Name: Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Poznaj bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra. Ta metoda pozwala manipulować składem ekstraktu i analizować dynamikę jądra komórkowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Członkowie laboratoriów Levy'ego i Gatlina, a także koledzy z Wydziału Biologii Molekularnej, służyli pomocnymi radami i dyskutowali. Rebecca Heald zapewniła wsparcie na wczesnych etapach opracowywania tego protokołu. Prace te były wspierane przez NIH/NIGMS (R15GM106318) i American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).

<ol><li>Conklin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+size+and+nuclear+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Cell size and nuclear size.</a> J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).</li>
<li>Wilson, E. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+EB+%22The+Cell+in+Development+and+Heredity%22">The Cell in Development and Heredity</a>. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+size+is+regulated+by+importin+alpha+and+Ntf2+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus.</a> Cell. 143 (2), 288-298 (2010).</li>
<li>Chan, Y. H., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+properties+of+cell+and+organelle+size%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Scaling properties of cell and organelle size.</a> Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).</li>
<li>Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nucleus%3A+Factors+and+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Shaping the nucleus: Factors and forces.</a> J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).</li>
<li>Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+nucleus%3A+nuclear+shape%2C+size+and+nuclear-envelope+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly.</a> J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).</li>
<li>Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+size+regulation%3A+from+single+cells+to+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear size regulation: from single cells to development and disease.</a> Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).</li>
<li>Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+shaping+the+nucleus%3A+mechanisms+and+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance.</a> Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+scaling%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular scaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).</li>
<li>Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+mechanisms+and+functions+of+nuclear+size+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).</li>
<li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+size+scaling+during+Xenopus+early+development+contributes+to+midblastula+transition+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing.</a> Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).</li>
<li>Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+DNA+density+affects+chromosome+condensation+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans.</a> Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).</li>
<li>Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure in cancer cells.</a> Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).</li>
<li>Jevtic, P., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nuclear+size+regulation+in+model+systems+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer.</a> Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).</li>
<li>Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+envelope+environment+and+its+cancer+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The nuclear envelope environment and its cancer connections.</a> Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).</li>
<li>Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometrically+estimated+variation+in+nuclear+size.+A+useful+tool+in+grading+prostatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Res%22%5BJournal%5D)">Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer.</a> Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).</li>
<li>Dey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nucleus%3A+morphology+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn+Cytopathol%22%5BJournal%5D)">Cancer nucleus: morphology and beyond.</a> Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+about+cancer+from+frogs%3A+analysis+of+mitotic+spindles+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts.</a> Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).</li>
<li>Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li>
<li>Chan, R. C., Forbes, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+study+of+nuclear+assembly+and+nuclear+import+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).</li>
<li>Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdens%2C+LJ+%22Xenopus+Development%22">Xenopus Development</a>. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).</li>
<li>Levy, D. L., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Scaling+Problems+and+Solutions+in+Amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166(2016).</li>
<li>Edens, L. J., Levy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cPKC+regulates+interphase+nuclear+size+during+Xenopus+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development.</a> J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNieuwkoop%2C+PD+%22Normal+Table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal Table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+II.+Control+of+the+onset+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription.</a> Cell. 30 (3), 687-696 (1982).</li>
<li>Newport, J., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+developmental+transition+in+early+Xenopus+embryos%3A+I.+characterization+and+timing+of+cellular+changes+at+the+midblastula+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage.</a> Cell. 30 (3), 675-686 (1982).</li>
<li>Maresca, T. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+spindle+assembly+and+chromosome+condensation+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts.</a> Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).</li>
<li>Hannak, E., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+mitotic+spindle+assembly+and+function+in+vitro+using+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).</li>
<li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle extracts.</a> Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).</li>
<li>Khan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+alterations+in+nuclear+structure+predict+prostate+carcinoma+distant+metastasis+and+death+in+men+with+biochemical+recurrence+after+radical+prostatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy.</a> Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).</li>
<li>Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+nuclear+morphometry+with+pathologic+parameters+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).</li>
<li>Zeimet, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+ploidy%2C+nuclear+size%2C+proliferation+index+and+DNA-hypomethylation+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecol+Oncol%22%5BJournal%5D)">DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).</li>
<li>Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleoporin+Nup188+controls+passage+of+membrane+proteins+across+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex.</a> J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).</li>
<li>Wuhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+upper+limit+to+mitotic+spindle+length%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for an upper limit to mitotic spindle length.</a> Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).</li>
<li>Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Katanin+contributes+to+interspecies+spindle+length+scaling+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus.</a> Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).</li>
<li>Wilbur, J. D., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+scaling+during+Xenopus+development+by+kif2a+and+importin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin.</a> eLife. 2, e00290(2013).</li>
<li>Kieserman, E. K., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+chromosome+size+scaling+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mitotic chromosome size scaling in Xenopus.</a> Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).</li>
<li>Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H1+is+essential+for+mitotic+chromosome+architecture+and+segregation+in+Xenopus+laevis+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts.</a> J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).</li>
<li>MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISWI+remodeling+complexes+in+Xenopus+egg+extracts%3A+identification+as+major+chromosomal+components+that+are+regulated+by+INCENP-aurora+B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).</li>
<li>Goehring, N. W., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+growth+control+through+limiting+pools+of+cytoplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components.</a> Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).</li>
<li>Du Toit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%3A+Honey%2C+I+shrunk+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development: Honey, I shrunk the nucleus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633(2014).</li>
<li>Buchner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+protein+kinase+C+in+the+regulation+of+cell+growth+and+in+signalling+to+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer+Res+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus.</a> J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).</li>
<li>Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C%2C+an+elusive+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C, an elusive therapeutic target.</a> Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiono nowatorską metodę badania mechanizmów regulacji wielkości jądra podczas rozwoju X. laevis . Postęp rozwojowy wiąże się z dramatycznymi zmianami w fizjologii komórki, metabolizmie, tempie podziału i migracji, a także zmianami w rozmiarach komórek i struktur wewnątrzkomórkowych. Te zróżnicowane procesy są złożone i niezbędne, dlatego trudno jest zbadać tylko jeden z tych aspektów rozwoju w warunkach in vivo . Opisany tutaj ekstrakt z zarodków X. laevis i test kurczenia się jądra poz...

Rozmiary organelli komórkowych zazwyczaj skalują się wraz z rozmiarem komórki, co zostało chyba najlepiej udokumentowane dla skalowania wielkości jądra przy rozmiarze komórki1-10. Jest to szczególnie prawdziwe podczas embriogenezy i różnicowania komórek, kiedy często obserwuje się dramatyczne zmniejszenie zarówno rozmiaru komórki, jak i jądra11,12. Co więcej, zmieniony rozmiar jądra jest kluczowym parametrem w diagnostyce i rokowaniu raka13-17. Mechanizmy, które przyczyniają się do regulacji wielkości jądra, są w dużej mierze nieznane, częściowo ze względu na złożoność i zasadniczy charakter struktury i funkcji jądra. Opisana tutaj metoda została opracowana jako test in vitro do skalowania wielkości jądra, który jest podatny na manipulacje biochemiczne i wyjaśnienie mechanizmów regulacji wielkości jądra.
Ekstrakt z jaj Xenopus laevis to sprawdzony system do podsumowania i badania złożonych procesów komórkowych w kontekście in vitro. Ekstrakty te ujawniły nowe podstawowe informacje na temat kilku procesów komórkowych, w tym budowy i funkcji wrzeciona mitotycznego, retikulum endoplazmatycznego i jądra18-22. Jedną z kluczowych zalet systemu ekstrakcji jest to, że ekstrakty z jaj X. laevis reprezentują prawie nierozcieńczoną cytoplazmę, której skład można łatwo zmienić, na przykład poprzez dodanie rekombinowanych białek lub wyczerpanie odporności. Co więcej, można manipulować istotnymi procesami, stosując leczenie, które w przeciwnym razie mogłoby być śmiertelne w kontekście in vivo. Modyfikacje procedury ekstrakcji z jaj pozwalają na izolację ekstraktów z zarodków X. laevis, a nie z jaj, a te ekstrakty z zarodków są równie podatne na manipulację biochemiczną23. Podczas rozwoju X. laevis zapłodniony zarodek jednokomórkowy (o średnicy ~1 mm) przechodzi serię dwunastu szybkich podziałów komórkowych (etapy 1 - 8), aby wytworzyć kilka tysięcy komórek o średnicy 50 μm i mniejszych, osiągając stadium rozwojowe zwane przejściem śródblastulowym (MBT) lub stadium 824-26. MBT charakteryzuje się początkiem transkrypcji zygotycznej, migracją komórek, asynchronicznymi podziałami komórek, nabywaniem faz przerwy i ustalaniem rozmiarów jądra w stanie ustalonym, a nie ciągłą ekspansją jądrową, jak w zarodku przed MBT. Od stadium 4 do gastrulacji (etapy 10,5 - 12) objętość pojedynczych jąder zmniejsza się ponad 10-krotnie11.
Tutaj celem jest zidentyfikowanie mechanizmów odpowiedzialnych za te zmniejszenia rozmiaru jądra podczas postępu rozwojowego. Podejście polega na tym, aby najpierw złożyć jądra w ekstrakcie z jaj X. laevis i wyizolować te jądra z cytoplazmy/ekstraktu z jaja. Jądra te są następnie ponownie zawieszane w cytoplazmie z zarodków w późnym stadium gastruli. Po okresie inkubacji jądra ekstraktu z jaja stają się mniejsze w późnym stadium ekstraktu z zarodka. Doszliśmy do wniosku, że byłby to przydatny test do identyfikacji składników cytoplazmatycznych obecnych w zarodkach w późnym stadium, które przyczyniają się do skalowania wielkości jądra rozwojowego. Korzystając z tego testu, w połączeniu z walidacją in vivo, wykazaliśmy, że kinaza białkowa C (PKC) przyczynia się do rozwojowego zmniejszenia wielkości jądra u X. laevis23.

<table><tbody><tr>Alexa Fluor 568 <td>Sondy molekularne</td> <td>IgG przeciw mysim osłom</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Sól disodowa ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Benzokaina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1501</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman</td><td>J2-21M</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik wirówki</td><td>Beckman</td><td>JS 13.1</td><td></td></tr><tr><td>chymosatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>fosforan kreatyny disodowy</td><td>Calbiochem</td><td>2380</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksymid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6255</td><td></td></tr><tr><td>cytochalazyna D</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8273</td><td></td></tr><tr><td>jednorazowe chusteczki (chusteczki kimwipe)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W326306</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Szklane naczynie krystalizujące (150 x 75 mm)</td><td>VWR</td><td>89090-662</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Macron</td><td>5094-16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst - trichlorowodorek bisBenzimide H 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>HCG - Ludzka gonadotropina kosmówkowa&nbsp;</td><td>Prospec</td><td>hor-250-c</td><td></td></tr><tr><td>L15 Media</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L4386</td><td></td></tr><tr><td>leupeptyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Lizolecytyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1381</td><td></td></tr><tr><td>mAb414</td><td>Abcam</td><td>ab24609</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>EMD</td><td>MX0045-2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 </td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9397</td><td></td></tr><tr><td>Maltoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>BDH</td><td>56009</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehydowa</td><td>mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina + Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Pp0781</td><td></td></tr><tr><td>pepstatyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa folia parafinowa (parafilm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>70100</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Baker</td><td>5 3140</td><td></td></tr><tr><td>PMSG - Surowica klaczy ciężarnej Gonadotropina</td><td>Prospec</td><td>hor-272-a</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher</td><td>BP328</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD</td><td>SX0720-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Tłuczek</td><td>Thomas Scientific</td><td>3411D56</td><td></td></tr><tr><td>Rurki szklane z okrągłym dnem, 15 ml</td><td>Corex</td><td>8441</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne (Alexa Fluor 568 osioł anty-mysie IgG)</td><td>ThermoFisher</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Calbiochem</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka</td><td>Beckman</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik ultrawirówki</td><td>Beckman</td><td>SW 50.1</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (medium montażowe zapobiegające blaknięciu)</td><td>Vector</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation

Fundamentalnym pytaniem w biologii komórki jest to, jak regulowane są rozmiary komórek i organelli. Od dawna wiadomo, że rozmiar jądra na ogół skaluje się wraz z rozmiarem komórki, zwłaszcza podczas embriogenezy, kiedy dochodzi do dramatycznego zmniejszenia rozmiarów zarówno komórki, jak i jąder. Mechanizmy regulacji wielkości jądra są w dużej mierze nieznane i mogą być istotne w przypadku raka, w którym zmieniony rozmiar jądra jest kluczowym parametrem diagnostycznym i prognostycznym. Podejścia in vivo do identyfikacji regulatorów wielkości jądra są skomplikowane ze względu na zasadniczą i złożoną naturę funkcji jądrowych. Opisane tutaj podejście in vitro do badania kontroli wielkości jądra wykorzystuje normalne zmniejszenie rozmiaru jądra, które występuje podczas rozwoju Xenopus laevis. Najpierw jądra są składane w ekstrakcie z jaj X. laevis. Następnie jądra te są izolowane i ponownie zawieszane w cytoplazmie z zarodków w późnym stadium rozwoju. Po 30-90 minutowym okresie inkubacji powierzchnia jądrowa zmniejsza się o 20-60%, zapewniając użyteczny test do identyfikacji składników cytoplazmatycznych obecnych w zarodkach w późnym stadium, które przyczyniają się do rozwojowego skalowania wielkości jądra. Główną zaletą tego podejścia jest względna łatwość, z jaką ekstrakty z jaj i zarodków mogą być biochemicznie manipulowane, co pozwala na identyfikację nowych białek i działań regulujących rozmiar jądra. Podobnie jak w przypadku każdego podejścia in vitro, walidacja wyników w systemie in vivo jest ważna, a mikroiniekcja zarodków X. laevis jest szczególnie odpowiednia w tych badaniach.

Montaż jąder w ekstrakcie z jajeczka
Pierwsze kroki tego protokołu polegają na przygotowaniu ekstraktu z jaj X. laevis (Protokół 1) oraz nuclei plemników pozbawionych błon (Protokół 2). Odczynniki te są następnie wykorzystywane do montażu jąder de novo (Protokół 3). Rycina 1 przedstawia reprezentatywne dane. Dodatek wapnia wprowadza ekstrakt z jaj, zablokowany w mejozie, w fazę...

Mechanizmy skalowania komórkowego i wewnątrzkomórkowego pozostają nieuchwytne. Stosowanie ekstraktów z zarodków Xenopus staje się coraz bardziej powszechne w celu wyjaśnienia mechanizmów regulacji wielkości organelli. Metoda ta opisuje przygotowanie ekstraktu z zarodka i nowatorski test skalowania jądrowego, za pomocą którego można zidentyfikować mechanizmy regulacji wielkości jądra.

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

A fundamental question in cell biology is how cell and organelle sizes are regulated. It has long been recognized that the size of the nucleus generally ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie ekstraktów z jaj i zarodków Xenopus do stworzenia testu, w którym duże jądra komórkowe ulegają pomniejszeniu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii jądra komórkowego, takie jak mechanizmy regulujące wielkość jądra. Główną zaletą tej techniki jest to, że skład i aktywność ekstraktów bezkomórkowych z Xenopus można łatwo modyfikować w celu oceny czynników wpływających na rozmiar jądra.Po przygotowaniu ekstraktów z jaj Xenopus, demembranowanych plemników oraz zmontowanych jąder komórkowych zgodnie z protokołem tekstowym, należy zebrać świeżo złożone jaja, trzymając żaby nad szklaną, wielorazową płytką Petriego. Aby pobudzić samice do składania jaj, należy wywrzeć delikatny ucisk na dolną część grzbietu w okolicy kloaki. Płytkę należy ustawić pod kątem około 45 stopni, aby jaja gromadziły się przy jej krawędzi.Następnie usuń nadmiar buforu i dodaj odpowiednią ilość roztworu MMR o stężeniu 1/3 X, aby ledwie pokryć jaja. Używając dopasowanego tłuczka, rozetrzyj i zhomogenizuj 1/4 jajnika w probówce o pojemności 1,5 ml z 500 µl wysokosolnego zmodyfikowanego roztworu soli Bartha (Modified Barth's Saline

a-cell-free-assay-using-xenopus-laevis-embryo-extracts-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Montaż otoczki jądrowej jest kluczowym etapem cyklu podziału komórkowego; proces ten można zreplikować in vitro, łącząc chromatynę plemników Xenopus, cytosol oraz lekkie frakcje błonowe. Powstają w pełni uformowane jądra, zawierające otoczki jądrowe z kompleksami porów, a tak zrekonstytuowane jądra są zdolne do przeprowadzania prawidłowych procesów jądrowych.

Montaż jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj Xenopus

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Opisano protokół przygotowania stabilnych ekstraktów jądrowych z komórek HeLa w małej skali. Protokół ten jest wartościowy dla analiz wymagających użycia niewielkich populacji komórek, takich jak komórki poddane działaniu leków lub RNAi. Metoda powinna być możliwa do zastosowania w szerokim zakresie analiz ekspresji genów oraz w przypadku innych typów komórek, w tym komórek pobranych od pacjentów.

Małoskalowe ekstrakty jądrowe do analiz funkcjonalnych aparatów ekspresji genów

Opisujemy zbieranie niezapłodnionych jaj Xenopus tropicalis i produkcję ekstraktu z jaj zatrzymanego przez mejozę II. Ten ekstrakt z jaj może być stosowany do oczyszczania mikrotubul i RNA związanych z mikrotubulami.

Produkcja ekstraktów jajowych Xenopus tropicalis w celu identyfikacji RNA związanych z mikrotubulami

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

Molekularne mechanizmy dekondensacji wysoce zagęszczonej chromatyny mitotycznej są źle zdefiniowane. Przedstawiamy bezkomórkowy test oparty na mitotycznych klastrach chromatyny wyizolowanych z komórek HeLa i ekstraktu z jaj Xenopus laevis, który wiernie odtwarza proces dekondensacji in vitro.

Test bezkomórkowy do badania dekondensacji chromatyny pod koniec mitozy

Opisujemy kroki, które umożliwiają szybkie pobieranie próbek in situ małej części pojedynczej komórki z dużą precyzją i minimalną inwazją, przy użyciu mikropróbkowania opartego na kapilarach, aby ułatwić chemiczną charakterystykę migawki aktywności metabolicznej w żywych zarodkach przy użyciu specjalnie zbudowanej platformy do elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas z pojedynczą komórką.

Elektroforeza kapilarna z mikrosondą Spektrometria mas do metabolomiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach żab (Xenopus laevis)

Prezentujemy metodę generowania in vitro samopodtrzymujących się oscylacji mitotycznych na poziomie pojedynczej komórki poprzez kapsułkowanie ekstraktów jajecznych Xenopus laevis w mikroemulsjach typu woda w oleju.

Rekonstrukcja oscylacji cyklu komórkowego w mikroemulsjach bezkomórkowych ekstraktów jajowych Xenopus

Opisujemy metodę przygotowania i obrazowania na żywo nierozcieńczonych ekstraktów cytoplazmatycznych z jaj Xenopus laevis.

Xenopus laevis (Xenopus laevis) Przygotowanie ekstraktu z jaj i metody obrazowania na żywo do wizualizacji dynamicznej organizacji cytoplazmy

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

Opisujemy metodę izolowania pojedynczych komórek z wczesnych zarodków Xenopus laevis i sortowania ich według wielkości komórek.

Izolowanie pojedynczych komórek z wczesnych zarodków Xenopus i sortowanie ich według rozmiaru

Poznaj bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra. Ta metoda pozwala manipulować składem ekstraktu i analizować dynamikę jądra komórkowego.

Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Przeglądaj więcej filmów