFP. Po krótkim, 30-minutowym szoku cieplnym w temperaturze 37 stopni Celsjusza, w jednym z zarodków ustalono wyraźny sygnał GFP, a w niektórych przypadkach zaobserwowano komórki GFP-dodatnie krążące w zarodku partnera, któremu nie wstrzyknięto. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności podczas zszywania dwóch blastuli ze sobą i o ponownym przyjrzeniu się fuzjom, jeśli operacja nie powiodła się za pierwszym razem. Zgodnie z tą procedurą, dodatkowe metody, takie jak obrazowanie żywych komórek, mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, czy HSC typu dzikiego mogą normalnie funkcjonować w niszy ze zmutowanymi komórkami lub odwrotnie, czy zmutowane HSC mogą funkcjonować w niszy typu dzikiego. Technika ta stanowi potężną metodę dla naukowców w dziedzinie hematologii do badania regulacji rozwoju krwi u danio pręgowanego.

Nie zapominaj, że tricaince może być niebezpieczne i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniego stroju ochronnego. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu i zastosowaniu zalecanych przez nas technik będziesz w stanie z większym sukcesem wygenerować lepsze biotyczne zarodki danio pręgowanego.