Bezkomórkowy test wykorzystujący ekstrakty z zarodków Xenopus laevis do badania mechanizmów regulacji wielkości jądra

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie ekstraktów z jaj i zarodków Xenopus do stworzenia testu, w którym duże jądra komórkowe ulegają pomniejszeniu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii jądra komórkowego, takie jak mechanizmy regulujące wielkość jądra. Główną zaletą tej techniki jest to, że skład i aktywność ekstraktów bezkomórkowych z Xenopus można łatwo modyfikować w celu oceny czynników wpływających na rozmiar jądra.

Po przygotowaniu ekstraktów z jaj Xenopus, demembranowanych plemników oraz zmontowanych jąder komórkowych zgodnie z protokołem tekstowym, należy zebrać świeżo złożone jaja, trzymając żaby nad szklaną, wielorazową płytką Petriego. Aby pobudzić samice do składania jaj, należy wywrzeć delikatny ucisk na dolną część grzbietu w okolicy kloaki. Płytkę należy ustawić pod kątem około 45 stopni, aby jaja gromadziły się przy jej krawędzi.

Następnie usuń nadmiar buforu i dodaj odpowiednią ilość roztworu MMR o stężeniu 1/3 X, aby ledwie pokryć jaja. Używając dopasowanego tłuczka, rozetrzyj i zhomogenizuj 1/4 jajnika w probówce o pojemności 1,5 ml z 500 µl wysokosolnego zmodyfikowanego roztworu soli Bartha (Modified Barth's Saline) lub MBS. Następnie dodaj rozetrty jajnik do jaj i pozwól na zapłodnienie w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Po inkubacji zalej jaja roztworem MMR w stężeniu 1/3X. Następnie, po upływie od 5 do 10 minut, potwierdź zapłodnienie, sprawdzając skurcz ciemnego, pigmentowanego bieguna zwierzęcego oraz obracając embriony tak, aby ich bieguny zwierzęce były skierowane do góry. Używając plastikowej pipety o szerokim wylocie, starannie usuń martwe, lizowane lub niezapłodnione i niepodzielone jaja, ponieważ będą one szybko indukować śmierć sąsiednich embrionów.

Od jednej do 2,5 godziny po zapłodnieniu należy przeprowadzić usuwanie galaretki z embrionów w roztworze cysteiny o stężeniu od dwóch do trzech procent rozpuszczonej w 1/3 X MMR, z pH dostrojonym do 7,9. Przed usunięciem galaretki embriony zajmują stosunkowo dużą objętość. Należy przeprowadzić dwie wymiany buforu, każdorazowo przez trzy do czterech minut.

Następnie należy dokładnie przemyć embriony, wymieniając od sześciu do 10 razy roztwór 1/3 X MMR w krótkich odstępach czasu, aby usunąć wszelkie ślady cysteiny. Po usunięciu otoczki galaretowatej embriony ściśle przylegają do siebie i zajmują stosunkowo niewielką objętość. Następnie, używając szklanej pipety o szerokim otworze, należy przenieść zdrowe, zapłodnione embriony do szalki Petriego zawierającej świeży roztwór 1/3 X MMR.

W temperaturze pokojowej należy pozwolić im na rozwój do pożądanego stadium. Należy kontynuować usuwanie martwych lub lizowanych embrionów, co rozpoznaje się po braku pierwszego podziału lub białym, napuchniętym wyglądzie. Gdy embriony osiągną stadium 11,5 do 12, należy przenieść je do świeżego medium one-third X MMR uzupełnionego o 0,5 mM cykloheksymidu i inkubować embriony w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby zatrzymać je w późnej interfazie.

Za pomocą szklanej lub plastikowej pipety o szerokim otworze przenieś co najmniej 15 embrionów zatrzymanych w fazie interfazy do probówki do mikrowirówki. Dodaj do embrionów jeden mililitr buforu do lizy komórek jajowych (egg lysis buffer, ELB) uzupełnionego o jeden mikrolitr roztworu stokowego LPC. Delikatnie odwróć probówkę, aby wypłukać embriony.

Następnie należy pozwolić zarodkom opaść na dno probówki. Przed usunięciem buforu powtórzyć płukanie jeszcze dwukrotnie. Resuspender zarodki w 500 µL ELB, dodając 0,5 µL zapasu LPC, 5 µL 19,7 mM cykloheksymidu oraz 5 µL 35,5 mM cytochalazyny D w celu zahamowania polimeryzacji aktyny.

Odwiruj próbki w wirówce nakładkowej przy 200 ×g przez jedną minutę, następnie usuń nadmiar buforu i za pomocą tłucika dokładnie rozgnieć zarodki. Umieść rozgniecione próbki w rotorze z koszyczkami i wiruj przy 10 000 ×g i 16 °C przez 10 minut. Za pomocą końcówki pipety 200 µL przebij warstwę lipidową od góry, a następnie, używając czystej końcówki pipety, przenieś środkową, bursztynową warstwę cytoplazmatyczną do probówki o odpowiedniej wielkości.

Uzupełnić ekstrakt z embrionów o następujące odczynniki. Następnie delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać zawartość. Po zwizualizowaniu endogennych jąder embrionalnych w ekstrakcie poprzez przygotowanie preparatu zgniatanego zgodnie z protokołem tekstowym, usunąć jądra z ekstraktu, dodając najpierw taką samą objętość buforu ELB zawierającego wymienione tutaj odczynniki.

Delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość. Odwiruj próbkę w rotorze z koszykami w 17 000 ×g w temperaturze 16 °C przez 15 minut. Następnie pobierz supernatant, uważając, aby nie pobrać pozostałych na górze lipidów, i nie naruszaj osadu z jąder komórkowych na dnie.

Przygotuj preparat metodą zgniatania (squash), zgodnie z opisem w protokole tekstowym, aby upewnić się, że większość jąder została usunięta. Następnie wykorzystaj świeży ekstrakt lub podziel próbkę na alikwoty i przechowuj ją w temperaturze -80 °C. Wyizoluj jądra zmontowane w ekstrakcie z jaj poprzez rozcieńczenie 25 do 150 µL wcześniej zmontowanych jąder w 1 mL buforu ELB w probówce o pojemności 1,5 mL.

Wiruj przy 1600 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy minuty. Następnie usuń bufor, uważając, aby nie naruszyć osadu. Dodaj do osadu objętość ekstraktu z embrionu równą pierwotnej objętości ekstraktu z jaja, a następnie delikatnie opukaj probówkę, aby rozbić osad i resuspender jądra.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, delikatnie opukując probówkę w celu wymieszania co 15 do 30 minut. Po inkubacji opukać probówkę, aby resuspenderć jądra bezpośrednio przed dodaniem 500 µL buforu ELB z 15% glicerolem i 2,6% Paraformaldehydem. Natychmiast odwrócić probówkę i umieścić ją na rotatorze w temperaturze pokojowej na 15 minut.

Przygotować probówki do wirowania, wyposażając szklane probówki o okrągłym dnie o pojemności 15 ml w plastikowe wkładki o okrągłym dnie. Dodać 5 ml buforu poduszki jądrowej, a następnie włożyć do probówki okrągłe szkiełko nakrywki o średnicy 12 mm, upewniając się, że leży ono płasko na plastikowej wkładce. Używając końcówki do pipety o szerokim otworze, ostrożnie nanieść roztwór utrwalonych jąder na warstwę poduszki jądrowej.

Odwiruj próbkę w rotorze z koszykami odchylającymi przy 1 000 ×g i 16°C przez 15 minut. Następnie, za pomocą aspiratora usuń cały bufor, przytrzymując plastikową wkładkę u góry probówki. Po czym, używając precyzyjnej pęsety, usuń szkiełko nakładkowe, pamiętając o zaznaczeniu strony szkiełka, na którą osadziły się jądra.

Utrwal szkiełko nakrywkę w zimnym metanolu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieś szkiełko nakrywkowe stroną z jądrami do góry na arkusz plastikowej folii parafinowej wyściełającej dużą, plastikową płytkę Petriego. Następnie umieść mokre, jednorazowe ściereczki wzdłuż krawędzi płytki, aby zapobiec odwodnieniu.

Za pomocą 500 µL PBS NP40 rehydratyzuj jądra na szkiełku nakrywce przez 5 do 10 sekund, a następnie odessij płyn. Następnie ostrożnie nanieś 75 µL PBS 3%BSA na szkiełko nakrywkę i pozostaw do zablokowania w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę lub w temperaturze 4 °C przez noc. Usuń bufor blokujący i inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym rozcieńczonym w PBS 3%BSA.

Następnie przemyć próbki pięciokrotnie, za każdym razem stosując świeżą porcję PBS NP40. Powtórzyć te etapy inkubacji i płukania z przeciwciałami wtórnymi. Inkubować z 10 µg/mL Hoechst rozcieńczonego w PBS 3% BSA przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie przemyj pięć razy roztworem PBS NP40 i usuń cały nadmiar buforu. Na koniec przymocuj szkiełko coverglass do preparatu, używając 5 µL medium montującego typu anti-fade. Użyj bezbarwnego laku do paznokci, aby uszczelnić szkiełko, a następnie niezwłocznie wykonaj obrazowanie za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego lub przechowuj w temperaturze 4°C do późniejszego obrazowania.

Rysunek ten przedstawia proces składania się jąder w ekstrakcie z komórek jajowych. 30-45 minut po rozpoczęciu reakcji cienkie, S-kształtne jądra plemników powinny zacząć grubieć, tworząc ślimakowate masy chromatyny. Po zajściu procesu składania się jądra, jego kształt powinien stać się bardziej okrągły, a objętość jądra powinna wzrosnąć w miarę rozszerzania się otoczki jądrowej i importu białek jądrowych.

Jak pokazano tutaj, preparat zgniotu niewielkiej porcji ekstraktu z zarodka, barwiony Hoechstem, wykazuje liczne zabarwione jądra, co świadczy o prawidłowym przygotowaniu ekstraktu. Po usunięciu jąder drogą wirowania, w porównaniu do pierwszego zgniotu, w ekstrakcie powinno pozostać bardzo mało jąder, co obrazuje ten panel, zapewniając, że endogenne jądra nie będą zakłócać dalszych analiz. Jeśli jądra nadal są obecne, konieczna jest druga runda wirowania.

W tym teście kurczenia się jąder komórkowych jądra z ekstraktu z jajeczka resuspenderowane w ekstrakcie z embrionu w późnym stadium rozwoju stopniowo zmniejszają swoją objętość. Natomiast jądra inkubowane z termicznie inaktywowanym ekstraktem z embrionu nie wykazują takiego zjawiska. Wielokrotne powtórzenie eksperymentu jest istotne ze względu na wpisane w ten test zróżnicowanie wyników.

Po opanowaniu techniki cały protokół można zrealizować w ciągu dwóch dni, przy czym sam test kurczenia się jąder komórkowych zajmuje około czterech godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały czas kontrolować jakość jaj i embrionów oraz zachować szczególną ostrożność, aby nie pobrać osadu i warstw lipidowych podczas zbierania ekstraktu cytoplazmatycznego po wirowaniu. Wyniki uzyskane zgodnie z tą procedurą powinny zostać zwalidowane.

Na przykład mikroiniekcja zarodków lub transfekcja hodowli komórkowych. Ponadto metoda ta może być wykorzystana do badania regulacji wielkości innych organelli. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu biologii jądra komórkowego do zgłębiania mechanizmów regulujących wielkość jądra oraz funkcjonalnej roli wielkości jądra w rozwoju i kancerogenezie.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować i wyizolować jądra komórkowe z ekstraktu z jaj Xenopus, generować embriony Xenopus oraz ekstrakt z embrionów, przeprowadzić test kurczenia się jądra oraz zwizualizować wyniki.