Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie ekstraktów z jaj i zarodków Xenopus do uzyskania testu, w którym duże jądra kurczą się mniejsze. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biologii komórki jądrowej, takie jak jakie są mechanizmy regulujące rozmiar jądra? Główną zaletą tej techniki jest to, że składem i działaniem bezkomórkowego ekstraktu Xenopus można łatwo manipulować w celu oceny faktów dotyczących wielkości jądra.

Po przygotowaniu ekstraktów z jaj Xenopus, zdemembranowanych plemników i złożonych jąder zgodnie z protokołem tekstowym, zbierz świeżo złożone jaja, trzymając żaby nad szklaną szalką Petriego wielokrotnego użytku. Promuj składanie jaj, wywierając delikatny nacisk na dolną część pleców w pobliżu kloaki. Podeprzyj naczynie pod kątem około 45 stopni, aby jajka zebrały się wzdłuż krawędzi naczynia.

Następnie usuń nadmiar buforu i dodaj tyle jednej trzeciej X MMR, aby ledwo przykryć jaja. Za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka maceruj i homogenizuj 1/4 jądra w 1,5-mililitrowej probówce z 500 mikrolitrami modyfikowanej soli fizjologicznej Bartha o wysokiej zawartości soli lub MBS. Następnie dodaj zmacerowane jądro do jaj i pozwól zapłodnieniu nastąpić w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Po inkubacji zalej jaja jedną trzecią X MMR. Następnie, pięć do 10 minut później, potwierdź zapłodnienie, sprawdzając, czy nie skurczył się ciemno zabarwiony słup zwierzęcy i obracając zarodki z ich zwierzęcymi biegunami skierowanymi do góry. Za pomocą plastikowej pipety o szerokim otworze należy starannie usunąć martwe, zlizowane lub niezapłodnione, rozszczepione jaja, ponieważ szybko spowodują one śmierć sąsiednich zarodków.

W dowolnym miejscu od jednej do 2,5 godziny po zapłodnieniu, zarodki dejelly w dwóch do trzech procentach cysteiny rozpuszczają się w jednej trzeciej X MMR, który został dostosowany do pH 7,9. Pryor do dejellyingu, zarodki zajmują stosunkowo dużą objętość. Wykonaj dwie zmiany bufora przez trzy do czterech minut każda.

Następnie dokładnie umyj zarodki sześcioma do dziesięciu krótkich zmian jednej trzeciej X MMR, aby usunąć wszelkie ślady cysteiny. Po dejellyingu zarodki ciasno się pakują i zajmują stosunkowo niewielką objętość. Następnie, za pomocą szklanej pipety o szerokim otworze, przenieś zdrowe, zapłodnione zarodki na szalkę Petriego zawierającą świeżą jedną trzecią X MMR.

A w temperaturze pokojowej pozwól im rozwinąć się do pożądanego etapu. Kontynuuj usuwanie martwych lub zlizowanych zarodków, na co wskazuje brak pierwszego podziału lub biały, opuchnięty wygląd. Gdy zarodki osiągną stadium od 11,5 do 12, przenieś je do świeżej jednej trzeciej X MMR uzupełnionej 0,5 milimolowym cykloheksymimidem i inkubuj zarodki w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby zatrzymać je w późnej interfazie.

Za pomocą szklanej lub plastikowej pipety o szerokim otworze przenieś co najmniej 15 zarodków zatrzymanych w interfazie do probówki mikrowirówkowej. Dodaj jeden mililet buforu do lizy jaj lub ELB, uzupełniony jednym mikrolitrem bulionu LPC do zarodków. Delikatnie odwróć rurkę, aby umyć zarodki.

Następnie pozwól zarodkom opaść na dno probówki. Przed wyjęciem bufora powtórz mycie jeszcze dwa razy. Ponownie zawiesić zarodki w 500 mikrolitrach ELB, plus 0,5 mikrolitra bulionu LPC, 5 mikrolitrów 19,7 milimolowego cykloheksymidu i 5 mikrolitrów 35,5 milimolowej cytochalazyny D, aby zahamować polimeryzację aktyny.

Odwirować próbki w wirówce stołowej o temperaturze 200 razy G przez jedną minutę, a następnie usunąć nadmiar buforu i użyć tłuczka, aby dokładnie zmiażdżyć zarodki. Umieść rozdrobnione próbki w wahadłowym wirniku kubełkowym i odwiruj w temperaturze 10 000 razy G i 16 stopni Celsjusza przez 10 minut. Za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów nakłuj warstwę lipidową od góry i za pomocą czystej końcówki pipety usuń środkową cytoplazmatyczną warstwę w kolorze bursztynowym do probówki o odpowiedniej wielkości.

Uzupełnij ekstrakt z zarodków następującymi odczynnikami. Następnie delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać. Następnie, po uwidocznieniu endogennych jąder embrionalnych w ekstrakcie poprzez przygotowanie dyni zgodnie z protokołem tekstowym, usuń jądra z ekstraktu, dodając najpierw równą objętość ELB zawierającą wymienione tutaj odczynniki.

Delikatnie odwróć rurkę, aby wymieszać. Odwirować próbkę w obracającym się wirniku kubełkowym pod ciśnieniem 17 000 razy G w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie zebrać supernatant, uważając, aby nie pozostały żadne pozostałości lipidów na górze, i pozostawić granulowane jądra na dole w spokoju.

Przygotuj dynię zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby upewnić się, że większość jąder została usunięta. Następnie użyj świeżego ekstraktu lub porcji próbki i przechowuj ją w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wyizoluj jądra złożone w ekstrakcie jajowym, rozcieńczając od 25 do 150 mikrolitrów wstępnie złożonych jąder w jednym mililecie ELB w probówce o pojemności 1,5 mililitra.

Wirować w temperaturze 1600 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez trzy minuty. Następnie wyjmij bufor, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj do osadu objętość ekstraktu z zarodka równą pierwotnej objętości ekstraktu z jaja i delikatnie postukaj w probówkę, aby rozbić osad i ponownie zawiesić jądra.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, delikatnie stukając w probówkę, aby mieszać co 15 do 30 minut. Po inkubacji postukaj w probówkę, aby ponownie zawiesić jądra tuż przed dodaniem 500 mikrolitrów ELB z 15% glicerolem i 2,6% paraformaldehydem. Natychmiast odwróć rurkę i umieść rurkę na rotatorze w temperaturze pokojowej na 15 minut.

Przygotuj rurki wirujące, wyposażając 15-mililitrowe szklane rurki z okrągłym dnem w plastikowe wkładki z okrągłym dnem. Dodaj 5 mililitrów bufora poduszki jądrowej, a następnie wrzuć 12-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe do tuby, upewniając się, że leży płasko na plastikowej wkładce. Używając końcówki pipety o szerokim otworze, delikatnie ułóż roztwór utrwalonych jąder na wierzchu poduszki jądrowej.

Odwiruj go w obracającym się wirniku kubełkowym przy 1 000 razy G i 16 stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie użyj aspiratora, aby usunąć cały bufor i przytrzymaj plastikową wkładkę do górnej części rurki. Następnie, za pomocą cienkich kleszczyków, usuń szkiełko nakrywkowe, zwracając uwagę na stronę szkiełka nakrywkowego, na którą zostały odwrócone jądra.

Gospodarz utrwal szkiełko nakrywkowe w zimnym metanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieś szkiełko nakrywkowe, jądrami do góry, na arkusz plastikowej folii parafinowej wyściełającej dużą, plastikową szalkę Petriego. Następnie umieść mokre, jednorazowe chusteczki wzdłuż boku naczynia, aby zapobiec odwodnieniu.

Za pomocą 500 mikrolitrów PBS NP40 należy ponownie uwodnić jądra na szkiełku nakrywkowym przez pięć do 10 sekund i aspirować. Następnie ostrożnie nałóż 75 mikrolitrów PBS 3% BSA na szkiełko nakrywkowe i pozwól mu zablokować się w temperaturze pokojowej przez godzinę lub cztery stopnie Celsjusza przez noc. Usunąć bufor blokujący i inkubować z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w PBS 3% BSA.

Następnie przemyć próbki pięcioma natychmiastowymi zmianami PBS NP40. Powtórz te etapy inkubacji i mycia z przeciwciałami drugorzędowymi. Inkubować z 10 mikrogramami na mililitr Hoechst rozwartego w PBS 3% BSA przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyć pięciokrotnie PBS NP40 i usunąć cały nadmiar buforu. Na koniec zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełku z pięcioma mikrolitrami środka montażowego zapobiegającego blaknięciu. Użyj przezroczystego lakieru do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i natychmiast zobrazuj za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub przechowuj w temperaturze 40 stopni Celsjusza do późniejszego obrazowania.

Rysunek ten przedstawia składanie się jąder ekstraktu z komórki jajowej. 30-45 minut po zainicjowaniu reakcji cienkie jądra plemników w kształcie litery S powinny zacząć gęstnieć w masy chromatyny w kształcie ślimaka. Po złożeniu jądrowym kształt jądra powinien stać się bardziej zaokrąglony, a objętość jądra powinna wzrastać wraz z rozszerzaniem się otoczki jądrowej i importem białek jądrowych.

Jak pokazano tutaj, barwiona kabaczek Hoechsta z małej porcji ekstraktu z zarodka wykazuje wiele barwionych jąder wskazujących, że przygotowanie ekstraktu zakończyło się sukcesem. Po usunięciu jąder przez odwirowanie, w porównaniu z pierwszym zgniataniem, w ekstrakcie należy pozostawić bardzo niewiele jąder, jak pokazano w tym panelu, zapewniając, że jądra endogenne nie zakłócają dalszej analizy. Jeśli jądra są nadal obecne, wymagana jest druga runda wirowania.

W tym teście kurczenia się jądra jaj jądra ekstraktu z jaj ponownie zawieszone w ekstrakcie zarodkowym w późnym stadium z powodzeniem zmniejszają się z czasem. Jednak jądra inkubowane z inaktywowanym termicznie ekstraktem z zarodków tego nie robią. Wielokrotne powtarzanie eksperymentu jest ważne, aby uwzględnić nieodłączną zmienność testu.

Po opanowaniu całego protokołu można wykonać w ciągu dwóch dni, a sam test kurczenia się jądrowego trwa około czterech godzin. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać o kontroli jakości jaj i zarodków przez cały czas oraz o zachowaniu szczególnej ostrożności, aby uniknąć warstwy osadu i lipidów podczas pobierania ekstraktu cytoplazmatycznego po odwirowaniu. Wyniki uzyskane w wyniku zastosowania tej procedury powinny zostać zwalidowane.

Na przykład mikroiniekcja zarodka lub transfekcja hodowli komórkowej. Co więcej, metoda ta może być wykorzystana do zbadania regulacji wielkości innych organelli. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią jądrową do zbadania mechanizmów regulacyjnych wielkości jądra oraz funkcjonalnej roli wielkości jądra w rozwoju i kancerogenezie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak składać i izolować jądra ekstraktu z jaj Xenopus, generować zarodki Xenopus i ekstrakt z zarodków, wykonywać test kurczenia się jądra i wizualizować wyniki.